本発明は、哺乳動物に投与した後、MICAまたはMICBタンパク質のNKG2D結合部分、すなわち、それらのα1−α2プラットフォームドメイン(α1ドメインおよびα2ドメインそれぞれにつき、アミノ酸1〜85および86〜178)を、α1−α2プラットフォームに付着した標的モチーフを介して意図する標的分子または細胞標的上の分子に特異的に結合させることによって、特異的な細胞の標的細胞を攻撃するためにNK細胞および特定のT細胞を動員および活性化することができる可溶性、単量体、非天然のタンパク質分子について記載する。標的モチーフは、MICAまたはMICBタンパク質のα3ドメインを含み、挿入された異種ペプチド(一つまたは複数)が標的分子に結合する。
「異種ペプチド」は、天然にはまたは通常はα3ドメイン内に存在しないペプチドである。いくつかの実施形態において、異種ペプチドは、可溶性MICAまたはMICBのα3ドメインの溶媒に暴露されたループのうちの1つに統合される。統合された異種ペプチドは、MICのα3ドメインの非末端構成要素であってもよく、MICα3ドメインの標的分子への結合を誘導する。異種ペプチドは、既存のループのいずれも欠失させることなく、ループの2つの隣接する残基の間でα3ドメインのループに挿入されてもよい。代替として、ループの全体または一部が欠失し、異種ペプチドで置換されてもよい。好ましい実施形態において、ループの全体が欠失し、インサートで置換される。さらなる実施形態において、ループの全体が欠失し、欠失部位の片側または両側に隣接するα3ドメインの1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの追加のアミノ酸もまた欠失している。好ましい実施形態において、欠失部位の片側または両側の1つ、2つ、または3つの残基が欠失している。特定の態様において、配列番号1〜13の188〜201に対応する残基および/または残基250〜258が欠失している。いくつかの実施形態において、1つ以上の残基を含むループの一部が欠失し、異種ペプチドで置換される。特定の実施形態において、欠失した部分は、ループの1つ〜3つの残基であるか、またはループの1つ〜5つのアミノ酸残基であるか、またはさらにはループの1つ〜7つの残基である。具体的な実施形態において、欠失した部分は、挿入部位の10アミノ酸残基内にある。他の実施形態において、欠失した部分は、挿入部位の9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸残基内にある。
いくつかの実施形態において、異種ペプチドは、スペーサーおよび結合モチーフを含んでもよい。そのようなスペーサーは、その標的分子に結合できるように、または標的分子に結合する能力を向上させることができるように、異種ペプチドの結合モチーフを位置付けるために使用される、短い可撓性のリンカーペプチドであってもよい。
具体的な実施形態において、異種ペプチドは、天然もしくは組換え抗体、別のタンパク質もしくはペプチド分子、または結合モチーフの補体決定領域の一部を含んでもよい。特定の実施形態において、異種ペプチドは、抗体の補体決定領域である。他の実施形態において、異種ペプチドは、付着した多糖または他の炭水化物、核酸分子のアプタマーまたは合成類似体等の核酸分子をさらに含む。異種ペプチド(一つまたは複数)を組み入れることによって、MICAまたはMICBタンパク質の非自然(または非天然)の、修飾または変換されたα3ドメインが生じ、それは、異種ペプチド(一つまたは複数)の結合特性(例えば、同族の結合パートナー)に基づいて、α1−α2プラットフォームの標的化を誘導する有用な機能を獲得する。本発明の非天然の一価分子は、一般的な提示表面に結合されないまたは限定されないという明確な利点を有し、それによって、修飾すること、製剤化すること、および従来の生物製剤として哺乳動物に投与することができる。
好ましい実施形態において、本発明の非天然、可溶性の単量体MICタンパク質のループ1、ループ2、またはループ3のうちの1つより多くが異種ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、異種ペプチドは、同じ標的分子に結合する。一態様において、異種ペプチドは、結合モチーフ内に同じアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、標的分子は、同じ細胞または同じ細胞型上にあってもよい。他の態様において、標的分子は、異なる細胞または細胞型上にあってもよい。他の実施形態において、異種ペプチドは、異なる標的分子に結合する。いくつかの態様において、標的分子は、同じ細胞または同じ細胞型上にあってもよい。他の態様において、標的分子は、異なる細胞または細胞型上にあってもよい。
所望されるα3ドメインに対する修飾は、標的細胞(例えば、悪性細胞またはウイルス感染細胞)の表面上の分子等の標的分子に対するα3ドメインの結合の特異性または感受性を加えるかまたは増加させるものを含む。α1−α2プラットフォームドメインは、修飾された標的α3ドメインに繋ぎ止められ、哺乳動物の細胞間または血管内の空間において拡散性である。好ましくは、本発明の非天然MICタンパク質のα1−α2プラットフォームドメインは、ヒトMICAまたはMICBタンパク質の野生型または天然のα1−α2ドメインと少なくとも80%同一または相同であり、NKG2D受容体に結合する。いくつかの実施形態において、α1−α2プラットフォームドメインは、ヒトMICAまたはMICBタンパク質の野生型または天然のα1−α2プラットフォームドメインと80%同一であり、NKG2D受容体に結合する。他の実施形態において、α1−α2プラットフォームドメインは、ヒトMICAまたはMICBタンパク質の野生型または天然のα1−α2プラットフォームドメインと90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であり、NKG2D受容体に結合する。いくつかの実施形態において、α3ドメインは、ヒトMICAまたはMICBタンパク質の野生型または天然のα3ドメインと85%同一(いずれの修飾されたループも含まずに)である。他の実施形態において、α3ドメインは、ヒトMICAまたはMICBタンパク質の野生型または天然のα3ドメインと90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一(いずれの修飾されたループも含まずに)である。例示的なヒトMICAタンパク質(可溶性形態)は、配列番号1〜6、および13を含む。例示的なヒトMICBタンパク質(全タンパク質)は、配列番号7〜12を含む。
他の実施形態において、異種ペプチドタグは、可溶性MICタンパク質の精製を補助するために、可溶性MICタンパク質のN末端またはC末端に融合されてもよい。タグ配列は、ポリヒスチジン、myc−ペプチド、またはFLAGタグ等のペプチドを含む。そのようなタグは、当業者に既知の方法によってMIC分子の単離後に除去されてもよい。
本明細書で使用される場合、「可溶性MICタンパク質」、「可溶性MICA」、および「可溶性MICB」は、MICタンパク質のα1、α2、およびα3ドメインを含むが、貫通膜または細胞内ドメインを含まないMICタンパク質を指す。例示的な可溶性MICタンパク質は、配列番号1〜13のアミノ酸残基1〜274または1〜276を含む。
本明細書で使用される場合、「完全なMICタンパク質」は、α1、α2、およびα3ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに細胞内ドメインを含むMICタンパク質を指す。完全なMICタンパク質の例は、配列番号7〜12に記載される。
本発明は、MIC遺伝子のライブラリーまたはその結果生じる可溶性MICタンパク質をさらに提供し、ライブラリーの各メンバーは、標的細胞に対するその結合特性等の異なる特性を有するかまたは示すため、多様な分子のライブラリーが生じる。例えば、ライブラリーは、10以上の異なる結合特異性を表す多様な個々の標的結合特性を含むことができる。本明細書で使用される場合、「多様な個々の標的結合特性」とは、ライブラリーの個々のメンバーが、異なる標的分子に結合するか、または同じ標的分子に対して異なる親和性もしくは結合力を有する、MICタンパク質のライブラリーを指す。いくつかのMICタンパク質のライブラリーにおいて、2つ以上のメンバーが同じ標的に結合してもよいが、異なる結合親和性または結合力を有してもよい。
本発明のさらなる実施形態において、悪性腫瘍またはウイルス感染を有する哺乳動物は、悪性またはウイルス性の状態に影響を与えるように有効量の可溶性MICタンパク質を投与することによって治療することができる。哺乳動物への分子の投与は、NKG2D保有NK細胞またはT細胞の標的悪性細胞またはウイルス感染細胞への接着をもたらし得、NK細胞またはT細胞が、標的悪性細胞またはウイルス感染細胞を破壊的に攻撃するかまたは破壊する。本発明の方法に照らして本明細書で使用される場合の「破壊する」という用語は、標的細胞の生存能を破壊することを意味する。
本明細書で使用される場合、「悪性」または「悪性の状態」は、癌、一群の細胞が制御されない増殖を示す疾患のクラス、隣接する組織に侵入して破壊する浸潤、および場合によっては転移(すなわち、リンパまたは血液を介して体内の他の場所に広がること)を指す。いくつかの実施形態において、悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。具体的な実施形態において、白血病は、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、有毛細胞白血病、または急性単球性白血病(AMOL)であり、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫であり、骨髄腫は多発性骨髄腫である。他の実施形態において、悪性腫瘍は、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、脳癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、結腸癌、食道癌、肝臓癌、胃癌、子宮癌、内分泌癌、腎癌、膀胱癌、または子宮頸癌を含む悪性固形腫瘍である。好ましい実施形態において、悪性腫瘍は、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、脳癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、または結腸癌である。より好ましい実施形態において、悪性腫瘍は乳癌である。
また、本発明は、MICタンパク質のα3ドメイン(たとえば、配列番号1〜13のアミノ酸182〜274)を、NKG2D保有NK細胞またはT細胞を誘引するか、動員するか、またはそれらに結合するために、その繋ぎ止められたα1−α2ドメインを細胞間空間から標的細胞表面に直接送達することができる特異的な標的ドメインに変換する手段も含む。
これらの「受動ワクチン」の用途は、病的であるにもかかわらず、NK細胞または特定のT細胞を攻撃するために必要な適切なレベルのMICAまたはMICB等のリガンドを発現しない病的細胞を破壊することである。例えば、ヒト肺癌のわずか30%がMICAを発現する(Busche, A et al.2006)。神経膠芽腫細胞は、先天性の免疫攻撃を防止するNK細胞阻害シグナルを過剰発現するが、実験動物の肺癌または神経膠芽腫細胞における天然MICA遺伝子産物の過剰発現は、NK細胞の癌に対する効果的な攻撃を回復する(Friese,M.et al.2003)。
NKG2D受容体に結合したヒトMICAの高分解能構造が解明されており、MICAのα3ドメインは、NKG2D受容体と直接的には相互作用しないことが示されている(Li et al.2001.Complex structure of the activating immunoreceptor NKG2D and its MHC class I−like ligand MICA.Nature Immunol.2:443−451;Protein Data Bank accession code 1HYR)。MICAのα3ドメインは、MICBのα3ドメインと同様に、短い可撓性のリンカーペプチド、アミノ酸175〜182[配列番号1〜13]によってα1−α2プラットフォームドメインに接続され、それ自体がプラットフォームと、MICを発現する細胞の表面との間の「スペーサー」として天然に位置する。ヒトMICAおよびMICBのα3ドメインの三次元構造は、ほぼ同一であり(94C−αα’s上で平均二乗距離の平方根<1Å)、機能的に交換可能である(Holmes et al.2001.Structural Studies of Allelic Diversity of the MHC Class I Homolog MICB, a Stress−Inducible Ligand for the Activating Immunoreceptor NKG2D.J Immunol.169:1395−1400)。
さらに、MICタンパク質のIg様α3ドメインの三次元構造は、テンダミスタットの構造に類似し、また配列反転形態においては、10番目のヒトフィブロネクチンドメインIII型の構造に類似している:どちらの構造も、タンパク質結合モチーフを操作するための足場としての役割を果たしてきた(Pflugrath,JW,G Wiegand,R Huber,L Vertesy(1986)Crystal structure determination,refinement and the molecular model of the α−amylase inhibitor Hoe−467A.J.Molec.Biol.189:383−386;Koide A,Bailey CW,Huang X,Koide S.1998.The fibronectin type III domain as a scaffold for novel binding proteins.J.Mol.Biol.284:1141−1151;Li,R,RH Hoess,JS Bennett and WF DeGrado(2003)Use of phage display to probe the evolution of binding specificity and affinity in integrins.Protein Engineering 16:65−72;Lipovsek,D.et al.(2007)Evolution of an inter−loop disulfide bond in high−affinity antibody mimics based on fibronectin type III domain and selected by yeast surface display: molecular convergence with single−domain camelid and shark antibodies.J.Mol Biol 368:1024−1041;米国特許第7153661号;Protein Data Bank accession code 1TTG)。
本発明の一態様は、MICAまたはMICBのα3ドメインの溶媒に暴露された6つのループのうちの1つ以上に、遺伝子操作によって特異的結合特性を持たせることを企図し、哺乳動物への投与後、血管内または細胞間空間内に拡散し、続いて、意図する標的細胞上の標的分子に高い感受性および特異性で付着することができ、それによって、結合ならびにそれに続くNKG2D保有NKおよび/またはT細胞による特定の標的細胞の破壊的攻撃を促進することができる、可溶性の非天然MIC分子が形成される。標的悪性細胞上の表面接近性分子の例は、インテグリン、癌遺伝子産物またはそれらの断片、例えば、NK−1R、ヒト上皮増殖因子2(Her2またはErbB2)、増殖因子受容体、例えば、上皮増殖因子受容体(EGFR)、FGF受容体3、CD30、CD19、CD20、血管新生因子受容体(血管内皮増殖因子(VEGF)受容体およびVEGF関連分子のため等)、メラノーマ抗原、ならびにLNcaPおよびPC−3前立腺癌細胞の抗原を含む。標的ウイルス感染細胞上の表面接近性分子は、アポリポタンパク質H、Gas6、MFG−E8等のアクセサリータンパク質を有するかまたは有しない「裏表が反転した」ホスファチジルセリン;ウイルスによってコードされる抗原、ウイルスによってコードされる肝炎ウイルスの抗原;アデノウイルス;サイトメガロウイルス;他のヘルペスウイルス;HIV(特にpI7);ワクシニア;ポックスウイルス;ロタウイルス;インフルエンザ;パルボウイルス;西ナイルウイルス;狂犬病;ポリオーマ;パピローマウイルス;風疹;ジステンパー;および日本脳炎ウイルスを含む(Balasubramanian,K and Schroit,AJ.2003.Ann.Rev.Physiol.65:701−734;Soares,MM,SW King&PE Thorpe.(2008)Targeting inside−out phosphatidylserine as a therapeutic strategy for viral diseases.Nature Medicine 14:1358−62;Slavuljica et al,2010)。本発明の組成物は、合成DNA、バクテリオファージディスプレイ、または酵母表面ディスプレイもしくは細菌表面ディスプレイ技術(これらのうちのいくつかは、テンダミスタットおよび10番目のヒトフィブロネクチンドメインIIIに特異的結合特性を形成するために展開されている)を展開して、MICAまたはMICBのα3ドメインに特異的な結合モチーフを導入することによって生成することができる(McConnell,SJ and RH Hoess,(1995)Tendamistat as a Scaffold for Conformationally Constrained Phage Peptide Libraries.J.Molec.Biol 250:460−470;Li et al.(2003);Sidhu,S.S.&S.Koide(2007)Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces.Current Opinion in Struct.Biol.17:481−487;Lipovsek,D.et al.2007)。これらの方法は、溶媒に暴露されたループ内で高度に多様化され、選択、スクリーニング、またはパニング(全て当業者に既知である)によって、所望の表現型の結合特性を示すこれらのα3ドメインをコードする遺伝子型をそこから単離するための、α3ドメイン構造のライブラリーを作製することを伴う。
Millerらの多様性を生成するレトロエレメント(DGR)は、ループ内の多様なアミノ酸位置に多様性を生成する方法の一例である(Medhekar,B.&J.F.Miller.2007.Diversity−Generating Retroelements.Current Opinion in Microbiol.10:388−395、および米国特許第7,585,957号)。ヒトMICAおよびMICBのα3ドメインは、276個のアミノ酸の水溶性形態うちの95個のアミノ酸(182〜276)からなっているため、全ての溶媒に暴露されたループ、たとえば、配列番号1〜13のアミノ酸190〜199、208〜211、221〜228、231〜240、250〜258、または264〜266が多様化されてもよく、またさらには、操作可能であることが分かっている長さである200ヌクレオチドを超えない長さの合成鋳型反復配列(Template Repeat:TR)を展開して突然変異誘発をホーミングすることにより、挿入したアミノ酸によって伸長されてもよい(Guo,H et al.2008.Diversity−Generating Retroelement Homing Regenerates Target Sequences for Repeated Rounds of Codon Rewriting and Protein Diversification.Molecular Cell 31,813−823)。
いくつかの要因によって、α3ドメインの、多様化された、溶媒に暴露されたループのDGRベースのライブラリの作成が誘導される。第1に、DGRは、可変反復配列(variable repeat:VR)と称される、タンパク質をコードするDNA配列の所定のセグメントに多様性を生成する。いくつかの異種配列は、VRとして機能するために、それらの末端で変異原性ホーミングの開始(initiation of mutagenic homing:IMH)配列と隣接する。IMH配列は、変異原性ホーミングを誘導し、配列の多様化の3’境界を決定する、シス作用部位としての役割を果たす。第2に、VRの多様化の5’境界は、VRとその同族TRとの間の相同性の程度によって決定され得る。部分的な相同性のみが必要とされ、ミスマッチも許容される。第3に、多様化に供されるVRの特異的部位は、TRにおけるアデニン残基の位置によって決定され得る。「合成」TRの適切な位置にアデニン残基を挿入することによって、特異的なVRによってコードされるアミノ酸残基を多様化することができる。第4に、atdタンパク質、TRによってコードされるRNA中間体、およびRT逆転写酵素は、異種プロモーター、例えば、PtetAまたはPbad−の制御下でプラスミドベクターpDGR上に発現されたときに効率的にトランスで機能する。このことは、細菌細胞内の多様化を切り換えるための便利な手段、および多様化される正確な部位をプログラムするための合成TR配列への便利なアクセスを提供する。さらに、トランス作用構成要素の高レベルの発現は、高効率の多様化をもたらす。
α3ドメインを多様化するためのDGRベースのアプローチの一般的な概要を図5に示す。多様化される配列は、α3ドメインのループに対応する。IMH配列は、α3ドメインをコードする遺伝子の停止コドン(約AV277)のすぐ下流に位置し、多様化に供される「合成VR」を作製する
α3ドメインをコードする合成VRは、プラスミドpDGR上の合成TRによって多様化される(図5)。このTR要素は、IMH*と、VRに相同な上流配列とを含む。突然変異誘発に供される特異的なVR残基は、TRにおけるアデニンの置換によって正確にプログラムされ、高密度のアデニン残基がシステムによって許容され得る。また、pDGRは、AtdおよびRT逆転写酵素をコードする座位も含む。Atd、TR、およびrtは、厳重に抑制されたtetAプロモーター/オペレーター(PtetA)から発現され、アンヒドロテトラサイクリンの添加または除去により、多様化プロセスの正確な制御を可能にする。
標準的なファージディスプレイ形式において、DGR機構を介してα3ドメインを多様化することを検討することは有益である。この場合、α3ドメインは、大腸菌においてファージミドベクター上でコードされる繊維状ファージコートタンパク質に融合される。VRは、α3ドメインの溶媒に暴露されたループを含み、pDGRは、それらのループ内の指定された場所で効率的にVRを多様化するように設計される(Guo et al.2008)。atd、TR、およびrtの発現を活性化することにより、ファージミドゲノム上に存在するVR配列の突然変異が誘発される。この結果、ファージのライブラリーが作製され、それらの各々が、その表面上で多様化された結合タンパク質を表し、コード化DNAパッケージングする。所望の特異性は、固定化された標的分子、例えば、癌遺伝子Her2の表面露出タンパク質生成物にファージを結合させ、非結合ファージを除去するために洗浄し、再増幅および濃縮することによって選択される。選択された表現型のさらなる最適化のラウンドは、単純に、pDGRを含む大腸菌を選択またはパニングされたファージに感染させ、上述のステップを繰り返すことによって効率的に達成することができる。このシステムは、従来のアプローチによって達成されるものよりも数桁大きいライブラリーサイズを生成することができる。α3ドメイン骨格の完全性を犠牲にすることなく、累積的な改善を伴って連続ラウンドの最適化が達成され得る容易さも、等しく有利である。
大腸菌等の細菌の表面上に多様化したタンパク質を表示することは、ファージディスプレイに優る潜在的な利点を提供する代替のアプローチである。例えば、いずれのファージも作製する必要なく、または選択されたファージの複数ラウンドの感染を繰り返す必要もなく、連続ラウンドの最適化を達成することができる。また、α3ドメインは、直接的な生化学的または物理的分析のために細菌の表面から切断されるように設計することができる。DGRは、40を超える細菌種のゲノム内に天然に見られるが、いずれも大腸菌において同定されていない。しかしながら、最近、レジオネラ・ニューモフィラ由来のDGRのシスおよびトランス作用構成要素が大腸菌において効率的に機能することがMillerらによって示された。MICAまたはMICBの多様化されたα3ドメインは、非限定的な例として、腸管病原性大腸菌によってコードされたEaeAインチミンタンパク質の外膜局在化およびアンカードメインから構成される融合タンパク質として、大腸菌の表面上で発現される(Luo Y,Frey EA,Pfuetzner RA,Creagh AL,Knoechel DG,Haynes CA,Finlay BB,Strynadka NC.(2000)Crystal structure of enteropathogenic Escherichia coli intimin−receptor complex.Nature.405:1073−7)。EaeAは、タンパク質を外膜にアンカリングする約500アミノ酸のN末端セグメントからなり、転位を促進するポリン様構造を有する逆平行βバレルを形成すると考えられる(Touze T,Hayward RD,Eswaran J,Leong JM,Koronakis V.(2004)Self−association of EPEC intimin mediated by the beta−barrel−containing anchor domain:a role in clustering of the Tir receptor.Mol Microbiol.51:73−87)。この転位ドメインの後には、一連のIg様モチーフと、腸上皮表面への結合に寄与するC末端C型レクチンドメインとが続く(図6)。インチミンの細長い構造と、異種タンパク質ドメインを大腸菌外膜の外面に輸出してアンカリングするその能力は、それが、多様化されたα3タンパク質の表面ディスプレイのための理想的かつ用途の広い融合パートナーであることを示唆している(Wentzel A,Christmann A,Adams T,Kolmar H.(2001).Display of passenger proteins on the surface of Escherichia coli K−12 by the enterohemorrhagic E.coli intimin EaeA.J Bacteriol.183:7273−84;AdamsTM,A Wentzel,and H Kolmar(2005)Intimin−Mediated Export of Passenger Proteins Requires Maintenance of a Translocation−Competent Conformation.J.of Bacteriology,187:522−533)。
MICAおよびMICBの天然の配向では、C末端が細胞膜にアンカリングされる(I型膜タンパク質)。α3ドメインは、N末端のα1−α2プラットフォームと細胞膜との間に存在する。しかしながら、これらのα3ドメインのループをα1−α2プラットフォームから離れて突出するように多様化するために、反対の配向(例えば、II型膜タンパク質)が所望される、すなわち、配列番号1〜13のアミノ酸位置190〜199、221〜228、250〜258に位置するループ等のループが標的分子の結合に容易に利用可能となるように、N末端で図1のα3ドメインのリンカー部分をEaeAに付着させる。そのようなII型膜タンパク質の配向は、正に図6のEaeAの配向である。さらに、α3ドメインは、EaeAと同様にIg様モチーフを有するため、EaeAはα3ドメインを大腸菌表面に転位させる(Li et al.1999.Crystal structure of the MHC class I homolog MICA, a γδΤ cell ligand.Immunity 10:577−584)。実際、EaeAが異種パッセンジャーポリペプチドを転位させる能力は文献に記述されている(Wentzel et al.2001;Adams et al,2005)。
多様化は、α3−VRの多様化を誘発するために、EaeA−α3融合タンパク質およびアンヒドロテトラサイクリンの発現を誘導するようにアラビノースの存在下で表面ディスプレイ大腸菌を増殖することによって最初に達成される。該当する結合特性を示す細菌細胞は、蛍光活性化セルソーティング(FACS)または磁気ビーズ分離法等の標準的な方法を使用して濃縮することができる。選択された細菌細胞は、アラビノースの存在下およびアンヒドロテトラサイクリンの非存在下で成長させることによって増幅される。さらなる濃縮ステップが含まれてもよく、単純にプロトコルを繰り返すことによって追加ラウンドの最適化を達成することができる。重要なのは、NK細胞またはT細胞の攻撃のために望ましくない標的に結合するα3ドメインは、所望の結合特性の選択前に、例えば正常な組織に対してパニングすることによって、多様化ライブラリーから枯渇させることができるということである。選択されたα3タンパク質は、Factor Xaプロテアーゼの添加によって細菌細胞の表面から切断することができ、次いで、さらなる特徴付けおよび使用のために6xHisタグ化C末端ドメインの親和性精製によって精製される。これにより、選択されたα3ドメインの構造および機能に関する簡便な生化学的または物理的分析が可能となる。所望の非天然α3ドメインをコードする単離されたDNAを、α1−α2プラットフォームドメインをコードするMIC遺伝子の一部に融合することにより、いずれの場合においても、リンカーまたはテザー(アミノ酸177−182)を介して所望の非天然α3ドメインを残りの可溶性MICタンパク質に再導入し、単離されたα3ドメインの特異性および感受性を有する所望の受動的NK細胞ワクチンを作製することができる。
選択された遺伝子型は、細菌、酵母、昆虫、または哺乳類細胞において非天然または非自然の、可溶性の同族MICタンパク質を生成および単離するために使用することができる。生成されたMICAは、要求される程度まで精製され、インビトロおよびインビボで安定化するための利用可能な方法によって製剤化され、ヒトまたは他の哺乳動物に非経口的にまたは他の経路によって投与されることができ、そこで、先天性免疫系の細胞構成要素による標的攻撃を促進することにより、悪性腫瘍またはウイルス性疾患を治療するために拡散することができる。
いくつかの実施形態において、非天然MIC分子は、「薬学的に許容される」賦形剤または担体とともに製剤化される。そのような構成要素は、過度の有害な副作用なくヒトまたは動物に使用するために好適な構成要素である。有害な副作用の非限定的な例は、毒性、刺激、および/またはアレルギー反応を含む。賦形剤または担体は、通常、妥当な利益/リスク比に見合ったものである。多くの実施形態において、担体または賦形剤は、局所または全身投与に好適である。非限定的な薬学的な担体は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルションを含む。その例は、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルション等のエマルション、および種々の種類の湿潤剤等の標準的な薬学的賦形剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体は、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール/水溶液、エマルション、または懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル、またはおよび固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充剤、電解質補充剤(リンゲルデキストロースなどに基づくもの等)を含む。
任意選択的に、本開示の非天然MIC分子を含む組成物は、当該技術分野で周知の手段を使用して凍結乾燥または噴霧されてもよい。その後の再構成および使用は、当該技術分野で既知であるように実践することができる。
経口的および局所的使用に好適な薬学的グレードの有機または無機担体および/または希釈剤が、治療的に活性な化合物を含む組成物を作製するために使用されてもよい。安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、または適切なpH値を確保するための緩衝液が含まれてもよい。
非天然MIC分子は、通常、「安全かつ有効な」量または濃度で使用され、それは、上述のような過度の有害な副作用なく所望の治療応答をもたらすのに十分な量を意味する。非天然MIC分子は、そのインビボでの薬物動態特性を変化させるために生化学的に修飾されてもよい。循環タンパク質分子の半減期を増加させるための周知の方法は、MICタンパク質の結合機能に影響を及ぼすことなく、基本構造にポリエチレングリコール(PEG)を化学的に付着すること、または、遺伝子操作により、グリシンおよびセリン等の天然アミノ酸のポリマーをN末端、C末端、または内部(配列番号1〜13のアミノ酸179〜182のα1−α2とα3ドメインとの間のテザー内等)に付加することである。非天然MIC分子は、「治療的に有効な」量または濃度で使用されてもよく、それは、所望の治療応答を生じさせるための量を指し、例えば、限定されないが、標的細胞を死滅させるのに十分なNK細胞またはT細胞を動員するために標的細胞に結合するために効果的な量である。安全かつ有効な量または治療的に有効な量は、種々の要因に伴って変化するが、過度の実験を行うことなく、熟練した医師によって容易に決定され得る。要因の非限定的な例は、治療される具体的な状態、対象の物理的状態、治療される対象の種類、治療の期間、(ある場合は)併用療法の性質、および用いられる特定の製剤を含む。
「〜を含む(including)」、「〜を含む(containing)」、または「〜によって特徴付けられる」と交換可能に使用される「含む(comprising)」という用語は、包括的または開放型言語であり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。「〜からなる」という句は、特許請求の範囲に規定されていないあらゆる要素、ステップ、または成分を除外する。「〜から本質的になる」という句は、特許請求の範囲の範囲を、規定される材料またはステップ、および請求される発明の基盤および新規特徴に大きな影響を及ぼすことのないものに限定する。本発明の開示は、これらの句の各々の範囲に対応する本発明の実施形態、組成物、および方法を企図する。よって、列挙される要素またはステップを含む組成物または方法は、組成物または方法が、これらの要素またはステップから本質的になるかまたはなる具体的な実施形態を企図する。
本明細書に列挙される全ての参考文献は、以前に明示的に組み込まれているかまはいないかにかかわらず、参照によって、それらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「a」、「an」、および「any」という用語は、各々、単数形および複数形の両方を含むことを意図する。
本発明について十分に説明してきたが、当業者は、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、また過度な実験を行うことなく、様々な同等のパラメータ、濃度、および条件においてそれを実施することができることを理解するであろう。本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、さらなる変更が可能であることを理解されたい。本出願は、一般に本発明の原理に従い、また本発明が関連する技術における既知のまたは一般的な慣行に属するような、本発明の開示からのそのような逸脱を含む、本発明のいかなる変形、使用、または改作も包含することを意図し、上文に記載される本質的な特徴に適用されてもよい。
本明細書において提供される場合、所望の表現型をコードするDNAを単離するために選択、スクリーニング、またはパニングを可能にするために、どちらも当業者に周知である2つの技術を使用して、MICAのα3ドメインの遺伝子型をその(結合)表現型に物理的に付着した。第1の技術は、α3ドメインをコードするDNAを内部に持つ細菌の表面にα3ドメインが表示される、細菌表面ディスプレイである。第2の技術は、コードするDNA、遺伝子型がファージゲノム内にある、キメラファージのカプシドタンパク質としてのα3ドメインのバクテリオファージディスプレイである。表示されたα3ドメインの表現型を反映する結合表現型を有する可溶性の修飾されたヒトMICA分子を作製するためにα3ドメインの遺伝子型を使用する能力も、本明細書において証明される。
1.大腸菌の表面上におけるMIC−α3ドメインタンパク質の表示
端的に述べると、α3ドメインをコードするDNAを大腸菌eaeA(インチミン)遺伝子の一部に融合し、その結果得られた融合タンパク質を、α3ドメインが細菌表面に遠位であるそのC末端部分と方向を合わせるような様式で、大腸菌の表面上で発現させた。
オリゴヌクレオチドのAV1401(配列番号15)およびAV1402(配列番号16)をキナーゼ化し、アニーリングし、NdeIおよびNcoIで消化したプラスミドpET30a(Novagen)のアリコートに連結して、pelB分泌シグナル配列を含むpSW249を作製した。
プラスミドpSW249をNcoIおよびBlpIで消化し、キナーゼ化およびアニーリングしたオリゴヌクレオチドAV1445(配列番号17)およびAV1446(配列番号18)に連結してpSW263を作製した。この構築物は、pelB配列の次の6つのヒスチジン残基(配列番号127)をコードする配列を含んでいた。
5’非翻訳配列の一部、シグナル配列、および成熟コード配列のコドン1〜276、続いて停止コドンを含むヒトMICAのcDNAを、プライマーAV1466(配列番号19)およびAV1448(配列番号20)を使用して、ヒト脾臓一本鎖cDNA(Invitrogenより調達)からPCRにより増幅した。
PCR断片をNheIおよびHindIIIで消化し、同じくNheIおよびHindIIIで消化したpCDNA5−FRT(Invitrogen)に連結してpSW265を作製した。定方向突然変異誘発により3つの突然変異G14W、A24T、およびE125KのMICAコード化領域を修正してpSW271を作製した。
プライマーAV1447(配列番号21)およびAV1448(配列番号20)を用いてpSW271の一部をPCR増幅した。PCR断片は、tevプロテアーゼ切断部位ENLYFQG(配列番号128)、続いてヒトMICAのコドン1〜276からなっていた。このPCR断片をXhoIIIおよびHindIIIで消化し、同じくXhoIおよびHindIIIで消化したプラスミドpSW263のアリコートに連結してプラスミドpSW286を作製した。
AV1408(配列番号22)およびAV1409(配列番号23)プライマーを使用して大腸菌EDL933ゲノムDNAからeaeA遺伝子を増幅した。
このPCR産物をBamHIおよびHindIIIで消化し、同じくBamHIおよびHindIIIで消化したBluescript−SK+DNA(Stratagene)に連結してpSW284を作製した。
プライマーAV1602(配列番号24)およびAV1603(配列番号25)を使用してプラスミドpSW284の一部をPCR増幅した。PCR断片をNdeIおよびXhoIで消化し、同じくNdeIおよびXhoIで消化したpSW286のアリコートに連結してSW289を作製した。
プライマーkk43(配列番号26)およびkk44(配列番号27)を用いてpSW289の一部をPCR増幅した。その結果得られた、tevプロテアーゼ切断部位ENLYFQG(配列番号128)、続いてMICAの残基181〜276をコードする配列(注:連続する6C’sを分割するために、PI83のコドンをCCCからCCAに変更した)を含むPCR断片をXhoIおよびHindIIIで消化し、XhoIおよびHindIIIで消化したpSW289の別のアリコートの消化物からアガロースゲル上で精製された約7185bpの断片に連結してpKK5を作製した。7185bpの断片で、EaeA1〜659、その後にGG、次いでFactor Xaによる切断部位IEGR(配列番号129)、6つのHis残基(配列番号127)、次いで、XhoI部位を提供することの他は機能のないLEをコードするXhoI部位をコードした。
プライマーkk52(配列番号28)およびkk45(配列番号29)を用いてpKK5をPCR増幅した。NcoIおよびHindIIIでPCR断片を消化し、NcoIおよびHindIIIで消化したpBAD24(ATCCから)のアリコートに連結してpKK29を作製した。製造業者の推奨に従って、クローン株である大腸菌「NEB 10−β」(New England BioLabsカタログ番号AV C3019H)にプラスミドpKK29を形質転換し、100μg/mlカルベニシリンに対する耐性のために選択した。
pKK29で形質転換した大腸菌細胞のアラビノース誘導型および非誘導型の細胞質タンパク質、内膜タンパク質、および外膜タンパク質を各々単離し、SDS−PAGEにより分析した。SDS−PAGEゲルをクマシーブルーで染色するか、またはヒトMICAタンパク質に対すル抗体を用いてウエスタンブロットした。
OD600が0.915に等しくなるまでLB/Carb100中で細胞を増殖させた。10mlの細胞のアリコートを2本の50ml円錐管の各々に加えた。一方の管は0.002%アラビノースで誘導し、他方は誘導しないままにした。37℃で1時間振盪しながらサンプルをインキュベートした。
Eppendorf 5810R卓上型遠心機にて10分間4000rpmで細胞を遠心分離した。上清を廃棄し、6mlのFP緩衝液(0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、0.1M KCl、5mM EDTA、1mMジチオスレイトール、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル)中に細胞ペレットを緩やかに再懸濁し、15ml円錐管に移した。Biologies Incの300V/Tモデル超音波ホモジナイザーを使用して、6×15秒のバーストで細胞を超音波処理した。バースト間に氷上でサンプルをインキュベートした。超音波処理後、Eppendorf 5810R卓上型遠心機にて管を5分間4000rpmで遠心分離にかけ、破損した細胞を全て除去した。
上清をBeckmanポリカーボネート遠心管(カタログ番号AV355631)に移し、Type 60Tiローターを使用して、Beckman L8−80M床置き型超遠心機にて100,000Xgで1時間4℃で回転させた。細胞質タンパク質を含む上清を新しい管に移し、4℃で保存した。
2mlのME緩衝液(10mM Tris−HCl(pH8.0)、35mM MgCl2、1% Triton X−100)中に細胞膜のペレットを再懸濁した。サンプルを2時間25℃で緩やかに振盪し、次いで、Type 60Tiローターを使用して、Beckman L8−80M床置き型超遠心機にて100,000Xgで30分間4℃で再度遠心分離した。細胞膜のTriton可溶性タンパク質を含む上清を新しい管に移し、4℃で保存した。外膜タンパク質を含む最終的なペレット(Schnaitman,CA.1971.Solubilization of the Cytoplasmic Membrane of Escherichia coli by Triton X−100.J.Bacteriology 108:545−552)を0.1mlの水に再懸濁し、SDS−PAGEによる分析に供する前に同じく4℃で保存し、クマシーブルーで染色するか、またはヒトMICAに対するヤギポリクローナル抗体を使用してウエスタンブロットした(図2)。
SDS−PAGE分析では、サンプルを等量のNovex Tris−Glycine SDS 2Xサンプル緩衝液(Invitrogen AVLC2676)と混合し、4〜20%Tris−Glycine Gradient Gel(Invitrogen AVEC60285BOX)上で電気泳動した。ウエスタンブロット法では、スラブゲル中で電気泳動したサンプルのレーンをInvitrogen XCell II Blot Module(AVEI9051)を使用してニトロセルロース膜(Invitrogen Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich AVLC2001)に移した。5%牛乳−リン酸緩衝生理食塩水、Tween−20(PBST)中、4℃で膜フィルターを一晩ブロックした。一次抗体(抗ヒトMICA抗体−R&D Systems AVAF1300)を、5%牛乳−PBST中、1:500の希釈率で使用した。その結果得られたフィルターの「ブロット」を緩やかに振動させながら2時間25℃でインキュベートした。続いて、フィルターの「ブロット」をPBSTで20分間25℃で洗浄し、その後、5%牛乳−PBST中、1:1000の希釈率で二次抗体(抗ヤギIgG−HRP抗体−R&D Systems AVHAF017)を加えた。フィルターの「ブロット」を2時間25℃で振動させ、次いで、再びPBSTで20分間洗浄した。Novex HRP Chromogenic Substrate−TMB(Invitrogen AVWP20004)を用いてフィルターの「ブロット」を展開した。
独立した方法によりα3ドメインの細菌表面ディスプレイを確認するために、インタクトな、アラビノース誘導型および非誘導型大腸菌の蛍光顕微鏡法により、誘導型培養由来のインタクトな細菌の表面にのみ、MICAのα3の染色を確認した。
2.内部標的ドメインを有する可溶性の非天然ヒトMICタンパク質の生成
ヒトMICAは天然にグリコシル化されているが、その非グリコシル化形態は、その受容体であるNKG2Dにインビトロで結合する(Li et al,2001)。しかしながら、インビトロで、そして最終的にはインビボでヒト様グリコシル化形態を評価できるように、我々は、培養したヒト細胞においてMICAを発現させた。発現のために、ヒトCMVプロモーターおよびウシ成長ホルモン(bgh)ポリアデニル化シグナルを有する一過性発現ベクターpcDNA5/FRTに、2つの一般的なヒト対立遺伝子を挿入した(図3)。
機能的なプラスミド構築物
プライマーAV1466(配列番号30)およびAV1448(配列番号31)を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりヒト脾臓一本鎖cDNA(Life Technologies/Invitrogenより入手可能)から適切なDNA配列を増幅することによって、成熟HUMMHCREP(ヒトMHCクラスI関連タンパク質mRNA)の分泌シグナル配列およびコドン1〜276を得た。
増幅DNA産物をNheIおよびHindIII制限酵素で消化し、得られた産物をNheI/HindIIIで消化したpCDNA5/FRT(Invitrogen)に連結してpSW265を作製した。
pSW265の挿入されたPCR産物のDNAを配列決定し、NheI部位の後にb5’非翻訳(UT)配列の26塩基、その後に成熟HUMMHCREPの分泌シグナル配列およびコドン1〜276、その後に終止コドン、その後にHindIII部位を含むことを確認した。コード化配列が、翻訳された場合にアミノ酸の違いを生じるように意図する配列から逸脱した場合、アミノ酸配列が、配列番号13のように記載される配列の関連部分(アミノ酸1〜276)と一致するように、部位特異的突然変異誘発によりコドンを変更した(New England BioLabs Phusion(登録商標)部位特異的突然変異誘発キットおよび適切なプライマーを使用)。
修正されたプラスミドはpSW271と称され、5’UT配列の26塩基をコードする修正されたDNA配列、その後に成熟HUMMHCREPの分泌シグナル配列およびコドン1−276、その後に終止コドン、配列番号14を含んでいた。
プライマーAV1490(配列番号32)およびAV1489(配列番号33)ならびにpSW271を使用してPCR産物を生成し、続いてBamHIおよびBsmBIで消化し、pSW271の約5259bpのBamHI/BsmBI断片に連結した。その結果得られた構築物pSW275は、BsmBI部位を欠損している。
New England BioLabs Phusion(登録商標)の部位特異的突然変異誘発キットならびにプライマーAV1493(配列番号34)およびAV1494(配列番号35)を使用して、2つのBsmBI部位をpSW275のMICAコード化領域に挿入してpSW276を作製した。
MICAコドン125がAAG(Lys)の代わりにGAG (Glu)であることを除いて、プラスミドpSW267はpSW271と同じである。これは、部位特異的突然変異誘発によりpSW265から得た(New England BioLabs PhusionキットをプライマーAV1478(配列番号39)およびAV1479(配列番号40とともに使用)。この突然変異誘発により、GGG(Gly)〜TGG(Trp)のMICAコドン14およびGCT(Ala)〜ACT (Thr)のコドン24を変更した。
プライマーAV1486(配列番号41)およびAV1487(配列番号42)を使用して、部位特異的突然変異誘発によりpSW267からプラスミドpSW273を作製した。pSW273は、シグナルペプチドと成熟ペプチドの残基1との間に6つのヒスチジンコドンを含む。
部分的hph(ハイグロマイシン耐性)遺伝子からBsmBI部位が欠失されていることを除いて、プラスミドpKK33はプラスミドpSW273と同一である。プライマーAV1490(配列番号32)および1489(配列番号33)を用いて増幅することによりプラスミドpSW273からPCR断片を得た。この約727bpの断片をBamHIおよびBsmBIで消化し、pSW273の約5277bpのBamHI/BsmBI消化断片に連結した。これにより、BsmBI部位が除去され、pKK34が作製された。
次に、MICAのα3ドメインのループ1に結合配列を挿入するためのpKK34に由来する構築物について説明する。
以下のループ1の構築物は、MICAのT189とV200との間に指定された異種ペプチド「インサート」を挿入し、位置190〜199の残基を指定されたインサートで置換することによって生成した。
MICAのT189とV200との間に挿入されたSRGDHPRTQ(配列番号43、ループ3.1と称される)をコードする配列を有するpKK36を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1830(上の鎖)(配列番号44)およびAV1831(下の鎖)(配列番号45)をBsmBIで消化したpKK34に連結した。
MICAのT189とV200との間に挿入されたRTSRGDHPRTQ(配列番号46、ループ3.2と称される)をコードする配列を有するpKK37を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1832(上の鎖)(配列番号47)およびAV1833(下の鎖)(配列番号48)をBsmBIで消化したpKK34に連結した。
MICAのT189とV200との間に挿入されたRVPRGDSDLT(配列番号49、ループ3.3と称される)をコードする配列を有するpKK38を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1834(上の鎖)(配列番号50)およびAV1835(下の鎖)(配列番号51)をBsmBIで消化したpKK34に連結した。
MICAのT189とV200との間に挿入されたRSARGDSDHR(配列番号52、ループ3.4と称される)をコードする配列を有するpKK39を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1836(上の鎖)(配列番号53)およびAV1837(下の鎖)(配列番号54)をBsmBIで消化したpKK34に連結した。
MICAのT189とV200との間に挿入されたVTRGDTFTQS(配列番号55、ループ5.1と称される)をコードする配列を有するpKK40を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1838(上の鎖)(配列番号56)およびAV1839(下の鎖)(配列番号57)をBsmBIで消化したpKK34に連結した。
MICAのT189とV200との間に挿入されたRGDTFTQS(配列番号58、ループ5.2と称される)をコードする配列を有するpKK41を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1840(上の鎖)(配列番号59)およびAV1841(下の鎖)(配列番号60)をBsmBIで消化したpKK34に連結した。
MICAのT189とV200との間に挿入されたHLARGDDLTY(配列番号61、ループ5.3と称される)をコードする配列を有するpKK42を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1842(上の鎖)(配列番号62)およびAV1843(下の鎖)(配列番号63)をBsmBIで消化したpKK34に連結した。
MICAのT189とV200との間に挿入されたSGGSGGGSTSRGDHPRTQSGGSGGG(配列番号64、伸長ループ3.2spと称される)をコードする配列を有するpKK44を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1854(上の鎖)(配列番号65)およびAV1855(下の鎖)(配列番号66)をBsmBIで消化したpKK34に連結した。
MICAのT189とV200との間に挿入されたSGGSGGGSRVPRGDSDLTSGGSGGG(配列番号67、伸長ループ3.3spと称される)をコードする配列を有するpKK45を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1856(上の鎖)(配列番号68)およびAV1857(下の鎖)(配列番号69)をBsmBIで消化したpKK34に連結した。
MICAのT189とV200との間に挿入されたSGGSGGGSVTRGDTFTQSSGGSGGG(配列番号70、伸長ループ5.1spと称される)をコードする配列を有するpKK46を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1858(上の鎖)(配列番号71)およびAV1859(下の鎖)(配列番号72)をBsmBIで消化したpKK34に連結した。
MICAのT189とV200との間に挿入されたSGGSGGGSHLARGDDLTYSGGSGGG(配列番号73、伸長ループ5.3spと称される)をコードする配列を有するpKK47を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1860(上の鎖)(配列番号74)およびAV1861(下の鎖)(配列番号75)をBsmBIで消化したpKK34に連結した。
次に、ループ3に結合配列を挿入するための構築物について説明する。
以下のループ3の構築物は、MICA残基イソロイシン249とシステイン259との間に指定された異種ペプチド「インサート」を挿入し、位置250〜258の残基を指定されたインサートで置換することによって生成した。
プラスミドpSW276をBsmBIで消化し、キナーゼ化およびアニーリングしたオリゴヌクレオチドAV1826(配列番号36)およびAV1827(配列番号37)に連結してpKK35を作製した。このプラスミドは、MICA残基イソロイシン249とシステイン259との間のSGGSGGGSHHHHHHHHHHSGGSGGG(配列番号38)をコードし、位置250〜258の残基を置換する配列を含んでいた。
SGGSGGGSTSRGDHPRTQSGGSGGG(配列番号76、伸長ループ3.2spと称される)をコードする配列を有するpKK48を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1864(上の鎖)(配列番号77)およびAV1865(下の鎖)(配列番号78)をBsmBIで消化したpSW276に連結した。
MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSRVPRGDSDLTSGGSGGG(配列番号79、伸長ループ3.3spと称される)をコードする配列を有するpKK49を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1866(上の鎖)(配列番号80)およびAV1867(下の鎖)(配列番号81)をBsmBIで消化したpSW276に連結した。
MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSVTRGDTFTQSSGGSGGG(配列番号82、伸長ループ5.1spと称される)をコードする配列を有するpKK50を作製するために、
リン酸化オリゴヌクレオチドAV1868(上の鎖)配列番号83)およびAV1869(下の鎖)(配列番号84)をBsmBIで消化したpSW276に連結した。
MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSHLARGDDLTYSGGSGGG(配列番号85、伸長ループ5.3spと称される)をコードする配列を有するpKK51を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1870(上の鎖)(配列番号86)およびAV1871(下の鎖)(配列番号87)をBsmBIで消化したpSW276に挿入した。
次に、「緊密な」ループ1に結合配列を挿入するための構築物について説明する。
以下の「緊密な」(T)ループ1の構築物は、MICAのN187とC202の間に指定された異種ペプチドの「インサート」を挿入することによって生成した、すなわち、MICAの残基188〜201を指定されたインサートで置換した。
プラスミドpKK34をプライマーAV1873(配列番号88)およびAV1872(配列番号89)で変異誘発し、MICAのN187とC202との間のインサートをクローン化するために好適である都合のよいBsmBI部位を含むpSW324を作製した。
MICAのN187とC202との間に挿入されたTSRGDHPRTQ(配列番号90、緊密T−3.1と称される)をコードする配列を有するpKK52を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1874(上の鎖)(配列番号91)およびAV1875(下の鎖)(配列番号92)をBsmBIで消化したpSW324に連結した。
MICAのN187とC202との間に挿入されたGSRGDSLIMH(配列番号93、緊密T−3.5と称される)をコードする配列を有するpKK53を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1876(上の鎖)(配列番号94)およびAV1877(下の鎖)(配列番号95)をBsmBIで消化したpSW324に連結した。
MICAのN187とC202との間に挿入されたRVPRGDSDLT(配列番号96、緊密T−3.3と称される)をコードする配列を有するpKK54を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1878(上の鎖)(配列番号97)およびAV1879(下の鎖)(配列番号98)をBsmBIで消化したpSW324に連結した。
MICAのN187とC202との間に挿入されたVTRGDTFTQS(配列番号99、緊密T−5.1と称される)をコードする配列を有するpKK55を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1880(上の鎖)(配列番号100)およびAV1881(下の鎖)(配列番号101)をBsmBIで消化したpSW324に連結した。
MICAのN187とC202との間に挿入されたHLARGDDLTY(配列番号102、緊密T−5.3と称される)をコードする配列を有するpKK56を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1882(上の鎖)(配列番号103)およびAV1883(下の鎖X、配列番号104)をBsmBIで消化したpSW324に連結した。
MICAのN187とC202との間に挿入されたYQSWRYSQ(配列番号105、テンダミスタット由来のループ1、緊密T−AMYと称される)をコードする配列を有するpKK84を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1906(上の鎖)(配列番号106)およびAV1907(下の鎖)(配列番号107)をBsmBIで消化したpSW324に連結した。
次に、同じ可溶性MICA分子のループ1およびループ3の両方に結合配列を挿入するための構築物について説明する。
ループ1およびループ2の両方に挿入された結合配列を有する可溶性MICA分子をコードする構築物を作製するために、我々はpKK115を作製した。ベクターpKK115は、ループ1の伸長5.1sp(配列番号82)と、他の配列をループ3にクローン化するのに好適である都合のよいBsmBI部位とを含む。ベクターpKK115は、プライマーAV1493(配列番号108)およびAV1494(配列番号109)を用いたpKK46の部位特異的突然変異誘発によって作製した。
ループ1の伸長5.1spと、MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSTSRGDHPRTQSGGSGGG(配列番号76)、伸長ループ3.2spと称される)をコードする配列とを有するpKK128を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1864(上の鎖)(配列番号77)およびAV1865(下の鎖)(配列番号78)をBsmBIで消化したpKK115に連結した。
ループ1の伸長5.1spと、MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSVTRGDTFTQSSGGSGGG(配列番号82、伸長ループ5.1spと称される)をコードする配列とを有するpKK129を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1868(上の鎖X、配列番号83)およびAV1869(下の鎖)(配列番号84)をBsmBIで消化したpKK115に連結した。
ループ1の伸長5.1spと、MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSHLARGDDLTYSGGSGGG(配列番号85、伸長ループ5.3spと称される)をコードする配列とを有するpKK130を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1870(上の鎖)(配列番号86)およびAV1871(下の鎖)(配列番号87)をBsmBIで消化したpKK115に連結した。
ループ1の伸長5.1spと、MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSVTRGDTFTQSSGGSGGG(配列番号82)、非相同伸長ループ5.1spNHと称される)をコードする配列とを有するpKK131を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1908(上の鎖)(配列番号110)およびAV1909(下の鎖)(配列番号111)をBsmBIで消化したpKK115に連結した。
次に、内部結合インサートを有する可溶性MICA分子をコードする上述の作製した構築物の培養ヒト細胞発現と、それらの標的結合のELISAに基づく分析について説明する。
プラスミド構築物pKK35−42、pKK44−56、およびpKK128−131の場合、10cm組織培養皿中の培養密度90%の293T細胞(ATCC)の培養物に、Fugene HD遺伝子導入試薬(Roche Applied Science)を使用して、10μgの各プラスミドDNAを遺伝子導入した。3日後、各培養物の培養培地を回収し、Eppendorf 5810R卓上型遠心機にて4000rpmで遠心分離することにより、浮遊している細胞を除去した。Pierce濃縮機の7ml/9K(カタログ番号AV89884A)回転管を使用して、回収された約9.5mlの各サンプルを濃縮した。回転機は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で予め洗浄した。各サンプルを濃縮機に加え、次いで、Eppendorf 5810R卓上型遠心機にて30分間4000rpmで遠心分離した。6mlのPBSで各サンプルを3回洗浄し、濃縮した:各回ともEppendorf 5810R卓上型遠心機にて30分間4000rpm回転させた。可溶性MICAのためのELISAによって、得られた各サンプル溶液中の可溶性MICAの濃度を推定した。捕捉剤は、マウス抗ヒトMICA(R&D Systems 部品番号841612)、検出抗体は、ストレプトアビジン−HRPおよびUltra TMBを用いて展開したビオチン化ヤギ抗ヒトMICA(R&D Systems 部品番号841613)であった。
意図する標的タンパク質であるインテグリンαVβ3またはαVβ5をELISAプレート上の捕捉剤として使用して、ELISAより、濃縮した上清の各々において可溶性MICA分子が標的分子に結合する能力を測定した。それぞれのインテグリンがELISAプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、本分野で周知のようにブロックした。293T細胞によって生成および分泌された可溶性MICAの各サンプル(100μl)を、αVβ3またはαVβ5を含むウェルに加え、インキュベートし、洗浄した。Ultra TMB−ELISA基質を用いて展開したヒトMICAに対するHRPコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉された可溶性MICA分子を検出し、光学密度を読み取った。MICA特異的ELISAにより、各サンプル中の可溶性MICAの量を決定した。結合した可溶性MICA分子から特異的なインテグリンへのシグナル(全MICAのng当たり)が示される。非結合陰性対照MICA(pSW273によって生成した)からのELISAシグナルを各インテグリン結合シグナルから差し引いた。対照とともに、pKK35〜42およびpKK44〜56から生成された単一ペプチドインサートを有するMICA産物の結果を表1に示す。それらの特異的インサートのアミノ酸配列および配列番号を表2に表す。遺伝子操作によってそれらのループのうちの1つのみに挿入された結合ペプチドを有する可溶性MICA分子は、インテグリン標的に結合する。
表1.可溶性MICA中の単一インサートからのインテグリン結合ELISAデータ
表2.293細胞において発現されたプラスミドとファージプラスミドの相関関係、それらの慣用名、ループ1、ループ3、またはループ1および3の両方に挿入されたアミノ酸配列、ならびに対応するインサートの配列番号
対照とともに、pKK128〜131から生成された1つより多くのループに挿入された結合ペプチドを有するMICAの結果を表3に示す。pKK128〜131から生成された可溶性MICA分子のインテグリン標的結合についてのELISAアッセイを以下のように行った。それぞれのインテグリンがELISAプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、ブロックした。培養上清の各サンプル(100μl)をαVβ3またはαVβ5を含むウェルに加え、インキュベートし、洗浄した。Ultra TMB−ELISA基質を用いて展開したヒトMICAに対するHRPコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉された可溶性MICA分子を検出し、光学密度を読み取った。MICA特異的ELISAにより、各サンプル中の可溶性MICAの量を決定した。特異的インテグリンに結合した1つより多くのインサートを有する可溶性MICA分子のシグナル(全MICAのng当たり)を表3に示す。それらの特異的インサートのアミノ酸配列および配列番号を表2に表す。1つより多くの内部ループに挿入された結合ペプチドを有するこれらの可溶性MICA分子は、単一の内部結合ペプチドのみを有する分子よりも高い結合を示し、分子当たり1つより多くの結合モチーフの結合力効果が示唆された。さらに、可溶性MICA分子がMICA分子当たり1つより多くのαVβ5特異的な内部結合ぺプチドを有する場合に、可溶性MICA分子の意図する標的、例えば、αVβ5への特異性が、密接に関連する標的であるαVβ3よりも高かった。その標的に対する結合力を示すMICA分子には、そのような結合および結合特異性の増加が期待された。よって、複製結合剤および異なる結合剤の両方である二価のMICA結合剤を作製し、二重特異性MICA分子およびその標的に対する親和性を超える結合力を有するMICA分子を生成することができた。
表3.可溶性MICAにおける2つのインサートからのインテグリン結合ELISAデータ
3.M13ファージ上のMICA−α3ドメインタンパク質の表示
所望の標的結合表現型を有する遺伝子操作したMICA分子をコードする新しい遺伝子の単離のためのシステムを開発するために、α3ドメインのアミノ酸181〜276をコードするDNAをコドン位置198でM13ファージ(M13mp18、Smithベクター型「33」)のカプシド遺伝子IIIに融合し(図4)、混合された野生型(wt)およびα3−pIIIキメラカプシドを用い、ヘルパーファージM13ファージを用いずに生成した(Bass et al.,1990)。大腸菌からPEG精製したファージ調製物のタンパク質染色SDS−PAGE分析により、集団における融合タンパク質およびwt pIIIタンパク質の両方の存在を確認した(データは示さず)。
テンダミスタットは、MICAのα3ドメインの構造に類似した三次元構造を有する細菌タンパク質である(Pflugrath et al.,1986)。ランダムペプチドをテンダミスタットに挿入し、ヒトインテグリンへの結合のためにM13ファージディスプレイによって選択した(McConnell and Hoess,1995;Li et al,2003)。ELISAアッセイのための陽性対照として、テンダミスタットをM13のpIIIに融合した。平行して、ここで、MICAのα3ドメインのループ1または3に挿入された同じデカペプチドのうちのいくつかが、カプシドpIIIに融合されたα3ドメインを表示するM13ファージを、ELISAフォーマットにおいてインテグリンに結合するように同様に誘導することができるかどうかを判定した。
次に、ループ1、ループ3、またはループ1およびループ3の両方に異なる結合ペプチドを有するMICAのα3ドメインを表示するM13ファージの構築、発現、およびアッセイについて説明する。
M13ファージM13KE(New England BioLabsから得た)を、プライマーAV1887(配列番号112)およびAV1888(配列番号113)を用いたPCR増幅反応における鋳型として使用した。
M13KE遺伝子IIIのC末端部分からなるPCR産物をEcoRIおよびHindIIIで消化し、EcoRI/HindIIIで消化したM13ファージベクターM13mp 18(GenBank X02513)に連結してファージベクターpSW326を作製した。
EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND(配列番号114)をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK59を作製した。
EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND−3A(配列番号 115)をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK60を作製した。
EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND−3B(配列番号116)をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK61を作製した。
EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND−5A(配列番号117)をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK63を作製した。
EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND−5B(配列番号118)をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK64を作製した。
EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND−His8(配列番号119、His8は配列番号130)をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK65を作製した。
ファージベクターpKK106を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK29から約320bpの断片を増幅した。次いで、野生型MICAのα3配列(配列番号1〜6、13)を表すこの断片を、EcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK91を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK35から約356bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK92を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK36から約305bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK93を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK37から約311の断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK94を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK38から約308bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK95を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK39から約308bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK96を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK40から約308bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK97を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK41から約302bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK98を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK42から約308bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK100を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK44から約353bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK101を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK45から約353bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK102を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK46から約353bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK103を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK47から約353bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK104を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK48から約356bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK105を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK49から約356bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK107を作製するために、プライマーKK69(配列番号122)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK52から約344bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK108を作製するために、プライマーKK70(配列番号123)およびAV1898配列番号121)を使用して、PCRによりpKK53から約284bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK109を作製するために、プライマーKK71(配列番号124)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK54から約284bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK110を作製するために、プライマーKK72(配列番号125)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK55から約284bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK111を作製するために、プライマーKK73(配列番号126)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK56から約284bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK112を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK84から約278bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK136を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK128から約413bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK137を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK129から約413bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK138を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK130から約413bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
ファージベクターpKK139を作製するために、プライマーAV1897(配列番号120)およびAV1898(配列番号121)を使用して、PCRによりpKK131から約413bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。
NEBαF’tet形質転換受容性大腸菌細胞にファージベクターを独立して形質転換した。形質転換細胞によって生成されたファージを滴定し、それらの濃度を1ml当たり10
13に希釈して調製した。意図する標的タンパク質であるインテグリンαVβ3またはαVβ5をELISAプレート上の捕捉剤として使用して、ELISAによりファージ調製物の各々における可溶性MICA分子の能力を測定した。それぞれのインテグリンがELISAプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、本分野で周知のようにブロックした。ファージ調製物の各サンプル(100μl)を、αVβ3またはαVβ5を含むウェルに加え、インキュベートし、洗浄した。Ultra TMB−ELISA基質を用いて展開したM13ファージコートに対するHRPコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉されたファージを検出し、光学密度を読み取った。M13ファージの力価は、8X10
12〜1.1X10
13/mlの範囲だった。pKK91〜98および100〜112から生成された単一ペプチドインサートを有するα3ドメインを表示するファージの結果を表4に示す。それらの特異的インサートのアミノ酸配列および配列番号を表2に表す。遺伝子操作によってそれらのループのうちの1つのみに挿入された結合ペプチドを有するα3ドメインを表示する、pIIIカプシドタンパク質に融合されたファージは、インテグリン標的に結合する。
表4.MICAのα3−PIIIバクテリオファージディスプレイにおける単一インサートからのインテグリン結合ELISAデータ
対照とともに、pKK136、138、および139から生成された1つより多くのループに挿入された結合ペプチドを有するα3ドメインを表示するファージの結果を表5に示す。結合ペプチドインサートが1つより多くのループに移植されたα3ドメインを表示するM13ファージのインテグリン標的結合に関するELISAアッセイを以下のように行った。それぞれのインテグリンがELISAプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、ブロックした。ファージ調製物の各サンプル(100μl)をαVβ3またはαVβ5を含むウェルに加え、Ultra TMB−ELISA基質を用いて展開したM13ファージコートに対するHRPコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉されたファージを検出し、光学密度を読み取った。M13ファージの力価は、8X10
12〜1.1X10
13/mlの範囲だった。pKK136、138、および139から生成された1つより多くのペプチドインサートを有するα3ドメインを表示するファージ、ならびにpKK93、102、もしくは103から生成された1つのインサートを有するか、またはインサートを含まない(pKK106)α3ドメインを表示する対照の結果を示す。それらの特異的インサート(複数可)のアミノ酸配列および配列番号を表2に表す。1つより多くの内部ループに挿入された結合ペプチドを有するこれらのα3ドメインは、単一の内部結合ペプチドのみを有するドメインよりも高いファージの標的結合を伝達し、分子当たり1つより多くの結合モチーフの結合力効果が裏付けられた。さらに、α3ドメインが1つより多くのαVβ5特異的な内部結合ペプチドを有する場合に、α3ドメインのその意図する標的、例えば、αVβ5への特異性が、この場合も、密接に関連する標的であるαVβ3よりも高かった(結合力効果)。
表5.MICAのα3−PIIIバクテリオファージディスプレイにおける移植された2つのインサートからのインテグリン結合ELISAデータ
4.可溶性の標的MICAは、標的細胞を死滅させるためにNK細胞を動員するための特異的なアダプター分子として作用した。
LIVE/DEAD(登録商標)細胞生存率アッセイを、Chromy et al,2000によって本質的に記載されるように、また、製造業者のプロトコル(Invitrogen、Carlsbad,CA)従って行った。端的に述べると、96ウェル平底培養プレートに、1x104細胞/ウェルの密度でヒト標的細胞(MCF7およびHeLa)を播種したところ、2日で80%の培養密度に達した。pKK131を一過性に遺伝子導入した293T細胞の培養上清を、Pierce 9K MWCO 回転機により約100倍に濃縮し、MICA特異的ELISAによってMICAの濃度を決定した。可溶性の標的MICA分子が標的細胞を死滅させるためにヒトNK細胞を動員する能力を証明するために、標的細胞を含む異なるウェルにおいて、異なる濃度の濃縮した可溶性MICAタンパク質を16時間インキュベートした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いてウェルを2回洗浄することにより、非結合タンパク質を除去した。次いで、可溶性MICAに暴露した標的細胞をカルセイン−AM(2μΜ)を用いて30分間37℃で処理し、全ての生存細胞において緑色蛍光を得た。インキュベーション後、再びPBSを用いて細胞を2回洗浄し、次いで、標的細胞に対して10:1および5:1の比率で生存NK−92MI細胞に暴露した。NK−92MI細胞を標的細胞とともに4時間インキュベートし、次いで、非結合NK−92MI細胞を除去し、PBSを用いて標的細胞を2回洗浄した。次に、30分間37℃でエチジウムホモ二量体(2μΜ)を加え、NK細胞死滅の程度を判定した。細胞を洗浄し、蛍光プレートリーダー(SoftMaxPro)上で分析した。NK細胞の非存在下において、また5:1および10:1の比率ならびに0,64pgおよび128pgで可溶性の標的MICAを加えたウェルからの赤色(エチジウム)および緑色(カルセイン−AM)の蛍光シグナルの平均を使用して、生存細胞および死滅細胞を定量した。
標的MICAの非存在下において0、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、(死滅した)MCF細胞からの赤色蛍光シグナルは、12.6±1.1から12.9±2.9、そして12.0±1.0へと変化した。64pgの標的MICAの存在下において、0、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、(死滅した)MCF細胞からの赤色蛍光シグナルは、19.9±2.4から27.0±1.0、そして31.0±1.6へと変化した。標的MICAを128pgで加えた場合、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、(死滅した)MCF細胞からの赤色蛍光シグナルは、25.6±2.2から41.0±6.7へと変化した。標的MICAの非存在下で、0、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、同じウェル内の生存細胞からの対応する蛍光(緑色)シグナルは、5621±372、5535±205および5721±335であった。64pgの標的MICAの存在下において、0、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、生存MCF細胞からの緑色蛍光シグナルは、5028±177から5181±102、そして3697±591へと変化した。標的MICAを128pgで加えた場合、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、生存MCF細胞からの緑色蛍光シグナルは、3459±394から2191±331へと変化した。
徐々に増加する量の標的MICAをウェルに加えたところ、標的インテグリンを発現しないHeLa細胞からの蛍光シグナルは、NK−92MI細胞による死滅の増加を示唆しなかった。