JP2010099084A - Ｈｉｖ調節／アクセサリータンパク質の融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】ＨＩＶの調節／アクセサリータンパク質のいくつかまたは全部に対して有効なワクチンであって、ワクチン中の調節／アクセサリーＨＩＶタンパク質の機能が天然の調節／アクセサリータンパク質よりも低下しているために、望ましくない副作用の危険性は減少しているが、天然ＨＩＶタンパク質と同様の免疫応答を誘発するワクチンを提供する。
【解決手段】Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｐｘ、Ｒｅｖ、ＴａｔおよびＮｅｆから選択される少なくとも４つのＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列、または１種以上の前記タンパク質のアミノ酸配列の誘導体を含む融合タンパク質であって、天然のＮ末端およびＣ末端を持つ個々のＨＩＶタンパク質にはプロセシングされない融合タンパク質。前記タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、および前記タンパク質を製造する方法。本融合タンパク質、核酸およびベクターのＨＩＶ感染予防のためのワクチンとして使用。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｐｘ、Ｒｅｖ、ＴａｔおよびＮｅｆから選択される少なくとも４つのＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列、または１種以上の前記タンパク質のアミノ酸配列の誘導体を含む融合タンパク質であって、天然のＮ末端およびＣ末端を持つ個々のＨＩＶタンパク質にはプロセシングされない融合タンパク質に関する。さらに本発明は、前記タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、および前記タンパク質を製造する方法に関する。本融合タンパク質、核酸およびベクターは、少なくとも部分的なＨＩＶ感染予防のためのワクチンとして使用することができる。

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子である。すべてのレトロウイルスと同様に、このウイルスのゲノムも、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖタンパク質をコードしている。また、このウイルスゲノムは調節タンパク質、すなわちＴａｔおよびＲｅｖと、アクセサリータンパク質、すなわちＶｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、ＶｉｆおよびＮｅｆもコードしている。

ＡＩＤＳの流行が蔓延するのを抑制しようとする公衆衛生的努力にもかかわらず、新規感染数は依然として増加している。世界保健機関は、この世界的伝染病を、２０００年末の時点で感染者数３６１０万人と推定したが、これは１０年前のデータに基づいて予測された数値よりも５０％高い値であった（ＷＨＯおよびＵＮＡＩＤＳ，ＵＮＡＩＤＳ，２０００）。２０００年の新規ＨＩＶ−１感染者数は、全世界では、５３０万人と推定される。

この伝染病が着実に蔓延していることを考えると、有効なワクチンを臨床施設に提供する必要は依然として存在する。新規なベクターやアジュバント系など、多種多様なＨＩＶ−１ワクチン送達戦略が、現在既に開発され、さまざまな前臨床設定および臨床試験で評価されている。第ＩＩＩ相臨床試験に入った最初のワクチン候補は、アルミニウムアジュバント中のエンベロープｇｐ１２０タンパク質に基づいている（非特許文献１）。第ＩＩＩ相試験は開始されているが、このワクチンは先の第ＩＩ相試験ではあまりはかばかしい結果を残していない。

エンベロープ抗原に基づく予防ワクチンが長年にわたって試みられていたが、最近では、Ｔａｔ、ＮｅｆおよびＲｅｖなどの調節タンパク質を候補ワクチン抗原として使用することに努力が集中している。これらの調節抗原は、治療的には、数年前から使用されている（非特許文献２）。さらに最近になって、予防ワクチンの研究でも、小規模な前臨床試験で、これらの抗原の使用は有望であることが明らかになった。ＴａｔおよびＲｅｖまたはＴａｔのみを予防ワクチン候補として使用するとＳＩＶｍａｃは抑制されることが実証された（非特許文献３）。また、感染細胞が成熟ウイルス粒子を高レベルに産生し始める前に感染細胞を排除するには、ウイルス初期調節タンパク質に対するＣＴＬが重要であることも指摘されている（非特許文献４）。

ＨＩＶの調節／アクセサリータンパク質は有効な免疫応答を誘発するが、それらは、全部ではないにしても、その大半が重大な副作用を持ち、今までは、その副作用によって、ワクチンとしてのそれらの使用が制限されてきた。Ｎｅｆ、ＴａｔおよびＶｐｕはＣＤ４＋および（または）ＭＨＣクラスＩ発現のダウンレギュレーションに関与することが示されている（非特許文献５）。Ｔａｔは生体内で急性免疫抑制を媒介することが知られている（非特許文献６）。Ｖｐｒについても免疫抑制効果が記載されている（非特許文献７）。酵母細胞ではＶｐｒとＶｐｘが異なる細胞分裂抑制効果および細胞毒性を持つことが記載されている（非特許文献８）。したがって、ＨＩＶのアクセサリー／調節タンパク質は、全部ではないにしても、その大半が、ワクチン製剤には望ましくない機能的特性を持つようである。

Ｆｒａｎｃｉｓら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １９９８；１４（Ｓｕｐｐｌ ３）（５）：Ｓ３２５−３１ Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９７，３，３８９−９４、Ｃａｌａｒｏｔａら、Ｌａｎｃｅｔ １９９８，３５１，１３２０−５、Ａｙｙａｖｏｏら、ＡＩＤＳ，２０００，１４，１−９ Ｏｓｔｅｒｈａｕｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９９９，１７，２７１３−４ ｖａｎ Ｂａａｌｅｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ １９９７，７８，１９１３−８；Ａｄｄｏら、ＰＮＡＳ，２００１，９８，１７８１−６ Ｈｏｗｃｒｏｆｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６０，１３２０−２；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１９９６，２，３３８−４２；Ｓｗａｎｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００１，２８２，２６７−７７；Ｊａｎｖｉｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００１，７８，３９７１−６；Ｗｅｉｓｓｍａｎｎら、ＰＮＡＳ １９９８，９５，１１６０１−６ Ｃｏｈｅｎら、ＰＮＡＳ，１９９９，９６，１０８４２−１０８４７ Ａｙｙａｖｏｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，１９９７，３：１１１７−１１２３ Ｚｈａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７，２３０，１０３−１２

ＨＩＶタンパク質の有害作用を軽減する試みが、ＷＯ ０２／０６３０３に開示されている。特に、ＷＯ ０２／０６３０３には、ＨＩＶ Ｖｉｆ、ＶｐｕおよびＮｅｆのアミノ酸配列を含む融合タンパク質が開示されている。この融合タンパク質では、成分タンパク質がもう１つの成分タンパク質と連続しているか、またはタンパク質分解切断部位を構成するアミノ酸配列などの非成分タンパク質で隔てられている。成分タンパク質間にタンパク質分解切断部位を含む融合タンパク質を使用することが好ましいと記載されている。成分タンパク質はタンパク質分解切断部位によって隔てられているので、有害であることがわかっている天然のＨＩＶタンパク質が生成される。融合タンパク質の切断によって生じるＨＩＶタンパク質の有害作用を軽減するために、ＷＯ ０２／０６３０３では、弱毒化タンパク質を使用することが提案されている。したがって、ＷＯ ０２／０６３０３では、ＨＩＶ Ｖｉｆ、ＶｐｒおよびＮｅｆタンパク質を含む融合タンパク質であって、ＨＩＶタンパク質間に切断部位が挿入されており、ＨＩＶタンパク質が弱毒化タンパク質である融合タンパク質が教示されている。しかし、弱毒化タンパク質の欠点は、弱毒化タンパク質のアミノ酸配列が天然タンパク質のアミノ酸配列とは異なるので、弱毒化タンパク質による免疫化で生成する免疫応答は、天然タンパク質を弱く認識するに過ぎないか、天然タンパク質を全く認識しない場合さえありうるということである。

ＨＩＶの調節／アクセサリータンパク質のいくつかまたは全部に対する有効な免疫応答の発生、特に、有効な細胞傷害性Ｔ細胞応答の発生を可能にするワクチンであって、ワクチン中の調節／アクセサリーＨＩＶタンパク質またはワクチンが産生する調節／アクセサリーＨＩＶタンパク質の機能が天然の個々の調節／アクセサリータンパク質よりも低下しているために、ワクチン中のアクセサリー／調節タンパク質が望ましくない副作用を発揮する危険性が減少していると共に、それら低活性ＨＩＶタンパク質が天然ＨＩＶタンパク質と同様の免疫応答を誘発するようなワクチンを提供することが、本発明の目的だった。

オリゴヌクレオチドのアニーリングを表す略図である。 ブロブ（ｂｌｏｂ）の４つの遺伝子のアニーリングを表す略図である。 ＭＶＡゲノムに外来遺伝子を挿入するための組換えベクターに、本発明の融合タンパク質をコードする配列をクローニングするための戦略図である。 ＭＶＡゲノムの概略図である。

この目的は、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｐｘ、Ｒｅｖ、ＴａｔおよびＮｅｆから選択される少なくとも４種類のＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列、または１種以上の前記タンパク質のアミノ酸配列の誘導体を含む融合タンパク質であって、天然のＮ末端およびＣ末端を持つ個々のＨＩＶタンパク質にはプロセシングされない融合タンパク質を提供することによって達成された。特に、本発明の目的は、前記融合タンパク質をコードする核酸およびベクターによって達成された。

本融合タンパク質をヒト細胞などの動物細胞中で産生させた場合、本融合タンパク質は、天然のＮ末端およびＣ末端を持つアクセサリー／調節タンパク質を与えるような形では、細胞性プロテアーゼによって切断されない。

融合タンパク質の一部であるＨＩＶタンパク質が持つ二次／三次構造は、個々のＨＩＶタンパク質と比較すると変化しているという事実により、融合タンパク質中のＨＩＶタンパク質は、全く機能しないわけではないとしても、個々のタンパク質よりも機能が低下している。機能が低下しているか、または全く機能しない調節／アクセサリータンパク質は、天然のコンフォメーションをとっているＨＩＶタンパク質の望ましくない副作用を持たない。免疫原性に関する限り、融合タンパク質の免疫原性と、その融合タンパク質を構成している個々のＨＩＶ調節／アクセサリータンパク質の免疫原性とを比較しても、実質的な違いはない。特に、免疫系に対して提示されるエピトープは同じであるから、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答に関して、実質的な違いはない。融合タンパク質を患者に投与する場合にも、同じことが言える。

本発明に関して「ＨＩＶ」という用語は、当業者に知られている任意のＨＩＶグループ、サブタイプ（クレード）、株または分離株を表す。具体的には、ＨＩＶは、ＨＩＶ−１でもＨＩＶ−２でもよい。ＨＩＶ−１は９つのサブタイプ（クレードＡ〜Ｉ）に分類されており、ＨＩＶ−２は５つのサブタイプ（Ａ〜Ｅ）に分類されているが、これらはすべて本発明の範囲に包含される。本発明の場合、最も好ましいＨＩＶクレードは、ＨＩＶ−１クレードＡ、ＢおよびＣである。しかし本発明は最も好ましいこれらのクレードに限定されるわけではない。

ＨＩＶ調節タンパク質Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、Ｔａｔ、ＶｐｘおよびＮｅｆのタンパク質配列は、当業者に知られている。一例として、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに開示されているさまざまな配列、特にＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０３４５５を持つＨＩＶ−１分離株ＨＸＢ２Ｒの配列が挙げられるが、本発明はこの態様に限定されるわけではない。このＧｅｎＢａｎｋエントリーでは、さまざまなＨＩＶ１遺伝子の配列とそれらの遺伝子がコードするタンパク質が特定されている。

本融合タンパク質を構成するＨＩＶタンパク質は、好ましくは、同じクレードに由来する。もう１つの態様では、本融合タンパク質を構成するＨＩＶタンパク質が、２つ以上のクレードに由来する。また、本融合タンパク質を構成するＨＩＶタンパク質の１つ以上がＨＩＶ−１タンパク質であり、本融合タンパク質を構成するＨＩＶタンパク質の１つ以上がＨＩＶ−２タンパク質であることも可能である。

本融合タンパク質を構成するＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列は、好ましくは、既知のＨＩＶ分離株がコードする配列である。すなわち、本融合タンパク質中のＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列は、天然のＨＩＶ分離株がコードする対応タンパク質のアミノ酸配列と同一である。もう１つの選択肢として、本融合タンパク質中の１種以上のＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列は、コンセンサス配列、すなわち、既知ＨＩＶ分離株中にそのままの形で見いだすことはできないが、既知ＨＩＶ分離株のいくつかまたはすべてに対して（特にＣＴＬエピトープに関して）最適な相同性を示す配列であってもよい。コンセンサス配列を割り出すためのコンピュータアルゴリズムは当業者に知られている。

もう１つの態様として、本融合タンパク質は、融合タンパク質の一部である１種以上のＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列の誘導体を含んでもよい。本明細書で使用する「ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列の誘導体」という用語は、対応する天然ＨＩＶタンパク質と比較して変化したアミノ酸配列を持つＨＩＶタンパク質を表す。変化したアミノ酸配列として、ＨＩＶタンパク質の配列の１種以上のアミノ酸が置換もしくは挿入されているか、または欠失している配列が挙げられる。より具体的に述べると、「ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列の誘導体」は、本融合タンパク質中のアミノ酸配列の対応する部分を、既知ＨＩＶ分離株の各ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列と比較した場合に、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列である。あるアミノ酸配列は、その相同性がたった１つのＨＩＶ分離株の対応するタンパク質について見いだされるに過ぎない場合でも、他の分離株の対応するタンパク質にはそれより低い相同性を示すものがあるかもしれないという事実とは関わりなく、上記の配列相同性を持つものと見なされる。例えば、本融合タンパク質中のＶｐｒ誘導体が、あるＨＩＶ分離株のＶｐｒ配列には９５％の相同性を示すが、他のＨＩＶ分離株（のすべて）には５０〜７０％の相同性しか示さない場合、当該Ｖｐｒ誘導体の相同性は少なくとも９０％であると見なされる。

本融合タンパク質中のタンパク質のコンフォメーションは生物学的に活性なタンパク質の天然のコンフォメーションとは異なるので、本融合タンパク質中のＨＩＶタンパク質が個々のタンパク質と比較して低下した活性を持つこと、または全く活性を持たないことは、既に指摘したとおりである。しかし、融合タンパク質中のＨＩＶタンパク質が生物学的に活性である危険性は、さらに減少させることが望ましいかもしれない。この目的にとって、融合タンパク質の一部である個々のＨＩＶタンパク質の特に好ましい「誘導体」は、低下した活性を持つＨＩＶタンパク質または活性を全く持たないＨＩＶタンパク質が得られるように、いくつかのアミノ酸、より好ましくは１０個を超えないアミノ酸、最も好ましくは５個を超えないアミノ酸が、欠失しているか、または挿入もしくは置換されているアミノ酸配列誘導体である。あるＨＩＶタンパク質の生物活性が低下しているかどうかを判定するための試験は、当業者に知られている。

生体内でのウイルス複製に不可欠なＶｉｆタンパク質の分子機序はまだ分かっていないが、Ｖｉｆは強い自己会合傾向を持っている。この多量体化は、ウイルスの生活環におけるＶｉｆの機能にとって重要であることが示されている（Ｙａｎｇ Ｓ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１；２７６：４８８９−４８９３）。また、ｖｉｆはウイルス核タンパク質複合体と特異的に会合することも示されており、これが機能的に重要であるのかもしれない（Ｋｈａｎ Ｍ．Ａ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００１；７５（１６）：７２５２−６５）。したがって、低下した活性を持つｖｉｆタンパク質は、多量体化および（または）核タンパク質複合体への会合の減少を示す。

Ｖｐｒタンパク質はウイルスの生活環に重要な役割を果たす。Ｖｐｒはウイルスのプレインテグレーション複合体の核内移行を調節し、マクロファージなどの非分裂細胞の感染を促進する（Ａｇｏｓｔｉｎｉら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２００２；１８（４）：２８３−８）。また、それはＬＴＲとの相互作用によって媒介されるトランス活性化活性も持っている（Ｖａｎｉｔｈａｒａｎｉ Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００１；２８９（２）：３３４−４２）。したがって、低下した活性を持つｖｐｒは、トランス活性化および（または）ウイルスプレインテグレーション複合体との相互作用の減少を示すか、またはトランス活性化および（または）ウイルスプレインテグレーション複合体との相互作用を全く示さない。

Ｖｐｒに対して高い相同性を持つＶｐｘも、非分裂細胞における効率のよいウイルスの複製にとって重要である。Ｖｐｘは、ｇａｇ前駆体ポリタンパク質のｐ６ドメインとの相互作用によって、ウイルス粒子にパッケージングされる。Ｖｐｒと同様に、Ｖｐｘも核内へのプレインテグレーション複合体の輸送に関与する（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ２００１；７５（１）：３６２−７４）。したがって、低下した活性を持つＶｐｘは、ｇａｇ前駆体を介してプレインテグレーション複合体に会合する能力が減少している。

Ｖｐｕタンパク質はＣＤ４の細胞質尾部と相互作用することが知られており、ＣＤ４分解を引き起こす（Ｂｏｕｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５；６９（３）：１５１０−２０）。したがって、低下した活性を持つＶｐｕは、ＣＤ４分解を誘発する能力が低下している。

詳しく特徴づけられているＴａｔタンパク質の関連する生物活性は、トランス活性化応答要素（ＴＡＲ）との相互作用を介した転写のトランス活性化である。ＴａｔはＴＡＲ以外のＨＩＶ配列を欠く異種プロモーターをトランス活性化できることが実証されている（Ｈａｎ Ｐ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９９１；１９（２５）：７２２５−９）。したがって、低下した活性を持つｔａｔタンパク質は、ＴＡＲ要素を介したプロモーターのトランス活性化の減少を示す。

Ｎｅｆタンパク質は、ＣＤ４の細胞表面ダウンレギュレーションを誘発することから、疾患進行の原因となるウイルス複製にとって不可欠である（Ｌｏｕ Ｔら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ １９９７；４（４）：１３２）。このダウンレギュレーションは、ＣＤ４とＮｅｆの間の直接的相互作用によって開始される（Ｐｒｅｕｓｓｅｒ Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００２；２９２（３）：７３４−４０）。したがって、低下した機能を持つＮｅｆタンパク質は、ＣＤ４との相互作用の減少を示す。

Ｒｅｖの関連する機能は、ウイルスＲＮＡのＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）との相互作用によって開始される転写後トランス活性化である（Ｉｗａｉら、１９９２；Ｎｕｃｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９２；２０（２４）：６４６５−７２）。したがって、低下した活性を持つＲｅｖは、ＲＲＥとの相互作用の減少を示す。

本発明の融合タンパク質は、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、Ｖｐｘ、ＴａｔおよびＮｅｆから選択される少なくとも４種類のＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列を含む。本融合タンパク質は、好ましくは、前記ＨＩＶタンパク質のうち、５つ、６つまたはすべてを含みうる。本融合タンパク質におけるＨＩＶタンパク質の順序は決定的な問題ではない。

上記少なくとも４種類のＨＩＶタンパク質のうちの１つ以上が、本融合タンパク質中に２コピー以上含まれていてもよい。したがって例えば、本発明の融合タンパク質は、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕおよび２コピーのＲｅｖを含みうる。それら２コピー以上のＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列は同一でありうる。もう１つの選択肢として、それらのコピーのアミノ酸配列は異なっていてもよく、特に、異なるＨＩＶ株またはＨＩＶクレードに由来するタンパク質配列（例えば１コピーのＨＩＶ−１ Ｒｅｖと１コピーのＨＩＶ−２ Ｒｅｖ）を使用する場合には異なっていてもよい。

融合タンパク質中の隣り合うＨＩＶタンパク質は、アミノ酸を追加せずに融合するか、または融合タンパク質中の隣り合う２つのＨＩＶタンパク質が少なくとも１つの追加アミノ酸で隔てられるような形で融合することができる。両者の組合せも本発明の範囲に包含される。例えば、４つのＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列を含む本発明の融合タンパク質では、隣り合う２つのＨＩＶタンパク質を互いに直接連結し、３番目と４番目のＨＩＶタンパク質は追加アミノ酸を介して連結することができる。この態様に関して「追加アミノ酸」という用語は、天然ＨＩＶタンパク質のその位置には見いだされないアミノ酸を表す。

したがって本発明の融合タンパク質は、好ましくは、以下の一般式：
＋Ｐ１−−−Ｐ２−−−Ｐ３−−−Ｐ４−−−Ｐ５^＊−−−Ｐ６^＊−−−Ｐ７^＊＋
［式中、Ｐ１〜Ｐ７は、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、Ｔａｔ、ＲｅｖおよびＮｅｆから選択される異なるＨＩＶタンパク質を表す］
を持ち、本融合タンパク質は、少なくとも４種類の前記ＨＩＶタンパク質、すなわちＰ１〜Ｐ４と、要すればさらに１つ（Ｐ５^＊）、２つ（Ｐ５^＊−−−Ｐ６^＊）または３つ（Ｐ５^＊−−−Ｐ６^＊−−−Ｐ７^＊）追加の前記ＨＩＶタンパク質を含む。略号「−−−」は、独立して、０個またはｎ個の追加アミノ酸を意味する。「−−−」が０個のアミノ酸を意味する場合、隣り合うＨＩＶタンパク質は、アミノ酸を追加せずに互いに直接融合される。「−−−」が１〜ｎ個のアミノ酸を意味する場合、隣り合うＨＩＶタンパク質は１〜ｎ個のアミノ酸によって隔てられる。追加アミノ酸数の上限、すなわち整数ｎは、細胞中で産生または発現されうる融合タンパク質の最大サイズに依存する。

ある態様では、すべての「−−−」が独立して０〜２０個、より好ましくは０〜１０個、さらに好ましくは０〜５個の追加アミノ酸を意味する。

もう１つの態様では、「−−−」の少なくとも１つが、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、ＴａｔおよびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質ではない追加タンパク質またはその一部のアミノ酸配列を意味する。したがって、このもう１つの態様では、追加タンパク質に、調節／アクセサリーＨＩＶタンパク質が隣接している。追加タンパク質はどのタンパク質であってもよい。追加タンパク質は、より好ましくは、ＨＩＶに対してより良い免疫応答を誘発するのに役立ちうる追加エピトープを含む。したがって、追加タンパク質は、ＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇおよび（または）Ｐｏｌタンパク質またはその一部でありうる。この場合、Ｅｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌの「一部」という用語は、前記タンパク質の１つに由来するアミノ酸ストレッチであって、少なくとも１つのエピトープを含むものを表す。一部という用語は、より好ましくは、前記タンパク質の１つに由来する少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも２０個、最も好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を表す。これに関連する態様では、「−−−」のうち少なくとも１つが、本融合タンパク質の一部であるタンパク質Ｐ１〜Ｐ７の１種以上のアミノ酸配列を意味する。したがってこの場合、本融合タンパク質は、本融合タンパク質の一部であるタンパク質のうちの１つ以上について、１コピー以上を含みうる。上述のように、それらのタンパク質コピーは、同じアミノ酸配列を持っていてもよいし、同じアミノ酸配列を持っていなくてもよい。

上記の式において、略号「＋」は、独立して、０〜ｎ個の追加末端アミノ酸を意味する。したがって、本発明の融合タンパク質は、そのタンパク質のＣ末端および（または）Ｎ末端に追加アミノ酸を含んでもよいし、含まなくてもよい。ある態様では、「＋」の少なくとも一方が、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、ＴａｔおよびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質ではない追加タンパク質のアミノ酸配列またはその一部を意味する。したがって、この態様では、本融合タンパク質は、そのＣ末端および（または）Ｎ末端に、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、ＴａｔまたはＮｅｆではない追加タンパク質を含む。追加タンパク質はどのタンパク質であってもよい。追加タンパク質は、より好ましくは、ＨＩＶに対してより良い免疫応答を誘発するのに役立ちうる追加エピトープを含む。例えば、追加タンパク質は、ＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇおよび（または）Ｐｏｌタンパク質またはその一部でありうる。この場合、Ｅｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌの「一部」という用語は、前記タンパク質の１つに由来するアミノ酸ストレッチであって、少なくとも１つのエピトープを含むものを表す。一部という用語は、より好ましくは、前記タンパク質の１つに由来する少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも２０個、最も好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を表す。

もう１つの態様では、「＋」の少なくとも一方が、融合タンパク質の検出または精製を容易にするアミノ酸配列を意味する。したがって、「＋」の少なくとも一方は、例えばＨｉｓタグなどのタグであるかもしれない。

本発明によれば、本融合タンパク質は、天然のＮ末端およびＣ末端を持つ個々のＨＩＶタンパク質にはプロセシングされない。より具体的に述べると、本発明の融合タンパク質は、ヒト細胞中で発現させた場合に、天然のＮ末端およびＣ末端を持つ個々のＨＩＶタンパク質にプロセシングされない。ヒト細胞中で発現させた場合に、ある融合タンパク質が天然のＮ末端およびＣ末端を持つ個々のＨＩＶタンパク質にプロセシングされるかどうかを調べる方法は、当業者に知られている。これについては、Ａｙｙａｖｏｏら、ＡＩＤＳ ２０００，１４，１−９、特に同文献の図２に記載の実験を参照されたい。簡単に述べると、当業者は各融合タンパク質をＨｅＬａ細胞などのヒト細胞中で容易に発現させることができるだろう。次に、細胞を溶解し、その細胞溶解物を、集合して各ＨＩＶ融合タンパク質を形成している個々のＨＩＶタンパク質に特異的な抗体によるウェスタンブロット実験または免疫沈降アッセイにかける。本発明の融合タンパク質の場合、個々のＨＩＶ調節／アクセサリータンパク質のサイズに一致するサイズを持つ有意な量のＨＩＶタンパク質は検出されない。

本発明の融合タンパク質が天然のＮ末端およびＣ末端を持つ個々のＨＩＶタンパク質にプロセシングされないことを保証するために、融合タンパク質は、天然のＮ末端およびＣ末端を持つＨＩＶタンパク質の生成を誘発するかもしれない細胞性プロテアーゼの特異的切断配列を、融合タンパク質を構成するＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列間に含んではならない。したがって、上記の一般式で略記したアミノ酸配列「−−−」は、天然のＮ末端およびＣ末端を持つＨＩＶタンパク質の生成を誘発するかもしれない細胞性プロテアーゼの特異的切断配列を含有しない。特に、本融合タンパク質は、融合タンパク質を構成する異なるＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列間に切断配列ＲＥＫＲＡＶＶＧ（アミノ酸の一文字表記）を含有しない。当業者には細胞性プロテアーゼの切断配列が他にも知られている。したがって、当業者は、天然のＮ末端およびＣ末端を持つ個々のＨＩＶタンパク質をもたらすかもしれない（細胞性）プロテアーゼの切断部位が含まれることを、容易に防ぐことができる。システインプロテアーゼの切断配列の一例は、Ｉｌｅ／ｌｅｕ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｇｌｙである。

本発明のタンパク質は、天然Ｎ末端と天然Ｃ末端の両方を持つＨＩＶタンパク質をもたらす特異的切断配列を含まない。しかしこれは、当該切断部位が天然Ｎ末端と天然Ｃ末端の両方を持つＨＩＶタンパク質の生成を媒介するのでない限り、融合タンパク質中のタンパク質間に細胞性プロテアーゼの切断部位が存在することを、広く排除しているわけではない。特に、上記の一般式で略記したアミノ酸配列「−−−」は、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ上に提示される短いペプチドの生成に関与するプロテアーゼの切断部位を含みうる。この態様では、切断反応の結果は、好ましくは２０アミノ酸未満の短いペプチドストレッチであり、そのＮ末端またはＣ末端は、ＨＩＶアクセサリー／調節タンパク質の１つのＮ末端またはＣ末端と一致してもよい。ただし、これらの短いペプチドが抗原提示の過程で生成する場合、これらの短いペプチドは、それらが由来するＨＩＶタンパク質の活性を、もはや持っていない。

また、本発明は、上に定義した本発明の融合タンパク質をコードする核酸に関する。この核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。プラスミドまたはＤＮＡウイルスに基づくベクターなどのＤＮＡベクターを使って核酸をヒト細胞中に挿入しようとする場合、核酸はＤＮＡであることが好ましい。

本発明の融合タンパク質をコードする核酸を構築する方法は、当業者に知られている。以下の方法に限定されるわけではないが、当業者は、ゲノムＨＩＶクローンから、サブゲノムＨＩＶクローンから、または調節／アクセサリーＨＩＶタンパク質の１種以上のコード配列を含む任意の出発物（例えばプラスミド）から、出発することができる。調節／アクセサリータンパク質のコード配列が連続した読み枠の形をとっている場合は、適当な制限酵素で当該コード配列を含む核酸を切断することにより、そのコード配列を単離することができる。このようにして得たＤＮＡ断片は、さらなるクローニングに使用することができる。もう１つの選択肢として、アクセサリー／調節タンパク質のコード配列は、適当なプライマーとポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法とを使って得ることもできる。調節／アクセサリータンパク質が、例えばＴａｔおよびＲｅｖがそうであるように、２つ以上のエクソンによってコードされている場合は、異なるエクソンを別個にクローニングし、それらを融合して、調節／アクセサリータンパク質の連続した読み枠を生成させるか、またはＲＴ−ＰＣＲなどの逆転写技術を用いる必要がありうる。

コード配列は遺伝子合成によって、すなわち一組の相補的なかつ／またはオーバーラップしたオリゴヌクレオチドを使って遺伝子を生成させることによって得ることもできる。

融合タンパク質を得るために、当該融合タンパク質をコードする核酸は連続した読み枠を持つことが好ましい。したがって、ＨＩＶタンパク質または追加タンパク質をコードする配列の停止コドンは、最後の配列を除くすべての配列について、アミノ酸をコードするコドンに突然変異させるか、完全に欠失させることが好ましい。これは、好ましくは、停止コドンを含まないコード配列を増幅させる特異的プライマーをＰＣＲに使用すると、容易に達成することができる。言い換えると、この選択肢では、下流プライマーが停止コドンに相補的であってはならない。したがって、増幅されるＤＮＡ断片は停止コドンを含まないことになり、これをクローニングベクターにクローニングすることができる。もう１つの選択肢として、停止コドンを持つコード配列をクローニングベクターにクローニングすることもできる。この停止コドンは後に、例えば特異的エンドヌクレアーゼを使って、または突然変異誘発によって除去することができる。

これらのクローニング工程により、本発明の融合タンパク質をコードする連続した読み枠がもたらされるはずである。

融合タンパク質を発現させるのに必要な調節要素は、所望する発現系での発現を駆動する調節要素であれば何でもよい。大腸菌などの原核細胞中で融合タンパク質を生成させようとする場合は、細菌プロモーターまたはファージプロモーターを使用することが好ましい。真核細胞中で融合タンパク質を発現させようとする場合は、真核またはウイルスプロモーター／エンハンサーを使用することが好ましい。ポックスウイルスプロモーターを使って融合タンパク質を発現させようとする場合（下記参照）は、７．５プロモーターまたはＡＴＩプロモーターなどのポックスウイルスプロモーターを使用することが好ましい。

上述のように、本融合タンパク質は、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、Ｔａｔ、ＲｅｖおよびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質ではない融合パートナーを含みうる。したがって、本融合タンパク質は、他のタンパク質のアミノ酸配列またはその一部を含みうる。他のタンパク質の例は、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖタンパク質である。したがって、本発明の核酸は、少なくとも４つの調節／アクセサリーＨＩＶタンパク質またはその誘導体をコードするオープンリーディングフレーム中に、１種以上の追加タンパク質のコード配列またはその一部も含みうる。

本発明のさらにもう１つの態様では、本核酸はさらに、ＨＩＶに対する免疫応答をより一層改善するのに役立ちうる追加タンパク質をコードする独立した発現カセットも含みうる。好ましい一態様として、本核酸はさらに、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖから選択される少なくとも１つの追加ＨＩＶタンパク質のコード配列またはその一部を含む発現カセットを含みうる。さらに好ましくは、本核酸は、融合タンパク質のコード配列に加えて、ＨＩＶタンパク質Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖのすべてのコード配列を含みうる。本核酸は、好ましくは、ベクターの一部である。本核酸は、ウイルスベクター（好ましくはＭＶＡなどのポックスウイルスベクター）のウイルスゲノムまたはその一部であることもできる。したがって、ポックスウイルスベクターから本融合タンパク質および追加ＨＩＶタンパク質（例えばＧａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖから選択される少なくとも１つの追加ＨＩＶタンパク質）を発現させることができる。

さらに本発明は本発明の核酸を含むベクターに関する。「ベクター」という用語は、当業者に知られる任意のベクターを表す。ベクターは、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣ系ベクターなどのプラスミドベクターであることができる。ベクターは、より好ましくは、ウイルスベクターである。本発明に関して「ウイルスベクター」という用語は、ウイルスゲノムを含む感染性および（または）弱毒化ウイルスを表す。この場合、本発明の核酸は、各ウイルスベクターのウイルスゲノムの一部であり、かつ／またはウイルスゲノムを構成している。本組換えベクターは、細胞および細胞株の感染、特にヒトを含む生きている動物の感染に使用することができる。典型的な本発明のウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルス２（ＡＡＶ２）に基づくベクターである。ポックスウイルスベクターが最も好ましい。ポックスウイルスとして、好ましくは、カナリア痘瘡ウイルス、鶏痘ウイルスまたはワクシニアウイルスを挙げることができる。変異ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ：ＭＶＡ）（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ら［１９９４］Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１０３２−４０）が、さらに好ましい。典型的なＭＶＡ株は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に受託番号ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７として寄託されているＭＶＡ５７５である。２００１年１１月２２日に「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ Ｖｉｒｕｓ Ｖａｒｉａｎｔ」という名称で欧州特許庁に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８に記載されているＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体が、最も好ましい。ＭＶＡ−ＢＮはヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに受託番号ＥＣＡＣＣ Ｖ０００８３００８として寄託されている。ＭＶＡ−ＢＮウイルスベクターは変異ワクシニアアンカラに由来する著しく弱毒化されたウイルスであり、ヒト細胞で増殖的に複製する能力を持たないことを特徴とするので、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を用いることにより、ＨＩＶに対して特定の安全なウイルスワクチンを提供するというもう１つの技術的課題が解決された。ＭＶＡ−ＢＮはヒトでは複製しないので他のどの既知ワクシニアウイルス株よりも安全である。好ましい一態様では、本発明は、本発明のＤＮＡを含むウイルスベクターとして、ＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ−ＢＮの誘導体に関する。ＭＶＡ−ＢＮの特徴、あるＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体であるかどうかを調べることを可能にする生物学的アッセイの説明、およびＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体の取得を可能にする方法は、上記のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８に開示されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。

したがってこれらの態様では、本発明は、好ましくは、本発明の融合タンパク質をコードする発現カセットをウイルスゲノム中に含む組換えＭＶＡ（例えばＭＶＡ−ＢＮ）に関する。

本発明の核酸をウイルスゲノムに挿入する方法、および組換えウイルスを取得する方法は、当業者に知られている。

組換えワクシニアウイルスにおいて、本発明ＤＮＡの発現は、好ましくはポックスウイルスプロモーターの転写制御、より好ましくはワクシニアウイルスプロモーターの転写制御を受けるが、これに限るわけではない。本発明のＤＮＡは、好ましくは、ウイルスゲノムの非必須領域に挿入される。本発明のもう１つの好ましい態様では、異種核酸配列を、ポックスウイルスゲノムの天然の欠失部位（ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６に記載されているもの）に挿入する。しかし、挿入部位の性質は、組換えワクシニアウイルスが得られる限り、本発明にとって決定的な問題ではない。したがって当業者は他の適切な挿入部位を容易に思いつくことができる。

ウイルスベクター、特にポックスウイルスベクターは、好ましくは、本発明の融合タンパク質のコード配列に加えて、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ遺伝子から選択される追加のレトロウイルス遺伝子を、ウイルスゲノム中に含みうる。ウイルスベクター、特にポックスウイルスベクターは、より好ましくは、本発明の融合タンパク質のコード配列に加えて、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖをコードするＨＩＶ遺伝子をすべて含みうる。本発明では同じ核酸を使ってこれらの追加遺伝子を挿入することができる。この態様では、すべてのＨＩＶ遺伝子が、ウイルスゲノムの同じ挿入部位に位置することになる。もう１つの態様では、追加遺伝子はウイルスゲノムの異なる位置に挿入される。

好ましい一態様として、本発明は、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳを少なくとも部分的に予防するためのワクチンとしての、本発明の核酸、ベクターまたは融合タンパク質に関する。「ワクチン」は、特異的免疫応答を誘導する化合物、すなわち核酸、融合タンパク質、ベクターまたはウイルスである。

この態様の一選択肢として、本発明の「ワクチン」は、本発明の融合タンパク質に基づく。

好ましい一態様では、本発明の核酸、特にＤＮＡを、ワクチンとして使用する。本発明の場合と同様に真核発現カセットを含んでいる裸のＤＮＡを投与すると（特にＤＮＡを筋肉内投与すると）、その発現カセットによってコードされているタンパク質の発現が起こることが、当業者に知られている。そのタンパク質は免疫系にばく露され、特異的免疫応答を生じさせる。もう１つの態様では、本発明のベクター、特にウイルスベクター、より好ましくはポックスウイルスベクター、最も好ましくはＭＶＡベクターなどのワクシニアウイルスベクターを投与することによって、予防接種を行う。

ワクシニアウイルス系ワクチンを製造するには、本発明のウイルスを生理学的に許容できる形態に変換する。これは、天然痘の予防接種に用いられるポックスウイルスワクチン（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ら［１９７４］Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２に記載されているもの）を製造する際の経験に基づいて行うことができる。例えば、精製ウイルスは、５×１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの力価で約１０ｍＭトリスおよび１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に製剤化して、−８０℃で保存する。ワクチン注射剤を製造するには、例えば、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００ｍＬ中のウイルス粒子１０^２〜１０^８個を、アンプル（好ましくはガラスアンプル）中で凍結乾燥する。もう１つの選択肢として、ワクチン注射剤は、製剤中のウイルスの段階的凍結乾燥によって製造することもできる。この製剤は、さらに、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドンなどの添加剤、または、生体内投与に適した酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤または組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）などの他の添加剤も含むことができる。その場合、このガラスアンプルを封印して、４℃〜室温で数ヶ月間保存することができる。しかし、必要がない限り、アンプルは−２０℃未満の温度で保存することが好ましい。予防接種を行うには、上記の凍結乾燥物を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解し、それを全身的または局所的に、すなわち非経口投与、筋肉内投与、または当業者に知られる他の任意の投与経路によって、投与することができる。当業者であれば、投与様式、投与量および投与回数を、既知の方法で最適化することができる。ポックスウイルスベクターの場合は、皮下投与または筋肉内投与が最も好ましい。

ワクチンが本発明のＤＮＡを含むＭＶＡ−ＢＮベクターまたはその誘導体である場合、本発明の一特定態様は、第１接種（「初回免疫接種」）および第２接種（「追加免疫接種」）で、治療有効量の当該ワクチンを投与することに関する。

ワクチンが本発明のＤＮＡを含むＭＶＡ−ＢＮベクターまたはその誘導体である場合、本発明の一特定態様は、第１バイアル／容器に入った第１予防接種（「初回免疫」）用の本発明ＭＶＡ−ＢＮウイルスベクターと、第２バイアル／容器に入った第２予防接種（「追加免疫」）用の本発明ＭＶＡ−ＢＮウイルスベクターとを含む予防接種用キットに関する。したがって本発明は、ワクチン態様として、本発明の核酸、ベクターまたは融合タンパク質を含むワクチン、およびワクチンの製造を目的とする前記核酸、ベクターまたはタンパク質の使用に関する。

さらにもう１つの態様として、本発明は、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸、または本発明のベクターを保護を必要とする、ヒトを含む動物に投与することによって、ヒトを含む動物をＨＩＶ感染から保護する方法に関する。

さらに本発明は、本発明のタンパク質を製造する方法であって、（ｉ）本発明の核酸またはベクターを宿主細胞にトランスフェクトする工程、または（ｉｉ）宿主細胞に本発明のウイルスベクターを感染させる工程、（ｉｉｉ）工程（ｉ）のトランスフェクト宿主細胞または工程（ｉｉ）の感染宿主細胞中で融合タンパク質を発現させる工程、および（ｉｖ）融合タンパク質を回収する工程を含む方法に関する。

さらに本発明は、本発明の核酸またはベクターをトランスフェクトした宿主細胞、または本発明のウイルスベクターに感染した宿主細胞に関する。

もう１つの態様として、本融合タンパク質は、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、ＶｐｘおよびＴａｔから選択される少なくとも３種類のＨＩＶタンパク質を含みうる。本融合タンパク質は、好ましくは、前記ＨＩＶタンパク質の４個、５個またはすべてを含みうる。この態様の融合タンパク質の典型例は、ＨＩＶタンパク質Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、ＲｅｖおよびＴａｔのアミノ酸配列、または１種以上の前記タンパク質のアミノ酸配列の誘導体を含む。上述のように、融合タンパク質中のＨＩＶタンパク質の順序は決定的な問題ではない。上述した好ましい態様はすべてこの代替態様にも当てはまる。

図面の簡単な説明
図１：図１は、オリゴヌクレオチドのアニーリングを表す略図である。この図は４つのオリゴヌクレオチドのアニーリングを示している。各オリゴヌクレオチドは一本鎖であり、相補的末端によってアニールすることができる。プルーフリーディング活性を示すポリメラーゼ（例えばＰｆｘポリメラーゼ）を使ってギャップを埋める。

図２：図２は、ブロブ（ｂｌｏｂ）の４つの遺伝子のアニーリングを表す略図である。ｖｉｆ遺伝子はｖｐｒ断片とのオーバーラップ配列を示し、ｖｐｕコード断片はｒｅｖ遺伝子とのオーバーラップ配列を示す（灰色の部分）。ＰＣＲ断片を変性し、オーバーラップする相補的末端をハイブリダイズさせる。その結果生じたギャップをＰｆｘポリメラーゼで埋める。ｖｉｆ−ｖｐｒ断片をｖｐｕ−ｒｅｖ断片のオーバーラップ配列に融合し、それを再び融合に使用する。

図３：図３は、ＭＶＡゲノムに外来遺伝子を挿入するための組換えベクターに、本発明の融合タンパク質をコードする配列をクローニングするための戦略である。融合したｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｒｅｖポリタンパク質コード領域を、ＣｌａＩおよびＡｐａＩ制限酵素部位を含むプライマーを使って増幅した。このｐＣＲ産物を、ポックスウイルスＡＴＩプロモーターを持つベクターｐＢＮＸ６５のＣｌａＩ／ＡｐａＩ切断物にクローニングした。Ａｃｃ６５Ｉ制限酵素部位を含むプライマーを使ったＰＣＲによってｔａｔコード領域を増幅し、Ａｃｃ６５Ｉで線状化したｐＢＮＸ６５＋ｖｉｆ−ｒｅｖにライゲートした。得られた発現カセット（ＡＴＩプロモーター＋本発明の融合タンパク質をコードする配列）をＰａｃＩ制限酵素消化によって単離し、ＭＶＡゲノムＩ４Ｌ遺伝子間領域に外来遺伝子を挿入するための組換えベクター（ｐＢＮＸ３９）に挿入した。ｐＢＮＸ３９は、ＭＶＡゲノムの挿入部位の隣接配列に相同な配列（Ｆ１ Ｉ４ＬおよびＦ２ Ｉ４Ｌ）を持っている。ＭＶＡゲノムとｐＢＮＸ３９との相同組換え後に組換えウイルスを選択することができるように、このベクターは大腸菌ｇｐｔ遺伝子（ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子）も持っている。この選択カセットは、組換えウイルスの精製後に、Ｆｌａｎｋ１とｆｌａｎｋ１の反復配列（Ｆ１ｒｐｔ）との間で起こる相同組換えによって欠失する。

図４：図４は、ＭＶＡゲノムの概略図である。ＭＶＡは、ＨｉｎｄＩＩＩによる制限酵素消化後に特徴的な断片（Ａ〜Ｏ）を示す線状ゲノムを持っている。Ｉ４Ｌ遺伝子とＩ５Ｌ遺伝子の間の非機能領域はＩ断片中に位置している。ｐＢＮＸ３９を使った外来遺伝子の挿入は５６７６７〜５６７６８位で起こる。

（ＨＩＶ Ｖｉｆ−Ｖｐｒ−Ｖｐｕ−Ｒｅｖ−Ｔａｔ融合タンパク質をコードするＤＮＡの作製）
ＨＩＶゲノムの単一遺伝子は、標準的ＰＣＲプロトコールを用いるＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡから調製するか、またはオーバーラップ配列を介したオリゴヌクレオチドのアニーリングと、その結果生じた一本鎖ギャップの充填とに基づく技術によって合成的に調製した。

本発明の融合タンパク質をコードする核酸に挿入しようとする遺伝子のコード領域をオリゴヌクレオチドに基づいて作製するために、１５ｂｐのオーバーラップを持つ４０マーのオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、ＩＩＩＢ株に由来するＨＩＶ１分離株ＨＸＢ２Ｒのゲノム地図に基づいている。アニーリング反応用のオリゴヌクレオチド、または必要な配列を単離するためのＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドは、結果として得られるコード領域から翻訳終結用の停止コドンが欠失するように設計した。ｔａｔ遺伝子は停止コドンを含むオリゴを使って合成した。というのも、この遺伝子は本発明の融合タンパク質をコードする核酸の最後に挿入されるものなので、ポリタンパク質の翻訳が正しく終結するように停止トリプレットを含むべきだからである。

オリゴアニーリング反応については、１０サイクルの２段階Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）反応（９５℃で変性および６８℃でアニーニング／伸長）を行った。この反応中に、オリゴのオーバーラップ配列はアニールした状態になり、ギャップがＰｆｘプルーフリーディングポリメラーゼによって充填される（図１）。融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列中の第１コード遺伝子であるｖｉｆコード領域を合成するために、ゲノムＨＩＶ ｃＤＮＡを使ったＰＣＲを行った。このＰＣＲは、続いて行うｖｉｆとｖｐｒのアニーリングに備えて、ｖｉｆコード領域が次のｖｐｒ遺伝子の最初の１５ｂｐに融合されるように行った。ＨＩＶ ＨＸＢ２Ｒゲノムのｂｐ５５５９−５８４７に広がるＶｐｒコード領域は、１０個のヌクレオチドのアニーリングによって調製した。生じたギャップを充填し、増幅のためのＰＣＲを行った後、ｖｉｆ用の隣接領域と、ｖｐｒコード領域の後ろに挿入する予定であるｖｐｕ用の隣接領域とに融合したｖｐｒコード領域を含む生成物を得た。

ｖｉｆの合成に使用したものと同じｃＤＮＡから、ＰＣＲによってＶｐｕコード領域を増幅することにより、ｖｐｒおよびｒｅｖと融合させるための隣接領域を含む生成物を得た。

ｒｅｖコード領域は、ＨＩＶ ＨＸＢ２Ｒゲノムのｂｐ５９７０−６０４５および８３７９−８６５０の領域を覆うと共に、ｖｐｕおよびｔａｔとのアニーリング用の１５ｂｐオーバーラップを持つ１４個のオリゴヌクレオチドのアニーリングによって合成した。

ｔａｔコード領域は、ＨＩＶ ＨＸＢ２Ｒゲノムのｂｐ５８３１−６０４５および８３７９−８４６６を覆う１０個のオリゴヌクレオチドを使って作製した。

ｖｉｆおよびｖｐｒコード領域ならびにｖｐｕおよびｒｅｖコード領域は、それら２つの断片をそれぞれのオーバーラップを使ってアニールさせることにより、２段階Ｐｆｘポリメラーゼ反応で融合させた（図２）。その融合生成物をさらにＰＣＲ増幅した後、断片を精製し、ｖｐｒおよびｖｐｕのオーバーラップを使って互いにライゲートした（図２）。得られた生成物（ｖｉｆ−ｖｐｒ−ｖｐｕ−ｒｅｖのコード配列）をＰＣＲ増幅した後、ポックスウイルスＡＴＩプロモーターを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋ベクター（図３、ｐＢＮＸ６５）中の隣り合うクローニング部位に、ｖｉｆ−ｖｐｒ−ｖｐｕ−ｒｅｖ断片とｔａｔとをクローニングすることにより、ｔａｔコード領域を融合した。次に、ＰａｃＩ制限酵素消化によって発現カセット全体を単離し、ｐＢＮＸ３９（図３）に挿入した。ｐＢＮＸ３９は、ＭＶＡゲノムに相同な配列を含んでおり、それが相同組換えによるゲノム（図４）の非コード領域（Ｉ４Ｌ）への挿入を可能にする。

Claims (31)

1. Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｐｘ、Ｒｅｖ、ＴａｔおよびＮｅｆから選択される少なくとも４つの非弱毒化ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列、または１種以上の前記タンパク質のアミノ酸配列の誘導体を含む融合タンパク質であって、当該融合タンパク質は、当該融合タンパク質を構成するＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列間に切断配列ＲＥＫＲＡＶＶＧを含まず、かつＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列の誘導体は、融合タンパク質中のアミノ酸配列の対応部分をＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２Ｒ、ＨＩＶ−２単離株ＢＥＮ、ＨＩＶ−２単離株ＣＡＭ２、ＨＩＶ−２単離株Ｄ１９４、ＨＩＶ−２単離株ＥＨＯ、ＨＩＶ−２単離株ＧＨ１、ＨＩＶ−２単離株ＫＲ、ＨＩＶ−２単離株ＭＤＳ、ＨＩＶ−２単離株ＲＯＤまたはＨＩＶ−２単離株ＳＢＬＩＳＹにおける各ＨＩＶタンパク質のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１５で表されるアミノ酸配列と比較した場合に、少なくとも５０％の相同性を示すアミノ酸配列である、融合タンパク質。
2. 前記相同性が少なくとも８０％である、請求項１記載の融合タンパク質。
3. 非弱毒化ＨＩＶタンパク質がＶｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、ＲｅｖおよびＴａｔから選択される、請求項１または２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
4. 非弱毒化ＨＩＶタンパク質Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、ＲｅｖおよびＴａｔのアミノ酸配列、または１種以上の前記タンパク質のアミノ酸配列の誘導体を含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
5. 少なくとも２つの非弱毒化ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列が追加アミノ酸なしで互いに融合される、請求項１〜４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
6. 少なくとも２つの非弱毒化ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列が少なくとも１つの追加アミノ酸によって隔てられる、請求項１〜５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
7. 少なくとも１つの非弱毒化ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列が、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、ＴａｔおよびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質ではない融合パートナーに融合される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
8. 請求項１〜７のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
9. 核酸がＤＮＡである、請求項８記載の核酸。
10. ＤＮＡからの融合タンパク質の発現が、真核プロモーター、原核プロモーターおよびウイルスプロモーターから選択される調節要素によって制御される、請求項９記載の核酸。
11. ウイルスプロモーターがポックスウイルスプロモーターである、請求項１０記載の核酸。
12. Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖから選択される少なくとも１つの追加ＨＩＶタンパク質のコード配列をさらに含む、請求項８〜１１のいずれか１つに記載の核酸。
13. ＨＩＶ Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖタンパク質のコード配列を含む、請求項１２記載の核酸。
14. 請求項８〜１３のいずれか１つに記載の核酸を含むベクター。
15. ベクターがウイルスベクターである、請求項１４記載のベクター。
16. ウイルスベクターがポックスウイルスベクターである、請求項１５記載のベクター。
17. ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項１６記載のベクター。
18. ワクシニアウイルスベクターが変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である、請求項１７に記載のベクター。
19. ＭＶＡがヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）に受託番号Ｖ００１２０７０７として寄託されているＭＶＡ−５７５、およびＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡ−ＢＮから選択される、請求項１８記載のベクター。
20. 請求項１〜７のいずれか１つに記載のタンパク質を製造する方法であって、
    請求項８〜１３のいずれか１つに記載の核酸もしくは請求項１４記載のベクターを宿主細胞にトランスフェクトする工程、または
    宿主細胞に請求項１５〜１９のいずれか１つに記載のウイルスベクターを感染させる工程と、
    トランスフェクトした宿主細胞または感染させた宿主細胞中で 、融合タンパク質を発現させる工程と、
    融合タンパク質を回収する工程と、
    を含む、上記方法。
21. 請求項８〜１３のいずれか１つに記載の核酸もしくは請求項１４記載のベクターをトランスフェクトするか、または請求項１５〜１９のいずれか１つに記載のウイルスベクターに感染させた宿主細胞。
22. 医薬としての、請求項１〜７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
23. 医薬としての、請求項８〜１３のいずれか１つに記載の核酸。
24. 医薬としての、請求項１４〜１９のいずれか１つに記載のベクター。
25. ワクチンとしての、請求項１〜７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
26. ワクチンとしての、請求項８〜１３のいずれか１つに記載の核酸。
27. ワクチンとしての、請求項１４〜１９のいずれか１つに記載のベクター。
28. 請求項１〜７のいずれか１つに記載の融合タンパク質、請求項８〜１３のいずれか１つに記載の核酸、または請求項１４〜１９のいずれか１つに記載のベクターを含むワクチン。
29. ワクチンの製造を目的とする、請求項１〜７のいずれか１つに記載の融合タンパク質の使用。
30. ワクチンの製造を目的とする、請求項８〜１３のいずれか１つに記載の核酸の使用。
31. ワクチンの製造を目的とする、請求項１４〜１９のいずれか１つに記載のベクターの使用。
    
    

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