CN116773828A - 一种大熊猫rln3酶联免疫检测方法及单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大熊猫RLN3酶联免疫检测方法及单克隆抗体，属于ELISA检测方法领域。该方法以大熊猫RLN3单克隆抗体作为包被抗体和RLN3多克隆抗体作为标记抗体进行检测，其中，大熊猫RLN3单克隆抗体由杂交瘤细胞株RLN‑3分泌产生；杂交瘤细胞株RLN‑3的保藏编号为CCTCC NO：C202129；于2021年1月7日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。本发明以制备得到的大熊猫RLN3单克隆抗体作为包被抗体和抗大熊猫RLN3多克隆抗体作为标记抗体，开发了大熊猫尿液RLN3酶联免疫检测方法，通过对大熊猫RLN3的测定，可适时监测大熊猫RLN3的变化。
Description
技术领域
本发明属于ELISA 检测方法领域，具体涉及一种大熊猫RLN3单克隆抗体、试剂盒以及其酶联免疫检测方法，适时监测RLN3的变化。
背景技术
松弛素（RLN）是在地鼠和豚鼠的性腺激素中发现并命名的一种短循环多肽激素，在妊娠、分娩及其他女性生殖方面起重要作用。松弛素及其类似物已经在临床和畜牧生产中成为一些疾病的治疗药物，并且有望在未来作为某些疾病的预测、评估指标，对新药物开发和利用具有重要意义。
研究表明，松弛素会促进妊娠期雌性动物生殖道生长和软化，在大鼠中松弛素可以抑制细胞凋亡，促进上皮细胞和基质细胞积累，刺激细胞增殖，导致子宫颈和阴道延展性发生变化。哺乳动物体内注射松弛素可以显著降低子宫肌层收缩频率和幅度；雌激素和孕酮刺激会增加大鼠和猪子宫肌层对松弛素的敏感性。更进一步研究表明，松弛素可能通过与雌激素、孕酮的协同作用降低妊娠动物子宫的自发性收缩。因此，体内松弛素水平的检测对生殖方面具有重要的指导意义。
已有研究表明犬RLN检测可识别妊娠或评定胎儿活力，但在流产后可能出现假阳性结果。而松弛素（RLN）3作为松弛素家族的重要成员之一，其可用于评估体内的松弛素水平。但是，目前缺乏针对大熊猫体内松弛素水平含量的检测方法，关于大熊猫体内松弛素水平的变化还有待研究。综上所述，建立一种RLN3的检测方法，适时监测RLN3的变化，适时反映大熊猫体内松弛素的水平，对大熊猫生殖方面的监测有重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供两种特异的抗大熊猫松弛素3(RLN3)单克隆抗体和多克隆抗体，并利用这两种抗体作为包被抗体和标记抗体及大熊猫RLN3重组蛋白研发了大熊猫尿液RLN3的检测方法，适时监测RLN3的变化。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种RLN3酶联免疫检测方法，以杂交瘤细胞株RLN-3产生的大熊猫RLN3单克隆抗体作为包被抗体和RLN3多克隆抗体作为标记抗体进行检测；
其中，杂交瘤细胞株RLN-3的保藏编号为CCTCC NO：C202129；于2021年1月7日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
进一步地，对RLN3进行检测时，使用杂交瘤细胞株RLN-3产生的大熊猫RLN3单克隆抗体作为一抗包被抗体和RLN3多克隆抗体作为标记抗体进行检测。
进一步地，大熊猫RLN3单克隆抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的RLN3特异序列(RLN3-2)作为免疫原，并由杂交瘤细胞株RLN-3分泌。
进一步地，大熊猫RLN3单克隆抗体的制备方法为：
（1）设计RLN3特异序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，并使其与KLH偶联，形成免疫原RLN3-2-KLH；
（2）采用免疫原RLN3-2-KLH免疫小鼠；
（3）细胞合得到大熊猫RLN3单克隆抗体杂交瘤细胞株RLN-3；
（4）扩大培养即可分别得到杂交瘤细胞株RLN-3产生的大熊猫RLN3单克隆抗体。
进一步地，RLN3多克隆抗体的制备方法为：
（1）免疫原及标准品的制备：采用原核表达的方法，先通过基因合成的方式，化学合成RLN3部分编码区基因片段及酶切位点NdeI和HindIII 及终止密码子，正向构建到pET30a载体上，并用NdeI-HindIII对重组载体进行酶切鉴定，通过原核表达系统，表达带6*His标签的RLN3 26-139氨基酸片段的重组蛋白（RLN3）, 并通过亲和层析（Ni-IDA树脂）纯化作为开发RLN3多克隆抗体的免疫原及酶联免疫方法检测的标准品；
（2）RLN3多克隆抗体的制备：将步骤（1）中所述的免疫原重组蛋白（RLN3）免疫兔，对免疫后的兔进行心脏采血，并分离血得到血清，将得到的血清通过亲和层析，分步收集高浓度的纯化产物，然后通过超滤离心管进行浓缩，即得浓缩后1种RLN3多克隆抗体。
进一步地，步骤（2）中将免疫原免疫兔包括以下内容：首次免疫剂时，是将500μg免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀后，对兔进行注射免疫；两周后进行第一次加强免疫，将250μg偶联免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂混合均匀后，对兔进行注射免疫；一周后进行第二次加强免疫，免疫剂量和方法与第一次加强免疫相同；待兔耳缘静脉血清效价达1:10000倍后，进行第三次加强免疫，免疫剂量和方法与第一次加强免疫相同。
进一步地，步骤（2）中的心脏采血是在第三次加强免疫3天后进行。
进一步地，步骤（2）中所述的亲和层析的填料为蛋白G琼脂糖。
进一步地，采用酶联免疫进行检测。
进一步地，当进行检测时，抗RLN3抗体包括一种单克隆抗体和一种多克隆抗体。
进一步地，包括以下内容：上述第一种大熊猫RLN3单克隆抗体包被的96孔酶标板、生物素标记的上述第二种RLN3多克隆抗体、抗生素蛋白链霉菌素-辣根过氧化物酶复合物、标准品、样品缓冲液、洗涤缓冲液、色原底物溶液和色原终止液；
进一步地，标准品为上述重组蛋白RLN3
进一步地，色原底物溶液为TMB显色液；色原终止液为浓度1M的硫酸溶液。
本发明的有益效果：
本发明以制备得到的大熊猫RLN3单克隆抗体作为包被抗体和抗大熊猫RLN3多克隆抗体作为标记抗体，开发了大熊猫尿液RLN3酶联免疫检测方法，通过对大熊猫RLN3的测定，可适时监测大熊猫RLN3的变化。
附图说明
图1为SDS-PAGE分析RLN3蛋白于BL21（DE3）的表达结果图；其中，条带 M: SDS-PAGE Protein Marker；条带 0:对照(不加IPTG)；条带 1: 37℃诱导16 h；条带 2: 全菌破菌后上清；条带3：全菌破菌后沉淀；
图2为SDS-PAGE分析包涵体中RLN3蛋白纯化结果图；其中，条带 M: SDS-PAGEProtein Marker；条带 1：包涵体溶解离心后上清；条带 2：上清同Ni-IDA孵育后流出液；条带 3：50mM Imidazole的洗脱组分；条带4-5：300mM Imidazole的洗脱组分；
图3为RLN3检测试剂盒的标准曲线图；
图4为RLN3检测变化图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法；下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
大熊猫RLN3单克隆抗体的制备
1.特异多肽片段的设计与合成：根据NCBI数据库RLN3氨基酸序列，登录号： XP_002921067.1，序列为：MAKHPLLLLLTVWVLAGELWLRTEARASPFGVKLCGREFIRAVIFTCGGSRWRRADVLAPEATGDPFPDADSDTDSELDEAVASSELLAMTKYPLASYGGRPGWQGTPGTLRGGRDVVAGLSSNCCKWGCSKSEISSLC（SEQ ID NO.3）,并参考其它物种序列分析，设计了RLN3特异序列DVVAGLSSNCCKWGCSKSEISSLC（RLN3-2）（SEQ ID NO.4），并通过人工合成，并与KLH（匙空血蓝蛋白）偶联，作为生产特异性抗体的免疫原（RLN3-2-KLH）。对于多肽片段的合成，此工艺比较成熟，通过本申请公开的序列，生工生物工程（上海）股份有限公司即可生产出多肽片段RLN3-2以及免疫原RLN3-2-KLH
2. 抗原小鼠免疫：用佐剂：抗原=1:1的混合液接种，(抗原量不够可与氯化钠混合后再与佐剂乳化)。首免用弗氏完全佐剂，后面免疫用弗氏不完全佐剂。免疫之前准备好灭菌的注射器、三通管、一次性注射器。先用灭菌好的注射器将抗原和NaCl吸进注射器中（共400μL，四只的量），再用灭菌好的注射器将佐剂吸入注射器中（共400μL，四只的量）；最后将灭菌好的注射器连在三通管中进行乳化（乳化大概10多分钟，至油包水状态即可），最后再将融合好的混合液转入一次性注射器中进行注射。
第1天： 腹腔注射，200μL一只。(抗原量为100μg/只)
第14天：腹腔注射，200μL一只。（之后抗原都为50μg/只）
第21天：腹腔注射，200μL一只。
第27天：腹腔注射，200μL一只。
第三次免疫后3到4天可小鼠尾部采血，12000rmp,8min，取血清测定其效价，以TSH-1，包被浓度为2μg/mL作为抗原，ELISA方法检测血清效价,效价达标后即可准备融合，效价不够高者需继续免疫直至达标。免疫血清效价如表1所示：
表1 免疫后血清效价
以上结果表明小鼠达到免疫要求，可进行细胞融合实验。
3.细胞融合：
3.1 骨髓瘤细胞（SP2）的复苏：先从液氮中取出冻存好的细胞，快速放于37℃水浴锅中融化，使细胞松散；再将细胞放入15mL的离心管中，再取大概5mL的PBS，混匀，1000rpm，5min，离心，弃上清，重复两次清洗SP2细胞，将细胞养在培养瓶中，做好标记，最后将培养瓶放入37℃、5%CO2培养箱中培养。
3.2 SP2细胞的传代：当培养瓶中的细胞长满瓶底80%左右，就可进行细胞传代。用枪头将细胞吹打下来，将培养液吸出至15mL离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，加PBS5mL，吹打混匀，再次离心弃上清，重复PBS洗涤步骤2次。洗涤完后加2mL 10%完全培养液重悬细胞，取适量细胞至培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。
3.3滋养层巨噬细胞的制备（融合前一天可准备）：
小鼠脱颈椎致死，注意断颈椎时尽量减少对腹腔的压迫，避免损伤腹腔内血管，以防饲养细胞内含有大量血细胞。将小鼠浸泡于75%酒精中5分钟，然后手提住小鼠尾巴，上下于酒精中涮洗数次。置于无菌平皿中。用无菌剪刀从后腹剪开皮肤，用手将两侧皮肤撕开，暴露腹部，注意不要损伤腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜。用注射器吸取6-8mL的含双抗的不完全培养基注射入腹腔（双抗:不完全培养液=1:100），注意注射时用镊子提起腹膜，避免针头刺到肠管等腹腔脏器。用棉球轻轻按摩腹部一分钟，吸出注入的培养液，转入离心管中。1000 r/min离心5min，弃去上清。再用PBS洗涤四次。将细胞重悬于10%的完全培养液中。
将上述细胞悬液加入96孔板，每孔加100μL，最后将96孔板放入CO2的培养箱培养。（巨噬细胞不易过多，可视情况丢弃一部分收集到的细胞。）
3.4免疫脾细胞制备：
（1）取小鼠脾脏
取达到免疫要求的小鼠。首先要注意无菌操作，以防细胞污染，处死小鼠后，将其在75%的酒精中浸泡五分钟左右，放在无菌的平皿中，摆放在利于自己操作的位置（超净台中），进行解剖。先用剪刀将小鼠尾部剪一个小口，再用手剖开皮毛层，用酒精棉球轻拭剖开部位，再用镊子挑起包裹内脏的那层半透明的薄膜，将其剪开，暴露出脾脏，轻轻取出脾脏，并尽量去除上面的脂肪组织，将取出的脾脏至于PBS中洗涤。
（2）脾细胞悬液制备
先用PBS洗涤脾脏，涮洗3次左右，将脾脏置于平皿中，用剪刀将脾脏尽可能的剪碎，加PBS洗涤过滤，不要组织细胞，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min，离心5分钟，弃上清；再用5mLPBS洗涤，1000r/min，离心5分钟；重复三次,洗涤完后加2mL 不完全培养液（DMEM）重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
（3）SP2细胞悬液的制备：用胶头吸管将吸取细胞液吸气吹打培养瓶底部的薄膜（细胞均为悬浮或轻微帖壁生长），再将细胞液用加样抢转移至15mL离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，再加PBS5mL，混匀，1000r/min，离心5分钟，重复洗涤两次，洗涤完后加2mL不完全培养液（DMEM）重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
3.5 PEG作用下进行细胞融合
将SP2与脾细胞按1：4（1:10至1:4之间）的比例混合在一起，离心，600rpm,3min;弃上清。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。1min内缓慢加入37℃预热好的0.6mL 50%PEG溶液，边加边轻微摇动和叩击。加完后静置1min。37℃预热好的不完全培养液10mL以终止PEG作用，边滴边叩击并旋转离心管，匀速加入，加完后静置2min。离心，800rpm，5min，弃上清；再用PBS或不完全培养液洗涤2次，以去除PEG。
洗涤完后弃上清，用10mLHAT选择培养液重悬细胞。上述细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内（用的是之前制备的巨噬细胞板，先将孔中的液体吸出不要，再用不完全培养液洗涤一次，吸出液体），每孔加100μL；将培养板置CO2培养箱中培养。4个小时之后再向孔中加入含HAT的完全培养液（19.6mL10%完全培养液+0.4mLHAT），每孔加100μL；将培养板置CO2培养箱中培养。
3.6选择培养
（1）融合培养的第四天半液法换HAT培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μL，弃掉，再加入新的每孔100μLHAT培养液（HAT培养液配制为：10%的完全培养液：HAT=1:50），每块板子需要在10mL完全培养液中加入200μL 50×HAT。
（2）融合培养的第七天半液法换HT培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μL，弃掉，再加入新的每孔100μLHT培养液（HT培养液的配制为：10%的完全培养液：HT=1:50），每块板子需要在10mL完全培养液中加入200μL 50×HT。
3.7阳性克隆筛选
在培养7天左右可见孔内明显的克隆细胞，待克隆细胞长得足够多时（大概在第12天左右），可吸取培养液检测其有无分泌抗体。
（1）先将之前包被好的相应的ELISA(包被TSH-1，包被浓度为2μg/mL)板子从冰箱拿出让其恢复室温，再向板中加入要检测的培养液100μL每一孔，两孔做阴阳性对照，阴性对照用10%的培养液，阳性对照用稀释10000倍的血清（融合前小鼠眼眶采血的血清）。
（2）孵育：用封板膜封板后置37℃孵育箱中孵育1小时。
（3）洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
（4）加双抗：双抗稀释10000倍，50μL每孔。
（5）孵育：用封板膜封板后置37℃孵育30分钟。
（6）洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
（7）显色：每孔加显色剂TMB100μL，轻轻振荡混匀，孵育箱显色大概10min。
（8）比色测定：每孔加终止液50μL（终止液=21.5mL的浓硫酸定容至200mL），轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为450nm，测定各孔值。
选取阳性结果高者（至少为阴性对照的4倍），作为阳性克隆孔。
3.8有限稀释法筛选大熊猫RLN3单克隆抗体杂交瘤细胞株
（1）阳性孔细胞的计数：将筛选得到的阳性克隆孔做有限稀释。先将孔中的细胞转移到15mL的离心管中（边吹打边旋转，使细胞悬浮），再补加10%的完全培养液至2mL；再用计数板计数，计数之后取只含1000个细胞的细胞液进行下一步实验（由于1个孔只需要一个细胞，96孔板一板就需要大约100个细胞，10板就是1000个细胞）。
（2）将细胞液加入200mL完全培养液中，混匀，96孔板加样，200μL/孔，共十块96孔板。
（3）最后将培养板置CO2培养箱中培养。
（4）培养4-5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，观察细胞的生长情况，记录单个细胞生长聚集的孔。
（5）培养第5天给有记录单个细胞生长聚集的孔进行换液，加10%完全培养液100μL/孔。
（6）第8-9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测，将由单个细胞生长聚集的孔并且生长情况比较好的孔进行培养液的检测（ELSIA检测），阳性强的孔即为大熊猫RLN3单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明最终筛选得到一株大熊猫RLN3单克隆抗体杂交瘤细胞株RLN-3，其于2021年1月7日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202129。
3.8亚型鉴定
使用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit 37503 试剂盒进行亚型鉴定。
准备工作：将试剂盒中TBS溶于500mL双蒸水中，用于稀释样品， 870mL双蒸水与30mL 30X Wash Buffer混匀，用于洗板， 根据所做样品的量确定需要多少条板子，其余放回4℃冰箱保存，准备450μL的样品稀释液，吸取20μL的细胞培养液加入980μL的TBS中混匀。
实验步骤：将板子平衡到室温，加入待测样品到每孔，50μL/孔，每个样需加8孔即一条，加入50μL/孔的 Goat Anti-Mouse IgG+IgA+IgM HRP，轻柔的晃动板子混匀 盖上封板膜，室温孵育一个小时， 洗板4次，扣干水分，加入75μL/孔的TMB显色液显色，将会看到孔内液体变成蓝色，显色5-15min之后加入75μL/孔的终止液终止反应。经鉴定筛选所得到的大熊猫RLN3单克隆抗体杂交瘤细胞株RLN-3所分泌的抗体亚型为IgG1型，结果如表2所示。
表2 杂交瘤细胞株亚型
3.9单克隆抗体的扩大培养及纯化，浓缩。
（1）批量培养：将进行了亚型鉴定，结果为单抗的细胞孔转移到24孔板中（边旋转边吹打，使细胞悬浮，进行完全转移）培养，并加600μL的10%完全培养液培养。
（2）观察细胞的生长情况，长得比较多之后进行效价测定，效价高的细胞进行转移，转移到小的培养瓶中培养（先将24孔板中的细胞吹打使细胞悬浮，在用加样枪将细胞转移到培养瓶中，补加10%的完全培养液7mL）。
（3）观察细胞生长情况，长得比较好之后再转移至大的培养瓶中培养。一个小的培养瓶分别转移两个大的培养瓶中进行培养（细胞传代）。
（4）可多传几个培养瓶培养，冻存一部分细胞，收集培养液进行抗体过柱纯化。所用柱子为所用填料为Pierce Protein G Agarose，并用10000kda超滤管浓缩纯化过的大熊猫RLN3单克隆抗体，-20度保存备用。
3.10单克隆抗体细胞株冻存
将鉴定的大熊猫RLN3单克隆抗体杂交瘤细胞株RLN-3培养稳定后，将培养瓶中的细胞吹打使细胞悬浮在培养液中（细胞一般悬浮在培养液中或贴壁生长），在将细胞转移至15mL的离心管中。离心，1000转/5分钟。用PBS洗涤两次：先将离心管中的上清液吸出，弃掉，加PBS，混匀，离心1000转/5分钟，最后重复一次。最后再用加样枪吸出上清液，再向细胞中加入适量冻存液（冻存液=5mL血清+4mLDMEM+1mLDMSO,颠倒混匀，过滤备用），混匀。最后加入冻存管中，每管1mL细胞液。放入冻存盒，先放-80℃过夜，再将细胞株TSHB-B放入液氮中长期保存备用。
实施例2、大熊猫RLN3单克隆抗体效价测定及序列测定
使用间接ELISA检测培养液上清纯化RLN-3细胞株单克隆抗体效价，具体步骤为：
（1）将实施例1中多肽片段RLN3-2 2μg/mL，50μL/孔包被酶标板，置于4℃孵育过夜包被。
（2）洗净包被板，加入200μL/孔 含2% BSA的PBS，37℃封闭2h。
（3）洗板后，加入倍比稀释浓度的大熊猫RLN3单克隆抗体（分别为：1000倍，2000倍，4000倍，8000倍，16000倍，32000倍，64000倍，128000倍，256000倍，512000倍）和PBS孔作为对照，37℃孵育1h。
（4）洗板后，加入1：5000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育1h。
（5）加入TMB显色底物100μL/孔，反应5min。
（6）加入50μL终止液终止反应。
（7）酶标仪450nm处，读取各孔OD值，检测结果见表3。
如表3所示，培养液上清纯化的RLN3抗体效价达106以上，表明抗体效价高。
表3 抗体效价
将获得的大熊猫RLN3单克隆抗体细胞株(RLN-3)送至通用生物（安徽）股份有限公司进行测序，该单克隆抗体的重链可变区序列如下：
QVQLKQSGPQLLRPGASVKISCKASGYSFTRYWIHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSDSESRLNQKFKDKATLTEDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCVRRYFDYWGHGTTLTVSS（SEQ ID NO.1）。
轻链可变区序列如下：
DIVLTQSPASLAVSLGQRTAISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPNLLIYAASNIESGIPARFSGSGYGTDFTLNIHPVEEEDVATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELK（SEQ ID NO.2）。
实施例3
RLN3多克隆抗体的制备
1、免疫原及标准品的制备
（1）RLN3重组质粒的构建
根据RLN3氨基酸序列(XP_002921067.1) MAKHPLLLLLTVWVLAGELWLRTEARASPFGVKLCGREFIRAVIFTCGGSRWRRADVLAPEATGDPFPDADSDTDSELDEAVASSELLAMTKYPLASYGGRPGWQGTPGTLRGGRDVVAGLSSNCCKWGCSKSEISSLC（SEQ ID NO.5）。构建用于表达含酶切位点NdeI，HindIII 和6 *His及RLN 26-139氨基酸目的序列RASPFGVKLCGREFIRAVIFTCGGSRWRRADVLAPEATGDPFPDADSDTDSELDEAVASSELLAMTKYPLASYGGRPGWQGTPGTLRGGRDVVAGLSSNCCKWGCSKSEISSLC（SEQ ID NO.6），以及终止密码子的基因合成序列正向构建到pET30a载体上作为RLN3重组质粒，并命名为pET30a- RLN3
（2）RLN3重组蛋白的原核表达：
将构建好的pET30a- RLN3质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上（含50 μg/mL的硫酸卡那霉素），之后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4 mL的LB培养基中（含50 μg/mL的硫酸卡那霉素），待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.5 mM IPTG，之后置于37℃诱导表达。取诱导后的培养液12000 rpm离心5 min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10 min，然后离心取上清电泳。160 V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1 cm，取出凝胶利用蛋白凝胶快速处理系统染脱色，SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果如图1所示：经全菌超声裂解分析，pET30a- RLN3重组蛋白表达在包涵体中。
（3）RLN3重组蛋白的纯化
包涵体采用20 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl含1% Triton X-100，2 mM EDTA，5mM DTT洗涤后，以20 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl，8 M Urea，20 mM Imidazole缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。分析结果见图2。经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度相对较高的Lane 3-5，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液［50 mMTris(pH8.8)，300 mM NaCl，4 mM GSH，0.4 mM GSSG，0.4 M L-Arginine，1 M Urea，10%Glycerol］中复性，复性后TSHB蛋白最终透析于储存液50 mM Tris(pH8.8)，300 mM NaCl，10% Glycerol溶液约6-8 h。透析复性结束后，上清用0.22 μm滤器过滤后分装，冻于-80℃。
（4）动物免疫
新西兰大白兔具体的免疫方法如下：以制备的pET30a- RLN3作为抗原，免疫新西兰白兔（2-2.5 kg)，皮下免疫，初免剂量为300 μg/只，二免、三免、四免剂量为150μg/只，2-3周免疫1次。免疫4次后，采血检测，通过间接ELISA 方法确定抗血清针对pET30a- RLN3 抗原的效价，待效价大于1:50,000 进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。
（5）间接ELISA效价检测
1）包被抗原：pET30a- pET30a- RLN3抗原用0.05mol/L 碳酸盐，按6μg/mL，100μL/孔，4℃孵育过夜。
2）洗板：用含0.05%Tween-20的PBS洗涤三次，3 分钟/次。
3）封闭：每孔加入5%脱脂奶粉150μL封闭液，37℃封闭60分钟。
4）洗板：用含0.05%Tween-20的PBS洗涤三次，3分钟/次。
5）加一抗：将兔子的血清分别按照1:1000稀释，然后倍比稀释，37℃孵育1小时。
6）洗板：用含0.05%Tween-20的PBS洗涤三次，3分钟/次。
7）加二抗：山羊抗兔IgG-HRP，1:8000稀释，37℃孵育45分钟。
8）洗板：用含0.05%Tween-20的PBS洗涤五次，3分钟/次。
9）显色：加入底物溶液（TMB）100μL/孔，反应约15分钟，最后加入100μL 2mol/L硫酸终止反应。
10）测OD值：用酶标仪在450nm波长下测定OD值，其结果如表4所示。
表4 450nm波长下的OD值
起始稀释度：1:1000；效价即样品OD/空白≥2 的最高稀释度。
（6）抗体纯化
1）偶联：取2mg pET30a- pET30a- RLN3抗原与1.5mL CNBr活化琼脂糖填料进行偶联。
2）孵育：10mL抗血清与1.5mL CNBr活化琼脂糖填料4℃过夜孵育。
3）预洗脱：加5mL预洗脱液，洗脱CNBr活化琼脂糖填料上结合的杂蛋白。
4）洗脱：加1mL洗脱液，用加入50μL中和液的EP管收集，重复10次，间隔90S。
5）浓度测定：将收集的抗体，用微量分光光度计测定抗体浓度为0.95 mg/mL。
通过ELISA 检测效价得出，抗RLN3β抗体效价在128K, 成功制备RLN3多克隆抗体。
实施例4
对大熊猫RLN3进行检测的方法，具体如下：
1、构建检测试剂盒
（1）对实施例3获得的RLN3多克隆抗体进行生物素标记，具体方法如下：
a、将待生物素化的多克隆抗体用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液( pH 8.0 )对目标抗体充分透析。
b、用1mL DMF溶解生物素琥珀酰亚胺酯（NHSB ) 1mg 。
c、向1mg目标抗体溶液加入150μg NHSB溶液（即含NHSB 150 μg ) 。
d、在室温下持续搅拌，保温2-4小时。
e、加入10μL1 mol/L NH4CL，在室温下搅拌10分钟。
f、在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素。
（2）将大熊猫RLN3单克隆抗体作为“一抗”，包被在结合率高而背景低的酶标板上。采用标准的抗体包被浓度和制备方法（10μg/mL;详见Harlow and Lane，Antibodies，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，p139,1988）。
（3）将采用生物素标记后的RLN3多克隆抗体作为“二抗”，再采用商业化的多链Streptoavidin-HRP复合物（抗生素蛋白链霉菌素-辣根过氧化物酶）放大检测信号。
（4）将实施例3中原核表达的pET30a- pET30a- RLN3重组蛋白作为检测方法的标准品。
（5）再辅以检测试剂盒中的常规成分，包括：样品缓冲液、洗涤缓冲液、色原底物溶液（TMB溶液）、色原终止液(1M的硫酸溶液)等，最终构建得到检测试剂盒。
该试剂盒的检测原理如下：
大熊猫RLN3单克隆抗体包被在96孔酶标板上，尿液中的可溶性RLN3代谢残留蛋白和大熊猫RLN3单克隆抗体结合；再采用生物素标记的另一种RLN3多克隆抗体与包被大熊猫RLN3单克隆抗体结合的、尿液中残留的RLN3蛋白进行夹心式结合。然后用Streptoavidin-HRP复合物结合抗生物素标记的RLN3多克隆抗体，最后再用辣根过氧化酶催化色原底物（TMB）显色，根据标准曲线确定检测样品中RLN3的浓度。
2、采用构建的试剂盒进行检测
1)测定时，将大熊猫尿液加到大熊猫RLN3单克隆抗体包被的酶标板上，每孔0.05mL。同时加入样品稀释液配制成0到5000 ng/mL (0, 0.073, 0.146, 0.291, 0.583,1.166, 2.33, 4.66, 9.325, 18.75, 37.5, 75, 150, 300) 的pET30a- RLN3重组蛋白的标准品，共计13个标准点，37℃孵育30分钟。
2）用洗涤液将酶标板洗涤5次。0.01（ng/mL）
3）加入用样品稀释液配制的1:1000的抗RLN多克隆抗体-生物素复合物，每孔0.05mL。
4）37℃孵育30分钟。
5）用洗涤液将酶标板洗涤5次。
6）加入用样品稀释液配制的1:1000的Strepoavidin-HRP复合物，每孔0.05mL，37℃孵育30分钟。
7）用洗涤液将酶标板洗涤5次。
8）加入TMB工作液，每孔0.1mL。在室温下孵育10到15分钟。
9) 用1M的硫酸停止颜色反应，每孔0.1mL。
10）用酶标仪在450nm的波长读取样品盒标准的光密度，然后从标准曲线计算样品中TSH的含量。
制备而得的标准曲线如图3所示。
实施例5
基于本申请实施例4构建的RLN3检测试剂盒，通过对收集尿液RLN3的检测，用肌酐对尿液结果进行校正，可实现对RLN3变化的适时监测（见图4，图中RLN3浓度军用尿液中肌酐浓度校正，单位为ng/mg Cr）。
Claims (5)
1.一种大熊猫RLN3酶联免疫检测方法，其特征在于，以大熊猫RLN3单克隆抗体作为包被抗体和RLN3多克隆抗体作为标记抗体进行检测，其中，所述大熊猫RLN3单克隆抗体由杂交瘤细胞株RLN-3分泌产生；所述杂交瘤细胞株RLN-3的保藏编号为CCTCC NO：C202129；于2021年1月7日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1所述的大熊猫RLN3酶联免疫检测方法，其特征在于，RLN3多克隆抗体由SEQ ID NO.6所示的免疫原刺激兔子产生。
3.根据权利要求1或2所述的大熊猫RLN3酶联免疫检测方法，其特征在于，在检测时RLN3多克隆抗体需用生物素进行标记。
4.一种大熊猫RLN3单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.一种分泌如权利要求4所述的大熊猫RLN3单克隆抗体的杂交瘤细胞株RLN-3，其特征在于，所述杂交瘤细胞株RLN-3的保藏编号为CCTCC NO：C202129；于2021年1月7日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
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