CN101463359A - 融合免疫毒素B-L-Vpr基因及克隆和异源表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种融合免疫毒素B－L－Vpr基因及克隆和异源表达方法。具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列，同时融合免疫毒素B－L－Vpr基因所编码的蛋白具有SEQ ID No：2中氨基酸序列。本发明以抗HER－2单链抗体作为靶向分子，以Vpr蛋白作为效应分子，经短肽连接构建成融合免疫毒素B－L－Vpr，并在大肠杆菌中高效表达融合免疫毒素蛋白。该融合免疫毒素可对HER－2受体过表达的肿瘤细胞产生特异性的细胞抑制作用。

Description

融合免疫毒素B-L-Vpr基因及克隆和异源表达方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种融合免疫毒素B-L-Vpr基因及克隆和异源表达方法。

背景技术

免疫毒素是在现代医学生物学发展的基础上提出的一种新的治疗策略，现已广泛应用于肿瘤治疗。融合免疫毒素是由靶向分子和细胞毒性分子结合而成的产物，抗体或基因工程抗体可变区片段常作为靶向分子，近年来单链抗体片段(Single Chain Variable Fragment，scFv)因其分子量小、肿瘤穿透力强、血液清除快和半衰期短等特点而被广泛的应用于药物靶向载体的研究。

人表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor-2，HER-2)是一种肿瘤相关抗原，在乳腺癌和卵巢癌患者中有25-30％的过表达，并且其过表达与患者的不良预后相关。HER-2受体表达于肿瘤细胞表面，是肿瘤靶向治疗的合适靶点。目前，以HER-2作为靶点对HER-2过表达的肿瘤进行靶向性治疗已经成为研究热点。

病毒蛋白r(Vi ral Protein R，Vpr)是I型人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus I，HIV-I)的非结构基因vpr所编码的一含96个氨基酸、分子量大约为14kDa的蛋白。

Vpr蛋白具有使人细胞或裂殖酵母细胞的细胞周期停止于G2/M期的作用，长期以来的研究表明，处于G2/M期的肿瘤细胞对于化疗和放疗都很敏感。因此设法使细胞周期停滞在G2/M期会提高肿瘤细胞对治疗的敏感性。研究结果表明，Vpr蛋白对肿瘤细胞同样具有核定位以及将肿瘤细胞周期停滞在G2/M期和杀死细胞的功能，因此Vpr用于肿瘤的治疗可以满足以下要求：1、Vpr可使肿瘤细胞停留在G2/M期，转入肿瘤细胞可提高化疗和放疗疗效；2、Vpr具有核定位功能，可提高基因冶疗的效率，更有效地摧毁肿瘤细胞。

Vpr结合了线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转移蛋白，并穿过线粒体外膜移动，导致线粒体内膜的去极化，使线粒体内膜膨胀并最终导致线粒体外膜渗透，释放促凋亡因子诱导细胞凋亡，该过程不依赖转录调节。因此Vpr蛋白通过线粒体作为作用靶点杀伤细胞，而不受P53功能的限制。与传统药物相比，Vpr在阻止肿瘤凋亡逃逸、杀伤肿瘤方面更具有优势。Vpr的另一个重要特性是特异性的杀伤快速分裂的细胞，而对不分裂的细胞没有作用，这一点对于癌症的治疗非常重要。另外，Vpr与糖皮质激素受体作用导致的NF-κB抑制进一步增加了肿瘤细胞对凋亡的敏感性。一些初步研究已经证实Vpr在抑制肿瘤生长方面具有强大作用。但Vpr蛋白的作用靶点缺乏特异性，多数快速生长细胞及体内大多淋巴细胞均可被Vpr蛋白识别并产生毒性作用，这种特异性的缺乏严重限制了Vpr蛋白作为抗肿瘤制剂在临床中的开发和应用。因此解决Vpr蛋白作用的靶向性问题成为进一步研发及利用Vpr蛋白的前提条件。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合免疫毒素B-L-Vpr基因及克隆和异源表达方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：融合免疫毒素B-L-Vpr基因：具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列。融合免疫毒素B-L-Vpr基因所编码的蛋白具有SEQ ID No：2中氨基酸序列。

融合免疫毒素b-1-vpr基因的克隆：将人源性抗HER-2的单链抗体基因b和HIV-1Vpr编码基因vpr通过编码连接短肽的DNA Linker以限制性核酸内切酶连接技术连接，即得具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列的融合免疫毒素B-L-Vpr基因；其中，所述连接短肽DNA Linker的碱基序列为：GGCCGCAGGTTCCGGATCTGGCAGCGGTTCCGGATCTGAATTC；所述的人源性抗HER-2的单链抗体基因b具有序列表SEQ ID No：3中碱基序列。

其中所述的人源性抗HER-2的单链抗体基因b，采用引物

B-F：5’-AAT TCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT-3’

B-R：5’-CTC TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGTC-3’

通过PCR技术扩增出具有序列表SEQ ID No：3中碱基序列。

所述HIV-1Vpr编码基因vpr，具有序列表SEQ ID No：5中碱基序列。

所述HIV-1Vpr编码基因vpr，采用引物

V-F：5’-ATA GAA TTC ATG GAA CAA-3’

V-R：5’-GCG CTC GAG GTT AGG AT-3’

通过PCR技术扩增出具有序列表SEQ ID No：5中碱基序列。

融合免疫毒素B-L-Vpr的异源表达方法：融合免疫毒素B-L-Vpr基因以pET-28a为表达载体，以大肠杆菌为BL21(DE3)宿主菌，异源表达融合免疫毒素B-L-Vpr包涵体蛋白，该包涵经变性、纯化、复性得融合免疫毒素B-L-Vpr。

本发明具有以下优点：

1.本发明构建的融合免疫毒素基因，其引入的连接序列保证抗体片段和Vpr蛋白各自的生物学活性。

2.本发明构建的融合免疫毒素基因，可进一步提供直接用于生产B-L-Vpr融合免疫毒素的工程菌株。

3.本发明构建的融合免疫毒素基因可在HER-2受体过表达的肿瘤细胞周围对该肿瘤产生杀伤作用，避免Vpr蛋白分子对正常细胞的毒性作用，消除全身给药引起的副反应。

4.本发明中所述融合免疫毒素的分子量小于普通抗体分子量的1/3，克服了单克隆抗体不易渗透到肿瘤组织的不足，抗肿瘤的作用更为明显。

5.本发明利用现代生物技术手段，以抗HER-2单链抗体作为靶向分子，以Vpr蛋白作为杀瘤效应分子，经短肽连接构建成融合免疫毒素B-L-Vpr，并在大肠杆菌中高效表达融合免疫毒素蛋白；该融合免疫毒素可特异性识别结合HER-2受体过表达的癌细胞，并对其产生特异性细胞抑制作用。

附图说明

图1为人源性抗HER-2的单链抗体基因b的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。(其中：1为b的PCR扩增产物；2为λ-EcoT14 I digest DNA分子量标准，由上至下分子量分别为(bp)：19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421。)

图2为HIV-1Vpr蛋白编码基因vpr的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。(其中：1为λ-Hind III digest DNA分子量标准，由上至下分子量分别为(bp)：23130、9416、6557、4361、2322、2027、564、125；2、3、4为vpr的PCR扩增产物。)

图3为本发明融合免疫毒素表达载体b-1-vpr的经NcoI和XhoI双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。(其中1为pET-28a-b-1-vpr的NcoI和XhoI双酶切验证；2，DL20000DNA分子量标准，由上至下分子量分别为(bp)：2000、1000、750、500、250、100。)

图4为本发明经包涵体变性、纯化、复性后的融合免疫毒素B-L-Vpr蛋白的SDS-PAGE电泳图。(其中：1为复性后的B-L-Vpr蛋白；2为蛋白分子量标准(由上至下分别为116，66，45，35，25，18，14KD)。)

图5为本发明复性的融合免疫毒素B-L-Vpr的特异性结合细胞ELISA实验结果图，图中纵坐标Binding Degree为结合程度。

图6为本发明复性的融合免疫毒素B-L-Vpr体外抗HER-2受体过表达的肿瘤SK-Br-3的实验结果图，图中纵坐标Tumor cell growth inhibition为肿瘤细胞生长抑制率百分数。

图7为本发明复性的融合免疫毒素B-L-Vpr体外抗HER-2受体非表达的肿瘤MCF-7的实验结果图，图中纵坐标Tumor cell growth inhibition为肿瘤细胞生长抑制率百分数。

具体实施方式

实施例1

融合免疫毒素B-L-Vpr基因具有序列表SEQ ID No：1的碱基序列。

ATGGCCCAGG   TGCAGCTGGT   GCAGTCTGGG   GCAGAGGTGA   AAAAGCCCGG  50

GGAGTCTCTG   AAGATCTCCT   GTAAGGGTTC   TGGATACAGC   TTTACCAGCT  100

ACTGGATCGC   CTGGGTGCGC   CAGATGCCCG   GGAAAGGCCT   GGAGTACATG  150

GGGCTCATCT   ATCCTGGTGA   CTCTGACACC   AAATACAGCC   CGTCCTTCCA  200

AGGCCAGGTC   ACCATCTCAG   TCGACAAGTC   CGTCAGCACT   GCCTACTTGC  250

AATGGAGCAG   TCTGAAGCCC   TCGGACAGCG  CCGTGTATTT  TTGTGCGAGA   300

CATGACGTGG   GATATTGCAC   CGACCGGACT  TGCGCAAAGT  GGCCTGAATA   350

CTTCCAGCAT   TGGGGCCAGG   GCACCCTGGT  CACCGTCTCC  TCAGGTGGAG   400

GCGGTTCAGG   CGGAGGTGGC   TCTGGCGGTG  GCGGATCGCA  GTCTGTGTTG   450

ACGCAGCCGC   CCTCAGTGTC   TGCGGCCCCA  GGACAGAAGG  TCACCATCTC   500

CTGCTCTGGA   AGCAGCTCCA   ACATTGGGAA  TAATTATGTA  TCCTGGTACC   550

AGCAGCTCCC   AGGAACAGCC   CCCAAACTCC  TCATCTATGA  TCACACCAAT   600

CGGCCCGCAG   GGGTCCCTGA   CCGATTCTCT  GGCTCCAAGT  CTGGCACCTC   650

AGCCTCCCTG   GCCATCAGTG   GGTTCCGGTC  CGAGGATGAG  GCTGATTATT   700

ACTGTGCCTC   CTGGGACTAC   ACCCTCTCGG  GCTGGGTGTT  CGGCGGAGGG   750

ACCAAGGTCA   CCGTCCTAGG   TGCGGCCGCA  GGTTCCGGAT  CTGGCAGCGG   800

TTCCGGATCT   GAATTCATGG   AACAAGCCCC  AGAAGACCAG  GGGCCGCAGA   850

GGGAACCATA   CAATGAATGG   ACATTAGAGC  TTTTAGAGGA  ACTTAAGCAT   900

GAAGCTGTTA   GACACTTTCC   TAGGCCATGG  CTCCATGGCT  TAGGACAATA   950

TATCTATGAA   ACCTATGGGG   ATACTTGGGC  AGGAGTTGAA  GCTATAATAA   1000

GAATTTTGCA   ACAACTACTG   TTTGTTCATT  TCAGAATTGG  GTGCCAACAT   1050

AGCAGAATAG   GCATTATGCA   ACAGAGAAGA  GCAAGAAATG  GAGCCAGTAG   1100

ATCCTAA                                                        1107

(1)SEQ ID No：1的信息

(a)序列特征

*长度：1107碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：CDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工序列

由SEQ ID No：1中核苷酸所编码的融合免疫毒素蛋白，具有SEQ ID No：2中的氨基酸序列。

MAQVQLVQSG  AEVKKPGESL  KISCKGSGYS  FTSYWIAWVR  QMPGKGLEYM  50

GLIYPGDSDT  KYSPSFQGQV  TISVDKSVST  AYLQWSSLKP  SDSAVYFCAR  100

HDVGYCTDRT  CAKWPEYFQH  WGQGTLVTVS  SGGGGSGGGG  SGGGGSQSVL  150

TQPPSVSAAP  GQKVTISCSG  SSSNIGNNYV  SWYQQLPGTA  PKLLIYDHTN  200

RPAGVPDRFS  GSKSGTSASL  AISGFRSEDE  ADYYCASWDY  TLSGWVFGGG  250

TKVTVLGAAA  GSGSGSGSGS  EFMEQAPEDQ  GPQREPYNEW  TLELLEELKH  300

EAVRHFPRPW  LHGLGQYIYE  TYGDTWAGVE  AIIRILQQLL  FVHFRIGCQH  350

SRIGIMQQRR  ARNGASRS                                        368

(2)SEQ ID No：2的信息

(a)序列特征

*长度：368残基

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

 (b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工序列

实施例2

1)人源性抗HER-2的单链抗体基因b具有序列表SEQ ID No：3中碱基序列。

ATGGCCCAGG  TGCAGCTGGT  GCAGTCTGGG  GCAGAGGTGA  AAAAGCCCGG  50

GGAGTCTCTG  AAGATCTCCT  GTAAGGGTTC  TGGATACAGC  TTTACCAGCT  100

ACTGGATCGC  CTGGGTGCGC  CAGATGCCCG  GGAAAGGCCT  GGAGTACATG  150

GGGCTCATCT  ATCCTGGTGA  CTCTGACACC  AAATACAGCC  CGTCCTTCCA  200

AGGCCAGGTC  ACCATCTCAG  TCGACAAGTC  CGTCAGCACT  GCCTACTTGC  250

AATGGAGCAG  TCTGAAGCCC  TCGGACAGCG  CCGTGTATTT  TTGTGCGAGA  300

CATGACGTGG  GATATTGCAC  CGACCGGACT  TGCGCAAAGT  GGCCTGAATA  350

CTTCCAGCAT  TGGGGCCAGG  GCACCCTGGT  CACCGTCTCC  TCAGGTGGAG  400

GCGGTTCAGG  CGGAGGTGGC  TCTGGCGGTG  GCGGATCGCA  GTCTGTGTTG  450

ACGCAGCCGC  CCTCAGTGTC  TGCGGCCCCA  GGACAGAAGG  TCACCATCTC  500

CTGCTCTGGA  AGCAGCTCCA  ACATTGGGAA  TAATTATGTA  TCCTGGTACC  550

AGCAGCTCCC  AGGAACAGCC  CCCAAACTCC  TCATCTATGA  TCACACCAAT  600

CGGCCCGCAG  GGGTCCCTGA  CCGATTCTCT  GGCTCCAAGT  CTGGCACCTC  650

AGCCTCCCTG  GCCATCAGTG  GGTTCCGGTC  CGAGGATGAG  GCTGATTATT  700

ACTGTGCCTC  CTGGGACTAC  ACCCTCTCGG  GCTGGGTGTT  CGGCGGAGGG  750

ACCAAGGTCA  CCGTCCTAGG  TGCG                                774

(1)SEQ ID No：3的信息

(a)序列特征

*长度：774碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人源性抗HER-2的单链抗体基因b。

2)人源性抗HER-2的单链抗体基因ml 3.9的制备：

上游引物V-F：5’-AAT TCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT-3’；

下游引物V-R：5’-CTC TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGTC-3’，

横线所示为添加的酶切位点，上下游分别为NcoI和NotI。

PCR反应体系为：10×Pyrobest buffer 5μl、dNTP 250μmol、质量浓度为0.02％ BSA 2μl、上下游引物各25pmol、模板含scFv-b的质粒DNA0.1μg(含该质粒DNA的大肠杆菌DH5α，该质粒DNA的提取操作如下：取1ml含该质粒DNA的大肠杆菌DH5α菌液，10000rpm离心30s钟收集菌体，悬浮于100μl溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA)中，吹打均匀，冰浴10min。加入200μl的溶液II(0.2mol/L NaOH，质量百分比1％十二烷基磺酸钠SDS)，颠倒混合几次，于室温下放置5min，再加入150μl冰冷的溶液III(5mol/L KAC 60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml)缓慢倒置混合几次，再于室温下放置10min，12000rpm离心12min。小心吸取上清液，加RNA酶2μl(10mg/mL)，37℃温育1h充分降解RNA。加入等体积Tris平衡酚(购自北京宝莱索科技有限公司)和氯仿异丙醇溶液抽提，12000rpm离心5min，吸出上清液。加入两倍体积无水乙醇于室温放置2min，沉淀双链DNA，12000rpm离心5min，吸出上清液。用1ml体积百分比70％乙醇洗沉淀块，12000rpm离心2min，沉淀块真空干燥或者室温干燥后溶解于30μl无菌超纯水)、Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)2U，无菌超纯水补齐体积至50μl。

PCR反应条件为：

第一阶段95℃，5分钟；

第二阶段94℃，50秒；55℃，50秒；72℃，90秒；共30个循环；

第三阶段72℃，10分钟；

PCR产物的回收：PCR扩增产物经质量浓度为1.2％琼脂糖凝胶电泳分析并分离(参见图1所示)，切下大小为770bp的目的带，按杭州维特洁生化技术有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收。

4)回收后产物的双酶切：回收后的PCR产物经限制性核酸内切酶NcoI和NotI充分消化，消化产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，再次胶回收，即得SEQ ID No：3序列表所述的碱基序列。

实施例3

1)HIV-1Vpr蛋白编码基因vpr，具有序列表SEQ ID No：5中碱基序列。

ATGGAACAAG  CCCCAGAAGA  CCAGGGGCCG  CAGAGGGAAC  CATACAATGA  50

ATGGACATTA  GAGCTTTTAG  AGGAACTTAA  GCATGAAGCT  GTTAGACACT  100

TTCCTAGGCC  ATGGCTCCAT  GGCTTAGGAC  AATATATCTA  TGAAACCTAT  150

GGGGATACTT  GGGCAGGAGT  TGAAGCTATA  ATAAGAATTT  TGCAACAACT  200

ACTGTTTGTT  CATTTCAGAA  TTGGGTGCCA  ACATAGCAGA  ATAGGCATTA  250

TGCAACAGAG  AAGAGCAAGA  AATGGAGCCA  GTAGATCCTA  A           291

(1)SEQ ID No：5的信息

(a)序列特征

*长度：291碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：HIV-1病毒

2)HIV-1Vpr基因vpr的制备：

上游引物V-F：5’-ATA GAA TTC ATG GAA CAA-3’

下游引物V-R：5’-GCG CTC GAG GTT AGG AT-3’

横线所示为添加的酶切位点，上下游分别为EcoRI和XhoI。

PCR反应体系为：10×Pyrobest buffer 5μl、dNTP 250μmol、0.02％BSA2μl、上下游引物各25pmol、模板含vpr基因的质粒DNA0.1μg(含该质粒DNA的大肠杆菌DH5α，该质粒DNA的提取操作如实施例2中scFv-b的质粒DNA中所述)、Pyrobest DNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至50μl。

PCR反应条件为：

第一阶段95℃，5分钟；

第二阶段94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，50秒；共30个循环；

第三阶段72℃，10分钟；

PCR产物的回收：PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析并分离(参见图2所示)，切下大小为300bp的目的带，按杭州维特洁生化技术有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；

回收后产物的双酶切：回收后的PCR产物经限制性核酸内切酶EcoRI和XhoI充分消化，消化产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，再次胶回收，即得SEQ ID No：5序列表所述的碱基序列。

实施例4

编码连接短肽的DNA Linker序列，具有如下碱基序列(寡聚核苷酸链)：

GGCCGCAGGTTCCGGATCTGGCAGCGGTTCCGGATCTGAATTC

1)DNA Linker序列基因的设计合成：

设计并合成两条寡聚核苷酸链：

正向链L-F：5’-G GCC GCA GGT TCC GGA TCT GGC AGC GGT TCC GGA TCT

G-3’；

反向链L-R：5’-AA TTC AGA GCC GGA ACC GCT GCC AGA TCC GGA ACC TGC-3’

上下游分别添加NotI和EcoRI粘末端，所编码的甘氨酸丝氨酸短肽为(GS)₅序列。

2)寡聚核苷酸链的退火：

10×退火杂交缓冲液(SSC)成分：1.5mol/L NaCl，0.3M柠檬酸三钠·2H₂O，以HCl调pH至7.0；

退火反应体系：10×SSC buffer 1μl，正反寡聚核苷酸链各5pmol，无菌超纯水补齐体积至10μl；

退火反应条件：94℃ 10min；0℃ 10min；72℃ 20min

实施例5

1)融合免疫毒素B-L-Vpr基因的制备

将退火后的linker片段、经NcoI和NotI双酶切的b片段、经EcoRI和XhoI双酶切的vpr片段和经NcoI和XhoI双酶切的pET-28a片段按摩尔比例为3:3:3:1的比例混合，以T4DNA连接酶16℃连接，构建融合免疫毒素表达载体pET-28a-b-1-vpr。连接产物转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞(转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)，以50μg/ml的卡那霉素抗性筛选转化子。

2)融合免疫毒素B-L-Vpr基因的验证

将挑选的阳性转化子扩培，提取质粒DNA(质粒DNA提取方法按J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》美国纽约冷泉港出版社2001年第三版P27-30)，经NcoI和XhoI双酶切鉴定(参见附图3所示)，并以鉴定正确的重组克隆质粒为模板，用T7启动子和终止子为引物，以Sanger双脱氧末端终止法测序证实，参见SEQ ID No：1序列表所示的碱基序列。

实施例6融合免疫毒素B-L-Vpr的表达及纯化

1)融合免疫毒素B-L-Vpr的表达：接种转化了pET-28a-b-1-vpr质粒的E.coliBL21(DE3)单菌落于含50μg/ml的卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活化培养，以1％体积百分比接种量转接下一级，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度1.0mmol/L的IPTG，37℃诱导表达6小时。离心收集菌体。

2)融合免疫毒素B-L-Vpr的变性：收集诱导表达后的菌体，每100ml原培养物的菌体重悬于10ml20mmol/L Tris-HCl pH7.5的缓冲液，于0℃超声破碎直至菌液变得清亮，12000g离心20min收集包涵体沉淀。每100ml原培养物的包涵体以10ml包涵体清洗溶液(2M尿素，10mM Tris-HCl，0.5％Triton X 100，pH8.0)重悬，室温下放置10min，期间不断振荡摇匀，12000g离心20min，弃上清。将每100ml原培养物的清洗后的包涵体以10ml包涵体变性缓冲液(0.5M NaCl，8M尿素，5mM咪唑，20mM Tirs-HCl pH8.0)重悬，室温下放置30min，期间不断振荡摇匀使包涵体蛋白充分溶解，12000g离心40min，保留上清部分。

3)融合免疫毒素B-L-Vpr的纯化：将上清部分以0.3ml/min的流速上样于包涵体变性缓冲液平衡好的Ni亲和层析柱，以包涵体变性缓冲液平衡至基线，用含40mmol/L咪唑的包涵体变性缓冲液洗去杂蛋白，用含80mmol/L咪唑的包涵体变性缓冲液洗脱融合免疫毒素蛋白B-L-Vpr，收集目的蛋白峰。

4)融合免疫毒素B-L-Vpr的复性：将洗脱下的纯化的变性目的蛋白置于处理好的透析袋中，每10ml纯化的变性目的蛋白置于1L的复性缓冲液(含400mM L-蛋白氨酸(L-arginine)、1mM还原型谷胱甘肽(GSH)和0.2mM氧化型型谷胱甘肽(GSSG)的PBS，pH7.9)中透析复性。透析操作于4℃进行，缓慢搅拌使透析充分均匀，每4h更换一次透析缓冲液，共三次。最后将透析袋置入大量PBS缓冲溶液中继续于4℃缓慢搅拌透析过液。12000g离心20min，取上清以SDS-PAGE电泳(电泳条件：50伏特，30分钟，然后再120伏特，2小时)(参见图4)，考马斯亮蓝染色分析复性的融合免疫毒素B-L-Vpr(参见SEQ ID No：2序列表所示的氨基酸序列)(电泳缓冲液配方：Tris 15.1g，甘氨酸94.0g，SDS5.0g，加水至5000ml，处理方法按汪家政，范明《蛋白质技术手册》科学出版社2002第一版P81和P87)。

实施例6

融合免疫毒素B-L-Vpr生物学活性研究：

1)融合免疫毒素B-L-Vpr特异性结合细胞ELISA实验：

以1×10⁵cells/孔接种MCF-7细胞(无HER-2受体表达)、SK-Br-3细胞(HER-2受体过表达)于96孔板，待细胞贴壁后去除培养基，PBS洗2次；每孔加150μl4％多聚甲醛，室温固定15min，用无菌超纯水洗板3次；每孔加250ml的含质量浓度2％BSA的PBS，37℃封闭1h，用无菌超纯水洗板3次；将融合免疫毒素蛋白B-L-Vpr以含2％BSA的PBS稀释成10ug/ml浓度，每孔加50μl，每样3个复孔，37℃温育1h，无菌超纯水洗板3次；以含2％BSA的PBS将兔抗His-tag抗体稀释1000倍，每孔加50μl，37℃温育1h，用无菌超纯水洗板3次；以含2％BSA的PBS将FITC标记的羊抗兔抗体稀释64倍，每孔加50μl，以锡纸包裹培养板，避光37℃温育1h，用无菌超纯水洗板3次；以不加融合免疫毒素作为对照孔，同时设BSA平行对照，其他操作同上；酶标仪检测荧光，激发光波长495nm、发射光波长525nm。

结合程度＝(实验孔-对照孔)

参见图5由实验结果可知，纯化复性的融合免疫毒素B-L-Vpr可以特异性的结合HER-2受体过表达的肿瘤细胞SK-Br-3。

2)融合免疫毒素B-L-Vpr体外特异性抑瘤活性实验：

将MCF-7细胞、SK-Br-3细胞以5×10⁴cells/孔加入96孔板，将融合免疫毒素B-L-Vpr及单独表达的Vpr蛋白(参见序列表5中的碱基序列所编码的蛋白)分别以不同浓度加入各孔，同时设空白对照孔(仅加培养基RPMI-1640)、肿瘤细胞对照孔(仅加肿瘤细胞)，每样3个复孔。同样方法以BSA为阴性对照设各孔。按常规条件(37℃、5％CO₂浓度)培养72h，加入50ul/孔的MTT液(含0.5％四甲基偶氮唑盐的PBS)。继续培养4h，1000g离心收集细胞，加入DMSO120ul/孔，溶解15min后，酶标仪上以570nm测定各孔的吸光值。

抑瘤率(Tumor growth inhibition，％)＝100-[(实验孔-空白对照孔)/(肿瘤细胞对照孔-空白对照孔)]×100。

参见图6、7实验结果显示，纯化复性的融合免疫毒素B-L-Vpr可以对HER-2受体过表达的肿瘤细胞SK-Br-3产生特异性的靶向杀伤作用，其作用效果明显强于单独Vpr蛋白。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院沈阳应用生态研究所

<120>融合免疫毒素B-L-Vpr基因及克隆和异源表达方法

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1107

<212>DNA

<213>人工设计

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1107)

<223>

<400>1

<210>2

<211>368

<212>PRT

<213>人工设计

<210>3

<211>774

<212>DNA

<213>人源性抗HER-2的单链抗体基因b

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(774)

<223>

<400>3

<210>4

<211>258

<212>PRT

<213>人源性抗HER-2的单链抗体基因b

<400>4

<210>5

<211>291

<212>DNA

<213>HIV-1病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(291)

<223>

<400>5

<210>6

<211>96

<212>PRT

<213>HIV-1病毒

<400>6

Claims (7)

1.一种融合免疫毒素B-L-Vpr基因，其特征在于：具有序列表SEQ IDNo：1中碱基序列。

2.一种按权利要求1融合免疫毒素B-L-Vpr基因，其特征在于：融合免疫毒素B-L-Vpr基因所编码的蛋白具有SEQ ID No：2中氨基酸序列。

3.一种按权利要求1所述的融合免疫毒素b-l-vpr基因的克隆，其特征在于：将人源性抗HER-2的单链抗体基因b和HIV-1Vpr编码基因vpr通过编码连接短肽的DNA Linker以限制性核酸内切酶连接技术连接，即得具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列的融合免疫毒素B-L-Vpr基因；

其中，所述连接短肽DNA Linker的碱基序列为：GGCCGCAGGTTCCGGATCTGGCAGCGGTTCCGGATCTGAATTC；所述的人源性抗HER-2的单链抗体基因b具有序列表SEQ ID No：3中碱基序列。

4.按权利要求3所述的融合免疫毒素b-1-vpr基因的克隆，其特征在于：其中所述的人源性抗HER-2的单链抗体基因b，采用引物

B-F：5’-AAT TCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT-3’

B-R：5’-CTC TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGTC-3’

通过PCR技术扩增出具有序列表SEQ ID No：3中碱基序列。

5.按权利要求3所述的融合免疫毒素b-1-vpr基因的克隆，其特征在于：所述HIV-1Vpr编码基因vpr，具有序列表SEQ ID No：5中碱基序列。

6.按权利要求5所述的融合免疫毒素b-1-vpr基因的克隆，其特征在于：所述HIV-1 Vpr编码基因vpr，采用引物

V-F：5’-ATA GAA TTC ATG GAA CAA-3’

V-R：5’-GCG CTC GAG GTT AGG AT-3’

通过PCR技术扩增出具有序列表SEQ ID No：5中碱基序列。

7.一种按权利要求1所述的融合免疫毒素B-L-Vpr的异源表达方法，其特征在于：融合免疫毒素B-L-Vpr基因以pET-28a为表达载体，以大肠杆菌为BL21(DE3)宿主菌，异源表达融合免疫毒素B-L-Vpr包涵体蛋白，该包涵经变性、纯化、复性得融合免疫毒素B-L-Vpr。

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