KR20230017840A

KR20230017840A - 조작된 인터루킨-10 폴리펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230017840A
Application number: KR1020227045737A
Authority: KR
Inventors: 케난 크리스토퍼 가르시아; 로버트 앤드류 색스턴
Original assignee: 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2023-02-06
Also published as: IL298471A; CN116615240A; EP4157855A1; EP4157855A4; CA3180304A1; US20230192796A1; JP2023527359A; WO2021243057A1; AU2021282361A1; MX2022014890A

Abstract

본 개시는 일반적으로 인터루킨-10(IL-10)에 의해 매개되는 신호 전달을 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 인터루킨-10 수용체 서브유닛 베타(IL-10Rβ)에 대한 결합 친화성이 변경된 신규한 IL-10 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 또한, 이러한 IL-10 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 데 유용한 조성물 및 방법뿐만 아니라 IL-10-매개 신호전달을 조절하는 방법 및/또는 IL-10에 의해 매개되는 신호 전달의 섭동과 관련된 병태를 치료하는 방법이 제공된다.

Description

조작된 인터루킨-10 폴리펩타이드 및 이의 용도

연방 후원 R&D에 관한 진술

[001] 본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 계약 AI51321에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

관련 출원에 대한 상호 참조

[002] 본 출원은 2020년 5월 28일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/031,186호에 대한 우선권의 이익을 청구한다. 상기 언급된 출원의 개시는 임의의 도면을 포함하여 그 전체가 참조로서 본원에 명백하게 포함된다.

서열 목록의 포함

[003] 첨부된 서열 목록의 자료는 본원에 참조로서 포함된다. 078430_520001WO_Sequence_Listing.txt로 명명된 첨부된 서열 목록 텍스트 파일은 2021년 5월 20일에 생성되었고 53 KB이다.

분야

[004] 본 개시는 일반적으로 인터루킨-10(IL-10)에 의해 매개되는 신호 전달을 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 인터루킨-10 수용체 서브유닛 베타(IL-10Rβ)에 대한 결합 친화성이 변경된 신규한 IL-10 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 또한, 이러한 IL-10 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 데 유용한 조성물 및 방법뿐만 아니라 IL-10-매개 신호전달을 조절하는 방법, 및/또는 IL-10에 의해 매개되는 신호 전달의 섭동과 관련된 병태의 치료에 유용한 방법이 제공된다.

[005] 건강적 병태 및 질환의 치료를 위한 생물약제학 또는 치료용 단백질(들)을 함유하는 약학적 제형의 사용은 다수의 제약 및 생명공학 회사의 핵심 전략이다. 예를 들어, 사이토카인 패밀리의 여러 구성원은 암의 치료에 효과적인 것으로 보고되었고, 암 면역요법의 개발에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 사이토카인 패밀리는 이의 투여 및 생체-동화를 개선시키기 위한 많은 임상 작업 및 노력의 초점이 되어 왔다.

[006] 그러나, 사이토카인을 포함하는 기존의 치료적 접근법의 임상적 성공은 제한적이었다. 이들의 한계는 종종 사이토카인의 표적외 독성 및 비효율성으로 인한 것이며, 이는 주로 사이토카인이 서로 균형을 이루고 원치 않는 부작용을 초래하는 요망되는 반응자 세포 및 요망되지 않는 반응자 세포 둘 모두 상에 수용체를 갖는다는 사실에 기인한다. 최근 몇 년 동안, 사이토카인 공학은 보다 바람직한 활성 및 감소된 독성을 갖는 재조합 사이토카인에 도달하도록 사이토카인을 맞춤화하려는 다양한 시도와 함께 유망한 전략으로 부상하였다.

[007] 특히, 인터루킨-10(IL-10)은 암 및 자가면역 질환과 같은 인간 질환에서 흔히 조절장애가 있는 중요한 항-염증 사이토카인으로 간주되어 왔다. 약물로서 재조합 IL-10의 사용에 대한 오랜 관심이 있었지만, IL-10은 매우 다면발현성이며, 많은 상이한 면역 세포 서브유형에 작용하고 다양하고 종종 반대되는 생물학적 효과를 유발한다. 자가면역 질환과 관련하여, IL-10 치료는 단핵구 및 대식세포에 의한 전염증성 사이토카인 제조 및 MHC 클래스 II 발현을 억제하는 이의 능력으로 인해 마우스 모델에서 매우 효과적일 수 있다. 그러나, IL-10은 또한 CD8+ T 세포에 의한 전염증성 사이토카인 인터페론-감마(INFγ)의 제조를 자극하는데, 이는 이의 항염증 효과에 대항하여 이의 치료 및 임상 유용성을 제한한다.

[008] 따라서, 치료제로서 사용하기 위해 IL-10의 특성을 개선하기 위한 추가적인 접근법이 필요하다. 특히, 다른 것들에 비해 특정 다운스트림 기능 및 작용을 선택적으로 활성화시킬 수 있는, 예를 들어, IL-10의 많은 유익한 특성을 보유하지만 이의 공지된 전염증성 부작용이 결여되어, 암, 자가면역 질환, 및 염증성 질환을 포함하는, 다양한 관련 질환의 치료에서 항종양제 또는 면역 조절제로서의 이러한 변이체의 개선된 사용을 야기시킬 수 있는 IL-10의 변이체가 필요하다.

[009] 본 개시는 일반적으로 면역학 분야, 및 특히 이를 필요로 하는 대상체에서 인터루킨 10(IL-10)에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 하기에 더 상세히 기술되는 바와 같이, 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, IL-10-매개 신호전달은 STAT3-매개 신호전달의 부분 작용을 통해 조절될 수 있다. 보다 특히, 일부 구현예에서, 본 개시는 IL-10의 천연 리간드, 예를 들어, 인터루킨 10 수용체 서브유닛 베타(IL-10Rβ)에 대해 조절된 결합 친화성을 갖는 새로운 부류의 IL-10 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 본 개시의 일부 구현예는 세포-유형 편향된 IL-10 신호전달을 초래하는 IL-10 부분 작용제를 제공한다. 본 개시의 일부 구현예는 세포독성 CD8 T 세포 기능을 자극하지 않으면서, 단핵구 및 대식세포 활성화/사이토카인 제조를 억제함으로써, 세포-유형 편향된 IL-10 신호전달을 부여하는 IL-10 부분 작용제, 예를 들어, 인간 PBMC에서 강한 단핵구-편향된 신호전달 효과를 나타내는 IL-10 부분 작용제를 제공한다. 본원에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 이러한 IL-10 부분 작용성 변이체는 IL-10 다면발현을 극복할 수 있고, 개선된 치료 가능성을 가질 수 있다. 본 개시는 또한, 이러한 IL-10 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 데 유용한 조성물 및 방법, 대상체에서 IL-10-매개 신호전달을 조절하는 방법뿐만 아니라 수용체 IL-10Rβ의 다운스트림에서 신호 전달의 섭동과 간련된 병태를 치료하는 방법을 제공한다.

[0010] 일 양태에서, 본원에는 (a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는 인터루킨-10(IL-10) 폴리펩타이드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, (b) SEQ ID NO:1의 X25, X14, X18, X24, X28, X74, X90, X92, X96, X100 및 X104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드가 제공된다.

[0011] 개시된 재조합 폴리펩타이드의 비-제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 (a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 (b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X25 및 X96으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 X21, X22, X32, 및 X93으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X25, X14, X18, X21, X22, X24, X28, X32, X74, X90, X92, X93, X96, X100 및 X104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-10 수용체 베타(IL-10Rβ)에 대한 변경된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 기준 IL-10 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-10Rβ에 대한 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교하여 STAT3 신호전달을 자극하는 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 기준 IL-10 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-10R에 대한 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교하여 IL-10을 통해 매개되는 다운스트림 신호 전달의 세포-유형 편향된 신호전달을 부여한다.

[0012] 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 알라닌 치환, 아르기닌 치환, 아스파르트산 치환, 히스티딘 치환, 글루탐산 치환, 리신 치환, 세린 치환, 트립토판 치환, 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된다.

[0013] 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, R24, D28, E74, H90, N92, E96, T100, 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 N21, M22, R32, 및 S93으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104W; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104W; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104W; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104W; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104W. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) D25A; (b) D25K; (c) E96A; (d) E96K; (e) D25A/E96A; (f) N21A/R104A; (g) N21A/D25A; (h) N21A/D25A/E96A; 및 (i) N21A/M22A/D25A.

[0014] 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 치환을 포함하고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, N21, M22, R24, D28, R32, E74, H90, N92, S93, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다.

[0015] 일 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 재조합 핵산 분자로서, 여기서 핵산은 본 개시의 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 발현 카세트 또는 발현 벡터에 도입된다.

[0016] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 재조합 세포로서, 여기서, 재조합 세포는 (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; 및/또는 (b) 본 개시의 재조합 핵산을 포함하는, 재조합 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 진핵 세포는 포유동물(예를 들어, 인간) 세포이다. 관련된 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 본 개시의 적어도 하나의 재조합 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물에 관한 것이다.

[0017] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 본 개시의 하나 이상의 재조합 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 세포가 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 제조하도록 배양 배지에서 하나 이상의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 제조된 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 반감기를 증가시키기 위해 제조된 폴리펩타이드를 추가로 구조적으로 변형시킨다. 일부 구현예에서, 변형은 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합, 및 PEG화로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경을 포함한다.

[0018] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 약학적 조성물로서, 여기서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및 (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; 및 (c) 본 개시의 재조합 세포 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 개시의 재조합 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 개시의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 개시의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 재조합 세포를 포함한다.

[0019] 일 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 대상체에서 IL-10-매개 신호전달을 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에 (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 본 개시의 재조합 세포; (d) 본 개시의 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 또는 비-바이러스 벡터; 및 (e) 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

[0020] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 건강적 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강적 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게 (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 본 개시의 재조합 세포; (d) 본 개시의 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 또는 비-바이러스 벡터; 및 (e) 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교하여 IL-10을 통해 매개된 다운스트림 신호 전달의 세포-유형 편향된 신호전달을 발생시킨다. 일부 구현예에서, 세포-유형 편향된 IL-10 신호전달은 단핵구 및 대식세포에서 이의 STAT3-매개 항염증 기능을 실질적으로 유지하면서 B 세포, T 세포, 및 NK 세포에서 STAT1- 또는 STAT3-매개 전염증성 기능의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, STAT3-매개 신호전달은 유전자 발현 검정, 포스포-흐름 신호전달 검정, 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)으로 구성되는 군으로부터 선택된 검정에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, STAT3-매개 전염증성 기능은 사이토카인 제조, 케모카인 제조, 면역 세포 증식, 및 면역 세포 동원으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, STAT3-매개 전염증성 기능은 약 20%에서 약 100%로 감소된다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 대상체에서 IFN-γ, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 퍼포린, TNF-α, GM-CSF, 및 MIP1α로부터 선택된 전염증성 유전자의 발현을 유도하는 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 투여되는 조성물은 CD8+ T 세포에서 인터페론 감마(INFγ)의 발현을 자극한다. 일부 구현예에서, 건강적 병태는 암이다. 일부 구현예에서, 건강적 병태는 자가면역 질환이다. 일부 구현예에서, 건강적 병태는 만성 감염이다.

[0021] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 대상체에서 IL-10-매개 신호전달을 조절하거나 이를 필요로 하는 대상체에서 건강적 병태를 치료하기 위한 키트로서, 키트는 (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 본 개시의 재조합 세포; 및 (d) 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는, 키트에 관한 것이다.

[0022] 전술한 요약은 단지 예시적인 것이고, 어떤 식으로든 제한하려는 것이 아니다. 본원에 기재된 예시적인 구현예 및 특징에 추가하여, 본 개시의 추가 양태, 구현예, 목적 및 특징은 도면 및 상세한 설명 및 청구범위로부터 완전히 명백해질 것이다.

[0023] 도 1a 및 1b는 IL-10, IL-10Rα, 및 IL-10Rβ를 갖는 IL-10 수용체 복합체의 분자 모델의 정면도(1a) 및 측면도(1b)를 도시한다.
[0024] 도 2a 내지 2f는 IL-10에 의한 수용체 결합에 대한 구조적 기초를 예시하는 실험 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 도 2a 및 2b: IL-10, IL-10Rα, 및 IL-10Rβ를 갖는, IL-10/IL-10Rα/IL-10Rβ 삼원 서브-복합체의 2개의 도면. 도 2c 내지 2e: IL-10/IL-10Rβ 결합 계면의 확대도. 수소 결합 및 염-브릿지는 검은 점선으로 도시되어 있다. 친화성 성숙된 IL-10(Super-10)의 돌연변이된 잔기는 이탤릭체로 표시된다. 도 2f: IL-10Rβ 계면에서의 돌연변이는 IL-10 신호전달 활성을 감소시킨다. 20분 동안 WT IL-10 또는 지시된 변이체로 자극되고 유세포 분석에 의해 분석된 Daudi 세포에서 포스포-Y705-STAT3에 대한 용량 반응 곡선. 데이터는 최대 WT IL-10 신호의 백분율로 표시되는 2회의 독립적인 반복에 대한 평균 +/- SD이다.
[0025] 도 3a 내지 3e는 IL-10Rβ 친화성을 조정하는 것이 세포 유형에 걸쳐 차등적인 IL-10 신호전달 가소성을 나타낸다는 것을 예시하는 실험의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 3a: IL-10Rβ 결합 돌연변이체는 Daudi 및 THP-1 세포에서 차등 신호전달 반응을 나타낸다. 세포주를 100 nM IL-10 또는 지시된 돌연변이체로 20분 동안 처리하고 유세포 분석에 의해 분석하였다. 데이터는 2회의 독립적인 반복에 대한 평균 +/- SD이다. 도 3b: 고친화성 슈퍼-10 및 부분 작용제 10-DE(D25A/E96A 이중 돌연변이체)에서 돌연변이된 잔기를 나타내는 IL-10 나선 α1 및 α3의 도면. 도 3c: 도 3d에 제시된 S자형 용량-반응 곡선으로부터 계산된 포스포-Y705-STAT3에 대한 정규화된 E_max 값. 데이터는 3회 반복에 대한 평균 +/- SD이다. 도 3d: IL-10 돌연변이체 Super-10" 및 "10-DE"는 세포 유형에 걸쳐 차등 신호전달 프로파일을 나타낸다. WT IL-10, Super-10, D25A/E96A 돌연변이체(10-DE)로 20분 동안 자극되고 유세포 분석에 의해 분석된 표시된 세포주에서 포스포-Y705-STAT3에 대한 용량 반응 곡선. 데이터는 3회 반복에 대한 평균 +/- SD이며, 해당 세포주에서 최대 WT IL-10 신호의 백분율로 표시된다. 도 3e: IL-10 신호전달 가소성은 IL-10Rβ 발현과 상관관계가 있다. 유세포 분석에 의해 분석된 표시된 세포주에서 표면 염색된 IL-10Rα(좌) 및 IL-10Rβ(우)의 형광 강도를 나타내는 히스토그램.
[0026] 도 4a 내지 4g는 예시적인 골수-편향 부분 작용제가 IL-10의 항염증 및 면역자극 기능을 분리한다는 것을 예시하는 실험의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 4a: IL-10Rβ는 일차 인간 면역 세포에서 차등적으로 발현된다. 도 6a에 도시된 바와 같은 게이팅 전략을 사용하여 유세포 분석에 의해 분석된 인간 PBMC에서 지시된 세포 유형에 대한 IL-10Rβ의 형광 강도를 나타내는 히스토그램. 도 4b: IL-10 변이체 10-DE는 인간 PBMC에서 단핵구-편향된 신호전달을 유발한다. 10 nM WT IL-10으로 처리된 인간 PBMC 또는 유세포 분석에 의해 분석된 지시된 변이체에서 지시된 세포 유형에서 정규화된 포스포-Y705-STAT3 신호전달 반응. 데이터는 2회 반복에 대한 평균 +/- SD이고, 상이한 공여자 PBMC로 3회 수행된 대표적인 실험이다. 도 4c: 10-DE는 벌크 PBMC에서 염증성 사이토카인 제조를 억제한다. PBMC를 1 nM LPS 단독으로 또는 10 nM WT IL-10, 10-DE, 또는 Super-10을 첨가하여 24시간 동안 자극하였다. 상청액에서 TNF-α, IL-6, 및 IL-8의 수준을 ELISA에 의해 분석하였다. 데이터는 3회의 독립적인 반복에 대한 평균 +/- SEM이다. 도 4d: 10-DE는 활성화된 단핵구에서 MHC-II 표면 발현을 하향조절한다. PBMC를 1 nM LPS 및 PBS, 10 nM WT IL-10, 10-DE, 또는 Super-10으로 24시간 동안 자극하고, 단핵구(CD14+)를 유세포 분석에 의해 표면 HLA-DR 발현에 대해 분석하였다. 도 4e: 10-DE는 인간 단핵구-유래 대식세포에서 염증성 사이토카인 제조를 억제한다. 단리된 인간 대식세포를 1 nM LPS 단독으로 또는 10 nM WT IL-10, 10-DE, 또는 Super-10을 첨가하여 24시간 동안 자극하였다. 상청액에서 TNF-α, IL-6, 및 IL-8의 수준을 ELISA에 의해 분석하였다. 데이터는 3회의 독립적인 반복에 대한 평균 +/- SEM이다. 도 4f: 10-DE는 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 또는 그랜자임 B 제조를 강화시키지 않는다. 인간 PBMC로부터의 사전-활성화된 CD8+ T 세포를 항-CD3 항체 단독으로 또는 10 nM WT IL-10, 10-DE, 또는 Super-10과 함께 3시간 동안 자극하였다. 상청액에서 IFN-γ 및 그랜자임 B의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 데이터는 3회의 독립적인 반복에 대한 평균 +/- SEM이다. 도 4g: IL-10 변이체 10-DE의 세포-유형 편향된 신호전달이 IL-10의 면역억제 및 면역자극 기능을 어떻게 분리하는 지를 보여주는 모델.
[0027] 도 5a: 무작위화를 위해 표적화된 7개의 잔기, 라이브러리 생성에서 각 부위에 사용된 코돈, 및 클론 5.1, 5.2, 및 5.3의 각 위치에 존재하는 아미노산(각각 SEQ ID NO: 2, 3, 및 4). 도 5b: 친화성 성숙된 IL-10 변이체는 IL-10Rβ에 대한 향상된 결합을 나타낸다. WT 모노머성 IL-10 또는 친화성 성숙된 클론을 표시하는 효모에 대한 SA-647-IL-10Rβ의 결합 적정. 효모를 500 nM의 표지되지 않은 IL-10Rα와 미리 결합시켰다. 도 5c 및 5d: 고정된 친화성 성숙 IL-10 클론 5.1 단독(도 5f)에 대한 또는 포화 가용성 IL-10Rα와 미리 결합된(도 5d) 가용성 IL-10Rβ 결합의 표면 플라즈몬 공명 센소그램. K_D, 해리 상수.
[0028] 도 6a: 도 4a 및 4b의 PBMC 포스포-유세포 분석 신호전달 실험을 위한 게이팅 전략. 도 6b: WT IL-10 또는 10-DE로 20분 동안 자극되고 유세포 분석에 의해 분석된 인간 PBMC에서 포스포-Y705-STAT3에 대한 용량 반응 곡선. 데이터는 최대 WT IL-10 신호의 백분율로 표시되는 2회 반복에 대한 평균 +/- SD이다. 상이한 공여자 PBMC로 적어도 3회 수행된 대표적인 실험이 도시되어 있다.
[0029] 도 7a: ELISA에 의해 측정된, LPS 및 지시된 IL-10 변이체로 처리된 벌크 인간 PBMC로부터의 IL-1β의 수준(평균 ± SEM, n=3, N=2, **P<0.01, 양측 스튜던트 t 시험). 도 7b 및 7c: 유세포 분석에 의해 분석된, LPS 단독으로 또는 10 nM의 표시된 IL-10 변이체와 조합하여 활성화된 단핵구에서의 표면 HLA-DR(7b) 및 CD86 표면 발현(7c)(평균 ± SD, n= 4, N=2). 도 7d: ELISA에 의해 측정된, 단독으로 또는 표시된 IL-10 변이체와 함께 항-CD3 항체로 72시간 동안 자극된 벌크 PBMC로부터의 IFN-γ의 수준(평균 ± SEM, n=3, N=3, **P<0.01, 양측 스튜던트 t 검정). 도 7e: PBS, WT IL-10 또는 10-DE와 조합된 LPS(15 mg/kg)의 복강내 주사 후 생존(n=8 마우스, N=2, **P <0.01, log-rank Mantel-Cox 시험). 도 7f 및 7g: ELISA에 의해 측정된, LPS(4 mg/kg) 및 지시된 IL-10 변이체의 주사 후 마우스 혈청에서 TNF-α, IL-6, 및 합토글로빈의 수준(평균 ± SEM, n=3, N=2, *P<0.05, **P<0.01, 양측 스튜던트 t 검정).
[0030] 도 8a: 유세포 분석에 의해 분석된, 10 nM의 WT 또는 돌연변이체 IL-10으로 처리된 일차 면역 세포에서의 포스포-STAT1 활성화(평균 ± SEM, n=3, N=2). 도 8b: 10 nM WT IL-10, Super-10, 또는 10-DE로 처리되고 유세포 분석에 의해 분석된 CD4⁺ T 세포로부터의 포스포-STAT3에 대한 정규화된 MFI 값(평균 ± SEM, n=4, N=2). 도 8c: RNA-seq에 의해 분석된, 24시간 동안 표시된 IL-10 변이체로 처리된 활성화된 CD8⁺ T 세포에서 선택된 IL-10-조절된 유전자의 배수 변화(n=2 생물학적 반복).

[0031] 본 개시는 일반적으로 대상체에서 인터루킨 10(IL-10)에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 선택적으로 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, IL-10-매개 신호전달은 STAT3-매개 신호전달의 세포-유형 편향된 작용성을 통해 조절될 수 있다. 본 개시의 일부 구현예는 IL-10이 이의 동족 수용체, 특히, IL-10Rβ와 어떻게 상효작용하는 지에 대한 새로운 통찰을 기초로 하여 설계된 신규한 IL-10 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 구현예는 IL-10의 천연 수용체, 예를 들어, 인터루킨 10 수용체 서브유닛 베타(IL-10Rβ)에 대해 조절된 결합 친화성을 갖는 IL-10 폴리펩타이드 변이체의 부류를 제공한다. 본 개시의 일부 구현예는 단핵구 및 대식세포에서 이의 STAT3-매개 기능을 실질적으로(예를 들어, 90 내지 110%) 유지하면서, 세포-유형 선택적 IL-10 신호전달을 보유하고, 예를 들어, 벌크 PBMC, B 세포, T 세포, 및 NK 세포에서 STAT3-매개 전염증성 기능의 감소를 부여하는 IL-10 부분 작용제를 제공한다. 본 개시는 또한 이러한 IL-10 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 데 유용한 조성물 및 방법, 대상체에서 IL-10-매개 신호전달을 조절하는 방법뿐만 아니라 IL-10 수용체의 다운스트림에서 신호 전달의 섭동과 관련된 병태를 치료하기 위한 방법을 제공한다.

[0032] 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 완전한 IL-10 수용체 신호전달 복합체의 저온-EM 구조를 결정함으로써 IL-10 작용을 디콘볼루션시키기 위해 구조-기반 접근법이 사용되었으며, 이는 또한 골수-선택적 작용제의 설계를 가능하게 한다. IL-10 수용체 신호전달 복합체의 스타-형상 육량체 구조는 IL-10 및 IL-10Rα가 어떻게 복합 표면을 형성하여 공유 수용체 서브유닛 IL-10Rβ와 결합하여 IL-10 부분 작용제의 설계를 가능하게 하는 지를 보여준다. 다양한 IL-10Rβ-결합 친화성으로 설계된 일련의 IL-10 돌연변이체의 특성화는 IL-10 신호전달 가소성이 세포 유형에 따라 어떻게 달라지는 지를 보여주었다. 특히, 본원에 제시된 실험 데이터는 IL-10R에 대한 IL-10 결합 부위의 돌연변이가 세포-유형 의존적 방식으로 전염증성 기능 및/또는 STAT3-매개 신호전달을 선택적으로 억제할 수 있는 편향된 작용제를 초래한다는 것을 밝혔다. 본원에 개시된 특정 IL-10 편향된 작용제는 단핵구 및 대식세포에서 STAT3-매개 기능을 실질적으로 유지하면서 벌크 PBMC, B 세포, T 세포, 및 NK 세포에서 STAT3-매개 기능의 감소를 부여할 수 있다. 이러한 IL-10 편향된 작용제의 예시로서, 실시예 5 및 6에 제시된 실험 결과는 인터페론-γ 제조를 촉진하지 않으면서 염증성 대식세포 활성화를 억제하는 것을 포함하는 골수-편향된 활성을 갖는 IL-10 변이체를 기술한다.

[0033] 이러한 결과는 IL-10 다면 발현성의 기초가 되는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 IL-10 신호전달 가소성이 IL-10 기능을 조정하기 위해 어떻게 이용될 수 있는 지를 입증한다.

정의

[0034] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 과학적 용어 또는 전문 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에 이러한 정의를 포함하는 것이 반드시 당 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 기술되거나 언급된 많은 기술 및 절차는 당업자에 의해 통상적인 방법을 사용하여 잘 이해되고 통상적으로 사용된다.

[0035] 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포(a cell)"는 이들의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함한다. "A 및/또는 B"는 하기 대안 모두를 포함하기 위해 본원에서 사용된다: "A", "B", "A 또는 B", 및 "A 및 B".

[0036] 본원에서 사용되는 용어 "약"은 대략의 통상적인 의미를 갖는다. 근사 정도가 문맥상 달리 명확하지 않은 경우, "약"은 제공된 값을 포함하는 모든 경우에 제공된 값의 + 또는 - 10% 이내, 또는 가장 가까운 유효 숫자로 반올림됨을 의미한다. 범위가 제공되는 경우, 이는 경계 값을 포함한다.

[0037] 본원에서 사용되는 용어 "투여" 및 "투여하는"은 경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 피하, 근육내, 및 국소 투여, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이로 제한되지 않는 투여 경로에 의한 생물활성 조성물 또는 제형의 전달을 지칭한다. 상기 용어는 의료 전문가에 의한 투여 및 자가 투여를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

[0038] 용어 "세포", "세포 배양물", 및 "세포주"는 특정 대상체 세포, 세포 배양물, 또는 세포주뿐만 아니라 이러한 세포, 세포 배양물, 또는 세포주의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하고, 이는 배양물에서의 전달 또는 계대 수와 무관하다. 모든 자손이 모 세포와 정확히 동일한 것은 아님이 이해되어야 한다. 이는 돌연변이(예를 들어, 고의적이거나 부주의한 돌연변이) 또는 환경 영향(예를 들어, 메틸화 또는 다른 후성적 변형)으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있어, 자손이 실제로 모 세포와 동일하지 않고, 자손이 원래의 세포, 세포 배양물, 또는 세포주의 것과 동일한 기능성을 유지하는 한, 이는 여전히 본원에서 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다.

[0039] 본 개시의 대상 재조합 폴리펩타이드의 용어 "유효량", "치료적 유효량", 또는 "약학적 유효량"은 일반적으로 조성물의 부재에 비해 조성물이 언급된 목적을 달성하기에 충분한 양을 지칭한다(예를 들어, 투여되는 효과를 달성하거나, 질병을 치료하거나, 신호전달 경로를 감소시키거나, 질병 또는 건강 상태의 하나 이상의 증상을 감소시킴). "유효량"의 예는 질병의 증상 또는 증상들의 치료, 예방 또는 감소에 기여하기에 충분한 양이며, 이는 "치료적 유효량"으로도 지칭될 수 있다. 증상의 "감소"는 증상(들)의 중증도 또는 빈도의 감소, 또는 증상(들)의 제거를 의미한다. "치료적 유효량"을 포함하는 조성물의 정확한 양은 치료의 목적에 의존할 것이고, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(예를 들어, 문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); 및 Remington: Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins] 참조).

[0040] 본원에서 사용되는 용어 IL-10 폴리펩타이드의 "변이체"는 기준 IL-10 폴리펩타이드, 예를 들어, 야생형 IL-10 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입이 존재하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이와 같이, 용어 "IL-10 폴리펩타이드 변이체"는 IL-10 폴리펩타이드의 자연 발생 대립유전자 변이체 또는 대안적인 스플라이스 변이체를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 변이체는 모 IL-10 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 유사하거나 상동성인 아미노산(들) 또는 상이한 아미노산(들)으로의 치환을 포함한다.

[0041] 본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 요소, 예를 들어, 폴리펩타이드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 물리적 또는 기능적 연결을 나타내며, 이는 이들이 의도된 방식으로 작동하도록 한다. 예를 들어, 관심 폴리뉴클레오티드와 조절 서열(예를 들어, 프로모터) 사이의 작동 가능하게 연결은 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 기능적 연결이다. 작동 가능하게 연결된 요소는 인접하거나 비연속적일 수 있음이 이해되어야 한다. 폴리펩타이드의 맥락에서, "작동 가능하게 연결된"은 폴리펩타이드의 기재된 활성을 제공하기 위해 아미노산 서열(예를 들어, 상이한 도메인) 사이의 물리적 연결(예를 들어, 직접 또는 간접적으로 연결된)을 지칭한다. 본 개시에서, 본 개시내용의 재조합 폴리펩타이드의 다양한 도메인은 세포에서 재조합 폴리펩타이드의 적절한 폴딩, 프로세싱, 발현, 결합, 및 다른 기능적 특성을 유지하기 위해 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 작동 가능하게 연결된 도메인은 인접하거나 비-인접할 수 있다(예를 들어, 링커를 통해 서로 연결될 수 있다).

[0042] 2개 이상의 핵산 또는 단백질의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "퍼센트 동일성"은 하기 기재된 디폴트 파라미터를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정하는 경우, 동일하거나 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 특정 백분율(예를 들어, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 대해 최대 일치성을 위해 비교되고 정렬될 때, 특정 영역에 비해 약 60% 서열 동일성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성)을 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다(예를 들어, NCBI 웹 사이트(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 참조). 이러한 서열은 이후 "실질적으로 동일한" 것으로 언급된다. 이러한 정의는 또한 서열의 상보체를 지칭하거나 이에 적용될 수 있다. 이러한 정의는 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열뿐만 아니라 치환을 갖는 서열을 포함한다. 서열 동일성은 공개된 기술 및 널리 이용 가능한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, GCS 프로그램 패키지(Devereux et al, Nucleic Acids Res. 12:387, 1984), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul et al., J Mol Biol 215:403, 1990)을 사용하여 계산될 수 있다. 서열 동일성은 위스콘신 대학교 생명공학 센터(University of Wisconsin Biotechnology Center)(1710 University Avenue, Madison, WI. 53705)의 유전학 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지(Sequence Analysis Software Package)와 같은 서열 분석 소프트웨어(이의 디폴트 파라미터를 가짐)를 사용하여 측정될 수 있다.

[0043] 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 부형제"는 대상체에게 관심 화합물(들)을 투여하기 위한 약학적으로 허용되는 담체, 첨가제 또는 희석제를 제공하는 임의의 적합한 물질을 지칭한다. 이와 같이, "약학적으로 허용되는 부형제"는 약학적으로 허용되는 희석제, 약학적으로 허용되는 첨가제, 및 약학적으로 허용되는 담체로 지칭되는 물질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학적 투여와 혼화 가능한 염수, 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 보충 활성 화합물(예를 들어, 항생제 및 추가 치료제)이 또한 조성물에 도입될 수 있다.

[0044] 본원에서 사용되는 용어 "재조합" 또는 "조작된" 핵산 분자는 인간 개입을 통해 변경된 핵산 분자를 지칭한다. 비제한적인 예로서, cDNA는 시험관내 폴리머라제 반응(들)에 의해 생성되거나 링커가 부착되거나 벡터, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 통합된 임의의 핵산 분자와 마찬가지로, 재조합 DNA 분자이다. 비제한적인 예로서, 재조합 핵산 분자는 1) 예를 들어, 화학적 또는 효소적 기술을 사용하여 시험관내에서 합성 또는 변형되고/되거나; 2) 자연적으로 공동결합되지 않은 공동결합된 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 3) 자연 발생 핵산 분자 서열과 관련하여 하나 이상의 뉴클레오티드가 결여되도록 분자 클로닝 기술을 사용하여 조작되고/되거나; 4) 자연 발생 핵산 서열과 관련하여 하나 이상의 서열 변화 또는 재배열을 갖도록 분자 클로닝 기술을 사용하여 조작된 것일 수 있다. 비제한적인 예로서, cDNA는 시험관내 폴리머라제 반응(들)에 의해 생성되거나 링커가 부착되거나 벡터, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 통합된 임의의 핵산 분자와 마찬가지로, 재조합 DNA 분자이다. 재조합 핵산 및 재조합 단백질의 또 다른 비제한적인 예는 본원에 개시된 바와 같은 IL-10 폴리펩타이드 변이체이다.

[0045] 본원에서 사용되는 "개체" 또는 "대상체"는 인간(예를 들어, 인간 개인) 및 비-인간 동물과 같은 동물을 포함한다. 일부 구현예에서, "개체" 또는 "대상체"는 의사의 치료를 받는 환자이다. 따라서, 대상체는 관심 질병(예를 들어, 암) 및/또는 질병의 하나 이상의 증상을 갖거나 가질 위험이 있거나 가질 것으로 의심되는 인간 환자 또는 개체일 수 있다. 대상체는 또한 진단 시점 또는 그 이후에 관심 질환의 위험으로 진단된 개인일 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 비-인간 영장류, 및 양서류, 파충류 등과 같은 다른 포유동물, 예를 들어, 양, 개, 소, 닭, 및 비-포유동물을 포함한다.

[0046] 용어 "벡터"는 다른 핵산 분자를 전달 또는 수송할 수 있는 핵산 분자 또는 서열을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 전달된 핵산 분자는 일반적으로, 예를 들어, 벡터 핵산 분자에 연결되고, 예를 들어, 여기에 삽입된다. 일반적으로, 벡터는 적절한 제어 요소와 회합될 때 복제될 수 있다. 용어 "벡터"는 클로닝 벡터 및 발현 벡터뿐만 아니라 바이러스 벡터 및 통합 벡터를 포함한다. "발현 벡터"는 조절 영역을 포함하여, 시험관내 및/또는 생체내에서 DNA 서열 및 단편을 발현할 수 있는 벡터이다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 유도하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는, 예를 들어, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자 전달 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달 비히클로서 사용된다.

[0047] 본원에 기재된 개시내용의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하는(comprising)", "구성되는", 및 "필수적 요소로 하여 구성되는(consisting essentially of)"을 포함하는 것으로 이해된다.

[0048] 본원에서 사용되는 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)", "함유하는", 또는 "~에 의해 특징되는"과 동의어이고, 포괄적이거나 개방적이며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본원에서 사용되는 "~로 구성되는"은 청구된 조성물 또는 방법에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용되는 "필수적 요소로 하여 구성되는"은 청구된 조성물 또는 방법의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 특히 조성물의 성분의 설명 또는 방법의 단계의 설명에서 용어 "포함하는"의 본원의 임의의 언급은 인용된 성분 또는 단계로 필수적으로 구성되고 이들로 구성된 그러한 조성물 및 방법을 포함하는 것으로 이해된다.

[0049] 표제, 예를 들어, (a), (b), (i) 등은 단지 명세서 및 청구범위를 읽기 쉽게 하기 위해 제시된다. 명세서 또는 청구범위에서 표제의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 또는 숫자 순서 또는 제시된 순서로 수행될 것을 요구하지 않는다.

[0050] 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 서면 설명을 제공하는 것과 같은 임의의 및 모든 목적을 위해, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위 범위 및 이들의 하위 범위의 조합을 포함한다. 열거된 임의의 범위는 동일한 범위를 적어도 동일한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 분류할 수 있도록 충분히 기술하고 가능하게 하는 것으로 용이하게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 논의된 각각의 범위는 하위 1/3, 중간 1/3, 상위 1/3 등으로 용이하게 나누어질 수 있다. 당업자에 의해 또한 이해되는 바와 같이, "최대", "적어도", "보다 큰", "보다 작은", 및 유사한 용어는 인용된 번호를 포함하고, 상기 논의된 바와 같이 후속하여 하위 범위로 분류될 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1 내지 3개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2, 또는 3개의 물품을 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 1 내지 5개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 물품 등을 갖는 그룹을 지칭한다.

[0051] 특정 범위는 본원에서 용어 "약"이 앞에 오는 수치 값으로 제시된다. 용어 "약"은 그것이 선행하는 정확한 숫자 뿐만 아니라 용어가 선행하는 숫자에 가깝거나 대략적인 숫자에 대한 문자 그대로의 지지를 제공하기 위해 본원에서 사용된다. 숫자가 구체적으로 인용된 수에 근접하거나 대략적으로 있는 지의 여부를 결정함에 있어서, 인용되지 않은 수에 가깝거나 근사한 수는 제시된 맥락에서 구체적으로 인용된 수와 실질적으로 등가물을 제공하는 수일 수 있다.

[0052] 명확성을 위해, 별도의 구현예의 맥락에서 설명되는 본 개시의 특정 특징은 또한 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수 있음이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 맥락에서 설명되는 본 개시의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 본 개시에 관한 구현예의 모든 조합은 본 개시에 의해 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 구현예 및 이의 요소의 모든 하위-조합은 또한 본 개시에 의해 구체적으로 포함되며, 각각의 이러한 하위 조합이 본원에 개별적으로 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다.

인터루킨-10 및 염증성 면역 반응

[0053] 사이토카인 인터루킨-10(IL-10)은 항염증성 및 면역자극성 특성 둘 모두를 보유하고 흔히 인간 질환에서 조절장애를 일으키는, 면역조절 사이토카인이다. 이는 ~37 kDa의 비공유적으로 연결된 호모다이머로서 발현되는 다면발현성 사이토카인이고, T 세포, B 세포, 대식세포, 및 항원 제시 세포(APC)에 대한 작용을 통해 다중 면역 반응을 조절한다. 이의 대부분의 항-염증 특성이 널리 보고되었다. IL-10은 활성화된 단핵구 및 활성화된 대식세포에서 IL-1, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, GM-CSF, 및 G-CSF의 발현을 억제함으로써 면역 반응을 억제하는 것으로 보고되었다. IL-10은 주로 대식세포에서 발현되지만, 발현은 또한 활성화된 T 세포, B 세포, 비만 세포, 및 단핵구에서도 검출되었다. 면역 반응을 억제하는 것 외에도, IL-10은 IL-2 및 IL-4로 처리된 흉선세포의 증식을 자극하고, B 세포의 생존력을 향상시키고, MHC 클래스 II의 발현을 자극하는 것을 포함하는 면역-자극 특성을 나타낸다.

[0054] IL-10의 다양한 면역-자극 특성이 보고되었다. IL-10은 B-세포 활성화를 공동자극하고, B-세포 생존을 연장하고, B-세포에서 클래스 전환에 기여할 수 있다. 또한, 이는 자연 살해(NK) 세포 증식 및 사이토카인 제조를 공동자극할 수 있고, CD8+ T 세포의 특정 서브세트의 증식을 자극하는 성장 인자로서 작용할 수 있다. 인간에서 고용량의 IL-10은 INFγ의 제조를 증가시킬 수 있는 것으로 보고되었다. IL-10은 각각 IL-10 수용체 1(IL-10Rα) 및 IL-10Rβ의 2개의 복사체로 구성된 2-수용체 복합체를 통해 신호전달한다. IL-10Rα는 IL-10에 비교적 높은 친화성(약 35 내지 200 pM)으로 결합하고, 수용체 복합체에 대한 IL-10Rβ의 동원은 리간드 결합에 단지 미미한 기여를 하는 것으로 보고되었다. 그러나, 복합체에 대한 IL-10Rβ의 결합은 리간드 결합 후 신호 전달을 가능하게 한다. 따라서, 기능성 수용체는 IL-10Rα 및 IL-10Rβ의 헤테로다이머의 다이머로 구성된다. 대부분의 조혈 세포는 구성적으로 낮은 수준의 IL-10Rα를 발현하고, 수용체 발현은 종종 다양한 자극에 의해 극적으로 상향조절될 수 있다. 대조적으로, IL-10Rβ는 대부분의 세포에서 발현된다. 수용체 복합체에 대한 IL-10의 결합은 각각 IL-10Rα 및 IL-10Rβ와 관련된 야누스 티로신 키나제, JAK1 및 Tyk2를 활성화시켜 수용체의 세포질 꼬리를 인산화시킨다. 이는 IL-10Rα에 대한 STAT3의 동원을 초래한다. STAT3의 호모다이머화는 수용체로부터의 이의 방출 및 인산화된 STAT 호모다이머의 핵으로의 전위를 초래하며, 여기서 이는 다양한 유전자의 프로모터에서 STAT3-결합 요소에 결합한다. 이들 유전자 중 하나는 STAT3에 의해 양성 조절되는 IL-10 자체이다. STAT3는 또한 STAT 활성화의 품질 및 양을 조절하는 사이토카인 신호전달 3(SOCS3)의 억제제를 활성화시킨다. SOCS3은 IL-10에 의해 유도되고 다양한 사이토카인 유전자에 대해 음성 조절 효과를 발휘한다.

[0055] 이의 다면발현 활성의 결과로서, IL-10은 염증성 병태, 면역-관련 장애, 섬유성 장애 및 암을 포함하는 광범위한 질환, 장애 및 병태와 관련이 있다. IL-10-관련 질환, 장애 및 병태의 유병률 및 중증도의 관점에서, 신규한 IL-10 제제 및 이의 변형은 IL-10-관련 질환, 장애 및 병태의 치료 및 예방에 엄청난 가치가 있을 것이다.

[0056] IL-10 수용체 신호전달 복합체는 각각 IL-10R1 및 IL-10R2, 또는 IL-10Rα 및 IL-10Rβ로도 지칭되는 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된다. 수용체 활성화는 알파 및 베타 둘 모두에 대한 결합을 필요로 한다. 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, IL-10 수용체 신호전달 복합체의 3.5-Å 저온-EM 구조를 결정함으로써 IL-10 작용, 예를 들어, 다면발광성을 디콘볼루션하기 위해 구조-기반 접근법이 사용되었다. 본원에 기재된 별형(예를 들어, 스타형) 육량체 구조는 IL-10 및 IL-10Rα가 어떻게 복합 표면을 형성하여 공유 수용체 서브유닛 IL-10Rβ와 결합하여 IL-10 부분 작용제의 설계를 가능하게 하는 지를 보여준다. 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 다양한 IL-10Rβ-결합 친화성(예를 들어, 강도)을 갖는 일련의 설계된 IL-10 변이체를 특성화함으로써 IL-10 신호전달 가소성이 세포 유형에 따라 어떻게 달라지는지, 신호전달 및 유전자 면역 세포 집단에 걸친 발현 반응 역치, 이는 차례로 IL-10 세포-유형 선택성을 조작하는 수단을 제공한다. 일부 변이체는, 염증성 CD8⁺ T 세포 기능을 자극하지 않으면서 단핵구 및 대식세포 활성화를 억제함으로써, IL-10의 주요 반대 기능을 분리시키는, 골수-편향된 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 IL-10 다면발현의 기초가 되는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고, IL-10 신호전달 가소성이 IL-10 기능을 조정하고 IL-10의 다면발현 작용을 조정하기 위한 구조적 및 기계론적 청사진을 추가로 제공하는 방법을 입증한다.

[0057] 용어 IL-10 또는 IL-10 폴리펩타이드는 천연이든 재조합이든 야생형 IL-10을 지칭하고, 이의 동족체, 이종상동체, 변이체, 및 단편뿐만 아니라, 예를 들어, 리더 서열(예를 들어, 신호 펩타이드)을 갖는 IL-10 폴리펩타이드를 포함한다. 이와 같이, IL-10 폴리펩타이드는 재조합적으로 제조된 IL-10 폴리펩타이드, 합성적으로 제조된 IL-10 폴리펩타이드, 및 세포 또는 조직으로부터 추출된 IL-10 폴리펩타이드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 개시의 IL-10 폴리펩타이드의 비-제한적인 예로서, 성숙한 인간 IL-10의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1에 도시되어 있다. 다른 포유동물 종으로부터의 예시적인 IL-10 상동체 및 이의 변형된 형태는 래트(수탁 NP_036986.2; GI 148747382); 소(수탁 NP_776513.1; GI 41386772); 양(수탁 NP_OO 1009327.1; GI 57164347); 개(수탁 ABY86619.1; GI 166244598); 및 토끼(수탁 AAC23839.1; GI 3242896)로부터의 IL-10 폴리펩타이드를 포함한다. 본원에 기재된 아미노산 치환의 도입에 적합한 IL-10 폴리펩타이드의 추가 예는 사이토메갈로바이러스, 림프크립토바이러스, 마카바이러스, 퍼카바이러스, 파라폭스바이러스, 카프리폭스바이러스 및 아비폭스바이러스 속으로부터의 IL-10 폴리펩타이드를 포함하는 바이러스-코딩된 IL-10 동족체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 사이토메갈로바이러스 IL-10 폴리펩타이드의 비-제한적인 예는 인간 사이토메갈로바이러스(수탁 AAR31656 및 ACR49217), 그린 원숭이 사이토메갈로바이러스(수탁 AEV80459), 레서스 사이토메갈로바이러스(수탁 AAF59907), 개코원숭이 사이토메갈로바이러스(수탁 AAF63436), 부엉이 원숭이 사이토메갈로바이러스(수탁 AEV80800), 및 다람쥐 원숭이 사이토메갈로바이러스(수탁 AEV80955)로부터의 것을 포함한다. 림포크립토바이러스 IL-10 폴리펩타이드의 예는 엡스타인-바르 바이러스(수탁 CAD53385), 보노보 헤르페스바이러스(수탁 XP_003804206.1), 레서스 림포크립토바이러스(수탁 AAK95412), 및 개코원숭이 림포크립토바이러스(수탁 AAF23949)로부터의 것들을 포함한다. 바이러스 IL-10 폴리펩타이드 및 이들의 숙주 면역 기능의 조절에 관한 추가 정보는, 예를 들어, 문헌[Slobedman B. et al., J. Virol. Oct. 2009, p. 9618-9629; 및 Ouyang P. et al., J. Gen. Virol. (2014), 95, 245-262]에서 확인될 수 있다.

[0058] 야생형 인간 IL-10 전구체 폴리펩타이드(예를 들어, 신호 펩타이드를 갖는 전-단백질)의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 160개 아미노산 성숙 단백질을 생성하기 위해 제거될 수 있는 N-말단 18개 아미노산 신호 펩타이드를 갖는 178개 아미노산 잔기 단백질인, SEQ ID NO: 16에 도시되어 있다. 그러나, 성숙한 단백질은 종종 재조합 폴리펩타이드 작제물을 생성하는 데 사용된다. 따라서, 본 개시의 목적을 위해, 모든 아미노산 번호매김은 SEQ ID NO: 1에 제시된 IL-10 단백질의 성숙 폴리펩타이드 서열을 기반으로 한다.

[0059] 염증은 감염으로부터 유기체를 보호하고 조직 항상성을 촉진하는 데 필수적이다. 그러나, 과도한 면역 세포 활성화는 방관자 조직을 손상시키고 기관 기능 장애, 만성 염증 및 자가면역 질환을 유발할 수 있다. IL-10은 염증 반응을 조절하고 종결시키는 데 중심적인 역할을 하는 중요한 항염증 사이토카인이다. 일부 예에서, IL-10은 자가면역 질환, 암, 및 만성 감염에서 조절장애가 있다. 다양한 면역 세포는 염증 동안 IL-10을 제조하며, 이는 또한 활성화된 골수 세포에 의한 사이토카인 제조 및 항원 제시를 주로 억제함으로써 강력한 항염증 효과를 발휘한다. 이러한 역할과 일치하게, IL-10 또는 IL-10 수용체의 유전적 손실은 마우스 및 인간 둘 모두에서 심각한 염증 및 염증성 장 질환(IBD)과 같은 자가면역 질환을 초래한다. 또한, 조절장애 IL-10 기능은 또한 암 및 만성 염증과 관련이 있다.

[0060] 이러한 중요한 항염증 기능에도 불구하고, IL-10은 또한 고도로 다면발현성이며, 다양하고 겉보기에 상반되는 생물학적 효과를 유발한다. 가장 특히, IL-10은 또한 TCR-자극된 CD8+ T 세포 활성을 강화시켜, 전염증성 사이토카인 인터페론-γ(IFN-γ)뿐만 아니라 그랜자임 B와 같은 세포용해 인자의 제조를 향상시킨다. 실제로, 외인성 IL-10의 투여는 인간 임상 시험에서 혈청 IFN-γ 수준을 상승시켜, 아마도 이의 항염증 효과를 상쇄시키는 것으로 나타났다.

[0061] IL-10은 고친화성 개인 수용체 서브유닛인 IL-10Rα 및 저-친화성 공유 수용체 서브유닛인 IL-10Rβ로 구성된 이종이량체 수용체 복합체의 2개 복사체를 결합시킴으로써 수용체 세포에서 신호전달을 개시하는 분비된 호모다이머로서 기능한다. IL-10은 IL-10Rα 및 IL-10Rβ의 이량체화를 유도하여, 전사 인자 STAT3(신호 변환기 및 전사 활성제 3)의 인산화 및 활성화를 초래하고, 더 적은 정도로 STAT1의 인산화 및 활성화를 초래하는데, 이는 IL-10의 다양한 기능적 효과를 매개한다.

[0062] 다운스트림 신호전달 반응을 분리시키는 기능적으로 선택적 또는 "편향된" 작용제는 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR)에 대해 광범위하게 특성규명되었으며, 최근 연구는 이러한 작용제가 사이토카인 수용체에도 가능함을 시사한다. 그러나, 이러한 접근법은 IL-10 수용체 복합체에 대해 현재 부족한 광범위한 구조적 정보에 의존한다. IL-10Rβ를 포함하는 완전한 IL-10 수용체 신호전달 복합체에 대한 구조적 정보가 부족하여, 설계된 변이체와 이 축의 질문을 가능하게 할 것이다. 이러한 구조적 정보의 부족은 주로 시험관내에서 복합체 조립을 방해하는 이의 공유된 수용체 서브유닛, IL-10R에 대한 IL-10의 극히 낮은 친화성 때문이다.

[0063] 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 유도 진화 접근법을 사용하여 IL-10Rβ에 대한 향상된 친화성을 갖는 IL-10 변이체를 조작하여, 본 발명자들이 육량체 IL-10/IL10R1/IL-10Rβ 복합체의 저온-EM 구조를 3.5 Å 분해능으로 해결할 수 있게 되었다. IL-10Rβ 계면을 표적화하는 IL-10에서의 구조-유도 돌연변이는 생체내에서 세포-유형 선택적 신호전달 반응을 유발하는 편향된 IL-10 변이체를 초래하였다. 특히, IL-10 변이체 10-DE는 단핵구 및 대식세포에서 IL-10 신호전달을 실질적으로 유지하면서 B 세포, T 세포, 및 NK 세포에서 감소된 IL-10 신호전달을 유도할 수 있어, 생체내에서 IL-10의 면역억제 및 면역자극 기능을 분리시킨다.

[0064] 사이토카인은 숙주 면역 반응을 제어하고 조직 항상성을 촉진하는 데 수많은 중요한 역할을 하지만, 종종 치료제로서 이들의 사용을 제한할 수 있는 다면발현 또는 역생산 효과를 발휘한다. 결과적으로, 사이토카인 및 사이토카인 수용체 길항제는 상당한 임상적 성공을 달성했지만, 사이토카인 수용체 작용제에 대한 이러한 예는 훨씬 적었다. 사이토카인 IL-10은 조직 및 질병 상황에 따라 유익한 기능과 해로운 기능 둘 모두를 발휘할 수 있는 사이토카인의 주요 예이다. 하기 더 상세히 기술되는 바와 같이, 구조-유도 접근법은 IL-10의 면역억제 및 면역자극 기능 기능을 효과적으로 분리하는 IL-10의 기능적으로 선택적 변이체를 개발하는 데 사용되었고, 이는 개선된 사이토카인-기반 치료제의 개발을 위한 경로를 제공하면서, IL-10이 이러한 별개의 기능을 어떻게 작용하는 지에 대한 새로운 통찰력을 나타낸다.

[0065] IL-10 수용체 복합체의 이전 구조 특징규명을 막는 1차 장벽은 서브유닛, 구체적으로, IL-10과 IL-10Rβ 간의 매우 낮은 친화성 상호작용의 존재이었다. 이러한 장벽은 삼원 수용체 복합체에 대한 접근을 가능하게 하는 리간드 조작 접근법을 사용함으로써 극복되었다.

[0066] 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, IL-10/IL-10Rβ 결합 부위를 분석함으로써 세포-유형 편향된 작용성을 야기시키는 IL-10의 IL-10Rβ 결합 계면에서 아미노산 치환을 갖는 일련의 IL-10 변이체의 생성을 가능하게 한다. 편향된 활성을 갖는 조작된 사이토카인 수용체 리간드의 이전 예는 수용체 토폴로지를 변경하는 것에 의존했지만, 하기 기재된 실험 결과는 이의 수용체에 대한 천연 사이토카인의 친화성을 조절하는 것이 또한 편향된 작용작용을 생성하기에 충분할 수 있음을 시사한다.

[0067] 임의의 특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본원에 기재된 실험 데이터는 IL-10Rβ에 대한 친화성 및 IL-10Rβ 발현 수준의 조합이 주어진 세포에서 IL-10에 의해 유도된 신호전달의 유형을 결정하는 모델을 지지한다. 상이한 면역 세포 집단에서 STAT1 및 STAT3를 차별적으로 활성화시킴으로써, 본원에 기재된 조작된 IL-10 변이체는 T 세포 기능을 자극하지 않으면서 단핵구 및 대식세포 활성화를 억제하여 IL-10의 면역억제 및 면역자극 기능을 분리시키는 능력을 보유한다.

[0068] IL-10에 의한 수용체 결합에 대한 구조적 기초는 IL-10 신호전달 가소성 및 기능적 다면발현의 기초가 되는 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공한다. 가장 특히, 구조는 IL-10이 이의 공유된 저-친화성 수용체 서브유닛 IL-10Rβ와 상호작용하여 이 계면을 교란시키는 돌연변이의 구조-유도 설계를 가능하게 하는 방법을 분자 세부적으로 보여준다. 이러한 조작된 IL-10 작용제의 분석은 (i) IL-10 신호전달의 가소성이 세포 유형 간에 다양하고, (ii) 이러한 차이가 IL-10Rβ에 대한 IL-10의 친화성을 조절함으로써 이용되어 변경된 세포 유형 특이성을 초래하고, (iii) 이러한 세포 유형 편향된 작용제가 IL-10 기능의 중요한 양태를 분리할 수 있음을 보여준다. 본 개시의 일 양태에서, 면역 세포 집단에 걸친 차등 IL-10Rβ 발현은 달리 다면발현성 IL-10 매개 반응에 기능적 특이성을 제공하기 위한 천연 메커니즘을 나타낼 수 있으며, 이는 본원에 제시된 바와 같은 조작된 작용제를 사용하여 이용될 수 있는 특징이다. CD8+ T 세포를 자극하지 않으면서 염증성 대식세포 활성화를 억제하는 부분 작용제 10-DE의 능력은 자가면역 및 염증성 질환과 같은 관련 건강적 병태의 치료에서 IL-10 수용체를 표적화하기 위한 상당한 의미를 나타낸다.

본 개시의 조성물

[0069] 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 본 개시의 일 양태는 IL-10 수용체의 다운스트림에서 STAT3 신호전달을 조절하도록 조작된 신규한 IL-10 폴리펩타이드 변이체에 관한 것이다. 또한 (i) 이러한 IL-10 폴리펩타이드 변이체를 인코딩하는 재조합 핵산, (ii) 본원에 개시된 바와 같은 IL-10 폴리펩타이드 변이체를 발현하도록 조작된 재조합 세포가 제공된다.

A. 재조합 IL-10 폴리펩타이드

[0070] 상기 개략된 바와 같이, 본 개시의 일부 구현예는, 예를 들어, 세포독성 CD8+ T 세포 기능을 자극하지 않으면서, 단핵구 및 대식세포 활성화/사이토카인 제조를 억제함으로써 인간 PBMC에서 강력한 단핵구-편향된 신호전달 효과를 강력하게 나타낼 수 있는 IL-10 수용체의 다운스트림의 STAT3 신호전달을 조절하도록 조작된 새로운 부류의 IL-10 폴리펩타이드 변이체에 관한 것이다. 따라서, 이러한 IL-10 변이체는 IL-10 다면발현을 극복하고 개선된 치료 가능성을 갖는다. 일부 다른 구현예에서, 본 개시의 IL-10 폴리펩타이드 변이체는 IL-10 수용체의 다운스트림에 세포-유형 편향된 STAT3 신호전달을 부여한다.

[0071] 일 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 (a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 인터루킨 10(IL-10) 폴리펩타이드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 (b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 6의 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 재조합 폴리펩타이드에 관한 것이다.

[0072] 본원에 개시된 재조합 폴리펩타이드의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 6의 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 6의 서열과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

[0073] 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X25, X14, X18, X21, X22, X24, X28, X32, X74, X90, X92, X93, X96, X100, 및 X104로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X25, X14, X18, X24, X28, X74, X90, X92, X96, X100 및 X104로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 (a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 (b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X25 및 X96으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 (a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 (b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 위치 X25에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 (a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 (b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 위치 X96에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X21, X22, X32, 및 X93으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 이러한 양태에 따른 예시적인 IL-10 폴리펩타이드 변이체는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X25, X14, X18, X24, X28, X74, X90, X92, X96, X100 및 X104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 추가로 포함한다.

[0074] 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X21, X22, X32 및 X93으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 추가 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나의 추가 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X22로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나의 추가 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X32로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나의 추가 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X93으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나의 추가 아미노산 치환을 추가로 포함한다.

[0075] 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X25, X14, X18, X21, X22, X24, X28, X32, X74, X90, X92, X93, X96, X100 및 X104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 잔기 X21, X22, X32, 및 X93에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함한다.

[0076] 본 개시내용에 따르면, IL-10 폴리펩타이드에서 이러한 임의의 치환은 이러한 치환이 없는 모 IL-10 폴리펩타이드의 결합 친화성에 비해 IL-10Rβ 및/또는 IL-10Rα에 대해 변경된 결합 친화성을 갖는 IL-10 변이체를 생성한다. 예를 들어, 본원에 개시된 IL-10 폴리펩타이드 변이체는 IL-10Rα 및/또는 IL-10Rβ에 대해 증가된 친화성 또는 감소된 친화성을 가질 수 있거나, 상응하는 야생형 IL-10의 것과 동일하거나 유사한 이러한 수용체에 대한 친화성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 폴리펩타이드 변이체는 IL-10의 다른 위치(예를 들어, IL-10 변이체의 이차 또는 삼차 구조에 최소 효과를 갖는 것들)에서의 보존적 변형 및 치환을 포함할 수 있다. 이러한 보존적 치환은 문헌[Dayhoff in The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978)], 및 문헌[Argos in EMBO J, 8:779-785 (1989)]에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, 하기 그룹 중 하나에 속하는 아미노산은 보존적 변화를 나타낸다: 그룹 I: Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; 그룹 II: Cys, Ser, Tyr, Thr; 그룹 III: Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; 그룹 IV: Lys, Arg, His; 그룹 V: Phe, Tyr, Trp, His; 및 그룹 VI: Asp, Glu.

[0077] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-10의 아미노산 서열에서 아미노산 치환(들)은 알라닌 치환, 아르기닌 치환, 아스파르트산 치환, 히스티딘 치환, 글루탐산 치환, 리신 치환, 세린 치환, 트립토판 치환, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 본원에 개시된 재조합 IL-10 폴리펩타이드에서 아미노산 치환의 비제한적인 예는 하기 표 1에 제공된다.

표 1: 본 개시의 재조합 IL-10 폴리펩타이드에서의 예시적인 아미노산 치환.

[0078] 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-10 부분 작용제 폴리펩타이드는 하기를 포함할 수 있다:

SPGQGTQSENSCT(H/A/D/E/I/K/L/M/N/Q/R/S/T/Y/V)FPG(N/F/A/D/E/L/V/S/T/I/V/M/H)LP(N/A/R/Q/H/KSVIL/M/T)(M/A/V/I/L/N/Q)L(R/E/D/N/Q/A/S/T)(D/A/N/H/I/K/L/V)LR(D/A/E/L/V/S/T/I/V/M/H/K/R)AFS(R/A/D/E/L/V/S/T/I/V/M/H)VKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYL(E/A/D/L/V/S/T/I/V/M/H/K/R)EVMPQAENQDPDIKA(H/A/D/E/I/K/L/M/N/Q/R/S/T/Y/V)V(N/Q/E/H/K/S/V/I/L/M/T/A)(S/E/A/R/N/D/Q/E/I/L/K/M/V)LG(E/A/N/D/Q/H/K/S)NLK(T/V/E/A/R/N/Q/E/I/L/K/M/S)LRL(R/A/W/Y/F/H/D/E/N/Q/S/T/I/L/V/M)LRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO: 32), 여기서 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 , 6 또는 그 이상)의 가변 위치는 SEQ ID NO:1의 상응하는 위치에서 발생하는 야생형 아미노산이 아니며, 위치에서의 대안은 괄호에 제시된다.

[0079] 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 서열과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, N21, M22, R24, D28, R32, E74, H90, N92, S93, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, R24, D28, E74, H90, N92, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25 및 E96으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 위치 D25에 있다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 위치 D25에서의 아미노산 치환(들)은 D25A 치환이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 위치 D25에서의 아미노산 치환(들)은 D25K 치환이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 위치 E96에 있다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 위치 E96에서의 아미노산 치환(들)은 E96A 치환이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 위치 E96에서의 아미노산 치환(들)은 E96K 치환이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 N21, M22, R32, 및 S93으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다.

[0080] 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104W 또는 R104A; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W 또는 R104A; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104W 또는 R104A; (d) N18Y/D25A 또는 D25K/N92Q/T100D/R104W 또는 R104A; (e) N18Y/D12A 또는 D25K/N92Q/T100D/R104W 또는 R104A; 및 (f) N18Y/D25A 또는 D25K/N92Q/E96A/T100D/R104W 또는 R104A.

[0081] 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104W; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104W; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104W; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104W; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104W. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104A; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104A; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104A; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104A; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104A; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104A.

[0082] 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104W; 및 (b) N21A. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104A; 및 (b) N21A. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104W; 및 (b) D25A, D25K, 및 D25A/E96A로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104A; 및 (b) D25A, D25K, 및 D25A/E96A로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이.

[0083] 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104W ; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104W; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104W; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104W; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104W. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104A ; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104A; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104A; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104A; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104A; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104A. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104W; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104W; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104W; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104W; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104W. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W; 및 (b) N21A. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W; 및 (b) D25A, D25K, 및 D25A/E96A로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104A; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104A; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104A; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104A; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104A; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104A. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104A; 및 (b) N21A. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104A; 및 (b) D25A, D25K, 및 D25A/E96A로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이.

[0084] 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) D25A; (b) D25K; (c) E96A; (d) E96K; (e) D25A/E96A; (f) N21A/R104A; (g) N21A/D25A; (h) N21A/D25A/E96A; 및 (i) N21A/M22A/D25A. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) D25A; (b) D25K; (c) E96A; (d) E96K; (e) D25A/E96A; (f) N21A/R104A; (g) N21A/D25A; (h) N21A/D25A/E96A; 및 (i) N21A/M22A/D25A. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) D25A; (b) D25K; (c) E96A; (d) E96K; (e) D25A/E96A; (f) N21A/R104A; (g) N21A/D25A; (h) N21A/D25A/E96A; 및 (i) N21A/M22A/D25A.

[0085] 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, N21, M22, R24, D28, R32, E74, H90, N92, S93, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 서열 동일성을 갖고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, N21, M22, R24, D28, R32, E74, H90, N92, S93, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, N21, M22, R24, D28, R32, E74, H90, N92, S93, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 또는 적어도 7개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.

[0086] 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, N21, M22, R24, D28, R32, E74, H90, N92, S93, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 서열 동일성을 갖고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, N21, M22, R24, D28, R32, E74, H90, N92, S93, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, N21, M22, R24, D28, R32, E74, H90, N92, S93, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 또는 적어도 7개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: : 16의 N21, M22, R32, 및 S93으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환을 추가로 포함한다.

[0087] 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 돌연변이, 예를 들어, 미스센스 돌연변이(예를 들어, 보존적 치환), 넌센스 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제외하고 본원에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 본 개시내용의 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2-15로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

[0088] 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-10 폴리펩타이드의 서열에서 아미노산 치환(들)은 IL10Rβ에 대한 재조합 IL-10 폴리펩타이드의 결합 친화성의 조절을 초래한다. IL-10 폴리펩타이드의 결합 활성과 관련하여 용어 "조절하는"은 IL10Rβ에 대한 폴리펩타이드의 결합 친화성의 변화를 지칭한다. 조절은 증가(예를 들어, 유도, 자극) 및 감소(예를 들어, 감소, 억제), 또는 그렇지 않으면 폴리펩타이드의 결합 친화성에 영향을 미치는 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-10 폴리펩타이드의 서열에서 아미노산 치환(들)은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교하여 재조합 IL-10 폴리펩타이드의 IL10Rβ-결합 친화성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교하여 재조합 IL-10 폴리펩타이드의 IL10Rβ-결합 친화성을 증가시킨다.

[0089] 본원에 기재된 IL-10 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 결합 활성은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 검정될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 IL-10 폴리펩타이드 변이체 및 이의 수용체(예를 들어, IL-10Rα 및/또는 IL10Rβ)의 결합 활성은 Scatchard 분석(Munsen et al. Analyt. Biochem. 107:220-239, 1980)에 의해 결정될 수 있다. 특이적 결합은 또한 경쟁 ELISA, Biacore® 검정 및/또는 KinExA® 검정을 포함하지만 이로 제한되지 않는 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 표적 단백질에 우선적으로 결합하거나 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 당 분야에서 잘 이해되는 개념이며, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법은 또한 당 분야에 공지되어 있다.

[0090] 관심 리간드(예를 들어, IL-10Rα 및/또는 IL-10Rβ)에 특이적으로 결합하는 재조합 IL-10 폴리펩타이드를 선택하기 위해 다양한 검정 포맷이 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체-상 ELISA 면역검정, 면역침전, Biacore™(GE Healthcare, Piscataway, NJ), KinExA, 형광-활성화 세포 분류(FACS), Octet™(ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) 및 웨스턴 블롯 분석은 동족 리간드 또는 결합 파트너와 특이적으로 결합하는 수용체 또는 이의 리간드 결합 부분과 특이적으로 반응하는 폴리펩타이드를 확인하기 위해 사용될 수 있는 많은 검정 중 하나이다. 일반적으로, 특이적 또는 선택적 결합 반응은 배경 신호 또는 잡음의 적어도 2배, 보다 통상적으로 배경의 10배 초과, 배경의 20배 초과, 더욱 더 통상적으로, 배경의 50배 초과, 배경의 75배 초과, 배경의 100배 초과, 더욱 더 통상적으로, 배경의 500배 초과, 더욱 더 통상적으로, 배경의 1000배 초과, 및 더욱 더 통상적으로, 배경의 10,000배 초과일 것이다.

[0091] 당업자는 결합 친화성이 또한 2개의 분자, 예를 들어, IL-10 폴리펩타이드 및 IL-10Rβ 수용체 사이의 비공유 상호작용의 강도의 척도로서 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 예에서, 결합 친화성은 1가 상호작용(고유 활성)을 기술하는 데 사용된다. 2개의 분자 사이의 결합 친화성은 해리 상수(K_D)의 결정에 의해 정량화될 수 있다. 또한, K_D는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 방법(Biacore)을 사용하여 복합체 형성 및 해리의 동역학의 측정에 의해 결정될 수 있다. 1가 복합체의 회합 및 해리에 상응하는 속도 상수는 각각 회합 속도 상수 k_a(또는 k_on) 및 해리 속도 상수 k_d(또는 k_off)로 지칭된다. K_D는 방정식 K_D = k_d/k_a를 통해 k_a 및 k_d와 관련이 있다. 해리 상수의 값은 문헌[Caceci et al. (Byte 9: 340-362, 1984)]에 기술된 방법과 같은 방법에 의해 직접 결정될 수 있다. 예를 들어, K_D는 문헌[Wong & Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428-5432)]에 개시된 것과 같은 이중-필터 니트로셀룰로스 필터 결합 검정을 사용하여 확립될 수 있다. 표적 수용체에 대한 본 개시의 IL-10 폴리펩타이드 변이체의 결합 능력을 평가하기 위한 다른 표준 검정은, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 및 유세포계산 분석, 및 실시예에 예시된 다른 검정을 포함하는 당 분야에 공지되어 있다. IL-10 폴리펩타이드 변이체의 결합 동역학 및 결합 친화성은 또한 당 분야에 공지된 표준 검정, 예컨대, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해, 예를 들어, Biacore™ 시스템 또는 KinExA를 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-10Rα 및/또는 IL-10Rβ에 대한 본 개시의 IL-10 폴리펩타이드 변이체의 결합 친화성은 고체-상 수용체 결합 검정에 의해 결정된다(Matrosovich MN et al., Methods Mol Biol. 865:71-94, 2012). 일부 구현예에서, IL-10Rα 및/또는 IL-10Rβ에 대한 본 개시의 IL-10 폴리펩타이드 변이체의 결합 친화성은 표면 플라스몬 공명(SPR) 검정에 의해 결정된다.

[0092] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-10 폴리펩타이드 변이체에서의 아미노산 치환은 아미노산 치환이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교하여 세포-유형 편향된 IL-10 신호전달을 초래한다. 하기에 추가로 상세히 기재된 바와 같이, 본 개시의 예시적인 IL-10 폴리펩타이드 변이체, 10-DE는 인간 PBMC에서 단핵구-편향된 신호전달을 나타내지만 벌크 PBMC에서 염증성 사이토카인 제조를 억제함으로써 생체내에서 세포-유형 편향된 신호전달 반응을 유도한다. 10-DE 변이체는 또한 LPS-자극된 단핵구에서 표면 MHC 클래스 II 발현을 강력하게 하향조절하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 하기 실시예 6 및 도 4 참조). 중요하게는, 10-DE 변이체는 또한 자가면역 및 자가-염증성 질환에서 IL-10에 대한 주요 표적인 단리된 단핵구-유래된 대식세포에서 LPS-유도된 TNF-α, IL-6, 및 IL-8 제조를 완전히 폐지하였다(도 4e). 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-10 폴리펩타이드 변이체에서의 아미노산 치환은 NK 세포, B 세포, CD4+ T 세포에서 IL-10 신호전달의 감소를 포함하는 세포-유형 편향된 IL-10 신호전달을 초래한다. 및/또는 CD8+ T 세포는 단핵구 및 대식세포에서 IL-10 신호전달을 실질적으로 유지한다.

[0093] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 폴리펩타이드 변이체에서 아미노산 치환(들)은, 예를 들어, 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교하여 STAT3의 인산화에 의해 결정되는 바와 같이 세포-유형 편향된 IL-10 신호전달을 초래한다. 일부 구현예에서, 편향된 IL-10 신호전달은 하나 이상의 세포 유형, 예컨대, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포에서 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교할 때 적어도 10%, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%만큼 STAT3 인산화의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 활성화된 CD8+ T 세포의 활성을 강화시키지 않는다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 제조 및/또는 그랜자임 B 제조를 강화하지 않는다.

[0094] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 폴리펩타이드 변이체에서 아미노산 치환(들)은 하나 이상의 세포 유형에서 하나 이상의 STAT3-매개 전염증성 기능의 감소를 초래한다. 적합하게 검정될 수 있는 STAT3-매개 기능에 대한 특정 제한은 없다. 적합한 STAT3-매개 전염증성 기능의 비-제한적인 예는 사이토카인 제조, 케모카인 제조, 및 면역 세포 동원을 포함한다. 일부 구현예에서, STAT3-매개 전염증성 기능은 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포에서 약 20% 내지 약 100% 감소된다. 일부 구현예에서, STAT3 신호전달은 유전자 발현 검정, 포스포-흐름 신호전달 검정, 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)으로 구성되는 군으로부터 선택된 검정에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 폴리펩타이드 변이체에서 아미노산 치환(들)은 전염증성 발현을 유도하는 폴리펩타이드의 능력에 의해 결정되는 바와 같이, 하나 이상의 STAT3-매개 전염증성 기능의 감소를 초래한다. 염증성 유전자 및/또는 MHC 클래스 II 발현. 전염증성 유전자의 비-제한적인 예는 IFN-γ, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 퍼포린, TNF-α, GM-CSF, 및 MIP1α를 포함한다. 일부 구현예에서, STAT1-매개 전염증성 기능은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-10과 비교하여 약 20% 내지 약 100%, 예를 들어, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 90%, 또는 약 30% 내지 약 100% 감소한다.

[0095] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 폴리펩타이드 변이체에서 아미노산 치환(들)은 B 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 NK 세포는 단핵구 및/또는 대식세포에서 이의 STAT3-매개 기능을 실질적으로 유지한다. 일부 구현예에서, STAT3 신호전달은 유전자 발현 검정, 포스포-흐름 신호전달 검정, 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)으로 구성되는 군으로부터 선택된 검정에 의해 결정된다.

[0096] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 폴리펩타이드 변이체에서 아미노산 치환(들)은 기준 IL-10 폴리펩타이드(예를 들어, 야생형 IL-10)의 결합 친화성과 비교하여 IL-10Rβ에 대한 결합 친화성을 증가시킨다. 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 IL-10 폴리펩타이드 변이체(예를 들어, "Super-10" 변이체)의 IL-10Rβ에 대한 증가된 결합 친화성은 CD8+ T 세포에서 INFγ 발현의 자극을 초래한다. 임의의 특정 이론으로 제한하지 않지만, 증가된 결합 친화성을 갖는 이러한 IL-10 변이체는 암과 같은 관련 증식성 질환을 치료하는 방법에 유용할 수 있다.

[0097] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 폴리펩타이드 변이체에서 아미노산 치환(들)은 기준 IL-10 폴리펩타이드(예를 들어, 야생형 IL-10)의 결합 친화성과 비교하여 IL-10Rβ에 대한 결합 친화성을 감소시킨다. 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 IL-10 폴리펩타이드 변이체(예를 들어, 부분 작용제 10-DE)의 IL-10Rβ에 대한 감소된 결합 친화성은 STAT3 신호전달을 자극하는 능력의 감소 및/또는 CD8+ T 세포를 자극하는 염증성 대식세포 활성화의 억제를 초래한다. 임의의 특정 이론에 제한하지 않고, 감소된 결합 친화성을 갖는 이러한 IL-10 변이체는 자가면역 및 염증성 질환과 같은 관련 건강적 병태의 방법에 유용할 수 있다.

B. 핵산

[0098] 일 양태에서, 발현 카세트를 포함하는 재조합 IL-10 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다양한 핵산 분자, 및 예를 들어, 숙주 세포 또는 생체외 무세포 발현 시스템에서 재조합 IL-10 폴리펩타이드의 생체내 발현을 가능하게 하는 조절인자 서열과 같은 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 이러한 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터가 본원에 제공된다.

[0099] 용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 및 핵산 유사체를 함유하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 핵산 분자를 포함하는, RNA 및 DNA 분자 둘 모두를 지칭한다. 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥(예를 들어, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥)일 수 있다. 핵산 분자는 비통상적이거나 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"은 상호교환적으로 폴리뉴클레오티드 분자의 서열을 지칭한다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩타이드 서열은 WIPO Standard ST.25 (1998), 부록 2, 표 1 내지 표 6을 참조로 포함하는 37 CFR §1.82)에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 염기 및 아미노산에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시된다.

[00100] 본 개시의 핵산 분자는 일반적으로 약 0.5 Kb 내지 약 20 Kb, 예를 들어, 약 0.5 Kb 내지 약 20 Kb, 약 1 Kb 내지 약 15 Kb, 약 2 Kb 내지 약 10 Kb, 또는 약 5 Kb 내지 약 25 Kb, 예를 들어, 약 10 Kb 내지 15 Kb, 약 15 Kb 내지 약 20 Kb, 약 5 Kb 내지 약 20 Kb, 5 Kb 및 약 10 Kb, 또는 약 10 Kb 및 약 25 Kb인 핵산 분자를 포함하는 임의의 길이의 핵산 분자일 수 있다.

[00101] 본원에 개시된 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 (a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는 IL-10 폴리펩타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 (b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X25, X14, X18, X21, X22, X24, X28, X32, X74, X90, X92, X93, X96, X100 및 X104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 (a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는 IL-10 폴리펩타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X25, X14, X18, X24, X28, X74, X90, X92, X96, X100 및 X104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X21, X22, X32, 및 X93으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, N21, M22, R24, D28, R32, E74, H90, N92, S93, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO:6과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, R24, D28, E74, H90, N92, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 N21, M22, R32, 및 S93으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환을 추가로 포함한다.

[00102] 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: a) N18Y/N92Q/T100D/R104W 또는 R104A; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W 또는 R104A; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104W 또는 R104A; (d) N18Y/D25A 또는 D25K/N92Q/T100D/R104W 또는 R104A; (e) N18Y/D12A 또는 D25K/N92Q/T100D/R104W 또는 R104A; 및 (f) N18Y/D25A 또는 D25K/N92Q/E96A/T100D/R104W 또는 R104A.

[00103] 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: a) N18Y/N92Q/T100D/R104W; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104W; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104W; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104W; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104W. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: a) N18Y/N92Q/T100D/R104A; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104A; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104A; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104A; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104A; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104A.

[00104] 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104W; 및 (b) N21A. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104A; 및 (b) N21A. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104W; 및 (b) D25A, D25K, 및 D25A/E96A로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104A; 및 (b) D25A, D25K, 및 D25A/E96A로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104W; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104W; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104W; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104W; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104W. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104A; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104A; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104A; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104A; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104A; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104A. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: (a) N18Y/N92Q/T100D/R104W; (b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W; (c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104W; (d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104W; (e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104W; 및 (f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104W. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: a) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W; 및 (b) N21A. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: a) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W; 및 (b) D25A, D25K, 및 D25A/E96A로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: a) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104A; 및 (b) N21A. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: a) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104A; 및 (b) D25A, D25K, 및 D25A/E96A로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이.

[00105] 본원에 개시된 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2-15로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

[00106] 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

[00107] SEQ ID NOS: 1-15의 상응하는 전구체 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열 목록의 SEQ ID NOS: 16-30에 제공된다.

[00108] 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 발현 카세트 또는 발현 벡터에 도입된다. 발현 카세트는 일반적으로 생체내 및/또는 생체외에서 수용자 세포에서 코딩 서열의 적절한 전사 및/또는 번역을 지시하기에 충분한 조절 정보 및 코딩 서열을 함유하는 유전 물질의 작제물을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 일반적으로, 발현 카세트는 원하는 숙주 세포 및/또는 개체로의 표적화를 위해 벡터에 삽입될 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 본 개시의 발현 카세트는 발현 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 및 선택적으로, 코딩 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 다른 핵산 서열 중 어느 하나 또는 이의 조합에 작동 가능하게 연결된 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함한다.

[00109] 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에 도입된다. 용어 "벡터"는 변형, 예를 들어, 이종 DNA의 숙주 세포에 도입할 목적으로 사용될 수 있는, 숙주 세포 사이에 전달을 위해 설계된 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물을 지칭한다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드, 파지, 또는 코스미드와 같은 레플리콘일 수 있고, 삽입된 세그먼트의 복제를 야기하기 위해 또 다른 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 통합 벡터일 수 있다.

[00110] 일부 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 통상적으로 핵산 분자의 전달 또는 세포의 게놈 내에 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자에 통합을 촉진하는 바이러스-유도 핵산 엘리먼트를 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 전달 플라스미드)를 지칭하기 위해 널리 사용된다. 바이러스 입자는 통상적으로 핵산(들) 이외에 다양한 바이러스 성분 및 때때로 또한 숙주 세포 성분을 포함할 것이다. 용어 바이러스 벡터는 핵산을 세포 내로 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자 또는 전달된 핵산 자체를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전 요소를 함유한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 바큘로바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터이다. 용어 "레트로바이러스 벡터"는 주로 레트로바이러스로부터 유래된 구조적 및 기능적 유전 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "렌티바이러스 벡터"는 레트로바이러스 속인 렌티바이러스로부터 주로 유래된 LTR을 포함하는, 구조적 및 기능적 유전적 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다.

[00111] 따라서, 또한 본원에 개시된 임의의 재조합 폴리펩타이드 또는 IL-10 폴리펩타이드 변이체를 인코딩하는 핵산 분자 중 하나 이상을 함유하는 벡터, 플라스미드, 또는 바이러스가 본원에 제공된다. 핵산 분자는, 예를 들어, 벡터로 형질전환/형질도입된 세포에서 이들의 발현을 지시할 수 있는 벡터 내에 포함될 수 있다. 진핵 및 원핵 세포에서 사용하기에 적합한 벡터는 당 분야에 공지되어 있으며 상업적으로 입수 가능하거나, 당업자에 의해 용이하게 제조된다.

[00112] DNA 벡터는 통상적인 형질전환 또는 트랜스펙션 기술을 통해 진핵 세포에 도입될 수 있다. 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 형질감염, 미세주입, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 스크래프 로딩, 탄도 도입, 핵천공, 유체역학적 쇼크, 및 감염과 같은, 숙주 세포를 형질전환시키거나 트랜스펙션시키기 위한 적합한 방법은 문헌[Sambrook et al. (2012, supra)] 및 다른 표준 분자 생물학 실험실 매뉴얼에서 확인될 수 있다.

[00113] 본 개시내용에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 예를 들어, 바큘로바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스, 원숭이 바이러스 40(SV40), 및 소 유두종 바이러스 벡터를 포함한다(예를 들어, 문헌[Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vector, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 참조).

[00114] 발현 시스템의 정확한 성분은 중요하지 않다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리펩타이드는 진핵 숙주, 예컨대, 포유동물 세포(예를 들어, COS 세포, NIH 3T3 세포, 또는 HeLa 세포)에서 생산될 수 있다. 이러한 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)을 포함하는 많은 공급원으로부터 입수 가능하다. 발현 시스템을 선택할 때, 성분이 서로 상용성인 지를 확인하기 위해 주의를 기울여야 한다. 숙련자 또는 통상의 기술자는 이러한 결정을 내릴 수 있다. 또한, 발현 시스템을 선택하는데 지침이 필요한 경우, 당업자는 문헌[P. Jones, "Vectors: Cloning Applications", John Wiley and Sons, New York, NY, 2009)]을 찾아볼 수 있다.

[00115] 제공된 핵산 분자는 자연 발생 서열, 또는 자연 발생 서열과 상이한 서열을 함유할 수 있지만, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 동일한 폴리펩타이드, 예를 들어, 항체를 인코딩한다. 이러한 핵산 분자는 RNA 또는 DNA(예를 들어, 게놈 DNA, cDNA, 또는 포스포아미다이트-기반 합성에 의해 생산된 것과 같은 합성 DNA), 또는 이러한 타입의 핵산 내의 뉴클레오티드의 조합 또는 변형으로 구성될 수 있다. 또한, 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥(예를 들어, 센스 또는 안티센스 가닥)일 수 있다.

[00116] 핵산 분자는 폴리펩타이드(예를 들어, IL-10 폴리펩타이드 변이체)를 인코딩하는 서열로 제한되지 않으며; 코딩 서열(예를 들어, IL-10 폴리펩타이드 변이체의 코딩 서열)의 업스트림 또는 다운스트림에 있는 비-코딩 서열의 일부 또는 모두가 또한 포함될 수 있다. 분자 생물학 분야의 당업자는 핵산 분자를 단리하기 위한 일상적인 절차에 익숙하다. 이들은, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제로 게놈 DNA를 처리함으로써, 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 수행에 의해 생성될 수 있다. 핵산 분자가 리보핵산(RNA)인 경우, 분자는, 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 생산될 수 있다.

[00117] 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포, 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 본원에 제공된다. 일반적으로, 배양 배지는 본원에 기재된 세포를 배양하기 위한 임의의 적합한 배양 배지일 수 있다. 광범위한 상기 언급된 숙주 세포 및 종을 형질전환시키는 기술은 당 분야에 공지되어 있으고, 기술 및 과학 문헌에 기재되어 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포를 포함하는 세포 배양물도 또한 본 출원의 범위 내에 있다. 세포 배양물을 생성하고 유지하는 데 적합한 방법 및 시스템은 당 분야에 공지되어 있다.

C. 재조합 세포 및 세포 배양

[00118] 본 개시의 재조합 핵산은, 예를 들어, 인간 T 림프구와 같은 숙주 세포에 도입되어 핵산 분자를 함유하는 재조합 세포를 생산할 수 있다. 세포로의 본 개시의 핵산 분자의 도입은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 바이러스 감염, 트랜스펙션, 컨쥬게이션, 원형질체 융합, 리포펙션, 전기천공, 뉴클레오펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개된 트랜스펙션, DEAE-덱스트란-매개된 트랜스펙션, 리포솜-매개된 트랜스펙션, 입자 건기술, 칼슘 포스페이트 침전, 직접 마이크로-주사, 나노입자-매개 핵산 전달 등에 의해 달성될 수 있다.

[00119] 따라서, 일부 구현예에서, 핵산 분자는 당 분야에 공지된 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 숙주 게놈에 안정적으로 통합될 수 있거나, 에피솜으로 복제될 수 있거나, 일시적 발현을 위한 미니-서클 발현 벡터로서 재조합 숙주 세포에 존재할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 핵산 분자는 에피솜 단위로서 재조합 숙주 세포에서 유지되고 복제된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 재조합 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 안정적인 통합은 고전적인 무작위 게놈 재조합 기술 또는 가이드 RNA-유도 CRISPR/Cas9 게놈 편집, 또는 NgAgo(나트로노박테리움 그레고리 아르고나우트(Natronobacterium gregoryi Argonaute))를 사용한 DNA-가이드 엔도뉴클레아제 게놈 편집, 또는 TALEN 게놈 편집(전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제)과 같은 보다 정확한 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 일시적인 발현을 위한 미니-서클 발현 벡터로서 재조합 숙주 세포에 존재한다.

[00120] 핵산 분자는 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자에 캡슐화될 수 있거나, 전기천공과 같은 당 분야에 공지된 바이러스 또는 비-바이러스 전달 수단 및 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 세포 내로 핵산의 도입은 바이러스 형질도입에 의해 달성될 수 있다. 비제한적인 예에서, 바큘로바이러스 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)는 바이러스 형질도입을 통해 표적 세포에 핵산을 전달하도록 조작될 수 있다. 여러 AAV 혈청형이 기술되었으며, 모든 공지된 혈청형은 다수의 다양한 조직 타입으로부터의 세포를 감염시킬 수 있다. AAV는 독성의 증거 없이 생체내에서 광범위한 종 및 조직을 형질도입할 수 있고, 비교적 온화한 선천성 및 적응성 면역 반응을 생성한다.

[00121] 렌티바이러스-유래 벡터 시스템은 또한 바이러스 형질도입을 통한 핵산 전달 및 유전자 요법에 유용하다. 렌티바이러스 벡터는 (i) 숙주 게놈으로의 안정적인 벡터 통합을 통한 지속적인 유전자 전달; (ii) 분열 세포 및 비분열 세포 둘 모두를 감염시키는 능력; (iii) 중요한 유전자- 및 세포-요법-표적 세포 타입을 포함하는 광범위한 조직 친화성; (iv) 벡터 형질도입 후 바이러스 단백질의 발현 없음; (v) 폴리시스트론 또는 인트론-함유 서열과 같은 복잡한 유전 요소를 전달하는 능력; (vi) 잠재적으로 더 안전한 통합 부위 프로파일; 및 (vii) 벡터 조작 및 생산을 위한 비교적 쉬운 시스템을 포함하는, 유전자-전달 비히클로서 여러 매력적인 특성을 제공한다.

[00122] 일부 구현예에서, 숙주 세포는, 예를 들어, 숙주 세포의 게놈의 일부와 상동성인 핵산 서열을 포함하는 상동성 재조합을 위한 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있거나 관심 폴리펩타이드의 발현을 위한 발현 벡터일 수 있는 예를 들어, 본 출원의 벡터 작제물로 유전자 조작(예를 들어, 형질 도입, 또는 변형 또는 트랜스펙션)될 수 있다. 숙주 세포는 형질전환되지 않은 세포 또는 적어도 하나의 핵산 분자로 이미 트랜스펙션된 세포일 수 있다.

[00123] 일부 구현예에서, 재조합 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체내이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체외이다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관내이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 비-인간 영장류 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 면역 시스템 세포, 예를 들어, 림프구(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포), 또는 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 B 세포, 단핵구, 자연 킬러(NK) 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 수지상 세포, 대식세포, 조절 T 세포, 헬퍼 T 세포(TH), 세포독성 T 세포(T_CTL), 또는 다른 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역계 세포는 T 림프구이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 수득된 샘플에 대해 수행된 백혈구 성분채집술에 의해 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 환자이다. 적합한 세포주의 비제한적인 예는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda (Sf9)), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(Hi5) 세포, Expi-293F 세포, Expi--CHO 세포, 및 HEK-293T(ATCC CRL-3216)을 포함한다.

[00124] 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포, 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 본원에 제공된다. 일반적으로, 배양 배지는 본원에 기재된 세포를 배양하기 위한 임의의 적합한 배양 배지일 수 있다. 광범위한 상기 언급된 숙주 세포 및 종을 형질전환시키는 기술은 당 분야에 공지되어 있으며 기술 및 과학 문헌에 기재되어 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포를 포함하는 세포 배양물도 또한 본 출원의 범위 내에 있다. 세포 배양물을 생성하고 유지하는 데 적합한 방법 및 시스템은 당 분야에 공지되어 있다.

D. IL-10 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법

[00125] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 본 개시의 재조합 폴리펩타이드를 생산하기 위한 다양한 방법으로서, 방법은 (a) 본 개시의 하나 이상의 재조합 세포를 제공하는 단계; 및 배양 배지에서 재조합 세포(들)를 배양하여 세포가 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 생산하도록 하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 재조합 폴리펩타이드는 또한 본 개시의 범위 내에 있다.

[00126] 재조합 폴리펩타이드를 생산하기 위한 개시된 방법의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 생산된 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 생산된 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 반감기를 증가시키기 위해 생산된 폴리펩타이드를 구조적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다.

[00127] 일부 구현예에서, 변형은 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합, 및 PEG화로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경을 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 임의의 재조합 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드 및 이종성 폴리펩타이드(예를 들어, IL-10이 아닌 폴리펩타이드 또는 이의 변이체)를 포함하는 융합 또는 키메라 폴리펩타이드로서 제조될 수 있다. 예시적인 이종성 폴리펩타이드는 생체내에서 재조합 폴리펩타이드의 순환 반감기를 증가시킬 수 있고, 따라서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 특성을 추가로 향상시킬 수 있다. 다양한 구현예에서, 순환 반감기를 증가시키는 이종성 폴리펩타이드는 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 또는 IgG 중쇄 가변 영역이 결여된 항체의 IgG 서브클래스의 Fc 영역일 수 있다. 예시적인 Fc 영역은 보체 고정 및 Fc 수용체 결합을 억제하는 돌연변이를 포함할 수 있거나, 이는 용해성, 예를 들어, 보체에 결합하거나, 항체-의존적 보체 용해(ADCC)와 같은 다른 메커니즘을 통해 세포를 용해시킬 수 있다.

[00128] 일부 구현예에서, "Fc 영역"은 IgG의 파파인 소화에 의해 생산된 IgG C-말단 도메인에 상동성인 천연 발생 또는 합성 폴리펩타이드일 수 있다. IgG Fc는 대략 50 kDa의 분자량을 갖는다. 본 개시의 재조합 융합 폴리펩타이드는 전체 Fc 영역, 또는 이것이 일부인 융합 폴리펩타이드의 순환 반감기를 연장하는 능력을 보유하는 이의 더 작은 부분을 포함할 수 있다. 또한, 전장 또는 단편화된 Fc 영역은 야생형 분자의 변이체일 수 있다. 즉, 이들은 폴리펩타이드의 기능에 영향을 미칠 수 있거나 영향을 미치지 않을 수 있는 돌연변이를 함유할 수 있고; 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 천연 활성은 모든 경우에 필요하거나 요망되지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 융합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 IL-10 부분 작용제 또는 길항제)은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다.

[00129] Fc 영역은 "용해성" 또는 "비-용해성"일 수 있지만, 통상적으로 비-용해성이다. 비-용해성 Fc 영역은 통상적으로 고친화성 Fc 수용체 결합 부위 및 C'1q 결합 부위가 결여되어 있다. 뮤린 IgG Fc의 고친화성 Fc 수용체 결합 부위는 IgG Fc의 위치 235에 Leu 잔기를 포함한다. 따라서, Fc 수용체 결합 부위는 Leu 235를 돌연변이시키거나 결실시킴으로써 파괴될 수 있다. 예를 들어, Leu 235에 대한 Glu의 치환은 고친화성 Fc 수용체에 결합하는 Fc 영역의 능력을 억제한다. 뮤린 C'1q 결합 부위는 IgG의 Glu 318, Lys 320, 및 Lys 322 잔기를 돌연변이시키거나 결실시킴으로써 기능적으로 파괴될 수 있다. 예를 들어, Glu 318, Lys 320, 및 Lys 322에 대한 Ala 잔기의 치환은 IgG1 Fc가 항체-의존적 보체 용해를 지시할 수 없게한다. 대조적으로, 용해성 IgG Fc 영역은 고친화성 Fe 수용체 결합 부위 및 C'1q 결합 부위를 갖는다. 고친화성 Fc 수용체 결합 부위는 IgG Fc의 위치 235에 Leu 잔기를 포함하고, C'1q 결합 부위는 IgG1의 Glu 318, Lys 320, 및 Lys 322 잔기를 포함한다. 용해성 IgG Fc는 이러한 부위에 야생형 잔기 또는 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 용해성 IgG Fc는 항체 의존성 세포 세포독성 또는 보체 유도된 세포용해(CDC)에 대해 세포를 표적화할 수 있다. 인간 IgG에 대한 적절한 돌연변이가 또한 당 분야에 공지되어 있다.

[00130] 다른 구현예에서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 본 개시의 재조합 IL-10 폴리펩타이드 및 FLAG 서열과 같은 항원성 태그로서 기능하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. FLAG 서열은 바이오티닐화된 고도로 특이적인 항-FLAG 항체에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 C-말단 c-myc 에피토프 태그를 추가로 포함한다.

[00131] 다른 구현예에서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 본 개시의 재조합 IL-10 폴리펩타이드 및 IL-10 폴리펩타이드, 예를 들어, Aga2p 응집소 서브유닛의 발현을 향상시키거나 세포 국소화를 지시하는 기능을 하는 이종성 폴리펩타이드를 포함한다.

[00132] 다른 구현예에서, 본 개시의 재조합 IL-10 폴리펩타이드 및 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 융합 폴리펩타이드가 생성될 수 있다. 재조합 IL-10 폴리펩타이드의 항체 또는 항원-결합 성분은 표적화 모이어티로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 이는 재조합 IL-10 폴리펩타이드를 세포 또는 표적 분자의 특정 서브세트에 국소화하는 데 사용될 수 있다. 사이토카인-항체 키메라 폴리펩타이드를 생성하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다.토카인-항체 키메라 폴리펩타이드를 생성하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다.

[00133] 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 IL-10 폴리펩타이드는 이의 반감기를 증가시키기 위해 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자로 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "PEG"는 폴리에틸렌 글리콜 분자를 의미한다. 이의 통상적인 형태에서, PEG는 말단 하이드록실 기를 갖는 선형 중합체이고, 화학식 HO-CH₂CH₂-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH를 가지며, 여기서 n은 약 8 내지 약 4000이다.

[00134] 일반적으로, "n"은 이산 값이 아니지만 평균 값 주위에 대략 가우스 분포를 갖는 범위를 구성한다. 말단 수소는 알킬 또는 알칸올 기와 같은 캡핑 기로 치환될 수 있다. PEG는 적어도 하나의 하이드록시 기를 가질 수 있으며, 보다 바람직하게는 말단 하이드록시 기이다. 이러한 하이드록시 기는 펩타이드와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 링커 모이어티에 부착될 수 있다. PEG의 수많은 유도체가 당 분야에 존재한다. 본 개시의 재조합 IL-10 폴리펩타이드에 공유적으로 부착된 PEG 분자는 대략 10,000, 20,000, 30,000, 또는 40,000 달톤의 평균 분자량일 수 있다. PEG화 시약은 선형 또는 분지형 분자일 수 있고, 단독으로 또는 나란히 존재할 수 있다. 본 개시의 PEG화된 IL-10 폴리펩타이드는 펩타이드의 C-말단 및/또는 N-말단에 부착된 탠덤 PEG 분자를 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "PEG화"는 본 개시의 IL-10 폴리펩타이드와 같은 분자에, 상술된 바와 같은 하나 이상의 PEG 분자의 공유 부착을 의미한다.

E. 약학적 조성물

[00135] 본 개시의 재조합 폴리펩타이드, 핵산, 재조합 세포, 및/또는 세포 배양물은 약학적 조성물을 포함하는 조성물에 도입될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 본원에 제공되고 기재된 바와 같은 재조합 폴리펩타이드, 핵산, 재조합 세포, 및/또는 세포 배양물, 및 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 담체를 포함한다.

[00136] 따라서, 본 개시의 일 양태는 약학적으로 허용되는 담체 및 하기 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다: (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; 및 (c) 약학적으로 허용되는 담체.

[00137] 일부 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 암과 같은 질병을 치료, 예방, 개선하거나 질병의 발병을 감소 또는 지연시키기 위해 제형화된다.

[00138] 개시된 약학적 조성물의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 개시의 재조합 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 개시의 재조합 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 본 개시의 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 새로운 치료적 접근법으로서 인터루킨을 발현하고 분비하도록 유전적으로 변형된 재조합 세포의 예는, 예를 들어, 문헌[Steidler L. et al., Nature Biotechnology, Vol. 21, No. 7, July 2003 및 Oh JH et al., mSphere, Vol. 5, Issue 3, May/June 2020]에 이전에 기술되어 있다.

[00139] 일부 구현예에서, 조성물은 본 개시의 재조합 핵산 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자에 캡슐화된다.

[00140] 주사용 사용에 적합한 약학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, N.J.), 또는 포스페이트 완충된 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제, 예를 들어, 소듐 도데실 설페이트의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 일반적으로 등장제, 예를 들어, 당, 다가알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 및/또는 소듐 클로라이드를 조성물에 포함할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.

[00141] 멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 도입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 멸균 비히클에 도입시킴으로써 제조되며, 이는 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유한다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조이며, 이는 사전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 요망되는 성분의 분말을 생성한다.

[00142] 본 개시의 대상 재조합 폴리펩타이드의 전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과되는 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여를 위해, 세제, 담즙산염, 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 당 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제형화된다.

[00143] 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 또한 문헌[McCaffrey et al. (Nature 418:6893, 2002), Xia et al. (Nature Biotechnol. 20: 1006-1010, 2002), 또는 Putnam (Am. J. Health Syst. Pharm. 53: 151-160, 1996, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53:325, 1996)]에 기술된 방법을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 트랜스펙션 또는 인펙션에 의해 투여될 수 있다.

[00144] 일부 구현예에서, 본 개시의 대상 재조합 폴리펩타이드는 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이, 신체로부터의 빠른 제거에 대해 재조합 폴리펩타이드를 보호할 담체와 함께 제조된다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형은 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포솜 포함)이 또한 약학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된, 미국특허 제4,522,811호에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다. 하기에 더욱 상세히 기재되는 바와 같이, 본 개시내용의 재조합 폴리펩타이드는 또한 PEG화, 아실화, Fc 융합, 알부민과 같은 분자에 대한 연결 등에 의해 연장된 작용 지속기간을 달성하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 생체내 및/또는 생체외에서 이들의 반감기를 연장하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 본 개시의 재조합 폴리펩타이드를 변형시키기에 적합한 공지된 전략 및 방법의 비제한적인 예는 (1) 프로테아제와의 접촉으로부터 재조합 폴리펩타이드를 방지하는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 고도 가용성 거대분자로 본원에 기술된 재조합 폴리펩타이드의 화학적 변형; 및 (2) 본원에 기재된 재조합 폴리펩타이드를 안정한 단백질, 예컨대, 예를 들어, 알부민과 공유적으로 연결하거나 컨쥬게이션시키는 것을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 알부민과 같은 안정한 단백질에 융합될 수 있다. 예를 들어, 인간 알부민은 이에 융합된 폴리펩타이드의 안정성을 향상시키는 데 가장 효과적인 단백질 중 하나로 알려져 있으며, 이러한 융합 단백질이 많이 보고되어 있다.

[00145] 일부 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 하나 이상의 페길화 시약을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "PEG화"는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 단백질에 공유 부착함으로써 단백질을 변형시키는 것을 지칭하며, "PEG화된"은 PEG가 부착된 단백질을 지칭한다. 약 10,000 달톤 내지 약 40,000 달톤의 선택적 범위를 갖는 다양한 PEG, 또는 PEG 유도체 크기는 다양한 화학을 사용하여 본 개시의 재조합 폴리펩타이드에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 PEG 또는 PEG 유도체의 평균 분자량은 약 1 kD 내지 약 200 kD, 예를 들어, 약 10 kD 내지 약 150 kD, 약 50 kD 내지 약 100 kD, 약 5 kD 내지 약 100 kD, 약 20 kD 내지 약 80 kD, 약 30 kD 내지 약 70 kD, 약 40 kD 내지 약 60 kD, 약 50 kD 내지 약 100 kD, 약 100 kD 내지 약 200 kD, 또는 약 150 kD 내지 약 200 kD이다. 일부 구현예에서, 상기 PEG 또는 PEG 유도체의 평균 분자량은 약 5 kD, 약 10 kD, 약 20 kD, 약 30 kD, 약 40 kD, 약 50 kD, 약 60 kD, 약 70 kD, 또는 약 80 kD이다. 일부 구현예에서, 상기 PEG 또는 PEG 유도체의 평균 분자량은 약 40 kD이다. 일부 구현예에서, 페길화 시약은 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG-숙신이미딜 부티레이트(mPEG-SBA), mPEG-숙신이미딜 석시네이트(mPEG-SS), mPEG-숙신이미딜 카보네이트(mPEG-SC), mPEG-석신이미딜 글루타레이트(mPEG-SG), mPEG-N-하이드록실-석신이미드(mPEG-NHS), mPEG-트레실레이트 및 mPEG-알데하이드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 페길화 시약은 폴리에틸렌 글리콜이며; 예를 들어, 상기 페길화 시약은 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 N-말단 메티오닌 잔기에 공유 결합된 평균 분자량이 20,000 달톤인 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 페길화 시약은 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 N-말단 메티오닌 잔기에 공유 결합된평균 분자량이 약 5 kD, 약 10 kD, 약 20 kD, 약 30 kD, 약 40 kD, 약 50 kD, 약 60 kD, 약 70 kD, 또는 약 80 kD인 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 페길화 시약은 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 N-말단 메티오닌 잔기에 공유 결합된 약 40 kD의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이다.

[00146] 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 모이어티로 화학적으로 변형되고, 예를 들어, PEG화되고; 또는 유사한 변형으로, 예를 들어, PAS화된다. 일부 구현예에서, PEG 분자 또는 PAS 분자는 개시된 재조합 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산 측쇄에 컨쥬게이션된다. 일부 구현예에서, PEG화된 또는 PAS화된 폴리펩타이드는 단지 하나의 아미노산 상에 PEG 또는 PAS 모이어티를 함유한다. 다른 구현예에서, PEG화된 또는 PAS화된 폴리펩타이드는 2개 이상의 아미노산 상에, 예를 들어, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 상이한 아미노산 잔기에 부착된 PEG 또는 PAS 모이어티를 함유한다. 일부 구현예에서, PEG 또는 PAS 사슬은 2000, 2000 초과, 5000, 5,000 초과, 10,000, 10,000 초과, 20,000, 20,000 초과, 및 30,000 Da이다. PAS화된 폴리펩타이드는 아미노 기, 설프히드릴 기, 하이드록실 기, 또는 카복실 기를 통해 (예를 들어, 연결 기 없이) PEG 또는 PAS에 직접적으로 커플링될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 약 1 kD 내지 약 200 kD, 예를 들어, 약 10 kD 내지 약 150 kD, 약 50 kD 내지 약 100 kD, 약 5 kD 내지 약 100 kD, 약 20 kD 내지 약 80 kD, 약 30 kD 내지 약 70 kD, 약 40 kD 내지 약 60 kD, 약 50 kD 내지 약 100 kD, 약 100 kD 내지 약 200 kD, 또는 약 150 kD 내지 약 200 kD 범위의 평균 분자량으로 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 약 5 kD, 약 10 kD, 약 20 kD, 약 30 kD, 약 40 kD, 약 50 kD, 약 60 kD, 약 70 kD, 또는 약 80 kD의 평균 분자량으로 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 약 40 kD의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된다.

부위-특이적 PEG화 부위의 도입

[00147] 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드(예를 들어, IL-10 변이체)는 예를 들어, 미국 특허 제7,045,337호; 제7,915,025호; 문헌[Dieters, et al. (2004) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 14(23):5743-5745; Best, M (2009) Biochemistry 48(28): 6571-6584]에 기술된 바와 같이 부위 특이적 컨쥬게이션(예를 들어, PEG화)을 용이하게 하기 위해 비-자연 발생 아미노산 측쇄를 비-천연 아미노산에 도입함으로써 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인 잔기는, 예를 들어, 문헌[Dozier and Distefano (2015) International Journal of Molecular Science 16(10): 25831-25864]에 기술된 바와 같은 시스테인 측쇄를 통해 부위-특이적 PEG화를 용이하게 하기 위해 본 개시의 재조합 폴리펩타이드 내의 다양한 위치에서 도입될 수 있다.

[00148] 특정 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 부위 특이적 PEG화(예를 들어, 시스테인 또는 비-천연 아미노산)를 가능하게 하는 하나 이상의 아미노산의 도입을 포함하는 IL-10 변이체 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 부위 특이적 PEG화에 대한 아미노산 치환은 부위는 IL-10과 IL-10 수용체 신호전달 복합체, 예를 들어, IL-10Rα 또는 IL-10Rβ의 성분 사이의 계면에 있지 않다. 이러한 경우에, 부위-특이적 아미노산 변형의 도입은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 잔기 34-69, 78-87, 및 108-160 이외의 IL-10 아미노산 위치에 도입되며, 이는 본원에 기재된 결정 구조에서 밝혀진 IL-10Rβ 결합 계면을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 하나 이상의 다음 아미노산 위치 34-69, 78-87, 및 108-160에서 부위 특이적 컨쥬게이션(예를 들어, PEG화)을 가능하게 하는 부위-특이적 아미노산 치환을 포함하는 IL-10 변이체 폴리펩타이드를 제공한다.

부위-특이적 PEG화 부위의 도입

[00149] 일부 구현예에서, IL-10 단백질과 IL-10Rβ 단백질의 상호작용은 IL-10 계면에서 본원에 기재된 아미노산 위치에서의 부위 특이적 페길화의 도입에 의해 조절될 수 있다. SEQ ID NO: 1의 13-33, 70-77, 및 88-107로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 하나 이상의 위치에서 부위 특이적 PEG화를 촉진하는 비-천연 아미노산(또는 시스테인 잔기)(즉, 신호 펩타이드를 포함하는 전-단백질 인간 IL-10 단백질에 따라 넘버링될 때 잔기 31-51, 88-95, 106-125, 즉, SEQ ID NO: 16의 서열)의 도입은 부분 작용제 활성을 갖는 변이체 IL-10/IL-10Rα/IL-10Rβ 수용체 복합체를 생성하는 IL-10Rβ 단백질에 대한 조절된 결합을 갖는 IL-10 변이체 폴리펩타이드를 제공한다. PEG 분자가 계면에서 도입되어, IL-10 변이체 폴리펩타이드와 IL-10Rβ 또는 IL10R1 단백질의 결합을 완전히 방해하여 활성을 제거하지 않는 경우, PEG는 통상적으로 약 1 kDa, 대안적으로 약 2 kDa, 대안적으로 약 3 kDa, 대안적으로 약 4 kDa, 대안적으로 약 5 kDa, 대안적으로 약 6 kDa, 대안적으로 약 7 kDa, 대안적으로 약 8 kDa, 대안적으로 약 9 kDa, 대안적으로 약 10 kDa, 대안적으로 약 12 kDa, 대안적으로 약 15 kDa, 또는 대안적으로 약 20 kDa의 저분자량 PEG 종이다.

제형

[00150] 본 개시의 IL-10 변이체 폴리펩타이드는 치료적 유효량의 이러한 I IL-10 변이체 폴리펩타이드를 단독으로 또는 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 염증 질환을 앓고 있는 포유류 대상체에서 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 또한, 본 개시는 치료적 유효량의 이러한 IL-10 변이체 폴리펩타이드를 단독으로 또는 하나 이상의 추가 치료제과 조합하여 대상체에게 투여함으로써 염증성 질환을 앓고 있는 포유류 대상체에서 염증성 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

[00151] 일부 구현예에서, 본 개시의 조성물 및 방법은 크론병(CD), 궤양성 대장염(UC), 및 장관의 만성 염증에 의해 특징되는 다른 형태의 염증성 장 질환(IBD)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 위장(GI)관의 염증성 질환의 치료에서 유용하다. 크론병은 입에서 항문까지의 장관 영역에 영향을 미칠 수 있지만, 궤양성 대장염은 통상적으로 대장 및 직장의 염증과 관련이 있다.

[00152] 이러한 염증성 장 질환에 대한 통상적인 1차 치료는 5-아미노살리사이클릭 산을 선택적으로 코르티코스테로이드와 함께 포함한다. 항-TNF 알파 항체(예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙) 및 인테그린 수용체 길항제(예를 들어, 나탈리주맙 및 베돌리주맙) 및 IL23 길항제(예를 들어, 우스테키누맙)와 같은 치료 단백질의 더욱 최근의 개발. 만성 염증성 질환의 치료에 상당한 효능을 제공하면서, 전신 노출에서 이러한 폴리펩타이드의 통상적인 비경구(IM, IV 또는 SQ) 투여는 치료제에 노출되는 제제의 비교적 작은 분획으로 이루어진다. 이러한 제제는 염증 경로의 특정 파괴를 제공하지만, 이들의 비경구 투여로 인한 이러한 제제에 대한 전신 노출은 면역억제를 포함하는 유의한 전신 부작용과 관련이 있으며, 이는 결핵, 진균 감염, 요로 감염, 및 림프종을 포함하는 중증의, 잠재적으로, 치명적인 감염에 대한 취약성을 증가시킨다. 이러한 상당한 전신 독성은 투여되는 제제의 용량을 제한하여 생물학적 치료제에 대한 영향을 받은 조직의 준최적 노출을 초래한다.

[00153] 본 개시의 IL-10 변이체 폴리펩타이드의 선택적 특성은 비경구 투여될 때 이러한 전신 부작용을 완화하지만, 일부 경우에 장관으로의 IL-10 변이체 폴리펩타이드의 직접 투여를 제공하는 것이 바람직할 수 있다.

IL-10 변이체 폴리펩타이드의 경구 투여용 제형

[00154] 본 개시는 추가로 포유동물 대상체에서 위장관의 염증성 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 방법은 포유동물 대상체에게 치료적 또는 예방적 유효량의 본 개시의 IL-10 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 단독으로 또는 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시는 본 개시의 IL-10 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 장내 조성물을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 장내 조성물은 IL-10 변이체 폴리펩타이드의 약학적으로 허용되는 제형을 포함하며, 여기서 이러한 제형은 상부 GI 관에서 IL-10 변이체 폴리펩타이드의 분해에 저항하여 소장, 대장, 직장 및 항문을 포함하는 하부 GI 관에 IL-10 변이체 폴리펩타이드의 투여, 및 궤양성 대장염을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 하부 GI 관의 염증성 질환의 치료를 용이하게 한다. 경구 투여에 적합한 예시적인 폴리펩타이드 제형은 문헌[Hamman, et al "Oral Delivery of Peptide Drugs" (2005). BioDrugs 19, 165-177; Blichmann, P. "Oral Delivery of Peptide Drugs for Mitigation of Crohn's Disease" (2012). All Theses. 1486 and reviewed in Anselmo, et al "Non-invasive delivery strategies for biologics) (2019) Nat Rev Drug Discov 18, 19-40]에 기재된 것과 같이 당 분야에 공지되어 있다.

조작된 원핵 세포의 전달

[00155] 또 다른 구현예에서, 본 개시는 포유동물 대상체의 GI 관에 IL-10 변이체를 투여하는 방법으로서, 방법은 재조합 공학처리된 원핵 세포를 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 원핵 세포는 하나 이상의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 본 개시의 IL-10 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 이에 따라, IL-10 변이체는 재조합 원핵 세포에서 발현되며, IL-10 변이체는 재조합적으로 변형된 원핵 세포로부터의 분비 또는 이의 용해에 의해 GI 관에 방출되거나, 원핵 세포의 표면 상에 디스플레이되는 방법을 제공한다. IL-10의 투여를 위한 재조합적으로 변형된 박테리아 세포의 예는 당 분야에 공지되어 있다(Steidler, et al. 2003, supra). 일부 구현예에서, IL-10 변이체를 발현하는 조작된 박테리아 세포는 경구로, 통상적으로 수성 현탁액으로, 또는 직장으로(예를 들어, 관장) 투여될 수 있다.

장내 세균총(intestinal flora)으로의 원핵생물 바이러스 전달

[00156] 일 구현예에서, 본 개시는 IL-10 변이체 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합적으로 변형된 원핵생물 바이러스(예를 들어, 박테리오파지)를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 포유동물 대상체의 장관의 염증성 질환을 치료하는 방법으로서, 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 IL-10 변이체 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합적으로 변형된 원핵생물 바이러스(예를 들어, 박테리오파지)의 약학적으로 허용되는 제형을 투여하는 단계를 포함하며, 핵산 서열은 바이러스에 대한 숙주 원핵 세포에서 기능적인 하나 이상의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되며, 이에 따라 원핵생물 바이러스에 의한 원핵 세포의 감염 시에, IL-10 변이체는 숙주 세포에서 발현되는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 박테리오파지는 박테리오파지가 감염 후 박테리아 세포의 용해 경로를 유도하여 IL-10 변이체의 국소 방출 및 장 점막으로의 IL-10 변이체의 전달을 초래하도록 하는 용해 파지이다.

[00157] 본원에서 사용되는 용어 '원핵생물 바이러스', "박테리오파지" 및 "파지"는 박테리아 내에서 감염 및 복제하는 임의의 다양한 박테리아 바이러스를 설명하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 광범위한 박테리아 세포를 선택할 수 있는 매우 다양한 박테리오파지가 과학 문헌에서 광범위하게 확인되고 특성화되었다. 박테리오파지는 감염에 민감한 박테리아 세포에서 상당한 선택성을 나타내기 때문에, 박테리오파지는 통상적으로 발현을 위한 장내 세균총의 표적 박테리아의 관점에서 선택된다. 임의의 매우 다양한 박테리아 세포에 대한 재조합 공학처리된 박테리오파지의 생성을 위한 출발 물질로서 적합한 박테리오파지의 샘플은 American Type Culture Collection(Manassas, VA)으로부터 입수 가능하다. 파지 게놈의 조작은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual]에 기술된 것(Cold Spring Harbor Press로부터 입수 가능) 및 매우 광범위한 실험실 공급업체로부터 입수 가능한 통상적인 시약과 같은 당업자에게 널리 공지된 제조합 핵산의 조작을 위한 표준 방법에 따라 수행된다.

[00158] 감염 부위로의 IL-10 변이체의 전달은 대상체의 장내 세균총의 원핵 세포를 감염시킬 수 있는 박테리오파지에 의해 달성되며, 박테리오파지는 IL-10 변이체를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 표적 원핵 세포에서 활성인 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 도입하는 재조합 기술를 이용하여 변형되며, 상기 발현 카세트는 재조합적으로 조작된 박테리오파지에 의한 표적 박테리아 세포의 트랜스펙션 후, IL-10 변이체 폴리펩타이드가 표적 박테리아 세포에서 발현되도록 박테리오파지 게놈의 비필수 영역에 삽입된다. 예를 들어, 박테리오파지 표적화 S. 아우레우스 세포의 경우, 발현 카세트는 S. 아우레우스 특이적 박테리아파지의 비필수 영역에 삽입된 IL-10 변이체의 발현을 구동하는 S. 아우레우스 프로모터를 사용할 것이다. 박테리오파지 게놈의 비필수 영역의 확인은 이러한 파지의 공지된 게놈 조직 및 코딩 서열에 의해 용이하게 확인된다. 매우 다양한 박테리아에서 활성인 원핵 프로모터 서열은 당 분야에 잘 알려져 있다. 프로모터 서열은 자연 발생 서열을 절단함으로써 또는 표적 박테리아 세포의 자연 발생 원핵 프로모터 서열에 상응하는 핵산 서열의 시퀀싱 및 합성 합성을 통해 수득될 수 있다(예를 들어, 문헌[Estrem, et al. (1999) Bacterial promoter architecture: Subsite structure of UP elements and interactions with the carboxy-terminal domain of the RNA polymerase alpha subunit; Genes & Development 13(16): 2134-2147] 참조).

코돈 최적화

[00159] IL-10 변이체가 본원에 제공되고 핵산 서열이 유전자 코드의 축퇴성에 기반하여 당업자에 의해 생성될 수 있는 경우, 아미노산 서열 및 상응하는 인코딩 핵산 서열이 제공된다. 일 구현예에서, IL-10 변이체의 포유동물 서열은 발현을 위해 최적화된 코돈의 사용을 통해 박테리아 세포 표적 환경에서의 발현을 위해 최적화된다. 박테리아 세포 발현에 최적이고 바람직한 코돈을 사용하여 IL-10 변이체를 인코딩하는 합성 핵산 서열의 작제를 위한 기술은 당 분야에 널리 공지된 기술에 의해 박테리오파지 게놈의 천연 단백질을 인코딩하기 위한 코돈 사용의 공통성 및 이들의 상대적 존재비를 분석하는 컴퓨터 방법에 의해 결정될 수 있다. 코돈 사용 데이터베이스(www.kazusa.or.jp/codon)는 박테리아 환경에서 코돈 최적화된 서열의 생성을 위해 사용될 수 있다. 또한, JCat Codon Optimization Tool(www.jcat.de), Integrated DNA technologies Codon Optimization Tool(www.idtdna.com/CodonOpt) 또는 Optimizer 온라인 코돈 최적화 툴(genomes.urv.es/OPTIMIZER)과 같은, 다양한 소프트웨어 툴이 하나의 유기체로부터 상이한 숙주 유기체를 위한 최적의 코돈 사용으로 서열을 전환시키기 위해 이용 가능하다. 이러한 합성 서열은 합성 핵산 분자의 작제를 위한 당 분야에 널리 공지된 기술에 의해 작제될 수 있고, 다양한 상업적 벤더로부터 입수될 수 있다.

파지 벡터의 PAM 모티프의 결실

[00160] 일부 구현예에서, 장내 세균총에서 재조합 벡터로부터 IL-10 폴리펩타이드의 발현을 용이하게 하기 위해, 본 발명의 재조합 원핵 벡터는 박테리아 숙주 세포의 방어 메커니즘을 피하거나 억제하도록 변형될 수 있다. 박테리아 숙주는 파지를 불활성화시키는 이중 가닥 DNA 절단을 도입하는 Cas9 엔도뉴클레아제와 같은 박테리오파지 감염에 대해 보호하기 위한 방어 메커니즘을 개발하였다. Cas9 엔도뉴클레아제는 Cas9가 표적 DNA에 결합하는 데 필수적인 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 부위를 확인하기 위해 게놈을 조사한다. PAM 서열은 Cas9 기능에 필수적이기 때문에, 원핵생물 바이러스로부터 Cas9 서열의 제거는 IL-10 변이체를 인코딩하는 침입 파지를 중화시키는 대상체의 장내 세균총에 내인성인 Cas9 엔도뉴클레아제의 능력을 최소화한다.

IL-10 변이체 폴리펩타이드를 발현하는 조작된 조절 T 세포(Treg)

[00161] 일부 구현예에서, 본 개시는 재조합적으로 변형된 Treg 세포를 추가로 제공하며, Treg는 IL-10 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 선택적으로 신호 펩타이드를 포함하고, 신호 펩타이드와 관련될 때 선택적으로 분비된 형태의 IL-10 변이체를 인코딩하는 핵산 서열의 전사 및 번역을 지시할 수 있는 Treg 세포에서 기능성인 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 당업자는 용어 "조절 T 세포" 또는 "Treg 세포"는 이펙터 T 세포(Teff)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다른 T 세포의 반응을 억제할 수 있는 CD4+ T 세포의 타입을 지칭하는 것으로 이해할 것이다. Treg 세포는 CD4, IL-2 수용체(CD25)의 α-서브유닛, 및 전사 인자 포크헤드 박스 P3(FOXP3)의 발현을 특징으로 한다. 조작된 Treg 세포 및 이들의 제조 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[McGovern, et al. Engineering Specificity and Function of Therapeutic Regulatory T Cells (2017). Front. Immunol. 8:1517; Scott, D. Genetic Engineering of T Cells for Immune Tolerance (2020) Molecular Therapy: Methods & Clinical Development 16:103 and include CAR Tregs as described in Zhang, et al (2018) Frontiers in Immunology 12(9):235] 참조).

바이러스 벡터를 통한 IL-10의 투여

[00162] 일부 구현예에서, IL-10 변이체는 대상체를 IL-10 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터와 접촉시킴으로써 포유동물 대상체에게 투여될 수 있다. 발현 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 용어 "비바이러스 벡터"는 정상 게놈과 구별되고 표적 세포에서 코딩 서열의 발현을 달성할 수 있는 비선택적 조건 하에 세포 생존에 필수적이지 않은 자율적으로 복제하는 염색체외 원형 DNA 분자를 지칭한다. 플라스미드는 비-바이러스 벡터의 예이다. 표적 세포의 트랜스펙션을 용이하게 하기 위해, 표적 세포는 비-바이러스 벡터의 흡수를 용이하게 하는 조건 하에 비-바이러스 벡터에 직접 노출될 수 있다. 포유동물 세포에 의한 외래 핵산의 흡수를 촉진하는 조건의 예는 당 분야에 잘 알려져 있고, 화학적 수단(예컨대, Lipofectamine®, Thermo-Fisher Scientific), 고염, 자기장(전기천공)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

[00163] 일 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 비-바이러스 전달 시스템으로 제공될 수 있다. 비-바이러스 전달 시스템은 통상적으로 표적 세포의 핵산 카고의 형질도입을 용이하게 하기 위한 복합체이며, 여기서 핵산은 양이온성 지질(DOTAP, DOTMA), 계면활성제, 생물학적 제제(젤라틴, 키토산), 금속(금, 자성 철) 및 합성 중합체(PLG, PEI, PAMAM)과 같은 제제와 복합체를 형성한다. 지질 벡터 시스템(Lee et al. (1997) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 14:173-206); 폴리머 코팅된 리포솜(미국 특허 제5,213,804호; 미국 특허 제5,013,556호); 양이온성 리포솜(미국 특허 제5,283,185; 미국 특허 제5,578,475호; 미국 특허 제5,279,833호; 미국 특허 제5,334,761호)을 포함하는 비-바이러스 전달 시스템의 수많은 구현예는 당 분야에 알려져 있다.

[00164] 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 바이러스 벡터는 단백질-합성 또는 에너지-생성 메커니즘을 갖지 않는 임의의 절대 세포내 기생충을 지칭하기 위해 이의 통상적인 의미로 사용되며, 일반적으로 포유동물 세포에 외인성 이식 유전자를 전달하기 위해 통상적으로 사용되는 임의의 외피보유 또는 비-외피보유 동물 바이러스를 지칭한다. 바이러스 벡터는 복제 적격(예를 들어, 실질적으로 야생형), 조건부 복제(특정 조건 하에 복제하도록 재조합적으로 조작됨) 또는 복제 결핍(바이러스의 결실된 기능을 보완할 수 있는 세포주의 부재 하에 실질적으로 복제 불가능)일 수 있다. 바이러스 벡터는 이를 "선택적으로 복제"하도록 하는, 즉, 특정 세포 타입 또는 표현형 세포 상태, 예를 들어, 암에서 우선적으로 복제하도록 하는 특정 변형을 가질 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스 벡터 시스템은, 예를 들어, 자연 발생 또는 재조합 바이러스 벡터 시스템을 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스의 예는 재조합적으로 변형된 외피보유 또는 비-외피보유 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 인간 또는 소 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스(예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스) 신드비스 바이러스, 및 레트로바이러스(Rous 육종 바이러스를 포함하지만, 이로 제한되지 않음), 및 B형 간염 바이러스의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 통상적으로, 관심 유전자는 이러한 벡터에 삽입되어, 통상적으로 바이러스 게놈 서열을 수반하는 유전자 작제물의 패키징을 가능하고 이후에 관심 유전자의 발현을 초래하는 민감한 숙주 세포를 감염시킨다.

[00165] 추가의 폴리펩타이드 치료제와의 조합 요법을 용이하게 하기 위해, 발현 벡터는 IL-10 변이체 폴리펩타이드 이외에 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 본 발명의 실시에서와 같이 다수의 폴리펩타이드를 발현시킬 때, 각 폴리펩타이드는 발현 조절 서열(모노시스트론)에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 다수의 폴리펩타이드는 폴리시스트론 작제물에 의해 인코딩될 수 있고, 여기서 다수의 폴리펩타이드는 단일 발현 제어 서열의 제어 하에 발현된다. 일 구현예에서, 표적화 항원을 인코딩하는 발현 벡터는 선택적으로 하나 이상의 면역학적 조절제를 추가로 인코딩할 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 면역학적 조절제의 예는 사이토카인을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 발현된 사이토카인은 세포내 발현을 위해 지시되거나 세포외 제시 또는 분비를 위한 신호 서열로 발현될 수 있다.

[00166] 발현 벡터는 선택적으로 "구조" 유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공할 수 있다(예를 들어, "구조 유전자"는 핵산 서열이며, 이의 발현은 세포가 사멸되도록 외부 인자에 의해 사멸하는 데 민감한 세포를 제공하거나 세포에서 독성 상태를 유발함). 구조 유전자의 제공은 형질도입된 세포의 선택적 세포 사멸을 가능하게 한다. 따라서, 구조 유전자는 상기 작제물이 포유동물 대상체의 세포에 도입되어 형질도입된 세포의 바람직하지 않은 확산 또는 복제 적격 벡터 시스템의 효과를 방지할 때 추가적인 안전 예방책을 제공한다. 일 구현예에서, 구조 유전자는 티미딘 키나제(TK) 유전자이며(예를 들어, 미국 특허 제5,631,236호 및 미국 특허 제5,601,818호 참조), 여기서 TK 유전자 생성물을 발현하는 세포는 간시클로버의 투여에 의해 선택적 사멸에 취약하다.

본 개시의 방법

[00167] 본원에 기재된 치료 조성물 중 어느 하나, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드(예를 들어, IL-10 폴리펩타이드 변이체), 핵산, 재조합 세포, 및 약학적 조성물의 투여는 암, 자가면역 질환, 면역 질환, 및 만성 감염과 같은 관련 건강 병태 및 질환의 치료에서 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 폴리펩타이드, IL-10 폴리펩타이드 변이체, 핵산, 재조합 세포, 및 약학적 조성물은 IL-10 신호전달과 관련된 하나 이상의 자가면역 질환 또는 병태를 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 이의 발병 위험이 높을 수 있는 개체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 치료제에 도입될 수 있다. 예시적인 자가면역 질환 또는 병태는 암, 면역 질환, 및 만성 감염을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 개체는 의사의 관리 하에 있는 환자이다.

[00168] 따라서, 일 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 대상체에서 IL-10-매개 신호전달을 조절하기 위한 방법으로서, 방법은 (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 재조합 세포; 및 (d) 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 치료적 유효량의 본 개시의 재조합 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함한다.

[00169] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강 병태를 치료하는 방법으로서, 방법은 대상체에게 (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 재조합 세포; 및 (d) 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 치료적 유효량의 본 개시의 재조합 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함한다.

[00170] 일부 구현예에서, 개시된 약학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 상용화 가능하도록 제형화된다. 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 경구로 또는 흡입에 의해 제공될 수 있지만, 비경구 경로를 통해 투여될 가능성이 더 크다. 비경구 투여 경로의 예는, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경피(국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제; 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조절용 제제, 예를 들어, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스. pH는 일- 및/또는 이-염기성 소듐 포스페이트, 염산 또는 소듐 하이드록사이드와 같은 산 또는 염기로 조정될 수 있다(예를 들어, 약 7.2 내지 7.8, 예를 들어, 7.5의 pH로). 비경구 제조물은 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 포함될 수 있다.

[00171] 본 개시의 이러한 대상 재조합 폴리펩타이드의 투여량, 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD₅₀(집단의 50%에 대한 치사량) 및 ED₅₀(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며, 이는 비 LD₅₀/ED₅₀으로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 일반적으로 적합하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 이러한 화합물을 감염된 조직의 부위에 표적화하는 전달 시스템을 설계하는 데 주의를 기울여야 한다.

[00172] 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 개시의 방법에서 사용되는 임의의 화합물의 경우, 치료적 유효량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정된 IC₅₀(예를 들어, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장 중 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

[00173] 본 개시의 대상 재조합 폴리펩타이드의 치료적 유효량(예를 들어, 유효 투여량)은 선택된 폴리펩타이드에 따라 다르다. 예를 들어, 환자 체중의 대략 0.001 내지 0.1 mg/kg 범위의 단일 용량 양이 투여될 수 있고; 일부 구현예에서, 약 0.005, 0.01, 0.05 mg/kg이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 600,000 IU/kg이 투여된다(IU는 림프구 증식 생물검정에 의해 결정될 수 있고 국제 단위(IU)로 표현된다). 조성물은 1일 1회 이상 내지 주 1회 이상 투여되며; 격일로 1회를 포함한다. 당업자는 질병의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함하지만 이로 제한되지 않는 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 개시의 대상 재조합 폴리펩타이드의 치료적 유효량으로 대상체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나, 일련의 치료를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 5일 동안 8시간마다 투여된 후, 2 내지 14일, 예를 들어, 9일의 휴식 기간이 지난 후, 8시간마다 추가로 5일 동안 투여된다.

[00174] 대상체에서 IL-10-매개 신호전달을 조절하고/하거나 이를 필요로 하는 대상체에서 건강적 병태의 치료를 위해 개시된 방법의 비-제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여되는 조성물은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드를 포함하는 조성물과 비교하여 대상체에서 세포-유형 편향된 IL-10 신호전달을 부여한다. 실시예에 더 상세히 기재된 바와 같이, 본 개시의 예시적인 IL-10 폴리펩타이드 변이체, 10-DE는 생체내에서 세포-유형 편향된 신호전달 반응을 유도하여, 단핵구 및 대식세포에서 완전한 STAT3 작용제로서 작용하지만, CD4+, CD8+ T 세포, NK 세포, 및 B 세포에서 약한 STAT3 작용제로서 작용한다. 특히, IL-10 변이체 10-DE는 B 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및/또는 NK 세포와 같은 벌크 PBMC에서 STAT3-매개 전염증성 기능의 감소를 부여하면서 이의 STAT3- 단핵구 및 대식세포에서 항염증 매개 기능, 이에 의해 생체내에서 IL-10의 항염증 및 면역자극 기능을 분리시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-10 폴리펩타이드 변이체에서의 아미노산 치환은 단핵구 및 대식세포에서 IL-10 신호전달을 실질적으로 유지하면서, 벌크 PBMC, B 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및/또는 NK 세포에서 IL-10 신호전달의 감소를 포함하는 세포-유형 편향된 IL-10 신호전달을 초래한다.

[00175] 따라서, 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 단핵구에서 IL-10 신호전달을 실질적으로 유지하면서 벌크 PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포에서 IL-10 신호전달의 감소를 포함하는 세포-유형 편향된 IL-10 신호전달을 초래한다. 일부 구현예에서, 세포-유형 편향된 IL-10 신호전달은 대식세포에서 IL-10 신호전달을 실질적으로 유지하면서 벌크 PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포에서 IL-10 신호전달의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 대상체에서 벌크 PBMC에서 염증성 사이토카인 제조를 억제한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 활성화된 단핵구에서 MHC-II를 하향조절한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 인간 단핵구-유래 대식세포에서 염증성 사이토카인 제조를 억제한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 활성화된 CD8+ T 세포의 활성을 강화시키지 않는다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 및/또는 그랜자임 B 제조를 강화하지 않는다.

[00176] 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드를 포함하는 조성물과 비교하여, 예를 들어, STAT3의 인산화에 의해 결정되는 바와 같이 편향된 IL-10 신호전달을 초래한다. 일부 구현예에서, 편향된 IL-10 신호전달은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교할 때 적어도 10%, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%만큼 STAT3 인산화의 감소를 포함한다.

[00177] 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 하나 이상의 STAT3-매개 전염증성 기능의 감소를 초래한다. STAT3-매개 전염증성 기능의 비-제한적인 예는 사이토카인 제조, 케모카인 제조, 면역 세포 증식, 및 면역 세포 동원을 포함한다. 일부 구현예에서, STAT3-매개 전염증성 기능은 유전자 발현 검정, 포스포-흐름 신호전달 검정, 및/또는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정시, 약 20%에서 약 100%로 감소된다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 전염증성 유전자의 발현을 유도하는 폴리펩타이드의 능력에 의해 결정되는 바와 같이, 하나 이상의 STAT3-매개 전염증성 기능의 감소를 초래한다. 전염증성 유전자의 비-제한적인 예는 IFN-γ, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 퍼포린, TNF-α, GM-CSF, 및 MIP1α를 포함한다.

[00178] 일부 구현예에서, STAT3-매개 전염증성 기능(예를 들어, Daudi, Jurkat 또는 YT-1 세포에서 측정시)은 일부 구현예에서, 일차 단핵구에서 STAT3-매개 기능을 유의하게 변경시키지 않으면서, 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-10과 비교하여 약 20% 내지 약 100%, 예를 들어, 약 20% 내지 약 50%, 약 30%, % 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 90%, 또는 약 30% 내지 약 100%이다.

[00179] 일부 구현예에서, 투여되는 조성물은 하나 이상의 STAT3-매개 기능을 실질적으로 보유한다. STAT3-매개 기능의 예는 단핵구 및 대식세포 활성화의 억제, 사이토카인 제조, 케모카인 제조, 및 MHC 발현을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 IL-6, TNF-α, IL-1b, IL-8, IL-12, 및 HLA-DR과 같은 바이오마커의 발현을 억제하는 폴리펩타이드의 능력에 의해 결정되는 바와 같이, 하나 이상의 STAT3-매개 기능을 실질적으로 보유한다.

[00180] 일부 구현예에서, 투여되는 조성물은 대상체에서 IFN-γ, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 퍼포린, TNF-α, GM-CSF, 및 MIP1α로부터 선택된 전염증성 유전자의 발현을 유도하는 감소된 능력을 부여한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 대상체에서 IL-6, TNF-α, IL-1b, IL-8, IL-12, 및 HLA-DR로부터 선택된 유전자의 발현을 감소시키는 이의 능력을 실질적으로 유지한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물의 투여는 대상체에서 T-세포 활성을 활성화시키지 않는다.

[00181] 일부 구현예에서, 투여되는 조성물은 종양 미세환경에서 항종양 면역을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 투여되는 조성물은 종양 미세환경 상피 보호 및 재생에서 항종양 면역을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 병태는 암, 면역 질환, 자가면역 질환, 또는 만성 감염이다.

[00182] 일부 구현예에서, 본원은 건강적 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강적 병태의 치료 방법을 제공하며, 여기서 건강적 병태는 암이다. 용어 암은 일반적으로 제어되지 않은 증식, 불멸성, 전이 가능성, 빠른 성장 및 증식 속도, 및 특정 특징적인 형태학적 특징과 같은 암-유발 세포의 통상적인 특징을 갖는 세포의 존재를 지칭한다. 암 세포는 종종 종양으로 응집되어 관찰되지만, 이러한 세포는 동물 대상체 내에 단독으로 존재할 수 있거나, 백혈병 세포와 같은 비종양유발성 암 세포일 수 있다. 따라서, 용어 "암"은 고형 종양, 연조직 종양, 또는 전이성 병변에 대한 언급을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "암"은 전암성, 뿐만 아니라 악성 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양, 연조직 종양, 또는 전이성 병변이다.

[00183] 일부 구현예에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암의 치료를 위한 방법이 본원에 제공되며, 여기서 암은 급성 골수종 백혈병, 역형성 림프종, 성상세포종, B-세포암, 유방암, 유방암, 암, 결장암, 뇌실막종, 식도암, 교모세포종, 신경아교종, 평활근육종, 지방육종, 간암, 폐암, 외투 세포 림프종, 흑색종, 신경모세포종, 비-소세포 폐 암, 희소돌기아교종, 난소암, 췌장암, 말초 T-세포 림프종, 신장암, 육종, 위암, 암종, 중피종, 및 육종을 포함한다.

[00184] 일부 구현예에서, 면역 질환은 자가면역 질환이다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 용혈성 빈혈, 류마티스 열, 갑상선염, 크론병, 중증 근무력증, 사구체신염, 자가면역 간염, 다발성 경화증, 원형 탈모증, 건선, 백반증, 이영양성 표피박리증, 전신 홍반 루푸스, 이식편 대 숙주 질환, 궤양성 대장염, 췌장염, 건선성 관절염, 및 당뇨병성 족부 궤양로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 IL-10 매개 신호전달과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다.

[00185] 일부 구현예에서, 건강적 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강적 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 건강적 병태는 미생물, 예를 들어, 박테리아, 미세진균, 또는 바이러스에 의한 만성 감염과 같은 만성 염증 상태와 관련된 악성종양이다. 따라서, 본 개시의 일부 구현예는 패혈증과 같은 박테리아 감염과 관련된 악성종양을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 개시의 일부 구현예는 만성 바이러스 감염과 관련된 악성종양을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 만성 바이러스 감염과 관련된 악성종양의 비-제한적인 예는 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 및 사이토카인 방출 증후군(CRS)을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 호흡기 감염이다. 일부 구현예에서, 감염은 인간 오르토뉴모바이러스 속의 종, 엔테로바이러스 패밀리의 종, 코로나바이러스과의 종, 또는 오르토믹소바이러스과의 서브유형에 속하는 바이러스에 의해 유발된다. 일부 구현예에서, 오르토믹소바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 또는 파라인플루엔자 바이러스이다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 A 바이러스는 서브유형 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, 및 H10N7. 일부 구현예에서, 파라인플루엔자 바이러스는 서브유형 HPIV-1, HPIV-2, HPIV-3, 및 HPIV-4로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 감염은 코로나바이러스에 의해 유발된다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스는 β-CoV 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 β-CoV 감염은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 SARSr-CoV(이는 SARS-CoV, SARS-CoV-2, 및 박쥐 SL-CoV-WIV1과 같은 모든 이의 균주를 포함함), 티로니크테리스 박쥐 코로나바이러스 HKU4(BtCoV-HKU4), 피피스트렐러스 박쥐 코로나바이러스 HKU5(BtCoV-HKU5), 및 중동 호흡기 증후군-관련 코로나바이러스 MERS-CoV(종 HCoV 포함 -229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1을 포함함)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 아속 사르베코바이러스와 관련이 있다. 일부 구현예에서, 인간 오르토믹소바이러스는 인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)이다. 일부 구현예에서, HRSV는 서브유형 A 및/또는 서브유형 B와 관련된다.

추가 요법

[00186] 상기 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 재조합 폴리펩타이드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물 중 임의의 하나는, 예를 들어, 화학치료제, 항암제, 면역억제성 제제, 면역억제제, 또는 항염증제와 같은 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가 치료제와 "조합하여" 투여는 임의의 순서로 동시(병용) 및 연속 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제, 화학치료제, 항암제, 면역억제제, 또는 항염증제는 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 수술, 및 질병 변형 항류마티스 약물(DMARD)로 구성된 군으로부터 선택된다. 다양한 부류의 항염증제가 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 사이토카인 길항제, 사이토카인 수용체 길항제, 가용성 수용체, 인테그린 길항제, 코르티코스테로이드, 키나제 억제제, S1P 작용제, 및 PDE4 길항제를 포함한다.

[00187] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법은 염증성 면역 반응을 억제하는 조성물, 예를 들어, 항염증 약물의 투여를 추가로 포함한다. 적합한 항염증 약물은 TNF 길항제(예를 들어, 아달리무맙, 인플릭시맙), IL-23 길항제(예를 들어, 우스테키누맙), IL-17 길항제(예를 들어, 세쿠키누맙), IL-1 길항제(예를 들어, 아나킨라), IL-6 길항제(예를 들어, 토실리주맙), IL-12 길항제(예를 들어, 우스테키누맙), IL-2 길항제(예를 들어, 다클리주맙), 인테그린 길항제(예를 들어, 베돌리주맙), 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손), 아미노살리실레이트(예를 들어, 메살라민, 발사아지드, 올살라진), 메토트렉세이트, 아자티오프린, 레플루노미드, 클로로퀸, 칼시뉴린 억제제(사이클로스포린, 타크로리무스), 아바타셉트, 리툭시맙, JAK 억제제(예를 들어, 토파시티닙), PDE4 억제제(예를 들어, 아프레밀라스트), mTOR 억제제(예를 들어, 시롤리무스), S1P 수용체 작용제(예를 들어, 오자니모드)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

[00188] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법은 Wnt 작용제 또는 Notch 작용제와 같은 조직 재생 인자를 포함하는 조성물의 투여를 추가로 포함한다.

[00189] "화학요법" 및 "항암제"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 다양한 부류의 항암제가 사용될 수 있다. 비-제한적인 예는 알킬화제, 항대사물, 안트라사이클린, 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 억제제, 포도필로톡신, 항체(예를 들어, 모노클로날 또는 폴리클로날), 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 이마티닙 메실레이트(Gleevec® 또는 Glivec®)), 호르몬 치료, 가용성 수용체 및 다른 항종양제를 포함한다.

[00190] 토포이소머라제 억제제는 또한 본원에서 사용될 수 있는 또 다른 부류의 항암제이다. 토포이소머라제는 DNA의 위상을 유지하는 필수 효소이다. 유형 I 또는 유형 II 토포이소머라제의 억제는 적절한 DNA 수퍼코일링을 업셋함으로써 DNA의 전사 및 복제 둘 모두를 방해한다. 일부 유형 I 토포이소머라제 억제제는 캄프토테신: 이리노테칸 및 토포테칸을 포함한다. 유형 II 억제제의 예는 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 및 테니포시드를 포함한다. 이들은 아메리칸 메이애플(Podophyllum peltatum)의 뿌리에서 자연적으로 발생하는 알칼로이드인 에피포도필로톡신의 반합성 유도체이다.

[00191] 항종양제는 면역억제제 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 이포스파미드를 포함한다. 항종양성 화합물은 일반적으로 세포의 DNA를 화학적으로 변형시킴으로써 작용한다.

[00192] 알킬화제는 세포에 존재하는 조건 하에 많은 친핵성 작용기를 알킬화할 수 있다. 시스플라틴 및 카르보플라틴, 및 옥살리플라틴은 알킬화제이다. 이들은 생물학적으로 중요한 분자에서 아미노, 카르복실, 설프히드릴, 및 포스페이트 기와 공유 결합을 형성함으로써 세포 기능을 손상시킨다.

[00193] 빈카 알칼로이드는 튜불린의 특정 부위에 결합하여 튜불린이 미세소관으로 조립되는 것을 억제한다(세포 주기의 M 단계). 빈카 알칼로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 및 빈데신을 포함한다.

[00194] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 억제하는 화합물의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 분자는 CTLA4, PD-1, PD-L1, A2AR, B7-H3, B7-H4, TIM3, 및 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 억제하는 화합물은 길항 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 길항 항체는 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 더발루맙, 아테졸리주맙, 트레멜리무맙, 또는 아벨루맙이다.

[00195] 항-대사산물은 퓨린(아자티오프린, 메르캅토퓨린) 또는 피리미딘과 유사하고, 이러한 물질이 세포 주기의 "S" 단계 동안 DNA에 도입되는 것을 방지하여 정상적인 발달 및 분열을 중단시킨다. 항-대사산물은 또한 RNA 합성에 영향을 미친다.

[00196] 식물 알칼로이드 및 테르페노이드는 식물로부터 수득되고 미세소관 기능을 방지함으로써 세포 분열을 차단한다. 미세소관은 세포 분열에 필수적이기 때문에, 미세소관 없이는 세포 분열이 일어날 수 없다. 주요 예는 빈카 알칼로이드 및 탁산이다. 포도필로톡신은 소화를 도울 뿐만 아니라 2개의 다른 세포증식억제제, 에토포시드 및 테니포시드를 제조하는 데 사용되는 것으로 보고된 식물-유래 화합물이다. 이들은 세포가 G1 단계(DNA 복제의 시작) 및 DNA 복제(S 단계)에 들어가는 것을 방지한다.

[00197] 탁산은 그룹으로서 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함한다. 파클리탁셀은 원래 탁솔(Taxol)로 알려져 있고 처음에는 태평양 주목(Pacific Yew) 나무의 껍질로부터 유래된 천연 생성물이다. 도세탁셀은 파클리탁셀의 반-합성 유사체이다. 탁산은 미세소관의 안정성을 향상시켜 후기 동안 염색체의 단리를 방지한다.

[00198] 일부 구현예에서, 항암제는 레미케이드, 도세탁셀, 셀레콕시브, 멜팔란, 덱사메타손(Decadron®), 스테로이드, 젬시타빈, 시스플라티넘, 테모졸로미드, 에토포시드, 사이클로포스파미드, 테모다르, 카보플라틴, 프로카바진, 글리아델, 메토트렉세이트, 게피티닙(Iressa®), 탁솔, 탁소테어, 플루오로우라실, 류코보린, 이리노테칸, 젤로다, CPT-11, 인터페론 알파, 페길화된 인터페론 알파(예를 들어, PEG INTRON-A), 카페시타빈, 시스플라틴, 티오테파, (리포솜 다우노루비신, 시타라빈, 독세탁솔, 파실리탁셀, 빈블라스틴, IL-2, GM-CSF, 다카르바진, 비노렐빈, 졸레드론산, 팔미트로네이트, 바이악신, 부설판, 프레드니손, 보르테조밉(Velcade®), 비스포스포네이트, 비소 트리옥사이드, 빈크리스틴, 독소루비신(Doxil®), 파클리탁셀, 간시클로버, 아드리아마이신, 에스트레이누스틴 소듐 포스페이트(Emcyt®), 설린닥, 에토포시드, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.

[00199] 다른 구현예에서, 항암제는 보르테조밉, 사이클로포스파미드, 덱사메타손, 독소루비신, 인터페론-알파, 레날리도마이드, 멜팔란, 페길화된 인터페론-알파, 프레드니손, 탈리도마이드, 또는 빈크리스틴으로부터 선택될 수 있다.

[00200] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법은 면역요법을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역요법은 하나 이상의 체크포인트 억제제의 투여를 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 치료 방법의 일부 구현예는 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 억제하는 화합물의 추가 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 억제하는 화합물은 길항 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 길항 항체는 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 더발루맙, 아테졸리주맙, 트레멜리무맙, 또는 아벨루맙이다.

[00201] 일부 양태에서, 하나 이상의 항암 요법은 방사선 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방사선 요법은 암 세포를 사멸시키기 위한 방사선의 투여를 포함할 수 있다. 방사선은 DNA와 같은 세포 내의 분자와 상호작용하여 세포 사멸을 유도한다. 방사선은 또한 세포 및 핵막 및 다른 소기관을 손상시킬 수 있다. 방사선 유형에 따라, DNA 손상의 메커니즘은 상대적 생물학적 효과와 마찬가지로 다양할 수 있다. 예를 들어, 무거운 입자(즉, 양성자, 중성자)는 DNA를 직접 손상시키고 더 큰 상대적 생물학적 효과를 갖는다. 전자기 방사선은 주로 세포 물의 이온화에 의해 생성된 단기 하이드록실 자유 라디칼을 통해 작용하는 간접적인 이온화를 초래한다. 방사선의 임상 적용은 외부 빔 방사선(외부 공급원으로부터) 및 근접요법(환자에게 이식되거나 삽입된 방사선 공급원을 사용함)으로 구성된다. 외부 빔 방사선은 X-선 및/또는 감마선으로 구성되는 반면, 근접요법은 붕괴되어 감마선과 함께 알파 입자 또는 베타 입자를 방출하는 방사성 핵을 사용한다. 본원에서 또한 고려되는 방사선은, 예를 들어, 암 세포로의 방사성동위원소의 지시된 전달을 포함한다. 마이크로파 및 UV 조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 인자가 또한 본원에서 고려된다.

[00202] 방사선은 단일 용량으로 또는 용량-분할 스케줄로 일련의 소용량으로 제공될 수 있다. 본원에서 고려되는 방사선의 양은, 예를 들어, 약 5 내지 약 80, 약 10 내지 약 50 Gy, 또는 약 10 Gy를 포함하는 약 1 내지 약 100 Gy의 범위이다. 총 용량은 분획된 요법으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 요법은 2 Gy의 분획화된 개별 용량을 포함할 수 있다. 방사성동위원소에 대한 투여량 범위는 광범위하게 변하며, 동위원소의 반감기 및 방출되는 방사선의 강도 및 유형에 의존한다. 방사선이 방사성 동위원소의 사용을 포함하는 경우, 동위원소는 표적 조직(예를 들어, 종양 조직)에 방사성뉴클레오티드를 운반하는 치료용 항체와 같은 표적화제에 컨쥬게이션될 수 있다.

[00203] 본원에 기재된 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거, 운동 및/또는 파괴되는 절제를 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제 이외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경으로 제어되는 수술(모스 수술)을 포함한다. 전암 또는 정상 조직의 제거가 또한 본원에서 고려된다.

[00204] 따라서, 본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 제1 요법으로서 개별적으로 또는 제2 요법과 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 요법은 화학요법, 방사선요법, DMARD, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 및 수술로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 병용 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법과 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 전 및/또는 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 교대로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 단일 제형으로 함께 투여된다.

키트

[00205] 또한, 본원은 본원에서 제공되고 기재된 IL-10 부분 작용제, 재조합 핵산, 재조합 세포, 또는 약학적 조성물뿐만 아니라 이를 제조하고 사용하기 위한 서면 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에는 본 개시의 재조합 폴리펩타이드, 본 개시의 IL-10 부분 작용제, 본 개시의 재조합 핵산, 본 개시의 재조합 세포 또는 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상; 및 이의 사용 설명서을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키트는 개체에 제공된 재조합 핵산, 재조합 세포, 또는 약학적 조성물 중 어느 하나를 투여하는 데 사용되는 하나 이상의 주사기(사전충전된 주사기 포함) 및/또는 카테터(사전충전된 주사기 포함); 및 이의 사용 설명서를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 요망되는 목적을 위해, 예를 들어, 세포의 활성을 조절하거나, 표적 암 세포를 억제하거나, 이를 필요로 하는 개인의 질병을 치료하기 위한 다른 키트 성분들을 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있는 하나 이상의 추가 치료제를 가질 수 있다.

[00206] 임의의 상기 기재된 키트는 하나 이상의 추가 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 추가 시약은 희석 완충제; 재구성 용액, 세척 완충제, 대조군 시약, 대조군 발현 벡터, 음성 대조군 폴리펩타이드, 양성 대조군 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드의 시험관내 생산을 위한 시약으로부터 선택될 수 있다.

[00207] 일부 구현예에서, 키트의 성분은 별도의 용기에 있을 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 키트의 성분은 단일 용기에서 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 일부 구현예에서, 키트는 하나의 용기에(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알에) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 I IL-10 폴리펩타이드, 재조합 핵산, 재조합 세포, 또는 약학적 조성물 중 하나 이상 및 또 다른 용기에(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알에) 추가 치료제를 포함한다.

[00208] 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 방법을 실시하기 위해 키트의 성분을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 키트의 약학적 조성물 및 투여 형태에 관한 정보를 포함하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 정보는 동봉된 약학적 조성물 및 투여 형태를 효과적이고 안전하게 사용하는 데 있어서 환자 및 의사를 돕는다. 예를 들어, 본 개시의 조합에 관한 하기 정보는 삽입물에 제공될 수 있다: 약동학, 약력학, 임상 연구, 효능 파라미터, 적응증 및 사용법, 금기, 경고, 주의사항, 부작용, 과다투여, 적절한 투여량 및 투여, 방법 제공, 적절한 보관 조건, 참조, 제조업체/배포자 정보 및 지적 재산권 정보.

[00209] 일부 구현예에서, 키트는 방법을 실시하기 위해 키트의 성분을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 방법을 실시하기 위한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기재 상에 인쇄될 수 있다. 설명서는 (예를 들어, 패키징 또는 서브패키징과 관련된) 키트의 용기 또는 이의 성분들의 라벨링에서 패키지 인서트로서 키트에 존재할 수 있다. 설명서는 적합한 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체, 예를 들어, CD-ROM, 디스켓, 플래시 드라이브 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재할 수 있다. 일부 예에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, (예를 들어, 인터넷을 통해) 원격 소스로부터 설명서를 얻기 위한 수단이 제공될 수 있다. 이러한 구현예의 예는 설명서가 보여질 수 있고/있거나 지침이 다운로드될 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 설명서에서와 같이, 설명서를 얻기 위한 이러한 수단은 적합한 기판에 기록될 수 있다.

[00210] 본 개시에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

[00211] 본원에 인용된 임의의 참고문헌이 종래 기술을 구성한다는 것은 인정되지 않는다. 참고문헌의 논의는 그들의 저자가 주장하는 바를 기술하고, 출원인은 인용된 문헌의 정확성 및 적절성에 이의를 제기할 권리를 보유한다. 과학 저널 기사, 특허 문헌, 및 교과서를 포함하는 다수의 정보 출처가 본원에서 언급되지만; 이 참고문헌은 이러한 문헌들 중 어느 것이 당 분야의 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것을 구성하지 않는다.

[00212] 본원에 제공된 일반적인 방법의 논의는 단지 예시 목적으로 의도된 것이다. 다른 대안적인 방법 및 대안은 본 개시의 검토시 당업자에게 명백할 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함된다.

실시예

[00213] 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업자에게 잘 알려진 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학, 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 예를 들어, 문헌[Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory (본원에서 "Sambrook"으로 공동으로 지칭됨); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Wiley (including supplements through 2014); Bollag, D. M. et al. (1996). Protein Methods. New York, NY: Wiley-Liss; Huang, L. et al. (2005). Nonviral Vectors for Gene Therapy. San Diego: Academic Press; Kaplitt, M. G. et al. (1995). Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications. San Diego, CA: Academic Press; Lefkovits, I. (1997). The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques. San Diego, CA: Academic Press; Doyle, A. et al. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York, NY: Wiley; Mullis, K. B., Ferre, F. & Gibbs, R. (1994). PCR: The Polymerase Chain Reaction. Boston: Birkhauser Publisher; Greenfield, E. A. (2014). Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.). New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Beaucage, S. L. et al. (2000). Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. New York, NY: Wiley, (including supplements through 2014); 및 Makrides, S. C. (2003). Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Amsterdam, NL: Elsevier Sciences B.V.]에서 충분히 설명되어 있으며, 이러한 문헌의 개시는 본원에 참조로 포함된다.

[00214] 추가 구현예는 하기 실시예에서 추가로 상세히 개시되며, 이는 예시로서 제공되며 어떠한 방식으로도 본 개시 또는 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

실시예 1

일반 실험 절차

단백질 생산 및 정제

[00215] 효모-결합 연구 및 SPR을 위해, 인간 IL-10Rα(2-235) 및 IL-10Rβ(20-200)의 ECD를 N-말단 GP64 신호 펩타이드, C-말단 3C 절단 부위에 이어 바이오틴-수용체 펩타이드 태그(BAP 태그, GLNDIFEAQKIEW, SEQ ID NO: 31) 및 6xHis 태그를 갖는 pAcGP67a 바큘로바이러스 벡터 내로 클로닝하였다. 바큘로바이러스 스톡을 BestBac™ DNA(Expression Systems) 및 pAcGP67-A DNA의 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9)로의 공동트랜스펙션에 의해 제조하였다. 다음으로, 바이러스를 사용하여 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(Hi5) 세포를 감염시켰다. 감염 72시간 후에 바큘로바이러스 감염된 Hi5 세포의 상청액으로부터 단백질을 정제하고 Ni-NTA 수지(Qiagen)로 정제한 후 Superdex 200 컬럼(GE)에서 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하였다. 단백질을 HEPES 완충된 염수(HBS, 20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM 소듐 클로라이드)에서 유지시켰다. IL-10Rβ ECD를 BirA 리가제를 사용하여 C-말단 BAP 태그에서 부위-특이적으로 바이오티닐화하고 크기 배제 크로마토그래피에 의해 재정제하였다.

[00216] 저온-EM 구조 연구의 경우, 당-돌연변이 버전은 IL-10Rβ ECD(도 6a), N-말단 GP64 신호 펩타이드 및 C-말단 6xHis 태그를 갖는 pAcGP67a 바큘로바이러스 벡터 내로 클로닝하고, 상기 기재된 바와 같이 발현 및 정제한 후, Superdex 200 컬럼(GE) 상에서 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하였다. 친화성 성숙된 IL-10("Super-10", 클론 5.1) 및 IL-10Rα ECD를 N-말단 HA 신호 펩타이드 및 C-말단 6xHis-태그를 함유하는 pD649 포유동물 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA를 에피펙타민 트랜스펙션 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 Expi-293F 세포(Thermo Fisher Scientific)에 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 약 72 내지 96시간 후에, 세포 상청액을 수확하고 단백질을 Ni-NTA 수지(Qiagen)로 정제한 후 HEPES 완충된 염수(HBS, 30 mM HEPES pH 7.4, 150 mM 염화나트륨)에서 Superdex 200 컬럼(GE)에서 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하였다.SEC 후, 개별 단백질을 1:1:1.2 몰비의 IL-10:IL-10Rα:IL-10Rβ로 밤새 인큐베이션하고 S200 컬럼(GE)에서 SEC에 의해 재정제하였다.

[00217] 신호전달 및 기능적 실험을 위해, IL-10 변이체를 N-말단 HA 신호 펩타이드 및 C-말단 6xHis-태그를 함유하는 pD649 포유동물 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA를 Expifectamine 트랜스펙션 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 Expi-293F 세포(Thermo Fisher Scientific)에 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 약 72-96시간 후에, 세포 상청액을 수확하고 단백질을 Ni-NTA 수지(Qiagen)로 정제한 후 HEPES 완충된 염수(HBS, 30 mM HEPES pH 7.4, 150 mM 염화나트륨)에서 Superdex 200 컬럼(GE)에서 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하였다.

표면 플라즈몬 공명

[00218] 단독으로 또는 가용성 IL-10Rα와 사전-결합된 친화성 성숙된 IL-10 클론 5.1에 의한 IL-10Rβ-결합에 대한 해리 상수(KD)는 BIAcore T100 기기(GE Healthcare)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정되었다. 먼저, 비오티닐화된 IL-10Rβ를 100 공명 단위(RU) 범위의 고정 밀도로 스트렙타비딘-코팅된(SA) 센서 칩(GE Healthcare)에서 포획하였다. 유사하게, 대조군 유동 세포는 또한 참조 차감용 표적을 벗어난 단백질(EpoR)로 제조되었다. 결합 동역학을 25℃에서 50 ㎕/분의 유량으로 수행하였다. IL-10 또는 IL-10/IL-10Rα 복합체를 0.005% P20 계면활성제가 보충된 HBS 완충제(GE Healthcare)에 연속 희석하고 SA 칩 위에 주입하였다. 해리 동역학은 리간드 친화성에 기반하여 필요에 따라 100 내지 500초 동안 모니터링되었다. BIAcore T100 평가 소프트웨어를 사용하여 정상 상태 친화성을 결정하였다. 동역학적 결합 곡선은 Prism 8(GraphPad)에서 시간-의존적 반응 단위를 플롯팅함으로써 생성되었다.

세포 배양

[00219] THP-1(ATCC TIB-202), YT-1(RRID: CVCL_EJ05), Jurkat(ATCC TIB-152), 및 Daudi(ATCC CCL-213) 세포를 모두 10% v/v 우태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신, 및 2 mM GlutaMAX™(Gibco)가 보충된 RPMI(둘베코 변형 이글 배지)에서 성장시켰다. 세포를 5% CO2로 37℃에서 유지시켰다. Expi293F 세포를 무혈청 Expi293 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)에서 성장시키고 5% CO₂로 37℃에서 유지시켰다.

세포주에서 포스포-플로우 신호전달 검정

[00220] THP-1, YT-1, Jurkat, 및 Daudi 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 20분 동안 WT 또는 돌연변이체 IL-10으로 자극한 다음, 실온에서 10분 동안 파라포름알데히드(Electron Microscopy Sciences)로 고정시켰다. -20℃에서 30분 동안 빙냉 메탄올(Fisher)로 처리하여 세포내 염색을 위해 세포를 투과시켰다. 이어서, 세포를 autoMACS 완충제(Miltenyi)에서 실온에서 1시간 동안 1:50 희석도로 Alexa Fluor 647 컨쥬게이션된 항-Stat3(pY705) 항체(BD Biosciences)와 함께 인큐베이션하였다. 자극되지 않은 샘플의 배경 형광을 모든 샘플에서 차감하였다. CytoFlex, 유세포 분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 데이터를 획득하였다. MFI 값을 각 실험 내에서 최대 WT IL-10 값으로 정규화하고 Prism 8(GraphPad)에 플롯팅하였다. "S자형 용량-반응" 분석을 사용하여 용량-반응 곡선을 생성하였다.

[00221] autoMACS 완충제에서 살아있는 세포를 재현탁시키고 인간 TruStain FcX(Biolegend)에 이어 항-인간 IL-10Rα AlexaFluor 647(BD Biosciences) 및 항-인간 IL-10Rβ AlexaFluor 488(R&D) 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 수용체 표면 발현을 분석하였다. 형광 강도는 Accuri C6 세포계산기(BD Biosciences)에서 유세포 분석에 의해 측정되었고, 데이터는 FlowJo 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석되었다.

인간 PBMC에서 포스포-플로우 신호전달 검정

[00222] PBMC를 따뜻한 배지에서 해동시키고, 2회 세척하고, 0.5 × 10⁶개 생존 세포/mL로 재현탁시켰다. 200 ㎕의 세포를 96-웰 딥-웰 플레이트에 웰당 플레이팅하였다. 37℃에서 2시간 동안 휴지시킨 후, 세포를 다양한 농도의 WT 또는 돌연변이체 IL-10으로 자극하고 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이후, PBMC를 실온에서 10분 동안 파라포름알데히드(Electron Microscopy Sciences)로 고정하고, -20℃에서 30분 동안 빙냉 메탄올(Fisher)로 처리함으로써 세포내 염색을 위해 투과화시켰다. 세포를 autoMACS 완충제(Miltenyi)로 세척하고, 인간 TruStain FcX(Biolegend)와 함께 인큐베이션한 후, 하기 항체로 염색하였다: CD3 Pacific Blue(BD), CD4 PerCP-Cy5.5(BD), CD20 PerCp-Cy5. 5(BD), CD33 PE-Cy7(BD), pSTAT-3(Y705) AlexaFluor 647(BD), 및 IL-10Rβ AlexaFluor 488(R&D). 이어서, 샘플을 세척하고 autoMACS 완충제에 재현탁시켰다. 데이터는 CytoFlex 유세포 분석기 기기(Beckman Coulter)를 사용하여 획득되었고, FlowJo 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석되었다. MFI 값을 각 세포 유형 내에서 최대 WT IL-10 값으로 표준화하고 Prism 8(GraphPad)에 플롯팅하였다. "S자형 용량-반응" 분석을 사용하여 용량-반응 곡선을 생성하였다. 세포는 전방 대 측면 산란 프로파일에 기초하여 살아있는 세포에 게이팅되었고, 이어서 전술한 바와 같이 세포 서브세트-특이적 게이팅이 뒤따랐다.

인간 PBMC, 단핵구, 및 대식세포의 LPS 자극

[00223] 벌크 PBMC의 자극을 위해, PBMC를 따뜻한 배지에서 해동시키고, 2회 세척하고, 1 × 10⁷개 세포/ml의 완전한 RPMI에 재현탁시켰다. 세포를 24웰 배양 접시에 500 ㎕/웰로 플레이팅하고 37℃에서 2시간 동안 휴지시켰다. 이후, 세포를 1 nM LPS(Sigma) 단독 또는 10 nM IL-10(WT 또는 돌연변이체)과 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 사이토카인 측정을 위해, 세포 상청액을 단리하고 TNF-α(Thermo Fisher Scientific), IL-6(R&D), 및 CXCL8(R&D)의 수준을 제조사의 설명서에 따라 ELISA에 의해 측정하였다.

[00224] 단핵구 HLA-DR 발현을 위해, 세포를 세척하고 autoMACS 완충제에 재현탁시키고, 인간 TruStain FcX(Biolegend)와 함께 인큐베이션하고, 4℃에서 30분 동안 CD14 PE-Cy7(BD) 및 항-HLA-DR BV605 항체로 염색하였다. 형광 강도는 CytoFlex 유세포 분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 측정하고 FlowJo 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. 정방향 대 측면 산란 프로파일에 기초하여 살아있는 세포에 대해 세포를 게이팅한 다음, 단핵구 특이적 게이팅(CD14+)을 수행하였다.

[00225] 일차 인간 대식세포의 분석을 위해, PBMC를 따뜻한 배지에서 해동시키고, 2회 세척하고, 완전한 RPMI에 재현탁시키고, 1×10⁷개 세포/웰로 6웰 조직 배양 접시에 플레이팅하고, 20 ng/ml로 인간 M-CSF에서 인큐베이션하였다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 단핵구를 플레이트에 부착시켰다. 배지를 흡인하여 비-부착 세포를 제거하고, 세포를 37℃에서 20 ng/ml M-CSF를 함유하는 신선한 배지에서 6일 동안 인큐베이션하였고, 이때 대부분의 부착된 세포는 육안 검사에 의해 별개의 대식세포 형태를 채택하였다. 이후, 세포를 1 ng/ml LPS 단독 또는 10 nM IL-10(WT 또는 돌연변이체)으로 24시간 동안 자극하였다. 세포 상청액을 단리하고 TNF-α(Thermo Fisher Scientific), IL-6(R&D), 및 CXCL8(R&D)의 수준을 제조자의 지시에 따라 ELISA에 의해 측정하였다.

CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 및 그랜자임 B 유도

[00226] 제조업체의 설명서에 따라 인간 CD8+ 분리 키트(Miltenyi)와 함께 MACS LS 컬럼(Miltenyi)을 사용하여 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 인간 PBMC로부터 CD8+ T 세포를 분리하였다. IL-10에 의한 IFN-γ 및 그랜자임 B 제조의 강화는 전술한 바와 같이 수행되었다. 간략하게, 단리된 CD8+ T 세포를 항-CD3 항체(클론 OKT1)로 미리 코팅된 6웰 조직 배양 접시에 2×10⁶개 세포/ml로 시딩하고, 가용성 항 CD28 항체(5 ㎍/ml)와 함께 3일 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 수집하고 10 nM 재조합 IL-10(WT 또는 돌연변이체)의 존재 또는 부재하에 24웰 조직 배양 디쉬에서 1 x 106개 세포/ml로 신선한 배지에 재-시딩하고, 추가 3일 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 가용성 항-CD3(클론 OKT1, 1 ㎍/ml)로 4시간 동안 재자극하였다. 이어서, 상청액을 단리하고, IFN-γ(Thermo) 및 그랜자임 B(R&D)의 수준을 제조사의 지침에 따라 ELISA에 의해 측정하였다.

실시예 2

육량체 IL-10/IL10R1/IL10Rß 복합체의 Cryo-EM 구조

[00227] 본 실시예는 헤테로머 수용체 복합체 IL-10/IL10R1/IL10Rß의 결정 구조를 결정하기 위해 수행된 실험의 결과를 설명하며, 이는 또한 헤테로머 수용체 복합체의 각각의 사이토카인-수용체 상호작용을 유도하는 화학을 설명하는 데 도움이 된다.

[00228] IL-10/IL-10Rβ 결합 계면의 면밀한 조사는 중심 접촉이 루프 L3에서 10Rβ-Tyr⁸²에 의해 형성되고, 이는 IL-10 나선 α1과 α3 사이에 삽입되어 주로 IL-10의 나선 α1의 Met²²와의 반 데르 발스 접촉을 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다(도 2d). 이전의 돌연변이유발 및 모델링 연구는 또한 10Rβ-Tyr⁸²가 IL-10Rβ와 IL-10 사이의 상호작용에 필요함을 시사하였다. 이러한 주요 소수성 접촉은 각각 10Rβ-Gln⁶³ 및 10Rβ-Lys⁸¹과 결합하는 나선 α1의 IL-10 잔기 Asn²¹ 및 Asp²⁵에 의해 부분적으로 매개되는 극성 및 정전기적 상호작용의 네트워크에 의해 둘러싸여 있다(도 2d 및 2e). L3 바로 위에, IL-10Rβ의 루프 L2에서 10Rβ-Tyr⁵⁹는 유사하게 IL-10 나선 α2와 α3 사이에 삽입되어, α2의 여러 잔기와 결합하는 반면, IL-10의 α3에서 Glu⁹⁶은 10Rβ-Lys⁶⁵와 결합한다(도 2e). IL-10의 전면 에지에서, IL-10Rβ의 D2에서 루프 L5는 IL-10 나선 α1의 전면을 따라 연장되는 "엄지"-유사 돌출부를 형성하여, 10Rβ-Tyr¹⁴⁰과 IL-10 잔기 Arg³²뿐만 아니라 IL-10의 10Rβ-Asn¹⁴⁷과 Asn²¹ 사이의 수소 결합 접촉을 촉진한다(도 2c 및 2d).

[00229] IL-10Rβ에 대한 Super-10의 증가된 친화성은 주로 N18Y 및 R104W 돌연변이로부터 기인하는 것으로 밝혀졌으며, 둘 모두는 Met²²에 인접하고 10Rβ-Tyr⁸²를 수용하는 이러한 중심 접촉 부위의 소수성을 향상시킨다(도 2d). 한편, N92Q 및 T100D 돌연변이는 각각 10Rβ-Gln⁶³ 및 10Rβ-Ser⁸⁰과의 수소 결합 접촉을 촉진하여, 아마도 WT IL-10 복합체에 존재하는 접촉을 향상시킬 것이다(도 2d 및 2e).

[00230] 전반적으로, 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, Super-10에서 친화성 향상 돌연변이는 신규한 접촉 부위를 생성하기보다는 WT IL-10과 IL-10Rβ 사이에 만들어진 기존의 극성 및 비극성 접촉시 주로 개선되는 것으로 보인다.

실시예 3

IL-10 수용체 부분 작용제의 구조-유도 설계

[00231] 본 실시예는 상기 실시예 3에 기재된 헤테로머 IL-10/IL10R1/IL10Rβ 복합체의 저온-EM 구조에 기반하여 편향된 IL-10 수용체 부분 작용제를 설계하기 위해 수행된 실험을 설명한다.

[00232] IL-10 신호전달에 대해 상기 기재된 IL-10/IL-10Rβ 접촉의 중요성을 평가하기 위해, IL-10Rβ와의 상호작용을 약화시킬 것으로 예측된 WT IL-10에서의 일련의 돌연변이를 설계하고 STAT3의 인산화를 통해 신호전달을 개시하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 알라닌(D25A) 또는 리신(D25K)으로의 Asp25의 돌연변이는 WT IL-10과 비교하여 B 세포-유래된 Daudi 세포에서 STAT3 활성화의 실질적인 감소를 초래하는 것으로 관찰되었다(도 2f). 유사하게, E96K, D25A/E96A, N21A/R104A 및 D25A/N21A/R104A를 포함하는 IL-10 변이체는 모두 이들 세포에서 각각 무시할 수 있는 STAT3 인산화를 유도하였다(도 2f). 그러나, 놀랍게도, E96K를 제외한 이들 변이체 모두는 단핵구-유래된 THP-1 세포에서 강하게 유도된 STAT3 활성화를 유도하였고, D25A/E96A 변이체(즉, "10-DE") 및 D25K 변이체는 THP-1과 Daudi 세포주 사이의 활성(도 3A.

실시예 4

IL-10 변이체 10-DE 및 Super-10은 세포-유형 선택적 신호전달을 유발한다

[00233] 본 실시예는 본 개시의 일부 비-제한적인 구현예에 따른 예시적인 편향된 IL-10 변이체(10-DE)가 세포-유형 선택적 신호전달 활성을 유도한다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험을 설명한다.

[00234] IL-10/IL-10Rβ 상호작용의 안정성을 변경하는 것이 세포 유형에 걸쳐 IL-10 신호전달 활성에 어떻게 영향을 미치는 지에 대한 보다 완전한 사진을 생성하기 위해, (i) WT IL-10의 활성을 비교하기 위해 추가 실험을 수행하였다. (ii) 상이한 부류의 면역 세포를 나타내는 4개의 IL-10 반응성 세포주의 패널에 걸친 고친화성 작용제 super-10, 및 (iii) 저-친화성 부분 작용제 10-DE 및 D25K 3B). 10-DE 변이체 및 D25K 변이체는 B 세포-유래된 Daudi 세포 또는 T 세포-유래된 Jurkat 세포에서 활성을 유도하지 않았지만, 이들은 자연 살해(NK) 세포-유래된 YT-1 세포에서 약 50%의 활성 및 거의 완전한 STAT3 활성화를 유도하였다. 골수성 THP-1 세포에서(도 3A-3D). 대조적으로, super-10은 Daudi 및 Jurkat 세포 둘 모두에서 WT IL-10에 비해 실질적으로 더 높은 Emax를 나타내었지만, YT-1 및 THP-1 세포에서는 WT IL-10과 유사한 신호전달을 나타내었다(도 3a 내지 3d). 따라서, super-10 대 10-DE STAT3 Emax의 비율은 THP-1 세포에서 약 1:1에서 Daudi 세포에서 20:1 초과까지 상당히 다양하여, 이들 세포주 사이의 신호전달 가소성의 실질적인 차이를 나타낸다.

[00235] 이러한 다양한 세포주에 걸친 IL-10Rα 및 IL-10Rβ 표면 발현의 비교는 IL-10Rα 및 IL-10Rβ의 수준이 조작된 IL-10 변이체에 의해 유도된 STAT3 신호전달의 상대적 강도와 잘 상관관계가 있음을 나타내었다(도 3e). super-10이 특정 세포주에서 WT IL-10에 비해 신호전달 Emax를 증가시킬 수 있다는 발견은 이러한 세포에서의 IL-10 신호전달 복합체의 조립이 낮은 IL-10R 발현에 의해 제한되며, 이는 IL-10-IL-10Rβ 상호작용의 친화성. 반대로, 다른 세포 유형은 이들의 상승된 IL-10R 발현으로 인해 10-DE 및 D25K와 같은 저-친화성 IL-10 부분 작용제에 대해서도 강력한 STAT3 반응을 유지할 수 있다(도 3c). 이러한 관찰은 좁은 IL-10 세포-유형 특이성을 달성하기 위해 조작된 작용제로 이용될 수 있는 기능적 창의 존재를 시사한다.

[00236] 이러한 다양한 세포주에 걸친 IL-10Rα 및 IL-10Rβ 표면 발현의 비교는 IL-10Rα 및 IL-10Rβ의 수준이 조작된 IL-10 변이체에 의해 유도된 STAT3 신호전달의 상대적 강도와 잘 상관관계가 있음을 나타내었다(도 S6, D 및 E). 따라서, 포화 IL-10 농도에서 STAT3 활성화의 정도는 수용체 발현 및 리간드 친화성의 조합에 의해 조절될 수 있다(도 3c). super-10이 특정 세포주에서 WT IL-10에 비해 신호전달 Emax를 증가시킬 수 있다는 발견은 이러한 세포에서의 IL-10 신호전달 복합체의 어셈블리가 낮은 IL-10R 발현에 의해 제한되며, 이는 IL-10/IL-10Rβ 상호작용의 친화성을 향상시킴으로써 보상될 수 있음을 시사한다. 반대로, 다른 세포 유형은 이들의 상승된 IL-10R 발현으로 인해 10-DE 및 D25K와 같은 저-친화성 IL-10 부분 작용제에 대해서도 강력한 STAT3 반응을 유지할 수 있다(도 3c). 이러한 관찰은 좁은 IL-10 세포-유형 특이성을 달성하기 위해 조작된 작용제로 이용될 수 있는 기능적 창의 존재를 시사한다.

실시예 5

IL-10 변이체 10-DE 및 D25K는 생체외 IL-10의 항염증제 및 면역자극을 분리시킴

[00237] 본 실시예는 편향된 IL-10 변이체 10-DE 및 Super-10이 IL-10의 항염증 및 면역자극 기능을 커플링 해제시킨다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 설명한다. 이러한 실험은 IL-10 신호전달 가소성의 자연적 차이가 일차 면역 세포 집단에서 IL-10의 기능적 다발성을 '조정'하는 데 이용될 수 있는지에 대한 질문을 다루기 위해 설계되었다.

[00238] 상기 설명된 바와 같이, IL-10은 다수의 면역 세포 유형에서 신호전달을 개시하는 능력으로 인해 생체내에서 항염증 및 면역자극 효과 둘 모두를 유발한다. IL-10의 항염증 효과는 주로 단핵구 및 대식세포 활성의 억제에 기인한 반면, IL-10은 CD8+ T 세포의 자극을 통해 전염증성 IFN-γ 제조를 촉진한다. 하기 기재된 실험은 IL-10 신호전달 가소성의 자연적 차이가 일차 면역 세포 집단에서 IL-10의 기능적 다면발현성을 '조정'하기 위해 이용될 수 있는 지에 대한 질문을 다루기 위해 수행되었다.

[00239] 유동 세포계산법에 의한 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분석은 IL-10Rβ가 일차 단핵구에서 높게 발현되지만, NK 세포, B 세포, 및 T 세포에서 훨씬 더 낮게 발현되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 단핵구가 보다 강력한 IL-1을 나타낼 수 있음을 시사한다. 10개의 신호전달 반응(도 4a). 실제로, IL-10Rβ에 대한 친화도의 큰 차이에도 불구하고, 10-DE 및 Super-10 변이체 둘 모두는 일차 단핵구에서 WT IL-10과 동등한 수준의 STAT3 활성화를 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 4b 및 6b). 대조적으로, 10-DE 변이체는 NK 세포, B 세포 및 T 세포에서 유의하게 감소된 신호전달을 나타내어, 이러한 집단에서 WT IL-10에 비해 35% 내지 50%의 STAT3 활성화를 유발하였다(도 4b 및 6b). 그러나, Super-10은 NK 세포에서 강력하게 향상된 STAT3 활성화를 유도하는 것으로 밝혀졌지만, B 및 T 세포에서 단지 약간 상승된 신호전달에 의해, 추가 인자가 또한 이러한 세포 유형에서 STAT3 활성화의 추가 증가를 제한할 수 있음을 시사한다(도 4b). 전반적으로, 이러한 데이터는 Super-10이 중간 정도의 NK 세포-편향된 활성을 나타내는 반면, 부분 작용제 10-DE는 일차 인간 세포에서 현저한 단핵구-편향된 신호전달을 나타낸다는 것을 보여준다.

[00240] 단핵구에서 10-DE 및 D25K 변이체에 의해 유도된 STAT3 활성화의 수준이 IL-10의 항염증 기능을 구동하기에 충분한지 여부를 시험하기 위해, 존재하에서 박테리아 지질다당류(LPS)로 벌크 인간 PBMC를 자극하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 이러한 변이체의 부재. 특히, 10-DE 변이체 및 D25K 변이체 둘 모두는 전염증성 사이토카인 IL-1β, TNF-α 및 IL-6 뿐만 아니라 케모카인 IL-8의 제조를 WT IL-10 및 Super-10 변이체(도 4c 및 7a). 또한, 10-DE 및 D25K는 항-CD3 항체로 활성화된 벌크 PBMC에서 IFN-γ 제조를 억제하는 능력을 보유하였으며(도 7d), 또한 말초 단핵구에서 MHC 클래스 II 및 공동-자극 리간드 CD86의 표면 발현을 하향조절한다(도 4d, 7d, 및 7c). 중요하게는, 10-DE 변이체 및 D25K 변이체는 또한 자가면역 및 자가-염증성 질환에서 IL-10에 대한 주요 표적인 단리된 단핵구-유래 대식세포에서 LPS-유도된 TNF-α, IL-6, 및 IL-8 제조를 강력하게 폐지하였다(도 4e).

[00241] 10-DE 변이체의 골수-편향된 활성이 LPS-유도된 패혈증의 마우스 모델에서 전신 염증을 억제하기에 충분한지 여부를 평가하기 위해 추가 실험을 또한 수행하였다. 중요하게는, 10-DE 변이체의 단일 주사는 WT IL-10과 동일한 정도로 이 모델에서 생존을 유의하게 촉진시키는 것으로 관찰되었다(도 7e). 또한, 10-DE 변이체는 또한 전신 염증의 주요 마커인 TNF-α, IL-6, 및 합토글로빈의 상승을 둔화시키는 것으로 관찰되었다(도 7f 및 7g).

골수-편향 IL-10 변이체는 염증성 T 세포 기능을 촉진하는 능력이 감소하였다

[00242] IL-10 전염증성 IFN-γ 제조를 유도하는 것으로 알려져 있고, 최근 연구는 이것이 주로 CD8+ T 세포 활성의 강화를 통해 발생한다고 제안하였다. CD8+ T-세포에 대한 본원에 기재된 조작된 IL-10 변이체의 효과를 분석하기 위해, RNA 시퀀싱(RNA-seq) 분석을 24시간 동안 WT IL-10, Super-10, 또는 10-DE와 결합된 TCR-자극 CD8⁺ T 세포에서 수행하였다(도 8c).

[00243] sup-10에 의해 유도된 발현 변화는 일부 IL-10 표적 유전자, 예컨대, GZMB, IL22, 및 SOCS3의 상향 조절, 및 다른 것들, 예컨대, IFNG 및 IL18RAP의 향상된 유도일지라도, WT IL-10으로 관찰된 패턴과 거의 매칭되며(도 8c), 이는 이러한 세포에서 WT IL-10과 비교하여, super-10에 의해 유발된 증가된 STAT1 활성화를 잠재적으로 반영한다(도 8a). 대조적으로, 부분 작용제 10-DE는 GZMB와 같은 전염증성 유전자의 발현 감소를 포함하여, 상향조절된 및 하향조절된 IL-10 표적 유전자 둘 모두에 걸쳐 실질적으로 더 약한 전사 변화의 패턴을 유도하였다(도 8c). 이와 일치하게, WT IL-10 및 Super-10과 대조적으로, 10-DE 및 D25K 둘 모두는 활성화된 CD8+ T 세포에 의한 그랜자임 B, IFN-γ, 및 IL-9 제조를 강화시키는 데 실패하였다(도 4f). 따라서, 골수-편향된 IL-10 변이체는 단핵구 및 대식세포 활성화를 억제하는 능력을 보유하였지만, 염증성 T 세포 활성을 강화시키는 능력이 실질적으로 감소하여 IL-10의 주요 항염증 및 전-염증 기능을 분리시켰다(도 4g).

[00244] 본원에 기재된 실험 데이터는 조작된 IL-10 부분 작용제에 의해 유도된 골수-편향 신호전달이 IL-10 기능의 중요한 양태를 분리할 수 있음을 보여주었다. 따라서, 골수성 및 림프구 집단 사이의 차등 IL-10 수용체 발현은 달리 다면발현성 IL-10 반응에 기능적 특이성을 제공하기 위한 천연 메커니즘을 나타낼 수 있으며, 이는 본원에 입증된 바와 같이 조작된 작용제를 사용하여 이용될 수 있는 특징이다. 예를 들어, 부분 작용제 10-DE 및 D25K는 IL-10의 항-염증 기능을 유지하였고, 이는 WT IL-10과 유사한 정도로 골수 세포에서 STAT3를 활성화시키는 능력과 일치한다(도 4b 내지 4e 및 7a 내지 7g). 대조적으로, 이러한 변이체는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두에 의한 염증성 IFN-γ 제조를 강화시키는 능력이 유의하게 감소하였고, 이는 이들 세포에서 STAT3 및 STAT1 둘 모두를 활성화시키는 이들의 감소된 능력과 일치한다(도 4b, 4f; 6b, 및 8a). 한편, super-10은 유사한 STAT3 반응을 유도함에도 불구하고, WT IL-10에 비해 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두에 의한 IFN-γ의 더 강한 유도를 유도하였다(도 4f, 6b, 및 8c). 이러한 발견은 super-10이 이들 세포에서 실질적으로 더 강한 STAT1 활성화를 유도했다는 관찰에 의해 설명될 수 있으며(도 8a), 이는 IL-10의 IFN-γ-유도 효과를 매개하는 것으로 제안된 STAT1과 일치한다.

[00245] 하기 추가로 상세히 논의되는 바와 같이, 생체내에서 IL-6 및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인의 제조를 강력하게 억제하는 IL-10의 자연적인 능력은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환(IBD), 및 제1형 당뇨병을 포함한다. IL-10 투여가 인간에서 IFN-γ 수준을 상승시킨다는 관찰은 이러한 맥락에서 IL-10의 사용에 대한 장벽을 제시한 것으로 관찰되었다. 따라서, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 제조를 자극하지 않으면서 염증성 단핵구 및 대식세포 활성화를 억제하는 조작된 IL-10 부분 작용제의 능력은 이러한 설정에서 IL-10의 임상적 사용에 중요한 의미를 가지며, IL-10의 완전한 치료 가능성을 잠금 해제를 위한 청사진을 제공한다.

[00246] 본 개시의 특정 대안이 개시되었지만, 다양한 변형 및 조합이 가능하고 첨부된 청구범위의 진정한 사상 및 범위 내에서 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본원에 제시된 정확한 개요 및 개시내용을 제한하려는 의도는 없다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University <120> Engineered Interleukin-10 Polypeptides and Uses Thereof <130> 078430-520001WO <140> Herewith <141> Herewith <150> US 63/031,186 <151> 2020-05-28 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 160 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Wild-type mature human IL-10 <400> 1 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 2 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> 10_clone 5.1 (super-10)(N18Y/N92Q/T100D/R104W) <400> 2 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Tyr Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Gln Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Asp Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 3 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> 10_clone 5.2 (N18Y/N21H /N92Q/E96D/T100V R104W) <400> 3 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Tyr Leu Pro His Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Gln Ser Leu Gly Asp 85 90 95 Asn Leu Lys Val Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 4 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> 10_clone 5.3 (N18Y/N21H/E96H T100V/R104W) <400> 4 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Tyr Leu Pro His Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly His 85 90 95 Asn Leu Lys Val Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 5 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant BS63 (D25A) <400> 5 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 6 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant BS64 (N21A/R104A) <400> 6 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Ala Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Ala Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 7 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant BS65 (10-DE) (D25A/E96A) <400> 7 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Ala 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 8 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant BS66 (N21A/D25A) <400> 8 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Ala Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 9 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant BS68 (N21A/D25A/E96A) <400> 9 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Ala Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Ala 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 10 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (N21A/D25A/ R104A) <400> 10 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Ala Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Ala Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 11 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (D25K) <400> 11 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Lys Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 12 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (E96K) <400> 12 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Lys 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 13 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104W) <400> 13 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Tyr Leu Pro Asn Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Gln Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Asp Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 14 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104W) <400> 14 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Tyr Leu Pro Asn Met Leu Arg Lys Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Gln Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Asp Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 15 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104W) <400> 15 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Tyr Leu Pro Asn Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Gln Ser Leu Gly Ala 85 90 95 Asn Leu Lys Asp Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 16 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Wild-type human IL-10; pre-protein with signal peptide <400> 16 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 17 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> 10_clone 5.1 (super-10)(N18Y/N92Q/T100D/R104W) with signal peptide <400> 17 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Tyr Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Gln Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Asp Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 18 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> 10_clone 5.2 (N18Y/N21H /N92Q/E96D/T100V R104W) with signal peptide <400> 18 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Tyr Leu Pro His Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Gln Ser Leu 100 105 110 Gly Asp Asn Leu Lys Val Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 19 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> 10_clone 5.3 (N18Y/N21H/E96H T100V/R104W) with signal peptide <400> 19 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Tyr Leu Pro His Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly His Asn Leu Lys Val Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 20 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant BS63 (D25A); with signal peptide <400> 20 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 21 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant BS64 (N21A/R104A); with signal peptide <400> 21 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Ala Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Ala Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 22 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant BS65 (10-DE) (D25A/E96A); with signal peptide <400> 22 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Ala Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 23 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant BS66 (N21A/D25A); with signal peptide <400> 23 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Ala Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 24 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant BS68 (N21A/D25A/E96A); with signal peptide <400> 24 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Ala Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Ala Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 25 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (N21A/D25A/ R104A); preprotein of SEQ ID NO: 10 with signal peptide <400> 25 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Ala Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Ala Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 26 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (D25K); preprotein of SEQ ID NO: 11 with signal peptide <400> 26 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Lys Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 27 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (E96K); preprotein of SEQ ID NO: 12 with signal peptide <400> 27 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Lys Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 28 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104W); preprotein of SEQ ID NO: 13; with signal peptide <400> 28 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Tyr Leu Pro Asn Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Gln Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Asp Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 29 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104W); preprotein of SEQ ID NO: SEQ ID NO: 14; with signal peptide <400> 29 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Tyr Leu Pro Asn Met Leu Arg Lys Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Gln Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Asp Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 30 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL-10 variant (N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104W); preprotein of SEQ ID NO: 15; with signal peptide <400> 30 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Tyr Leu Pro Asn Met Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Gln Ser Leu 100 105 110 Gly Ala Asn Leu Lys Asp Leu Arg Leu Trp Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> BAP tag <400> 31 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp 1 5 10 <210> 32 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is His, Ala, Asp, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Tyr, or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is Asn, Phe, Ala, Asp, Glu, Leu, Val, Ser, Thr, Ile, Val, Met, or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Asn, Ala, Arg, Gln, His, Lys, Ser, Val, Ile, Leu, Met, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is Met, Ala, Val, Ile, Leu, Asn, or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Arg, Glu, Asp, Asn, Gln, Ala, Ser, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Asp, Ala, Asn, His, Ile, Lys, Leu, or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Asp, Ala, Glu, Leu, Val, Ser, Thr, Ile, Val, Met, His, Lys, or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is Arg, Ala, Asp, Glu, Leu, Val, Ser, Thr, Ile, Val, Met, or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> Xaa is Glu, Ala, Asp, Leu, Val, Ser, Thr, Ile, Val, Met, His, Lys, or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) <223> Xaa is His, Ala, Asp, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Tyr, or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (92)..(92) <223> Xaa is Asn, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Val, Ile, Leu, Met, Thr, or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa is Ser, Glu, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu, Lys, Met, or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(96) <223> Xaa is Glu, Ala, Asn, Asp, Gln, His, Lys, or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> Xaa is Thr, Val, Glu, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu, Ile, Leu, Lys, Met, or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104) <223> Xaa is Arg, Ala, Trp, Tyr, Phe, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Ser, Thr, Ile, Leu, Val, or Met <400> 32 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr Xaa Phe Pro 1 5 10 15 Gly Xaa Leu Pro Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Arg Xaa Ala Phe Ser Xaa 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Xaa Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala Xaa Val Xaa Xaa Leu Gly Xaa 85 90 95 Asn Leu Lys Xaa Leu Arg Leu Xaa Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160

Claims

SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는 인터루킨-10(IL-10) 폴리펩타이드와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X25, X14, X18, X24, X28, X74, X90, X92, X96, X100 및 X104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X25, 및 X96으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있는, 재조합 폴리펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 X21, X22, X32, 및 X93으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-10 수용체 베타(IL-10Rβ)에 대한 변경된 결합 친화성을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
제4항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가 기준 IL-10 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-10Rβ에 대한 감소된 결합 친화성을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
제4항 또는 제5항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교하여 감소된 STAT3 신호전달을 자극하는 능력을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
제4항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가 기준 IL-10 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-10Rβ에 대한 증가된 결합 친화성을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교하여 IL-10을 통해 매개되는 다운스트림 신호 전달(downstream signal transduction)의 세포-유형 편향된 신호전달을 부여하는, 재조합 폴리펩타이드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 알라닌 치환, 아스파르트산 치환, 히스티딘 치환, 글루탐산 치환, 리신 치환, 세린 치환, 트립토판 치환, 티로신 치환, 발린 치환, 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 재조합 폴리펩타이드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25, H14, N18, R24, D28, E74, H90, N92, E96, T100 및 R104로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있는, 재조합 폴리펩타이드.
제10항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 D25 및 E96으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있는, 재조합 폴리펩타이드.
제10항 또는 제11항에 있어서, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16의 N21, M22, R32, 및 S93으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드:
a) N18Y/N92Q/T100D/R104W;
b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W;
c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104W;
d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104W;
e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104W; 및
f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104W.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드:
a) D25A;
b) D25K;
c) E96A;
d) E96K;
e) D25A/E96A;
f) N21A/R104A;
g) N21A/D25A;
h) N21A/D25A/E96A; 및
i) N21A/M22A/D25A.
제1항 내지 제14항 및 제23항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
제15항에 있어서, 핵산 서열이 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
제15항 또는 제16항에 있어서, 핵산 분자가 발현 카세트 또는 발현 벡터에 도입되는, 핵산 분자.
a) 제1항 내지 제14항 및 제23항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드; 및/또는
b) 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 재조합 핵산
을 포함하는, 재조합 세포.
제18항에 있어서, 재조합 세포가 진핵 세포인, 재조합 세포.
제19항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인, 재조합 세포.
제18항의 적어도 하나의 재조합 세포, 및 배양 배지를 포함하는, 세포 배양물.
폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,
a) 제18항의 하나 이상의 재조합 세포를 제공하는 단계; 및
b) 세포가 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 제조하도록 배양 배지에서 상기 하나 이상의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 제조된 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, 반감기를 증가시키기 위해 제조된 폴리펩타이드를 구조적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제24항에 있어서, 상기 변형(modification)이 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합, 및 PEG화로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경(alteration)을 포함하는, 방법.
제22항의 방법에 의해 제조된, 재조합 폴리펩타이드.
약학적으로 허용되는 담체 및
a) 제1항 내지 제14항 및 제23항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드;
b) 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 재조합 핵산; 및/또는
c) 제18항의 재조합 세포
를 포함하는, 약학적 조성물.
제27항에 있어서, 조성물이 제1항 내지 제14항 및 제23항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
제27항에 있어서, 조성물이 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
제27항에 있어서, 조성물이 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
대상체에서 IL-10-매개 신호전달을 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게
a) 제1항 내지 제14항 및 제23항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드;
b) 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 재조합 핵산;
c) 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 재조합 세포; 및/또는
d) 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항의 약학적 조성물
을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
건강적 병태(health condition)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강적 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게
a) 제1항 내지 제14항 및 제23항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드;
b) 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 재조합 핵산;
c) 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 재조합 세포; 및/또는
d) 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항의 약학적 조성물
을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서, 투여되는 조성물이 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 IL-10 폴리펩타이드와 비교하여 IL-10을 통해 매개된 다운스트림 신호 전달의 세포-유형 편향된 신호전달을 부여하는, 방법.
제33항에 있어서, 세포-유형 편향된 IL-10 신호전달이 B 세포, T 세포, 및 NK 세포에서 STAT1- 또는 STAT3-매개 전염증성 기능의 감소를 포함하면서 단핵구 및 대식세포에서 이의 STAT3-매개 항-염증성 기능을 실질적으로 유지하는, 방법.
제34항에 있어서, STAT3-매개 신호전달이 유전자 발현 검정, 포스포-흐름 신호전달 검정, 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)으로 구성되는 군으로부터 선택된 검정에 의해 결정되는, 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서, STAT3-매개 전염증성 기능이 사이토카인 제조, 케모카인 제조, 면역 세포 증식, 및 면역 세포 동원으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, STAT3-매개 전염증성 기능이 약 20% 내지 약 100%까지 감소되는, 방법.
제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 투여된 조성물이 대상체에서 IFN-γ, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 퍼포린, TNF-α, GM-CSF 및 MIP1α로부터 선택된 전염증성 유전자의 발현을 유도하는 능력을 감소시키는, 방법.
제32항에 있어서, 투여된 조성물이 CD8+ T 세포에서 인터페론 감마(INFγ)의 발현을 자극하는, 방법.
제39항에 있어서, 건강적 병태가 암인, 방법.
대상체에서 IL-10-매개 신호전달을 조절하거나 이를 필요로 하는 대상체에서 건강적 병태를 치료하기 위한 키트로서, 시스템은
a) 제1항 내지 제14항 및 제23항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드;
b) 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 재조합 핵산;
c) 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 재조합 세포; 및/또는
d) 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항의 약학적 조성물
을 포함하는, 키트.