CN105176931A

CN105176931A - 兔病毒性出血症病毒突变株及其构建方法、用途

Info

Publication number: CN105176931A
Application number: CN201510044194.XA
Authority: CN
Inventors: 刘光清; 朱杰; 孟春春; 李传峰; 陈宗艳
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2015-01-28
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2035-01-28
Also published as: CN105176931B

Abstract

本发明公开了一株兔病毒性出血症病毒突变株及其构建方法、用途；所述兔病毒性出血症病毒突变株，含有基因组编码的衣壳蛋白VP60，次级结构蛋白VP10和非结构蛋白p11、p28、p35、p32、VPg、3C样蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶；其中，衣壳蛋白含有RGD短肽；RGD短肽是由衣壳蛋白VP60的第305位精氨酸、306位甘氨酸、307位天冬氨酸组成。本发明构建的兔病毒性出血症病毒突变株能够在RK13细胞中稳定增殖、并能稳定传代；兔病毒性出血症病毒突变株细胞毒灭活后对宿主具有很好的保护效果；所述建方法能促使疫苗的批量产生，降低疫苗的成产成本。

Description

兔病毒性出血症病毒突变株及其构建方法、用途

技术领域

本发明属于重组病毒领域，具体涉及一种兔病毒性出血症病毒突变株及其构建方法、用途。

背景技术

兔病毒性出血症病毒(RabbitHemorrhagicDiseaseVirus,RHDV)是一种能引起多种家兔和野兔发生急性、致死性传染病的烈性病毒,其致死率高达90％-100％。由RHDV感染引起的兔病又称为“兔瘟”，1984年首次发现于中国江苏省。随后亚洲、欧洲、非洲以及南美洲等地区的许多国家也先后报道了该病疫情。时至今日，该疫情依然广泛存在，对养兔业发展构成了严重威胁,被视为养兔业的“头号杀手”。

RHDV属于杯状病毒科(Caliciviridae)，兔病毒属(Lagovirus)，同属的还有欧洲褐色野兔综合症(EBHSV)。迄今所发现的RHDV均属于同一种血清型，与同科的其它成员没有交叉发应。RHDV的基因组为一条单股正义的RNA分子，由约7500个核苷酸组成。3’端含有一个多聚腺嘌呤尾巴结构。基因组含有2个开放阅读筐架(ORF)：其中ORF1编码一个大的多聚蛋白前体，分子量约257kDa，该蛋白前体可被蛋白酶进一步水解为至少8个重要蛋白。其中，包括RHDV的主要结构蛋白--衣壳蛋白，它可以自聚形成病毒的衣壳，包裹核酸，装配成病毒颗粒，其分子量约为60kDa，因此该蛋白又被称为VP60。

自1984年首次报道RHDV以来，由于缺少稳定的体外培养细胞系和有效的操作技术平台，RHDV的基础研究进展一直比较缓慢。最初人们对RHDV的了解，仅局限于病原的生物学特性、病毒的致病特征、病理变化以及流行病学等方面。同样，关于该病疫苗学的研究也一直没有获得突破性进展。至今，RHDV的防控仍需依赖于传统的兔肝脏组织灭活疫苗。虽然，它在兔瘟的防制过程中发挥了重要的作用。但做为一种传统疫苗，它仍具有一些不可克服的缺陷。例如，生产过程中可能发生病毒的逃逸，化学灭活过程中可能残留活病毒，及接种剂量高、副作用大等。另外，随着非免疫兔的急剧减少，其生产成本也不断增加，并给该苗的生产带来了极大的困难。因此，尽快解决兔病毒性出血症病毒的体外培养问题已经成为研制安全、高效的兔出血症疫苗和加快研究兔病毒性出血症病毒分子生物学研究的瓶颈。

本发明针对上述技术缺陷，利用反向遗传学技术，通过改造病毒，使之利用宿主细胞中固有的细胞膜表面受体感染细胞，进而获得可以在细胞系中高效增殖的兔病毒性出血症病毒。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种兔病毒性出血症病毒突变株及其构建方法、用途；所述兔病毒性出血症病毒突变株，其表达的兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白第305位氨基酸由丝氨酸(S)突变为精氨酸(R)，第307位天冬酰胺(N)突变为天冬氨酸(D)。本发明还涉及生产所述突变株的方法，以及所述突变株的应用。

本发明所涉兔病毒性出血症病毒突变株已提交中国典型培养物保藏中心进行保藏；保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)；保藏日期为2015年1月5日；保藏编号为CCTCCV201501；分类名称为兔病毒性出血症病毒RGD突变株LagovirusRHDVRGD。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一株兔病毒性出血症病毒突变株，所述病毒突变株为兔病毒性出血症病毒突变株CCTCCV201501。

优选地，所述兔病毒性出血症病毒突变株，含有基因组编码的衣壳蛋白VP60，次级结构蛋白VP10和非结构蛋白p11、p28、p35、p32、VPg、3C样蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)；其中，衣壳蛋白VP60含有RGD序列。

优选地，所述RGD序列由衣壳蛋白VP60的第305位氨基酸、306位氨基酸、307位氨基酸组成。

优选地，所述衣壳蛋白VP60的第305位氨基酸由丝氨酸(S)突变为精氨酸(R)，第307位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为天冬氨酸(D)。

优选地，所述衣壳蛋白VP60的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

优选地，所述衣壳蛋白VP60由如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列表达。

本发明所涉的兔病毒性出血症病毒突变株是一株能够在细胞中稳定增殖的兔病毒性出血症病毒(RHDV)突变株，能够感染RK13细胞，并能够稳定传代。

第二方面，本发明提供一种用于拯救兔病毒性出血症病毒突变株的重组载体pRHDV_RGD；所述重组载体pRHDV_RGD含有兔病毒性出血症病毒全基因组和RGD序列。

第三方面，本发明还提供一种所述兔病毒性出血症病毒突变株的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

步骤一、根据野生型兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白VP60基因序列，设计带有衣壳蛋白第305位和第307位氨基酸突变的基因序列的PCR引物；通过融合PCR的方法获得含RGD短肽基因序列的片段；

步骤二、设计、扩增衣壳蛋白VP60全长引物，以所述含RGD短肽基因序列的片段为模板，通过PCR获得含RGD短肽基因序列的兔病毒性出血症病毒突变株的衣壳蛋白VP60全长基因序列；

步骤三、将所述含RGD短肽基因序列的兔病毒性出血症病毒突变株的衣壳蛋白VP60全长基因序列片段插入pTVT-RHDV载体中，构建含兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白第305位和第307位氨基酸突变的全长基因cDNA分子的重组载体pRHDV_RGD；

步骤四、将所述pRHDV_RGD重组质粒转染至稳定表达T7RNA聚合酶的BHK21细胞中，即拯救获得兔病毒性出血症病毒突变株。

优选地，步骤一种，所述野生型兔病毒性出血症病毒为JX97株。

优选地，步骤一中，所述引物的序列如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示。

优选地，步骤二中，所述引物的序列如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6所示。

优选地，步骤三中，所述重组载体pRHDV_RGD的构建中采用的限制性内切酶包括PmlI、ClaI。

优选地，步骤四中，所述拯救具体指，在转染前一天将稳定表达T7TNA聚合酶的BHK21细胞传代，当细胞密度在80％以上时，利用Lipofectamine^TM2000脂质体进行质粒转染，获得含有RGD序列的兔病毒性出血症病毒突变株的细胞培养物接种兔肾上皮细胞(RK13细胞)，盲传至细胞出现典型兔病毒性出血症病毒病变。

优选地，步骤一、二中，所述引物由Primer.Primer5软件设计，RGD-F和RGD-R引物含有15个相同的核苷酸。通过RGD-PmlI-F、RGD-R引物和RGD-F、RGD-ClaI-R引物以pTVT-RHDV重组质粒为模板，PCR扩增获得两个片段其中一个片段3′端和另一片段5′端有15个相同的碱基对，最后通过RGD-PmlI-F和RGD-ClaI-R引物以上述两对引物扩增所得混合物为模板，PCR扩增，获得包含突变位点以及5′端为PmlI酶切位点、3′端为ClaI酶切位点的片段。通过该融合PCR的方法，能够快速、准确、有效的进行碱基突变。

在所述重组载体pRHDV_RGD中，编码兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白的核苷酸包含碱基突变，使得衣壳蛋白第305位氨基酸由丝氨酸(S)突变为精氨酸(R)；第307位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为天冬氨酸(D)，衣壳蛋白第306位氨基酸为甘氨酸(G)，从而形成RGD序列，进而构成兔病毒性出血症病毒突变株，该株兔病毒性出血症病毒突变株能够感染RK13细胞，并能够稳定传代。

第四方面，本发明还提供一种所述兔病毒性出血症病毒突变株的用途，所述用途包括：用于在细胞中繁殖兔病毒性出血症病毒，制备细胞灭活疫苗；研究兔病毒性出血症病毒在细胞中的生命过程。

本发明所构建的兔病毒性出血症病毒突变株是通过突变衣壳蛋白高度变异区1(V1区)的两个可变异的氨基酸(第305位的丝氨酸(S)突变为精氨酸(R)，第307位的天冬酰胺(N)突变为天冬氨酸(D))，进而产生RGD序列而获得。该突变株能够利用宿主细胞膜表面的天然受体(整联蛋白)而感染细胞，并能进入细胞进行复制和增殖；由于兔病毒性出血症病毒突变株保持了母本毒株的生物学特性和免疫学特征，因此，该病毒突变株可以进一步开发成细胞灭活疫苗；由于由于兔病毒性出血症病毒突变株可以在细胞中增殖并具备母本毒株的生物学特征，因此，可以在细胞水平利用各种技术研究和分析兔病毒性出血症病毒的致病机制和复制、翻译等生命过程。

本发明利用反向遗传学技术，通过改造病毒，使之利用宿主细胞中固有的细胞膜表面受体感染细胞，进而获得可以在细胞系中高效增殖的兔病毒性出血症病毒。该发明的策略是基于“RGD-整联蛋白识别系统”而提出的。其中，RGD是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)的短肽,已经证明，RGD是最小的，且具有高度亲和活性的短肽。它存在于多种生物细胞外基质中,能特异性识别细胞表面整合素并与之结合,从而介导多种重要的生命活动。在已知的20多种整联蛋白中，超过一半的整联蛋白都可以识别其配体中的RGD短肽。整联蛋白则是一类由α亚基与β亚基以非共价键结合形成的α、β异源二聚体复合物,是一类具有多种生物学功能的细胞膜黏附因子受体，主要介导细胞粘附和信号传导,参与细胞的多种生理功能,如细胞的生长、发育、分化、凋亡等。整联蛋白分子的体内分布广泛,多数整联蛋白分子可以表达于多种组织细胞。

基于上述理论，我们设想可以在兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白(VP60)表面通过定点突变，人为制造一个可被细胞膜表面的整联蛋白所识别的细胞结合位点，即RGD序列。2013年，Wang等获得了RHDV病毒颗粒的晶体结构，并对其衣壳蛋白的三维结构进行了精准剖析。其研究结果表明，在RHDV衣壳蛋白(Vp60)上有7个变异区(V1-V7)暴露于表面，这些暴露区域有可能与细胞膜表面分子发生相互作用。通过序列分析，我们发现V1区(301aa-311aa)的第306位氨基酸为甘氨酸(Gly,G)，第305位和第307位氨基酸均为可变异的氨基酸，也即是说我们将这两个氨基酸分别突变为精氨酸(Arg，R)和天冬氨酸(Asp，D)，而不影响病毒的生物学特性。在此基础上，利用反向遗传学技术，我们能拯救出在衣壳蛋白表面含有RGD基序的RHDV突变株，这种突变病毒可以被兔肾上皮细胞(RK13)膜表面的整联蛋白所识别，进而侵入细胞，并在其中进行复制和增殖。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明提供一株兔病毒性出血症病毒突变株，该突变株能够在兔肾上皮细胞(RK13)中稳定增殖，并能够稳定传代；

(2)本发明构建的兔病毒性出血症病毒突变株灭活后对兔具有很好的免疫保护效果；

(3)本发明提供一种所述兔病毒性出血症病毒突变株的构建方法，该构建方法能促使疫苗的批量产生，降低疫苗的成产成本；

(4)本发明提供一种所述兔病毒性出血症病毒突变株的构建方法，该构建方法能用于研究兔病毒性出血症病毒在细胞中的复制、翻译等生命过程。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1、pRHDV_RGD重组质粒构建图；

其中，1：pTVT-RHDV重组质粒PmlI和ClaI双酶切；2:pRHDV_RGD重组质粒；3：pRHDV_RGD重组质粒PmlI和ClaI双酶切；

图2、pRHDV_RGD重组质粒测序图；

图3、兔病毒性出血症病毒突变株感染RK13细胞图；

其中，如图所标，为RHDV_RGD突变株感染RK13细胞24小时、48小时、60小时、72小时，所产生细胞病变情况；

图4、兔病毒性出血症病毒突变株在RK13细胞中RT-PCR检测图；

其中，图A为含RGD短肽序列的VP60PCR检测图，其中，1：空对照，2：阴性对照，RK13正常细胞，3：第5代RHDV_RGD突变株，4：第21代RHDV_RGD突变株；图B为兔源β-actin内参对照图；

图5、兔病毒性出血症病毒突变株RGD测序图谱；

图6、兔病毒性出血症病毒突变株在RK13细胞中IFA检测图；

其中，如图所示，为RHDV_RGD突变株感染RK13细胞12小时、24小时、48小时、60小时、72小时，96小时以VP60多抗为一抗间接免疫荧光检测结果；

图7、兔病毒性出血症病毒突变株在RK13细胞中Westernbloting检测图；

其中，P5：为第5代RHDV_RGD突变株；P21：第21代RHDV_RGD突变株；

图8、兔病毒性出血症病毒突变株的电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

1材料和方法

1.1质粒、细胞和病毒

质粒pTVT-RHDV已在下述文献中公开：杨宗伟,张伟伟,陈宗艳,李传峰,吴润,刘光清.兔出血症病毒感染性克隆的优化[J].甘肃农业大学学报,2011,03:8-12；

表达T7聚合酶的BHK21细胞(BSR细胞)由本实验室传代保存，培养基为含10％胎牛血清(FBS)的DMEM(Hyclone)；

RK13细胞购自CCTCC，培养基为含10％胎牛血清(FBS)的MEM(Hyclone)；

兔病毒性出血症病毒(RHDV)江西97株由本实验室-70℃保存。

1.2主要试剂和仪器

T4DNA连接酶、PmlI、ClaI限制性内切酶购自NEB公司；ECL显色液购自赛默飞公司；PfuDNA聚合酶购自北京天根生化技术有限公司；AxyPrep96DNA凝胶回收试剂盒，质粒小量提取试剂盒(PlasmidMiniKit)购自爱思进生物技术有限公司(杭州)；去内毒素质粒质粒中提试剂盒(PureYield^TMPlasmidMidiprepSystem)和反转录试剂盒(ImProm-II^TMReverseTranscriptionSystem)购自Progema公司。DMEM培养基、MEM培养基、1×PBS购于Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，Opti-MEM、转染试剂Lipofectamine^TM2000脂质体和Reagent购于Invitrogen公司；VP60多抗由本实验室前期制备并保存于-70℃冰箱。恒温摇床购于美国精骐有限公司，细胞培养购自于Thermoscientific公司，低温高速台式离心机、台式高速离心机均为Eppendorf公司产品，倒置荧光显微镜购置于日本Nikon公司，DNA电泳仪、PCR仪、凝胶成像分析系统、蛋白转印仪均为美国Bio-Rad公司产品；透射电子显微镜型号为TecnaiG2SpiritBIOTWIN。

1.3引物

参照GeneBank中所提供的RHDV-JX97株的基因序列(GeneBlank序列号为：DQ205345.1)的结构蛋白VP60的编码序列，将第305位氨基酸由丝氨酸S突变为精氨酸R，第307位天冬酰胺N突变为天冬氨酸D构建RHDV_RGD突变全基因组的引物见表1.上述引物由上海杰李生物技术有限公司合成。

表1RHDV突变株全基因组构建所用引物和RT-PCR检测所用引物

注：下划线部分为酶切位点；字符框区域为突变碱基。

1.4构建含RHDV_RGD突变株全基因的pRHDV_RGD重组质粒

以含RHDV全基因组的pTVT-RHDV质粒为模板，分别利用突变引物RGD-F、RGD-ClaI-R和RGD-PmlI-F、RGD-R进行融合PCR获得RGD突变序列，融合PCR的程序为：95℃变性15s，56℃退火20s，72℃延伸4min进行11个循环。然后利用RGD-PmlI-F和RGD-ClaI-R引物扩增RGD片段，程序为95℃预变性4min；94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸5min。胶回收获得RGD突变片段。再将RGD片段和pTVT-RHDV载体分别用PmlI和ClaI进行双酶切，并进行胶回收。最后利用T4DNA连接酶将RGD片段与PTVT-RHDV载体进行连接，在16℃连接仪过夜后进行DH5α工程菌进行转化。待出斑后利用用RGD-PmlI-F和RGD-ClaI-R引物进行菌落PCR鉴定。鉴定为阳性的菌落扩大培养，小量提质粒进行测序鉴定，并将正确的质粒命名为pRHDV_RGD。

本发明上述方面所述的构建RHDV全长cDNARGD突变重组载体pRHDV_RGD的策略可以适用于构建在RHDV全长cDNA基因中引入任何突变的重组载体。

1.5RHDV_RGD突变株的拯救

在转染前一天将表达T7聚合酶的BHK21细胞传至10cm的细胞培养皿中，当细胞密度在80％左右时利用Lipofectamine^TM2000脂质体进行质粒转染。将pRHDV_RGD10μg加至1ml的Opti-MEM中混匀；取30μlLipofectamine^TM2000至1ml的Opti-MEM中混匀，并静置2min，然后将稀释的pRHDV加入到稀释过的脂质体中，混合均匀，室温孵育15min。在此期间用1×PBS清洗表达T7聚合酶的BHK21细胞两次，然后加入Opti-MEM6ml，最后将Lipofectamine^TM2000-质粒混合液2ml加入到细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养8h后将转染液吸去，加入10％FBS的DEME新鲜培养基继续培养。72h后将表达T7聚合酶的BHK21细胞反复冻融三次，用0.22μm的滤器进行过滤，取5ml滤液接种至5ml细胞培养瓶的RK13细胞中。72h时候后收集接种的RK13细胞，反复冻融三次，进行盲传。传至第五代进行RT-PCR、Westernbloting、间接免疫荧光(IFA)等鉴定，并将获得的病毒株命名为RHDV_RGD株。

将在RK13细胞中出现病变的RHDV_RGD突变株连续进行传代，目前已传至30代，该突变株将在本实验室一直传代下去。

1.6病毒株RHDV_RGD鉴定

1.6.1病毒株RHDV_RGDRT-PCR鉴定

取第五代和第二十一代RHDV_RGD突变株感染48h的RK13细胞，利用TRizol法提取总RNA，然后利用ImProm-II^TMReverseTranscriptionSystem和随机引物进行反转录获得cDNA，反转录的程序为：42℃作用60min，70℃作用10min。然后利用表1中的RHD-RT-F(所述引物序列：SEQIDNO:7)和RHD-RT-R(所述引物序列：SEQIDNO:8)引物进行RT-PCR，扩增所得片段进行胶回收，然后送公司进行测序。

1.6.2病毒株RHDV_RGD间接免疫荧光IFA鉴定

第21代RHDV_RGD突变株感染RK13细胞后分别在12h，24h，48h，72h，96h的收集细胞进行IFA鉴定。首先用1×PBS清洗RK13细胞两次，然后用4％的多聚甲醛室温固定15min，再在-20℃透化10min。固定后用1×PBS清洗2次，5min/次；然后加入用PBST配制的3％BSA在37℃进行封闭2h，弃去封闭液，加入用3％BSA的PBST以1:200稀释的VP60多抗兔血清，37℃孵育2h，然后用PBST洗三次，10min/次；再避光加入用PBS以1:200稀释的羊抗兔FITC标记的IgG二抗，室温孵育1h；在避光的条件下用PBST清洗三次，10min/次。最后利用倒置荧光显微镜进行观察拍照。

1.6.3病毒株RHDV_RGDWesternbloting鉴定

取第五代和第21代RHDV_RGD突变株感染48h的RK13细胞，用PBS清洗两边后，加入细胞裂解液，作用10min中后用细胞刮将细胞收集，4℃，2000rpm离心2min，去上清加入4×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min，然后用12％的SDS-PAGE胶进行蛋白电泳，然后用NC膜利用半干转仪进行蛋白转膜。再用10％的脱脂乳37℃封闭2h，然后加入用10％脱脂乳以1:500稀释的VP60多抗兔血清，37℃孵育2h，然后用TBST洗三次，10min/次；再加入用TBST以1:2000稀释的羊抗兔HRP标记的IgG二抗，室温孵育1h；用TBST清洗三次，10min/次。最后利用ECL显影液进行显影。

1.6.4病毒株RHDV_RGD负染透射电镜观察

取第20代扩大培养的细胞液60ml进行差速离心，首先10000rpm离心10min取上清，然后40000rpm超速离心3h弃掉上清，用1mlPBS重悬沉淀，然后10000rpm离心2min；取上清5μl利用磷钨酸进行负染色，待干燥后进行透射电镜观察。

1.7RHDV_RGD致病性测定

将RHDV_RGD突变株接种至兔肾上皮细胞(RK13)，观察其对该细胞的致病能力。然后将由细胞扩增所得的RHDV突变株病毒，通过超速离心纯化后接种至家兔体内，观察对家兔的致病性。

2结果

2.1含RHDV衣壳蛋白第305位和第307位氨基酸突变全基因的pRHDV_RGD重组质粒构建与鉴定

利用引物将突变碱基带入，进行融合PCR获得衣壳蛋白第305位氨基酸由丝氨酸S突变为精氨酸R，第307位天冬酰胺N突变为天冬氨酸D的基因片段，然后通过双酶切，T4DNA连接酶连入pTVT-RHDV中，构建了pRHDV_RGD重组质粒。通过酶切鉴定和测序确认突变成功(图1、图2)。

2.2RHDV_RGD病毒突变株拯救

pRHDV_RGD转染至表达T7聚合酶的BHK21细胞中，通过T7聚合酶，转录翻译出RHDV_RGD病毒颗粒，然后用含有病毒颗粒的细胞培养液感染RK13细胞，进行盲传，经观察，盲传至第3代开始出现典型病变，第5代开始稳定病变(图3)，断定拯救成功。

2.3RHDV_RGD病毒突变株RT-PCR鉴定

取第5代和21代RHDV_RGD病毒突变株感染的RK13细胞，提取RNA，反转录为cDNA，进行RT-PCR分析，结果如图4所示，均能检测到RHDV衣壳蛋白VP60。PCR所得产物经过测序确定为RHDV_RGD突变株(图5)。

2.4RHDV_RGD病毒突变株IFA鉴定

取第21代RHDV_RGD病毒突变株感染的RK13细胞在12h，24h，48h，72h，96h时间点，以VP60兔免疫血清为一抗，进行IFA观察，如图6所示，可以检测到RHDV衣壳蛋白VP60。从而进一步表明RHDV_RGD突变株拯救成功。

2.5RHDV_RGD病毒突变株Westernbloting鉴定

取第5代和21代RHDV_RGD病毒突变株感染的RK13细胞，以VP60兔免疫血清为一抗进行Westernbloting分析，如图7所示，第5代和第21代均能检测到VP60衣壳蛋白的表达。从而表明所拯救的RHDV_RGD病毒突变株可以在RK13细胞中进行传代。

2.6病毒突变株RHDV_RGD负染透射电镜观察

取第二十代RHDV_RGD细胞毒，通过差速离心纯化后，利用磷钨酸进行负染色，利用透射电镜进行观察，如图8显示，可以观察到直径为30-40nm呈多面体对称的RHDV病毒颗粒。从而确定成功拯救了RHDV_RGD突变株，并且该突变株能够在RK13细胞中进行稳定传代。

2.7RHDV_RGD致病性

本发明所得兔病毒性出血症病毒突变株对兔肾上皮细胞(RK13)具有一定的致病性，用细胞扩增所得细胞毒接种家兔，出现一定的致病作用。

本发明的兔病毒性出血症病毒突变株能够在RK13细胞中复制繁殖，能够为研究RHDV生命活动的相关机制，提供良好的平台和物质基础。兔病毒性出血症病毒突变株，具有良好的免疫源性，灭活的兔病毒性出血症病毒突变株对家兔具有一定的保护作用。兔病毒性出血症病毒突变株能够用于制备RHDV细胞灭活疫苗，从而大大降低疫苗的成本。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一株兔病毒性出血症病毒突变株，其特征在于，所述病毒突变株为兔病毒性出血症病毒突变株CCTCCV201501。

2.根据权利要求1所述的兔病毒性出血症病毒突变株，含有基因组编码的衣壳蛋白VP60，次级结构蛋白VP10，非结构蛋白p11、p28、p35、p32、VPg、3C样蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶，其特征在于，所述兔病毒性出血症病毒突变株的衣壳蛋白VP60含有RGD短肽。

3.根据权利要求1所述的兔病毒性出血症病毒突变株，其特征在于，所述RGD短肽由兔病毒性出血症病毒突变株衣壳蛋白VP60的第305位精氨酸、306位甘氨酸、307位天冬氨酸组成。

4.根据权利要求3所述的兔病毒性出血症病毒突变株，其特征在于，所述兔病毒性出血症病毒突变株的衣壳蛋白VP60的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

5.根据权利要求4所述的兔病毒性出血症病毒突变株，其特征在于，所述兔病毒性出血症病毒突变株的衣壳蛋白VP60由如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列表达而来。

6.一种用于拯救权利要求1所述的兔病毒性出血症病毒突变株的重组载体pRHDV_RGD。

7.一种根据权利要求1所述兔病毒性出血症病毒突变株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述兔病毒性出血症病毒突变株的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述引物的序列如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示；步骤二中，所述引物的序列如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6所示。

9.根据权利要求7所述兔病毒性出血症病毒突变株的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述重组载体pRHDV_RGD的构建中采用的限制性内切酶包括PmlI、ClaI；步骤四中，所述拯救具体指，在转染前一天将稳定表达T7TNA聚合酶的BHK21细胞铺种于六孔细胞培养板，当细胞密度在80％以上时，利用Lipofectamine^TM2000脂质体进行质粒转染，72小时后，收获拯救的兔病毒性出血症病毒突变株细胞培养物，再接种于兔肾上皮细胞培养，72小时后再收获细胞培养物，接种RK13细胞；盲传，直至细胞出现兔出血症典型细胞病变。

10.一种根据权利要求1所述的兔病毒性出血症病毒突变株的用途，所述用途包括：用于在细胞中繁殖兔病毒性出血症病毒突变株，制备细胞灭活疫苗；研究兔病毒性出血症病毒在细胞中的生命过程。