CN104131034A - 一种嵌合载体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种嵌合载体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104131034A CN104131034A CN201410275218.8A CN201410275218A CN104131034A CN 104131034 A CN104131034 A CN 104131034A CN 201410275218 A CN201410275218 A CN 201410275218A CN 104131034 A CN104131034 A CN 104131034A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vif
- rbd
- albumen
- kras
- ptd
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 7
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 7
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 7
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 5
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 4
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 3
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 abstract description 33
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 abstract description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 16
- 101710201961 Virion infectivity factor Proteins 0.000 abstract description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 abstract 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 abstract 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 abstract 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 abstract 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 abstract 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 101150105104 Kras gene Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 3
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 3
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 102200006539 rs121913529 Human genes 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 2
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 2
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 102200006531 rs121913529 Human genes 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 2
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 2
- IVYQODXBAVAAMS-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[2-[[6-amino-2-[[6-amino-2-[[2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino] Chemical compound NC(N)=NCCCC(N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O IVYQODXBAVAAMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 230000010558 Gene Alterations Effects 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710141955 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009605 growth rhythm Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150059019 vif gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供一种嵌合载体，是通过将能够与GTP-Kras特异性结合的Raf蛋白N端的RAS结合结构域替换Vif蛋白的N端所得。本研究通过设计并构建RBD-Vif-C载体，然后通过细胞水平的体外实验和裸鼠肿瘤模型的体内实验证明RBD-Vif-C载体具有良好的肿瘤细胞杀伤效果，提出了一种特异性针对突变型KRAS的新型抗肿瘤技术。Vif-C载体在降解KRAS蛋白中的成功应用，使其有望成为一种新型的基因敲除手段。作用虽类似于siRNA，但却优越于siRNA的功能。Vif-C载体可以特异性地降解靶标蛋白，尤其是一些处于某种特殊修饰或特殊状态下的蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白抗癌药物，更具体地，涉及一种嵌合载体及其制备方法和应用。
背景技术
一直以来，控制细胞生长分化中的表达或功能的细胞基因组中如果发生改变都被认为是诱发肿瘤的主要原因。肿瘤的分子生物学研究旨在确定那些在各种肿瘤类型的基因改变，并阐明这些基因在肿瘤发生中的作用。其中，最常见的人类肿瘤突变的基因家族之一就是RAS基因。
正常生理情况下，在细胞受到外界刺激后激活EGFR等信号通路时，野生型的KRAS被活性EGFR等酪氨酸激酶磷酸化后短暂活化，活化后的KRAS可以激活该信号通路中的下游信号蛋白，而后KRAS迅速失活。KRAS激活/失活效应是受控的。然而，突变型KRAS蛋白导致蛋白功能异常，在无EGFR活化信号刺激下仍处于激活状态，其功能状态不可控，导致肿瘤的持续增殖等。RAS基因就像体内的一个“开关”，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用。正常的KRAS基因可抑制肿瘤细胞生长，而一旦发生突变，它就会持续刺激细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤的发生。因为KRAS基因突变一般发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致；一般认为，KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。因此，检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后和放化疗疗效的重要指标，具有极其重要的临床意义。
在我国，胰腺癌一直以来都是我国人口死亡的十大恶性肿瘤之一，5年生存率不到5%，是预后最差的恶性肿瘤之一。近年来，在广东地区，大肠癌已经成为第二大癌症杀手，有明显增加的趋势，其发病率和死亡率也明显逐年上升。肿瘤细胞RAS基因突变率大约为25%，而胰腺癌，结肠癌和非小肺泡肺癌中分别达到90%，45%和35%。
发明内容
本发明的目的之一提供一种嵌合载体是通过将能够与GTP-Kras特异性结合的Raf蛋白N端的RAS结合结构域替换Vif蛋白的N端所得。
本发明另外给出一种嵌合载体的制备方法，包括以下步骤：
S1. Raf的蛋白结构上有一个特异性结合GTP-KRAS的RAS结合结构域RBD，将这个RBD结构域替换Vif蛋白N端的1-79 位氨基酸序列，从而构建了一个新的嵌合蛋白RBD-Vif-C；
S2. 将嵌合载体克隆到表达载体pcDNA3.1上，通过转染进行瞬时表达，
S3. 从公司合成跨膜肽片段PTD，然后将其连接到pet-32a的大肠杆菌表达载体上
S4.以RBD-Vif-C为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物RBD-Vif-C连接到pet-32a的表达载体上，并且PTD位于RBD-Vif-C的N端，形成融合表达载体PTD-RBD-Vif-C
S5. 将PTD-RBD-Vif-C的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，
S6. 对转化的大肠杆菌进行培养，
S7. 经镍柱纯化，得到单一的PTD-RBD-Vif-C蛋白，
其中，S6中，所述培养是将转化的大肠杆菌单菌落接种至含氨苄青霉素LB液体培养基中培养过夜；再按1:50体积比接种到37℃预热的含氨苄青霉素LB液体培养基中培养至OD600达0.6；表达PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，经诱导后收集菌体，
S7中，所述纯化的方法是将总菌体用PBS Buffer洗涤，重悬，超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经镍柱亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白。
本发明提供一种上述的嵌合载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤为胰腺癌肿瘤、大肠癌肿瘤或肺癌肿瘤。
本发明另外提出一种上述的嵌合载体在制备降解突变KRAS的药物中的应用。
Vif蛋白是HIV-1自身的一个重要蛋白，可以结合靶标蛋白，把它们连结到一个E3连接酶（ligase）复合物（Vif-SCF-CUL5 complex）上，然后这个复合物将使靶标蛋白泛素化，从而导致其在proteasome（蛋白酶体）中的降解。本发明重点关注KRAS突变引发的相关癌症，试图将能够与GTP-Kras特异性结合的Raf蛋白N端的结合结构域RBD替换Vif的N端，通过体内体外等多种试验探索此嵌合型蛋白降解突变型KRAS的效率和作用机理。这一技术发明对进一步研发抗肿瘤的蛋白类药物具有十分重要的意义。因此，我们提出的这种新的构建嵌合蛋白的方法，将极有可能成为一种新的抗肿瘤的新技术，具有极为重要的学术价值和实用价值。
（1）为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种新型的嵌合载体的构建的方法及其在生命科学研究及肿瘤的临床治疗中的应用。
（2）本发明提供了一种全新的KRAS基因相关的肿瘤杀伤技术。
（3）本发明提出了一种降解KRAS蛋白表达的新技术。
（4）本发明提出了一种全新的在蛋白水平上可以特异性降解特殊状态或者特殊修饰的蛋白的新技术。
（5）本发明提出了一种新的降解多种蛋白的新手段——将某种蛋白的结合为点插入到Vif基因的N端，从而通过Vif C端的泛素化通路实现特异性蛋白的降解过程。
（6）本发明提供了一种新的技术在治疗胰腺癌肿瘤中的应用。
（7）本发明提供了一种新的技术在治疗大肠癌（结直肠癌）肿瘤中的应用。
（8）本发明提供了一种新的技术在治疗肺癌肿瘤中的应用。
附图说明
图1： 嵌合载体RBD-Vif-C的构建模型。
图2： 嵌合载体RBD-Vif-C可以降解KRAS蛋白，并抑制其下游磷酸化信号通路。
图3： PTD-RBD-Vif-C蛋白在体外具有良好的肿瘤细胞杀伤作用。
图4： PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内具有良好的抗肿瘤效果。
图5： PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内的急毒实验。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
实施例1 嵌合载体RBD-Vif-C的构建模型
众所周知，胰腺癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤的发生与KRAS基因的突变有莫大的关联。KRAS的单个点突变就足以导致肿瘤的发生，其中KRAS的第12位氨基酸的突变占了KRAS单点突变的98%，而在这第12位氨基酸的突变种类中又分别抑G12V和G12D突变最为显著，分别占了30%和51%。我们利用Vif诱导靶蛋白的降解机制实现对突变型KRAS蛋白的特异性降解，从而研发新型的抗肿瘤的药物。
根据查阅文献了解到，RAF-1蛋白的N-端存在一个特异性结合突变型KRAS的结合结构域RBD（KRAS binding domain），它在体内体外都可以特异地结合突变型KRAS蛋白，其对GTP-Kras与GDP-Kras结合的亲和力的差别达1000倍。于是，我们将RBD替换Vif蛋白的N端，然后连接到pcDNA3.1的载体上形成了RBD-Vif-C嵌合载体。
具体方法如下：
（1）Raf的蛋白结构上有一个特异性结合GTP-KRAS的RAS结合结构域RBD，将这个RBD结构域替换Vif蛋白N端的1-79 位氨基酸序列，从而构建了一个新的嵌合蛋白RBD-Vif-C
（2）将这三个嵌合载体分别克隆到表达载体pcDNA3.1上，通过转染进行瞬时表达
（3）从公司合成跨膜肽片段PTD，然后将其连接到pet-32a的大肠杆菌表达载体上
（4）以RBD-Vif-C为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物RBD-Vif-C连接到pet-32a的表达载体上，并且PTD位于RBD-Vif-C的N端，形成融合表达载体PTD-RBD-Vif-C
（5）将PTD-RBD-Vif-C的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中
（6）对转化的大肠杆菌进行培养
（7）经镍柱纯化，得到单一的PTD-RBD-Vif-C蛋白
其中，步骤（1）中，所述的载体构建包括以下步骤：根据HIV-1的Vif蛋白和KRAS蛋白分别合成2对引物，然后以HIV-1病毒的PNL4-3质粒序列为模板，利用上述引物进行PCR扩增；然后利用不同的酶切位点将PCR扩增产物克隆到pcDNA3.1上，其中RBD的片段插入位置在Vif片段的N端。
步骤（6）中，所述培养是将转化的大肠杆菌单菌落接种至含氨苄青霉素LB液体培养基中培养过夜；再按1:50体积比接种到37℃预热的含氨苄青霉素LB液体培养基中培养至OD600达0.6；表达PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，经诱导后收集菌体。
步骤（7）中，所述纯化的方法是将总菌体用PBS Buffer洗涤，重悬，超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经镍柱亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白。
实施例2 嵌合载体RBD-Vif-C可以降解KRAS蛋白，并抑制其下游磷酸化信号通路
将突变型的KRAS基因KRAS-G12D和KRAS-G12V分别与RFP基因融合表达并克隆到pcDNA3.1的载体上，这样可以通过观察RFP的表达来反映KRAS的表达情况；同时用western blot来进一步验证KRAS的表达情况。
（1）在6孔板的293t细胞中，共转染KRAS-G12D-RFP和RBD-Vif-C载体或KRAS-G12V-RFP和RBD-Vif-C载体，质粒的量均为1 ug，转染48h后观察RFP的表达；同时收细胞裂解做Western Blot检测KRAS的表达
该实验说明了，RBD-Vif-C可以降解突变型的KRAS蛋白。
（2）在6孔板的293t细胞中转染KRAS-G12D和RBD-Vif-C质粒，48h后收细胞裂解做Western Blot检测ERK及磷酸化的ERK的表达情况
该实验说明了，RBD-Vif-C可以通过降解KRAS蛋白来抑制其下游的磷酸化的信号通路。
实施例3 PTD-RBD-Vif-C蛋白在体外具有良好的肿瘤细胞杀伤作用
考虑到胰腺癌、肺癌和大肠癌细胞质粒系统转染效率低等因素，以及后续的蛋白成药性因素，于是，我们选择用大肠杆菌来表达相应的RBD-Vif-C蛋白，同时选择GFP-Vif-C作为阴性对照蛋白，试图直接通过蛋白的作用方式来验证RBD-Vif-C对KRAS基因的表达抑制。
我们首先参考相关文献的方法，合成了一个可以高效跨膜的短肽PTD，序列如图所示。然后，我们将跨膜肽和RBD-Vif-C一起克隆到pET-32a原核表达载体上，通过原核系统表达RBD-Vif-C蛋白。我们采用镍柱纯化带His-tag的PTD-RBD-Vif-C蛋白，通过多番优化后得到纯度相对较高的蛋白。然后，我们又进一步通过TritonX-114的方法去除蛋白中的内毒素。因为蛋白本身具有跨膜肽，所以我们可以直接将纯化好的蛋白加入到细胞培养上清中，这为我们后续的实验提供了较大的便利。
（1）将多种细胞铺板到24孔板中，待细胞贴壁后，分别加入4ug/well的PTD-RBD-Vif-C蛋白或PTD-GFP-Vif-C蛋白，处理48h后，显微镜下观察并记录各种细胞的生长状态。
该实验说明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白可以抑制多种KRAS相关的肿瘤细胞的增殖。
（2）在24孔板的Panc-1和A549细胞中，分别加入0 ug/well，2 ug/well ，4 ug/well ，8 ug/well的PTD-RBD-Vif-C蛋白，处理48h后，收集细胞，标记Annexin-V FITC的流式抗体，检测两种细胞的凋亡情况。
该实验说明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白可以诱导KRAS相关的肿瘤细胞发生凋亡，并具有一定的浓度梯度依赖性。
（3）在6孔板的Panc-1和A549细胞中，分别加入2 ug/well 的PTD-GFP-Vif-C蛋白和2 ug/well的PTD-RBD-Vif-C蛋白，处理12h后，收集细胞裂解做WB检测两种细胞内源性的KRAS的表达情况；
该实验说明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白可以抑制内源性的KRAS基因表达。
实施例4 PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内具有良好的抗肿瘤效果
在中山大学动物实验中心订购4-6周大小的雄性Balb/c裸鼠6只。随机的将他们分成2组，每组3只。然后分别将1×106的Panc-1和A549细胞接种到小鼠皮下成瘤，2周后观察小鼠皮下成瘤的现象并开始每周注射2-3次PTD-RBD-Vif-C蛋白和PTD-GFP-Vif-C蛋白，4周后处死小鼠取肿瘤组织观察并记录称重。
该实验说明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内具有良好的抗肿瘤效果，尤其是在胰腺癌和肺癌的肿瘤细胞中。
实施例5 PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内的急毒实验
（1）在中山大学动物实验中心订购4-6周大小的雄性Balb/c小鼠18只。随机的将他们分成3组，每组6只；
（2）以尾静脉注射的方式将PTD-RBD-Vif-C蛋白注入小鼠体内，注射量分别为0mg/kg(PBS)，10mg/kg， 20mg/kg，每组6只小鼠；
（3）两周后，取小鼠血样检测肝功能和肾功能，实验结果显示正常；
（4）处死后，取小鼠心肝脾肺肾各个组织样本，HE染色，观测是否有器官发生病变。
该实验说明了，20mg/kg剂量的蛋白对小鼠是无毒安全的，该蛋白具有较好的成药性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种嵌合载体及其制备方法和应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 914
<212> DNA
<213> 融合表达载体PTD-RBD-Vif-C
<400> 1
atgggccgta aaaaacgtcg tcagcgtcgt cgtggccata gcggccgtaa aaaacgtcgt 60
cagcgtcgtc gtggccatat ttatccgtat gatgtgccgg attatgcggg cgatccgggc 120
cgtaaaaaac gtcgtcagcg tcgtcgtaag cttatggagc acatacaggg agcttggaag 180
acgatcagca atggttttgg attcaaagat gccgtgtttg atggctccag ctgcatctct 240
cctacaatag ttcagcagtt tggctatcag cgccgggcat cagatgatgg caaactcaca 300
gatccttcta agacaagcaa cactatccgt gttttcttgc cgaacaagca aagaacagtg 360
gtcaatgtgc gaaatggaat gagcttgcat gactgcctta tgaaagcact caaggtgagg 420
ggcctgcaac cagagtgctg tgcagtgttc agacttctcc acgaacacaa aggtaaaaaa 480
gcacgcttag attggaatac tgatgctgcg tctttgattg gagaagaact tcaagtagat 540
ttcctgcgaa ttctgcagtc gacggtaccg cggcatttgg gtcagggagt ctccatagaa 600
ggaggaaaaa gagatatagc acacaagtag accctgaact agcagaccaa ctaattcatc 660
tgtattactt tgactgtttt tcagactctg ctataagaaa ggccttatta ggacacatag 720
ttagccctag gtgtgaatat caagcaggac ataacaaggt aggatctcta caatacttgg 780
cactagcagc attaataaca ccaaaaaaga taaagccacc tttgcctagt gttacgaaac 840
tgacagagga tagatggaac aagccccaga agaccaaggg ccacagaggg agccacacaa 900
tgaatggaca ctag 914
Claims (6)
1.一种嵌合载体，其特征在于，是通过将能够与GTP-Kras特异性结合的Raf蛋白N端的RAS结合结构域替换Vif蛋白的N端所得。
2.一种嵌合载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. Raf的蛋白结构上有一个特异性结合GTP-KRAS的RAS结合结构域RBD，将这个RBD结构域替换Vif蛋白N端的1-79 位氨基酸序列，从而构建了一个新的嵌合蛋白RBD-Vif-C；
S2. 将嵌合载体克隆到表达载体pcDNA3.1上，通过转染进行瞬时表达，
S3. 将跨膜肽片段PTD连接到pet-32a的大肠杆菌表达载体上,
S4.以RBD-Vif-C为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物RBD-Vif-C连接到pet-32a的表达载体上，并且PTD位于RBD-Vif-C的N端，形成融合表达载体PTD-RBD-Vif-C,
S5. 将PTD-RBD-Vif-C的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，
S6. 对转化的大肠杆菌进行培养，
S7. 经镍柱纯化，得到单一的PTD-RBD-Vif-C蛋白，
其中，S6中，所述培养是将转化的大肠杆菌单菌落接种至含氨苄青霉素LB液体培养基中培养过夜；再按1:50体积比接种到37℃预热的含氨苄青霉素LB液体培养基中培养至OD600达0.6；表达PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，经诱导后收集菌体，
S7中，所述纯化的方法是将总菌体用PBS Buffer洗涤，重悬，超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经镍柱亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的融合表达载体PTD-RBD-Vif-C的序列如SEQ NO:1所示，从N端到C端的结构分别为，跨膜肽PTD部分，RBD的Kras结合部位，Vif-C的降解部分。
4.一种根据权利要求1所述的嵌合载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为胰腺癌肿瘤、大肠癌肿瘤或肺癌肿瘤等KRAS相关的肿瘤。
6.一种根据权利要求1所述的嵌合载体在制备降解突变KRAS的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410275218.8A CN104131034B (zh) | 2014-06-19 | 2014-06-19 | 一种嵌合载体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410275218.8A CN104131034B (zh) | 2014-06-19 | 2014-06-19 | 一种嵌合载体及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104131034A true CN104131034A (zh) | 2014-11-05 |
| CN104131034B CN104131034B (zh) | 2017-04-05 |
Family
ID=51803886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410275218.8A Active CN104131034B (zh) | 2014-06-19 | 2014-06-19 | 一种嵌合载体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104131034B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113956349A (zh) * | 2014-11-26 | 2022-01-21 | 美国卫生和人力服务部 | 抗突变的kras的t细胞受体 |
| US11318134B2 (en) | 2018-01-10 | 2022-05-03 | Recurium Ip Holdings, Llc | Benzamide compounds |
| WO2022217691A1 (zh) * | 2021-04-14 | 2022-10-20 | 中山大学 | 一种融合蛋白及其制备方法与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011130628A1 (en) * | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Curis, Inc. | Treatment of cancers having k-ras mutations |
-
2014
- 2014-06-19 CN CN201410275218.8A patent/CN104131034B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011130628A1 (en) * | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Curis, Inc. | Treatment of cancers having k-ras mutations |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 所广军: "应用K-ras基因突变诊断胰腺癌的探讨", 《中国医师杂志》 * |
| 李震宇 等: "HIV-1 病毒感染因子Vif及其相关抑制剂的研究进展", 《药学学报》 * |
| 马怡晖 等: "靶向敲减Ras 癌蛋白融合型泛素连接酶E3 的构建", 《中国医学科学院学报》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113956349A (zh) * | 2014-11-26 | 2022-01-21 | 美国卫生和人力服务部 | 抗突变的kras的t细胞受体 |
| US11318134B2 (en) | 2018-01-10 | 2022-05-03 | Recurium Ip Holdings, Llc | Benzamide compounds |
| US11344546B2 (en) | 2018-01-10 | 2022-05-31 | Recurium IP Holding, LLC | Benzamide compounds |
| US11590126B2 (en) | 2018-01-10 | 2023-02-28 | Recurium Ip Holdings, Llc | Benzamide compounds |
| US11813259B2 (en) | 2018-01-10 | 2023-11-14 | Recurium Ip Holdings, Llc | Benzamide compounds |
| US11813260B1 (en) | 2018-01-10 | 2023-11-14 | Recurium Ip Holdings, Llc | Benzamide compounds |
| WO2022217691A1 (zh) * | 2021-04-14 | 2022-10-20 | 中山大学 | 一种融合蛋白及其制备方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104131034B (zh) | 2017-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3480307B1 (en) | New genetically-modified vaccinia virus | |
| CN103113470B (zh) | 靶向人egfr的基因工程化淋巴细胞及其制备方法和用途 | |
| US9856477B2 (en) | Delivery of therapeutic agent | |
| CN101495126A (zh) | Ⅱ型单纯疱疹病毒突变体在治疗癌症中的用途 | |
| CN107501405A (zh) | 一种细胞自噬抑制多肽 | |
| CN107760784A (zh) | 环状RNA circ‑FOXP1的用途 | |
| CN107475275A (zh) | 嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用 | |
| CN105802909A (zh) | 具有her2特异性tcr的t细胞制备物及其用途 | |
| CN104131034A (zh) | 一种嵌合载体及其制备方法和应用 | |
| CN106810610A (zh) | 抗EpCAM和CD3特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环DNA及应用 | |
| CN111548420A (zh) | 一种抗间皮素嵌合抗原受体、表达基因、表达载体、t细胞及其用途 | |
| CN105821080A (zh) | 一种提升安全性、用于表达密码子优化的Anti-MART-1 TCR基因的慢病毒载体的制备及其应用 | |
| CN108392492B (zh) | Ldlr过表达在nk细胞过继治疗中的应用 | |
| CN115227834A (zh) | 通过基因编辑技术联合dna损伤修复抑制剂特异杀伤癌细胞的方法 | |
| CN114957399A (zh) | 一种多肽、多肽衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| US10196426B1 (en) | Chimeric vector and preparation method and use thereof | |
| WO2021167994A1 (en) | Light-inducible gene activation systems and methods for making and using them | |
| CN111748619A (zh) | 抑制肿瘤细胞GSK-3β双靶点的抑制剂或抑制剂体系及其筛选方法 | |
| CN104357466B (zh) | 一种单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体及其制备方法和用途 | |
| CN105055447A (zh) | 氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐药性药物的应用 | |
| US20120100614A1 (en) | Method for production of anti-tumor TRAIL protein | |
| CN102212135A (zh) | 一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体及应用 | |
| Kopantsev et al. | Expression of therapeutic gene FCU1 sensitizes pancreatic cancer cells to 5-fluorocytosine and enhances the cytotoxic effect of 5-fluorouracil | |
| CN103114104A (zh) | 一种抑癌肽基因重组及其抗肿瘤应用 | |
| CN111053906B (zh) | 一种调控GSK-3β表达的试剂及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220712 Address after: Guangzhou International Business Incubator f411, No.3, Langyue Road, Science City, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province, 510670 Patentee after: GUANGZHOU QIANYANG BIOLOGICAL MEDICINE TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 510006 No. 132 East Ring Road, Panyu District University, Guangzhou, Guangdong. Patentee before: SUN YAT-SEN University |