WO2015192339A1 - 一种嵌合载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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WO2015192339A1
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protein
rev
rbd
vector
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张辉
潘婷
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中山大学
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    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a protein anticancer drug, and more particularly to a chimeric vector and a preparation method and application thereof.
  • wild-type KRAS is transiently activated by phosphorylation of tyrosine kinases such as active EGFR, and activated KRAS can activate downstream signals in the signaling pathway. Protein, and then KRAS is rapidly inactivated. The KRAS activation/deactivation effect is controlled. However, the mutant KRAS protein causes abnormal protein function, is still activated under the EGFR-free activation signal, and its functional state is uncontrollable, leading to sustained proliferation of the tumor.
  • the RAS gene is like a "switch" in the body, which plays an important regulatory role in the signal transduction pathways of tumor cell growth and angiogenesis.
  • the normal KRAS gene can inhibit the growth of tumor cells, and once a mutation occurs, it will continue to stimulate cell growth and disrupt the growth pattern, leading to tumors. Because the KRAS gene mutation usually occurs in the early stage of tumor malignancy, and the KRAS gene of the primary tumor and metastases is highly consistent; it is generally believed that the KRAS gene status will not change due to treatment. Therefore, detecting KRAS mutations is an important indicator for understanding the status of oncogenes, understanding the developmental prognosis of various cancers, and the efficacy of radiotherapy and chemotherapy. It has extremely important clinical significance.
  • pancreatic cancer In China, pancreatic cancer has always been one of the top ten malignant tumors in China, with a 5-year survival rate of less than 5%, which is one of the worst malignant tumors. In recent years, colorectal cancer has become the second largest cancer killer in Guangdong, with a marked increase, and its morbidity and mortality have also increased significantly year by year. Tumor cells have a RAS gene mutation rate of approximately 25%, while pancreatic cancer, colon cancer, and non-small alveolar lung cancer reach 90%, 45%, and 35%, respectively.
  • Rev regulation of virion protein expression
  • Rev interacts with the RRE of viral mRNA to facilitate extracellular transport of uncut or partially spliced HIV-1 mRNA. If the expression of Rev is inhibited, unspliced or partially spliced HIV-1 mRNA will not be transported extranuclear enough to cause complete degradation in the nucleus, further blocking HIV-1 replication. Therefore, how to inhibit the expression of Rev protein will be an important target for the development of anti-HIV-1 drugs.
  • One of the objects of the present invention is to invent a drug utilizing Vif in HIV-1.
  • a chimeric vector comprising a Vif protein and a functional protein is provided, and the functional protein is
  • One end of the functional protein is linked to a Vif protein.
  • the chimeric vector is obtained by replacing the N-terminus of the Vif protein with a binding domain capable of specifically binding to GTP-Kras.
  • the chimeric vector is named Rev-Vif-C.
  • the chimeric vector was obtained by replacing the multimerization domain of Rev with the N terminus of Vif, and this chimeric vector was named RBD-Vif-C.
  • the protein structure of Sl. Rev has two oligomerization domains, and the two oligomerization domains are substituted for the amino acid sequence of the N-terminal N79 of the Vif protein, thereby constructing three new chimeric proteins R0L1- Vif-C, R0L2-Vif-C and R0L12-Vif-C, the R0L1-Vif-C, including the Rev N terminal An oligomerization domain, wherein the ROL2-Vif-C comprises an oligomerization domain at the Rev C-terminus, and the ROL12-Vif-C comprises two oligomerization domains, a Rev N-terminus and a C-terminus.
  • the oligomerization domain of the Rev N terminus is the amino acids 9-26 of the Rev protein amino acid sequence
  • the oligomerization domain of the Rev C terminus is the amino acids 51-65 of the Rev protein amino acid sequence
  • the two oligomerization domains of the Rev N-terminus and the C-terminus are amino acids 9-65 of the Rev protein amino acid sequence.
  • the Vif-C moiety is amino acids 80-193 of the amino acid sequence of the Vif protein.
  • the three chimeric vectors were cloned into the expression vector pcDNA3.1, and transiently expressed by transfection.
  • the three vector sequences are as follows SEQ NO : 1, SEQ NO: 2
  • the cleavage sites used to ligate the vector to pcDNA3.1 are bamH I and Xhol I.
  • a method for preparing a chimeric vector comprising the steps of:
  • Raf has a RAS binding domain RBD that specifically binds to GTP-KRAS. This RBD domain replaces the N-terminal amino acid sequence of the N-terminus of Vif protein to construct a new chimeric protein RBD- Vif-C ;
  • the chimeric vector was cloned into the expression vector pcDNA3.1 and transiently expressed by transfection.
  • the transmembrane peptide fragment PTD was ligated into the E. coli expression vector of pet-32a.
  • PCR amplification was performed using RBD-Vif-C as a template, and the obtained PCR product RBD-Vif-C was ligated to the expression vector of pet-32a, and the PTD was located at the N-terminus of RBD-Vif-C to form a fusion expression vector.
  • PTD-RBD-Vif-C
  • the culture is to inoculate a transformed single colony of Escherichia coli into an ampicillin-containing LB liquid medium for overnight culture; and then inoculate a 37 ° C pre-warmed ampicillin-containing LB liquid culture at a volume ratio of 1:50.
  • the medium was cultured until the OD600 reached 0.6; the PTD-RBD-Vif-C protein was added to the IPTG to a final concentration of 0.4 mmol/L, and the cells were collected after induction.
  • the purification method comprises washing the total cells with PBS Buffer, resuspending, and sonicating, and then centrifuging at high speed to obtain a lysate supernatant, and purifying by nickel column affinity chromatography to collect the eluted protein.
  • the structure from the N-terminus to the C-terminus is the transmembrane peptide PTD moiety, the KRAS binding site of the RBD, Degraded part of VIF-C.
  • the tumor is a pancreatic cancer tumor, a colorectal cancer tumor or a lung cancer tumor.
  • the Vif protein is an important protein of HIV-1 itself, which binds to the target protein and binds them to an E3 ligase complex (Vif-SCF-CUL5 complex), which then makes the target protein ubiquitin It leads to its degradation in proteasome (proteasome).
  • the present invention focuses on cancers caused by KRAS mutations, and attempts to replace the N-terminal end of Vif with the N-terminal binding domain RBD capable of specifically binding to GTP-Kras, and explores the degradation of this chimeric protein by various experiments in vitro and in vivo. The efficiency and mechanism of action of mutant KRAS.
  • This technical invention is of great significance for the further development of anti-tumor protein drugs. Therefore, our proposed new method for constructing chimeric proteins will most likely become a new anti-tumor new technology with extremely important academic value and practical value.
  • the present invention provides a novel KRAS gene-associated tumor killing technique.
  • the present invention proposes a novel technique for degrading KRAS protein expression.
  • the present invention proposes a novel new technique for specifically degrading a special state or a specially modified protein at the protein level.
  • the present invention proposes a novel new method for degrading a plurality of proteins by inserting a certain protein into a N-terminus of a Vif gene, thereby realizing a specific protein through a ubiquitination pathway at the Vif C-terminus. Degradation process.
  • the present invention provides a new technique for the treatment of pancreatic cancer tumors.
  • the present invention provides a novel technique for treating colorectal cancer (colorectal cancer) tumors.
  • the present invention provides a new technique for the treatment of lung cancer tumors.
  • Vif protein is an important protein of HIV-1 itself, which can bind to target proteins and bind them to an E3 ligase complex (Vif-SCF-CUL5 complex), and then this complex
  • the target protein will be ubiquitinated, resulting in its degradation in the proteasome.
  • the present invention mainly replaces the N-terminus of Vif by the ubiquitination function of Vif protein, so that it can specifically bind to the Rev protein of HIV-1, and then degrade the Rev by the ubiquitination function of Vif. It has a strong novelty and specificity for the purpose of inhibiting the replication of HIV-1, and it provides a new idea and method for the development of anti-HIV-1 drugs.
  • the present invention provides a novel means for protecting cells from HIV-1 attack.
  • the CD4+ T cells in the patient are sorted and expanded in vitro to stably express the Rev-Vif-C vector, and then returned. Infusion into the patient not only protects the patient from the re-attack of HIV-1, but also helps the patient to understand the HIV-1 virus in the body.
  • the present invention proposes a novel new vector against spontaneous mutation of HIV-1.
  • the drug resistance of HIV-1 is mostly due to its drug-induced self-mutation, and our chimeric vector utilizes the Rev self domain. Constructed in combination with each other to avoid possible mutations and thus have a good inhibitory effect on multiple HIV-1 mutants
  • the present invention proposes a new technique for degrading the expression of Rev protein
  • the present invention proposes a novel new technique for degrading a plurality of proteins by inserting a certain protein into a N-terminus of a Vif gene, thereby realizing a specific protein through a ubiquitination pathway at the Vif C-terminus. Degradation process.
  • Figure 1 Construction model of the chimeric vector RBD-Vif-C.
  • Figure 2 Chimeric vector RBD-Vif-C degrades KRAS protein and inhibits its downstream phosphorylation signaling pathway.
  • FIG. 3 PTD-RBD-Vif-C protein has good tumor cell killing effect in vitro.
  • Figure 5 Acute toxicity test of PTD-RBD-Vif-C protein in mice.
  • Figure 6 Construction model of the chimeric vector Rev-Vif-C.
  • Figure 7 Chimeric vector Rev-Vif-C degrades Rev protein via the ubiquitination pathway.
  • Figure 8 The chimeric vector Rev-Vif-C inhibits replication of various wild-type HIV-1 strains by inhibiting the nuclear function of Rev-RRE. Concrete real
  • the N-terminus of the RAF-1 protein has a binding domain RBD (KRAS binding domain) that specifically binds to the mutant KRAS, which can specifically bind to the mutant KRAS protein in vitro and in vivo, and its GTP -
  • RBD KRAS binding domain
  • the affinity of Kras combined with GDP-Kras is 1000 times different.
  • Raf protein structure has a RAS binding domain RBD that specifically binds to GTP-KRAS, and this RBD domain replaces the N-terminal amino acid sequence of the N-terminus of Vif protein, thereby constructing a new chimeric protein RBD- Vif-C
  • the vector construction comprises the following steps: according to HIV-1 Vif protein and The KRAS protein was synthesized into two pairs of primers, and then the PCR sequence of the HIV-1 virus P L4-3 plasmid was used as a template, and the above primers were used for PCR amplification; then the PCR amplification product was cloned into pcDNA3.1 by using different enzyme cleavage sites. Above, where the fragment insertion position of the RBD is at the N-terminus of the Vif fragment.
  • the culture is to inoculate a single colony of the transformed Escherichia coli into the liquid medium containing ampicillin LB for overnight; and then inoculate the ampicillin-containing LB liquid preheated at 37 ° C in a volume ratio of 1:50.
  • the medium was cultured to an OD600 of 0.6; the PTD-RBD-Vif-C protein was added to IPTG to a final concentration of 0.4 mmol/L, and the cells were collected after induction.
  • the purification method is to wash the total cells with PBS Buffer, resuspend, and after ultrasonication, obtain the lysate supernatant by high-speed centrifugation, and purify by nickel column affinity chromatography to collect the eluted protein. .
  • Example 2 Chimeric Vector RBD-Vif-C Degrades KRAS Protein and Inhibits Its Downstream Phosphorylation Signaling Pathway
  • the mutant KRAS genes KRAS-G12D and KRAS-G12V were fused to the RFP gene and cloned into the vector of pcDNA3.1, so that the expression of KRAS could be reflected by observing the expression of RFP. Further verification was performed by western blot. The expression of KRAS.
  • KRAS-G12D and RBD-Vif-C plasmids were transfected into 293t cells in 6-well plates. After 48h, cell lysis was performed for Western Blot detection of ERK and phosphorylated ERK expression.
  • PTD-RBD-Vif-C protein or PTD-GFP-Vif-C protein after 48 hours of treatment, observe and record the growth state of various cells under the microscope.
  • mice Six male Balb/c nude mice, 4-6 weeks old, were ordered at the Animal Experimental Center of Sun Yat-sen University. Randomly divide them into 2 groups of 3 each. Then, 1 X 106 Panc-1 and A549 cells were inoculated subcutaneously into mice, and after 2 weeks, the subcutaneous tumor formation was observed and PT injections of PTD-RBD-Vif-C protein were started 2-3 times a week. PTD-GFP-Vif-C protein, 4 weeks later, the mice were sacrificed and the tumor tissues were observed and recorded.
  • This experiment demonstrates that a protein at a dose of 20 mg/kg is non-toxic and safe for mice, and the protein has good drug-forming properties.
  • the two oligomerization binding domains (amino acids 9-26 and 51-65 amino acids) on the HIV-1 Rev gene were cloned into the N-terminus of the Vif gene, respectively, and replaced with the binding site of APOBEC3G (1- The amino acid at position 79) was then ligated into the vector of pcDNA3.1 to form three different chimeric chimeras, designated R0L1-Vif-C, ROL2-Vif-C, ROL12-Vif-C.
  • ROL1 represents the oligomerization binding domain of the N-terminal portion of Rev, ie amino acids 9-26
  • ROL2 represents the oligomerization binding domain of the C-terminal portion of Rev, ie amino acids 51-65
  • ROL12 represents tandem Two oligomerization binding domains at the N-terminus and C-terminus of Rev, namely amino acids 9-26 and amino acids 51-65.
  • Rev has two oligomerization domains, and the two oligomerization domains are replaced by the N-terminal amino acid sequence of the N-terminal of the Vif protein, thereby constructing three new chimeric proteins ROL1. -Vif-C
  • the vector construction comprises the steps of: synthesizing four pairs of primers according to the Vif protein and the Rev protein of HIV-1, and then using the P L4-3 plasmid sequence of the HIV-1 virus as a template.
  • the above primers were subjected to PCR amplification; then the PCR amplification products were cloned into pcDNA3.1 using different restriction sites, wherein the fragment insertion position of the Rev was at the N-terminus of the Vif fragment.
  • the HIV-1 Rev gene was fused to RFP and cloned into the vector of pcDNA3.1, so that the expression of Rev can be reflected by observing the expression of RFP.
  • the Rev gene and the HA tag are fused and expressed, which is convenient for western blot. Verify the expression of Rev.
  • Rev-RFP and ROL1-Vif-C (or ROL2-Vif-C or ROL12-Vif-C) vectors were co-transfected into 293t cells in 24-well plates at a dose of 1: 0, 1 : 1, 1: 2, 1: 3, the expression of RFP was observed after transfection for 48h, and Rev-HA and ROLl-Vif-C vectors were co-transfected into 293t cells of 6-well plate.
  • the amount of plasmid was 1 : 0, 1: 1, 1: 2, 1: 3, transfected for 48h after transfection, and the expression of Rev was detected by Western Blot.
  • Example 8 Chimeric Vector Rev-Vif-C inhibits replication of various wild-type HIV-1 strains by inhibiting the nuclear function of Rev-RRE

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Abstract

本发明提供一种嵌合载体，由Vif蛋白和功能性蛋白连接形成，所述的功能性蛋白为Raf蛋白或Rev蛋白。本研究通过设计并构建Rev-Vif-C载体，然后通过多种实验证明Rev-Vif-C载体具有良好的抗病毒效果，提出了一种新的针对 HIV-1的Rev蛋白的抗病毒技术。另外，本研究通过设计并构建RBD-Vif-C载体，然后通过细胞水平的体外实验和裸鼠肿瘤模型的体内实验证明RBD-Vif-C载体具有良好的肿瘤细胞杀伤效果，提出了一种特异性针对突变型KRAS的新型抗肿瘤技术。

Description

一种嵌合载体及其制备旅和应用
技术领域
本发明涉及蛋白抗癌药物， 更具体地， 涉及一种嵌合载体及其制备方法和应 用。
背景技术
一直以来，控制细胞生长分化中的表达或功能的细胞基因组中如果发生改变 都被认为是诱发肿瘤的主要原因。肿瘤的分子生物学研究旨在确定那些在各种肿 瘤类型的基因改变， 并阐明这些基因在肿瘤发生中的作用。其中， 最常见的人类 肿瘤突变的基因家族之一就是 RAS基因。
正常生理情况下，在细胞受到外界剌激后激活 EGFR等信号通路时，野生型 的 KRAS被活性 EGFR等酪氨酸激酶磷酸化后短暂活化， 活化后的 KRAS可以 激活该信号通路中的下游信号蛋白， 而后 KRAS迅速失活。 KRAS激活 /失活效 应是受控的。 然而， 突变型 KRAS蛋白导致蛋白功能异常， 在无 EGFR活化信 号剌激下仍处于激活状态， 其功能状态不可控， 导致肿瘤的持续增殖等。 RAS 基因就像体内的一个 "开关"， 它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传 导通路中起着重要调控作用。 正常的 KRAS基因可抑制肿瘤细胞生长， 而一旦 发生突变， 它就会持续剌激细胞生长， 打乱生长规律， 从而导致肿瘤的发生。因 为 KRAS基因突变一般发生在肿瘤恶变的早期， 并且原发灶和转移灶的 KRAS 基因高度保持一致； 一般认为， KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。 因此， 检测 KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、 了解各种癌症的发展预后和放 化疗疗效的重要指标， 具有极其重要的临床意义。
在我国， 胰腺癌一直以来都是我国人口死亡的十大恶性肿瘤之一， 5年生存 率不到 5%， 是预后最差的恶性肿瘤之一。 近年来， 在广东地区， 大肠癌已经成 为第二大癌症杀手， 有明显增加的趋势， 其发病率和死亡率也明显逐年上升。肿 瘤细胞 RAS基因突变率大约为 25%， 而胰腺癌， 结肠癌和非小肺泡肺癌中分别 达到 90%, 45%和 35%。
在 20世纪 70年代末 80年代初， 欧洲和美国出现了一种以免疫系统功能障 碍为主要特征的疾病。随后，各国科学家就开始了对其致病原因以及治疗方案的 探寻。 直到 1983年， 法国巴斯德研究小组最先成功分离出了这种新的逆转录病 毒之后， 人们对于 HIV-1的理论研究以及医学治疗也随之越来越多。 目前， 针对 HIV-1的药物主要作用于病毒生活周期中不同环节， 尤其是一些所必需的酶类如 逆转录酶及蛋白酶。
尽管目前市场上有很多抗 HIV-1的药物， HARRT的广泛应用， 但是随之产 生的耐药性、 巨额的医药费用、 药物的副作用等问题也不容小觑。 HAART虽然 可以使相当一部分患者血浆病毒载量降至所能检测的水平以下，但停药后反弹及 严重的毒副作用尚未能解决； 基因治疗虽然显示了其抗病毒的潜力， 并有部分研 究成果进入临床试验阶段， 但其效率低、外源载体可能带来的不良反应等仍是研 发的一个主要障碍。 目前， 国际上抗 HIV-1药物的研发主要有四个热点： 一是进 入细胞抑制剂； 二是中和抗体； 三是整合酶抑制剂； 四是化学趋化因子受体拮抗 剂。 科学家们仍然在继续努力探索更加安全有效、 更加经济适用的抗病毒药物。
病毒颗粒蛋白表达调节因子 Rev ( regulation of virion protein expression ) 是 HIV-1转录过程中不可缺少的调控蛋白。 Rev与病毒 mRNA的 RRE相互作用， 从而帮助未剪切或部分剪切的 HIV-1 mRNA向核外转运。 如果 Rev的表达受到 抑制， 未剪接或部分剪接的 HIV-1 mRNA将不能向核外转运而导致其在核内完 全降解， 进一步阻断 HIV-1的复制。 因此， 如何抑制 Rev蛋白的表达， 将是研发 抗 HIV-1药物的一个重要靶点。
发明内容
本发明的目的之一发明一种利用 HIV-1中的 Vif的药物。
首先提供一种嵌合载体， 包括 Vif蛋白和功能性蛋白， 所述的功能性蛋白为
Ra/蛋白或 Rev 蛋白。
所述的功能性蛋白的一端和 Vif蛋白连接。
所述的嵌合载体是通过将能够与 GTP-Kras特异性结合的 ? 蛋白 N端的结 合结构域替换 Vif蛋白的 N端所得， 这一种嵌合载体命名为 Rev-Vif-C。
所述的嵌合载体是将 Rev的多聚化结构域替换 Vif的 N端所得，这一种嵌合 载体命名为 RBD-Vif-C。
更进一步提供一种嵌合载体的制备方法， 包括以下步骤：
Sl . Rev的蛋白结构上有两个寡聚化结构域， 分别将这两个寡聚化结构域替 换 Vif 蛋白 N端的 1-79 位氨基酸序列， 从而构建了三个新的嵌合蛋白 R0L1-Vif-C、 R0L2-Vif-C和 R0L12-Vif-C, 所述的 R0L1-Vif-C,包含 Rev N端的 寡聚化结构域， 所述的 ROL2-Vif-C包含 Rev C端的寡聚化结构域， 所述的 ROL12-Vif-C包含 Rev N端和 C端两个寡聚化结构域，
所述的 Rev N端的寡聚化结构域为 Rev蛋白氨基酸序列的第 9-26位氨基酸， 所述的 Rev C端的寡聚化结构域为 Rev蛋白氨基酸序列的第 51-65位氨基酸， 所述的 Rev N端和 C端两个寡聚化结构域为 Rev蛋白氨基酸序列的第 9-65位氨 基酸。
所述的 Vif-C部分为 Vif蛋白氨基酸序列的第 80-193位氨基酸
S2. 将这三个嵌合载体分别克隆到表达载体 pcDNA3.1上， 通过转染进行瞬 时表达， 其中， S 1中， 所述的 3个载体序列如下 SEQ NO : 1、 SEQ N0 : 2禾 P SEQ N0 : 3 所示， 将载体连接到 pcDNA3.1上所用的酶切位点是 bamH I and Xhol I。
再提供一种嵌合载体的制备方法， 包括以下步骤：
S I . Raf的蛋白结构上有一个特异性结合 GTP-KRAS的 RAS结合结构域 RBD， 将这个 RBD结构域替换 Vif蛋白 N端的 1-79 位氨基酸序列，从而构建了一个新 的嵌合蛋白 RBD-Vif-C ;
S2. 将嵌合载体克隆到表达载体 pcDNA3.1上， 通过转染进行瞬时表达，
53. 将跨膜肽片段 PTD连接到 pet-32a的大肠杆菌表达载体上，
54.以 RBD-Vif-C为模板进行 PCR扩增，得到的 PCR产物 RBD-Vif-C连接到 pet-32a的表达载体上， 并且 PTD位于 RBD-Vif-C的 N端， 形成融合表达载体 PTD-RBD-Vif-C,
S5. 将 PTD-RBD-Vif-C的质粒转化到大肠杆菌 BL21(DE3)中，
56. 对转化的大肠杆菌进行培养，
57. 经镍柱纯化， 得到单一的 PTD-RBD-Vif-C蛋白，
其中， S6中， 所述培养是将转化的大肠杆菌单菌落接种至含氨苄青霉素 LB 液体培养基中培养过夜； 再按 1 :50体积比接种到 37 °C预热的含氨苄青霉素 LB 液体培养基中培养至 OD600达 0.6;表达 PTD-RBD-Vif-C蛋白加入 IPTG至终浓 度为 0.4mmol/L， 经诱导后收集菌体，
S7中， 所述纯化的方法是将总菌体用 PBS Buffer洗涤， 重悬， 超声处理后， 高速离心获得裂解上清液， 经镍柱亲和层析纯化， 收集洗脱的蛋白。
所述的融合表达载体 PTD-RBD-Vif-C的序列如 SEQ NO : 4所示，
从 N端到 C端的结构分别为， 跨膜肽 PTD部分， RBD的 KRAS结合部位， VIF-C的降解部分。
提供其中一种的嵌合载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤为胰腺癌肿瘤、 大肠癌肿瘤或肺癌肿瘤。
提供其中一种的嵌合载体在制备降解突变 KRAS的药物中的应用。
提供其中一种的嵌合载体在制备抗 HIV药物中的应用。
提供其中一种的嵌合载体在制备抑制 HIV复制药物中的应用。
Vif蛋白是 HIV-1 自身的一个重要蛋白， 可以结合靶标蛋白， 把它们连结到 一个 E3连接酶 （ligase) 复合物 （Vif-SCF-CUL5 complex)上， 然后这个复合物 将使靶标蛋白泛素化， 从而导致其在 proteasome (蛋白酶体） 中的降解。 本发明 重点关注 KRAS突变引发的相关癌症， 试图将能够与 GTP-Kras特异性结合的 Raf蛋白 N端的结合结构域 RBD替换 Vif的 N端， 通过体内体外等多种试验探 索此嵌合型蛋白降解突变型 KRAS的效率和作用机理。 这一技术发明对进一步 研发抗肿瘤的蛋白类药物具有十分重要的意义。因此， 我们提出的这种新的构建 嵌合蛋白的方法， 将极有可能成为一种新的抗肿瘤的新技术， 具有极为重要的学 术价值和实用价值。
( 1 ) 为了克服现有技术的缺点与不足， 本发明的目的在于提供一种新型的 嵌合载体的构建的方法及其在生命科学研究及肿瘤的临床治疗中的应用。
(2) 本发明提供了一种全新的 KRAS基因相关的肿瘤杀伤技术。
(3 ) 本发明提出了一种降解 KRAS蛋白表达的新技术。
(4) 本发明提出了一种全新的在蛋白水平上可以特异性降解特殊状态或者 特殊修饰的蛋白的新技术。
( 5 ) 本发明提出了一种新的降解多种蛋白的新手段——将某种蛋白的结合 为点插入到 Vif基因的 N端， 从而通过 Vif C端的泛素化通路实现特异性蛋白的 降解过程。
(6) 本发明提供了一种新的技术在治疗胰腺癌肿瘤中的应用。
(7)本发明提供了一种新的技术在治疗大肠癌（结直肠癌）肿瘤中的应用。
( 8) 本发明提供了一种新的技术在治疗肺癌肿瘤中的应用。
针对另外一个技术方案
Vif蛋白是 HIV-1 自身的一个重要蛋白， 可以结合靶标蛋白， 把它们连结到 一个 E3连接酶 （ligase) 复合物 （Vif-SCF-CUL5 complex)上， 然后这个复合物 将使靶标蛋白泛素化， 从而导致其在 proteasome (蛋白酶体） 中的降解。 本发明 主要根据 Vif蛋白的泛素化功能， 将 Rev的多聚化结构域替换 Vif的 N端， 使其 能够特异性地结合 HIV-1的 Rev蛋白， 然后通过 Vif的泛素化功能降解 Rev, 以 己之矛攻己之盾，从而达到抑制 HIV-1复制的目地，具有很强的新颖性和特异性， 这也为研发抗 HIV-1药物提供了一种全新的思路和方法。
( 1 ) 为了克服现有技术的缺点与不足， 本发明的目的在于提供一种新型的 嵌合载体的构建的方法及其在生命科学研究及临床治疗中的应用。
(2) 本发明提供了一种保护细胞不受 HIV-1攻击的新手段， 将患者体内的 CD4+T细胞分选出来体外扩增后， 使其稳定表达 Rev-Vif-C载体，然后回输患者 体内， 不仅可以保护患者免受 HIV-1的再次攻击， 同时还能辅助患者清楚体内的 HIV-1病毒。
( 3 ) 本发明提出了一种全新的抗 HIV-1 自发突变的新载体一一 HIV-1的耐 药性多因其药物引起的自我突变，而我们的嵌合载体是利用 Rev自身结构域的相 互结合而构建， 可以避免可能的各种突变， 因而能对多个 HIV-1突变株有很好的 抑制效果
(4) 本发明提出了一种降解 Rev蛋白表达的新技术
( 5 ) 本发明提出了一种新的降解多种蛋白的新技术——将某种蛋白的结合 为点插入到 Vif基因的 N端， 从而通过 Vif C端的泛素化通路实现特异性蛋白的 降解过程。
附图说明
图 1： 嵌合载体 RBD-Vif-C的构建模型。
图 2: 嵌合载体 RBD-Vif-C可以降解 KRAS蛋白， 并抑制其下游磷酸化信号通 路。
图 3 : PTD-RBD-Vif-C蛋白在体外具有良好的肿瘤细胞杀伤作用。
图 4: PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内具有良好的抗肿瘤效果。
图 5: PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内的急毒实验。
图 6: 嵌合载体 Rev-Vif-C的构建模型。
图 7： 嵌合载体 Rev-Vif-C通过泛素化通路降解 Rev蛋白。
图 8： 嵌合载体 Rev-Vif-C通过抑制 Rev-RRE的出核功能抑制多种野生型 HIV-1 病毒株的复制。 具体实 式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明， 本发明 采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。 实施例 1 嵌合载体 RBD-Vif-C的构建模型
众所周知， 胰腺癌、 肺癌、 结肠癌等多种肿瘤的发生与 KRAS基因的突变 有莫大的关联。 KRAS的单个点突变就足以导致肿瘤的发生， 其中 KRAS的第 12位氨基酸的突变占了 KRAS单点突变的 98%，而在这第 12位氨基酸的突变种 类中又分别抑 G12V和 G12D突变最为显著， 分别占了 30%和 51%。 我们利用 Vif诱导靶蛋白的降解机制实现对突变型 KRAS蛋白的特异性降解， 从而研发新 型的抗肿瘤的药物。
根据查阅文献了解到， RAF-1蛋白的 N-端存在一个特异性结合突变型 KRAS 的结合结构域 RBD (KRAS binding domain), 它在体内体外都可以特异地结合突 变型 KRAS蛋白， 其对 GTP-Kras与 GDP-Kras结合的亲和力的差别达 1000倍。 于是， 我们将 RBD替换 Vif蛋白的 N端， 然后连接到 pcDNA3.1的载体上形成 了 RBD-Vif-C嵌合载体。
具体方法如下：
( D Raf的蛋白结构上有一个特异性结合 GTP-KRAS的 RAS结合结构域 RBD， 将这个 RBD结构域替换 Vif蛋白 N端的 1-79 位氨基酸序列，从而构建了一个新 的嵌合蛋白 RBD-Vif-C
(2) 将这三个嵌合载体分别克隆到表达载体 pcDNA3.1上， 通过转染进行瞬时 表达
( 3 ) 从公司合成跨膜肽片段 PTD， 然后将其连接到 pet-32a的大肠杆菌表达载 体上
( 4 ) 以 RBD-Vif-C为模板进行 PCR扩增， 得到的 PCR产物 RBD-Vif-C连接到 pet-32a的表达载体上， 并且 PTD位于 RBD-Vif-C的 N端， 形成融合表达载体
PTD-RBD-Vif-C
( 5 ) 将 PTD-RBD-Vif-C的质粒转化到大肠杆菌 BL21(DE3;>中
(6) 对转化的大肠杆菌进行培养
(7) 经镍柱纯化， 得到单一的 PTD-RBD-Vif-C蛋白
其中， 步骤 （1 ) 中， 所述的载体构建包括以下步骤： 根据 HIV-1的 Vif蛋白和 KRAS蛋白分别合成 2对引物， 然后以 HIV-1病毒的 P L4-3质粒序列为模板， 利用上述引物进行 PCR扩增； 然后利用不同的酶切位点将 PCR扩增产物克隆到 pcDNA3.1上， 其中 RBD的片段插入位置在 Vif片段的 N端。
步骤 （6) 中， 所述培养是将转化的大肠杆菌单菌落接种至含氨苄青霉素 LB液 体培养基中培养过夜； 再按 1 :50体积比接种到 37°C预热的含氨苄青霉素 LB液 体培养基中培养至 OD600达 0.6;表达 PTD-RBD-Vif-C蛋白加入 IPTG至终浓度 为 0.4mmol/L， 经诱导后收集菌体。
步骤 （7) 中， 所述纯化的方法是将总菌体用 PBS Buffer洗涤， 重悬， 超声处理 后， 高速离心获得裂解上清液， 经镍柱亲和层析纯化， 收集洗脱的蛋白。
实施例 2 嵌合载体 RBD-Vif-C可以降解 KRAS蛋白，并抑制其下游磷酸化信号 通路
将突变型的 KRAS基因 KRAS-G12D和 KRAS-G12V分别与 RFP基因融合 表达并克隆到 pcDNA3.1的载体上，这样可以通过观察 RFP的表达来反映 KRAS 的表达情况； 同时用 western blot来进一步验证 KRAS的表达情况。
( 1 )在 6孔板的 293t细胞中， 共转染 KRAS-G12D-RFP和 RBD-Vif-C载体 或 KRAS-G12V-RFP和 RBD-Vif-C载体， 质粒的量均为 1 ug， 转染 48h后观察 RFP的表达； 同时收细胞裂解做 Western Blot检测 KRAS的表达
该实验说明了， RBD-Vif-C可以降解突变型的 KRAS蛋白。
(2)在 6孔板的 293t细胞中转染 KRAS-G12D和 RBD-Vif-C质粒， 48h后收 细胞裂解做 Western Blot检测 ERK及磷酸化的 ERK的表达情况
该实验说明了， RBD-Vif-C可以通过降解 KRAS蛋白来抑制其下游的磷酸化的信 号通路。
实施例 3 PTD-RBD-Vif-C蛋白在体外具有良好的肿瘤细胞杀伤作用
考虑到胰腺癌、肺癌和大肠癌细胞质粒系统转染效率低等因素， 以及后续的 蛋白成药性因素， 于是， 我们选择用大肠杆菌来表达相应的 RBD-Vif-C蛋白， 同时选择 GFP-Vif-C作为阴性对照蛋白， 试图直接通过蛋白的作用方式来验证 RBD-Vif-C对 KRAS基因的表达抑制。
我们首先参考相关文献的方法， 合成了一个可以高效跨膜的短肽 PTD， 序 列如图所示。然后，我们将跨膜肽和 RBD-Vif-C—起克隆到 pET-32a原核表达载 体上， 通过原核系统表达 RBD-Vif-C蛋白。 我们采用镍柱纯化带 His-tag的 PTD-RBD-Vif-C蛋白， 通过多番优化后得到纯度相对较高的蛋白， 如图 3-13所 示。 然后， 我们又进一步通过 Triton X-114的方法去除蛋白中的内毒素。 因为蛋 白本身具有跨膜肽， 所以我们可以直接将纯化好的蛋白加入到细胞培养上清中， 这为我们后续的实验提供了较大的便利。
( 1 ) 将多种细胞铺板到 24孔板中， 待细胞贴壁后， 分别加入 4ug/Well的
PTD-RBD-Vif-C蛋白或 PTD-GFP-Vif-C蛋白， 处理 48h后， 显微镜下观察并记 录各种细胞的生长状态
该实验说明了， PTD-RBD-Vif-C蛋白可以抑制多种 KRAS相关的肿瘤细胞的增 殖。
(2)在 24孔板的 Panc-1和 A549细胞中， 分别加入 0 ug/well， 2 ug/well ，
4 ug/well ， 8 ug/well的 PTD-RBD-Vif-C蛋白， 处理 48h后， 收集细胞， 标记 Annexin-V FITC的流式抗体， 检测两种细胞的凋亡情况
该实验说明了， PTD-RBD-Vif-C蛋白可以诱导 KRAS相关的肿瘤细胞发生凋亡， 并具有一定的浓度梯度依赖性。
( 3 )在 6孔板的 Panc-1和 A549细胞中， 分别加入 2 ug/well 的 PTD-GFP-Vif-C 蛋白禾 P 2 ug/well的 PTD-RBD-Vif-C蛋白， 处理 12h后， 收集细胞裂解做 WB检 测两种细胞内源性的 KRAS的表达情况
该实验说明了， PTD-RBD-Vif-C蛋白可以抑制内源性的 KRAS基因表达。
实施例 4 PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内具有良好的抗肿瘤效果
在中山大学动物实验中心订购 4-6周大小的雄性 Balb/c裸鼠 6只。随机的将 他们分成 2组， 每组 3只。 然后分别将 1 X 106的 Panc-1和 A549细胞接种到小 鼠皮下成瘤， 2周后观察小鼠皮下成瘤的现象并开始每周注射 2-3 次 PTD-RBD-Vif-C蛋白和 PTD-GFP-Vif-C蛋白， 4周后处死小鼠取肿瘤组织观察并 记录称重
该实验说明了， PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内具有良好的抗肿瘤效果，尤 其是在胰腺癌和肺癌的肿瘤细胞中。
实施例 5 PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内的急毒实验
( 1 ) 在中山大学动物实验中心订购 4-6周大小的雄性 Balb/c小鼠 18只。随 机的将他们分成 3组， 每组 6只
(2) 以尾静脉注射的方式将 PTD-RBD-Vif-C蛋白注入小鼠体内， 注射量分 别为 0mg/kg(PBS)， lOmg/kg, 20mg/kg, 每组 6只小鼠
(3 ) 两周后， 取小鼠血样检测肝功能和肾功能， 实验结果显示正常
(4)处死后， 取小鼠心肝脾肺肾各个组织样本， HE染色， 观测是否有器官 发生病变
该实验说明了， 20mg/kg剂量的蛋白对小鼠是无毒安全的， 该蛋白具有较好 的成药性。
实施例 6 嵌合载体 Rev-Vif-C的构建模型
将 HIV-1 Rev基因上的两个寡聚化结合结构域（第 9-26位氨基酸和第 51-65氨基 酸）分别克隆到 Vif基因的 N端， 替换到 APOBEC3G的结合位点 （第 1-79位氨 基酸）， 然后连接到 pcDNA3.1的载体上形成了 3个不同的嵌合嵌合， 分别命名 为 R0L1-Vif-C， ROL2-Vif-C, ROL12-Vif-C。 其中 ROL1代表 Rev的 N端部分 的寡聚化结合结构域， 即第 9-26位氨基酸； ROL2代表 Rev的 C端部分的寡聚 化结合结构域， 即第 51-65位氨基酸； ROL12代表串联 Rev的 N端和 C端的两 个寡聚化结合结构域， 即第 9-26位氨基酸和第 51-65位氨基酸。
具体步骤如下：
( 1 ) Rev的蛋白结构上有两个寡聚化结构域， 分别将这两个寡聚化结构域替换 Vif蛋白 N端的 1-79 位氨基酸序列， 从而构建了三个新的嵌合蛋白 ROLl-Vif-C
(包含 Rev N端的寡聚化结构域， 即第 9-26位氨基酸）、 ROL2-Vif-C (包含 Rev C端的寡聚化结构域， 即第 51-65位氨基酸） 和 ROL12-Vif-C (包含 Rev N端和 C端两个寡聚化结构域， 即第 9-65位氨基酸）
(2) 将这三个嵌合载体分别克隆到表达载体 pcDNA3.1上， 通过转染进行瞬时 表达
其中， 步骤 （1 ) 中， 所述的载体构建包括以下步骤： 根据 HIV-1的 Vif蛋白 和 Rev蛋白分别合成 4对引物， 然后以 HIV-1病毒的 P L4-3质粒序列为模板， 利用上述引物进行 PCR扩增； 然后利用不同的酶切位点将 PCR扩增产物克隆到 pcDNA3.1上， 其中 Rev的片段插入位置在 Vif片段的 N端。
实施例 7 嵌合载体 Rev-Vif-C通过泛素化通路降解 Rev蛋白
将 HIV-1 Rev基因与 RFP融合表达并克隆到 pcDNA3.1的载体上，这样可以通过 观察 RFP的表达来反映 Rev的表达情况； 同时将 Rev基因与 HA标签融合表达， 方便做 western blot来进一步验证 Rev的表达情况。 ( 1 )在 24孔板的 293t细胞中，共转染 Rev-RFP和 ROLl-Vif-C (或 ROL2-Vif-C 或 ROL12-Vif-C) 载体， 质粒的量分别为 1 : 0， 1： 1， 1： 2， 1： 3， 转染 48h 后观察 RFP的表达，同时在 6孔板的 293t细胞中，共转染 Rev-HA和 ROLl-Vif-C 载体， 质粒的量分别为 1 : 0， 1： 1， 1： 2， 1： 3， 转染 48h后转染收细胞裂解 做 Western Blot检测 Rev的表达
该实验说明了，三个嵌合载体都可以抑制 Rev蛋白的表达，并且具有一定的浓度 梯度依赖性。
(2) 在 24孔板的 293t细胞中， 共转染 200 ng Rev-RFP和 200 ng ROL12-Vif-C 载体， 24 h后加入 10 uM的 MG132处理细胞， 处理 12 h后观察 RFP的表达 ( 3 ) 在 24孔板的 293t细胞中， 共转染 200 ng Rev-RFP和 200 ng ROL 12- Vif-C 载体， 6h后再转染 50 nM的 si-NC， si-ElonginB, si-ElonginC以及 si-Culin5，转 染 48h后观察 RFP的表达
(4) 在 6cm板的 293t细胞中， 分别共转染 3 ug Ub-Flag， 3 ug Rev-HA和 2 ug ROL 1 -Vif-C ROL2- Vif-C ROL 12- Vif-C载体， 转染 48h后收细胞裂解做 Co-IP 富集 Rev-HA蛋白， 并进一步检测 Rev蛋白的泛素化情况
以上三个实验说明了， 嵌合载体是通过 Vif介导的泛素化通路降解 Rev蛋白。 实施例 8 嵌合载体 Rev-Vif-C通过抑制 Rev-RRE的出核功能抑制多种野生型 HIV-1病毒株的复制
PDM628上存在 SD和 SA剪切位点， 当 Rev蛋白不存在时， PDM 628上携带的 luciferase基因被剪辑， 导致荧光素酶微量表达； 当两种质粒共转时， Rev和 RRE 结合， 将 luciferase基因片段带出细胞核， 避免被 SD和 SA剪辑， 使荧光素酶大 量表达。 因此， 当 Rev蛋白表达收到抑制时， Rev-RRE相关的出核转运系统将 受到抑制， 此时荧光素酶的表达量将下降。基于此原理， 可以判断 Rev蛋白的功 能是否会受到影响。
( 1 ) 在 96孔板的 293t细胞中， 分别共转染 10 ng pDM628质粒和 10 ng的 Rev 质粒，然后再共转染不同浓度的 R0L1-Vif-C、 ROL2- Vif-C ROL 12- Vif-C及 M10 质粒， 转染 48h后收细胞裂解检测 luciferase的表达情况
该实验说明了， 三个嵌合载体都可以抑制 Rev-RRE相关出核转运系统， 并且具 有一定的浓度梯度依赖性， 同时， 我们的嵌合载体的效果要明显优于已有的 RevMlO突变体。 (2) 在 24孔板的 293t细胞中， 分别共转染 50ngP L4-3质粒和不同浓度的 R0L1-Vif-C、 ROL2-Vif-C ROL12-Vif-C质粒 （50ng， 100 ng, 150 ng), 转染 48h后收上清 ELISA检测 P24的表达情况 （B) 在 24孔板的 293t细胞中， 分别 共转染 50 ng PYU-2质粒和不同浓度的 R0L1-Vif-C、 ROL2-Vif-C、 ROL12-Vif-C 质粒 （50ng， 100 ng, 150 ng), 转染 48h后收上清 ELISA检测 P24的表达情况 该实验说明了， 三个嵌合载体都可以抑制多种不同的野生型 HIV-1的复制， 并且 具有一定的浓度梯度依赖性。

Claims

权 利 要 求 书
1. 一种嵌合载体， 其特征在于， 包括 Vif蛋白和功能性蛋白， 所述的功能性蛋白 为 Ra/蛋白或 Rev 蛋白。
2. 根据权利要求 1所述的嵌合载体， 其特征在于， 所述的功能性蛋白的一端和 Vif蛋白连接。
3. 根据权利要求 1所述的嵌合载体， 其特征在于， 所述的嵌合载体是通过将能 够与 GTP-Kras特异性结合的 Raf 白 N端的结合结构域替换 Vif蛋白的 N端所 得。
4. 根据权利要求 1所述的嵌合载体， 其特征在于， 所述的嵌合载体是将 Rev的 多聚化结构域替换 Vif的 N端所得。
5.—种根据权利要求 3所述的嵌合载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
6. 根据权利要求 5所述的应用， 其特征在于， 所述的肿瘤为胰腺癌肿瘤、 大肠 癌肿瘤或肺癌肿瘤。
7. 一种根据权利要求 3所述的嵌合载体在制备降解突变 KRAS的药物中的应用。 8. 一种根据权利要求 4所述的嵌合载体在制备抗 HIV药物中的应用。
9. 一种根据权利要求 4所述的嵌合载体在制备抑制 HIV复制药物中的应用。
10. 一种嵌合载体的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤：
51. Rev的蛋白结构上有两个寡聚化结构域， 分别将这两个寡聚化结构域替 换 Vif 蛋白 N端的 1-79 位氨基酸序列， 从而构建了三个新的嵌合蛋白 ROLl-Vif-C、 ROL2-Vif-C和 ROL12-Vif-C, 所述的 ROLl-Vif-C,包含 Rev N端的 寡聚化结构域， 所述的 ROL2-Vif-C包含 Rev C端的寡聚化结构域， 所述的 ROL12-Vif-C包含 Rev N端和 C端两个寡聚化结构域，
所述的 Rev N端的寡聚化结构域为 Rev蛋白氨基酸序列的第 9-26位氨基酸， 所述的 Rev C端的寡聚化结构域为 Rev蛋白氨基酸序列的第 51-65位氨基酸， 所述的 Rev N端和 C端两个寡聚化结构域为 Rev蛋白氨基酸序列的第 9-65位氨 基酸，
所述的 Vif-C部分为 Vif蛋白氨基酸序列的第 80-193位氨基酸，
52. 将这三个嵌合载体分别克隆到表达载体 pcDNA3.1上， 通过转染进行瞬 时表达， 其中， S 1中， 所述的 3个载体序列如下 SEQ NO : 1、 SEQ N0 : 2禾 P SEQ N0 : 3 所示， 将载体连接到 pcDNA3.1上所用的酶切位点是 bamH I and Xhol I。
11. 一种嵌合载体的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤
S I . Raf 的蛋白结构上有一个特异性结合 GTP-KRAS的 RAS结合结构域 RBD , 将这个 RBD结构域替换 Vif蛋白 N端的 1-79 位氨基酸序列， 从而构建 了一个新的嵌合蛋白 RBD-Vif-C;
S2. 将嵌合载体克隆到表达载体 pcDNA3.1上， 通过转染进行瞬时表达，
53. 将跨膜肽片段 PTD连接到 pet-32a的大肠杆菌表达载体上，
54.以 RBD-Vif-C为模板进行 PCR扩增，得到的 PCR产物 RBD-Vif-C连接到 pet-32a的表达载体上， 并且 PTD位于 RBD-Vif-C的 N端， 形成融合表达载体 PTD-RBD-Vif-C,
S5. 将 PTD-RBD-Vif-C的质粒转化到大肠杆菌 BL21(DE3)中，
56. 对转化的大肠杆菌进行培养，
57. 经镍柱纯化， 得到单一的 PTD-RBD-Vif-C蛋白，
其中， S6中， 所述培养是将转化的大肠杆菌单菌落接种至含氨苄青霉素 LB 液体培养基中培养过夜； 再按 1 :50体积比接种到 37 °C预热的含氨苄青霉素 LB 液体培养基中培养至 OD600达 0.6;表达 PTD-RBD-Vif-C蛋白加入 IPTG至终浓 度为 0.4mmol/L， 经诱导后收集菌体，
S7中， 所述纯化的方法是将总菌体用 PBS Buffer洗涤， 重悬， 超声处理后， 高速离心获得裂解上清液， 经镍柱亲和层析纯化， 收集洗脱的蛋白。
所述的融合表达载体 PTD-RBD-Vif-C的序列如 SEQ NO : 4所示，
从 N端到 C端的结构分别为， 跨膜肽 PTD部分， RBD的 KRAS结合部位，
VIF-C的降解部分。
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