CN117362396A - 一种特异性亲和白介素-10的亲和多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性亲和白介素‑10的亲和多肽及其用途。亲和多肽的氨基酸序列选自SEQ ID No.2之一，亲和多肽能够高效特异性亲和白介素‑10，并衍射出生物活性片段、多聚核苷酸序列、复合材料。本发明的多肽对IL‑10具有很高的亲和性，能够高效募集IL‑10蛋白，进而在炎症组织中抑制过度激活的免疫反应，为炎症的抑制及IL‑10缺乏相关的疾病治疗提供了更多的选择。
Description
本发明申请是申请号为2022107246350、申请日为2022-06-23的发明专利的分案申请。
技术领域
本发明属于生物医学领域的一种炎症制药的亲和多肽及其用途，具体是涉及了一种能够特异性亲和白介素-10(IL-10)的新型亲和多肽及其用途。
背景技术
噬菌体展示技术是一种分子生物学技术，通过基因工程将外源肽或蛋白质基因插入到噬菌体外壳蛋白基因中，由外源基因编码的肽或蛋白质以融合蛋白的形式存在于噬菌体表面。展示的肽或蛋白质可以保持相对的空间结构和生物学活性，能够结合并识别靶分子。
白介素-10(IL-10)是一种抗炎细胞因子，在炎症的抑制和消退中发挥至关重要的作用。它能够抑制炎症因子的合成与释放，如：IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α，并增强抗炎性因子释放，如IL-1受体拮抗剂和溶解性TNF-α受体。此外，它还可以起到抑制单核巨噬细胞的抗原递呈作用。
针对炎症性肠病(IBD)，现有治疗方法可以分为两大类：一类是非手术性的IBD治疗，主要是一些传统药物和新兴生物制剂，另一类是手术治疗。传统的药物治疗手段效果有限、副作用高且剂量依赖性明显，而生物制剂价格昂贵、不良反应多。这些药物存在着对部分患者无效，还有部分患者治疗中途失效的问题。可能产生的免疫抑制反应会导致感染、神经系统疾病、恶性肿瘤等不良事件的发生，进一步增加了疾病的复杂性。此外，停药之后患者的疾病复发率比较高。而手术治疗一方面易于复发，另一方面存在严重术后并发症。因此，寻找新的治疗途径已成为当务之急。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种对IL-10具有高度亲和性的新型多肽序列，能够特异性募集IL-10，该多肽可用于炎症性疾病的抑制与消退以及IL-10缺乏相关疾病的治疗。
本发明采用以下技术方案。
一、一种亲和多肽，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.5之一。
所述的氨基酸序列分别为：HSGSSVFAQPVM；FPWPTPHWWHRS；HPSRRRDGNLPL；GHWKHHFRPPAP；EMFRELKNWTAA。如下表：
二、一种生物活性物质，包含多肽，包括但不限于化学偶联的化合物，改性的药物等。
该生物活性物质能够发挥所述亲和多肽相同的功能，即募集IL-10蛋白。
三、一种多聚核苷酸序列，能够编码所述的多肽，或者能够编码所述的生物活性物质。
四、一种复合材料，包含多肽，也为但不限于纳米颗粒、工程化的噬菌体、高分子材料等接枝多肽的载体材料。
该复合材料能够发挥所述亲和多肽相同的功能，即募集IL-10蛋白。
所述亲和多肽、所述生物活性片段、所述多聚核苷酸序列或者所述复合材料在制备用于炎症的生物医学材料和药物中的应用。具体是在制备用于特异性释放抗炎细胞因子IL-10的生物医学材料和药物中的应用。
所述的炎症为炎症性肠病、银屑病、关节炎等炎症性疾病中的炎症。
本发明得到的IL-10亲和肽对IL-10具有很高的亲和性，能够特异性募集IL-10，抑制促炎细胞因子的释放，提高抗炎细胞因子的水平，进而对炎症起到抑制和消退作用，进而在炎症组织中抑制过度激活的免疫反应。在多种炎症性疾病，例如：炎症性肠病、银屑病、关节炎等的治疗方面具有广泛的应用前景。
本发明以IL-10蛋白为靶标得到了特异性亲和IL-10的多肽序列。针对目前已有生物制剂存在疗效有限和副作用明显等缺点，所述多肽在生物医学领域上，本发明所涉及的多肽具有特异性亲和IL-10蛋白的能力，为抑制炎症反应及治疗IL-10缺乏相关的疾病提供了新的选择。
本发明采用以下技术方案：
1)利用Ph.D.-12TM噬菌体多肽文库对IL-10进行筛选，获得能够与IL-10特异性亲和的噬菌体；
2)将步骤(1)中的IL-10亲和噬菌体进行DNA测序，根据相应的DNA序列推导出亲和多肽的氨基酸序列；
3)验证步骤(2)中得到的多肽对IL-10的亲和能力。
附图说明
图1为实施例1中利用Ph.D.-12TM噬菌体多肽文库对IL-10蛋白进行4轮筛选的过程中，每一轮筛选的输出与投入比的对数值。
图2为实施例2中对DNA测序结果进行分析和翻译后，得到的一系列频次较高的序列。
图3为实施例3中通过酶联免疫吸附实验检验展示有5种不同多肽序列的噬菌体对IL-10蛋白的亲和能力。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是本发明的优选实施例而本发明并不局限于以下实施例。凡在本发明的精神和原则之内，所作的的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明的实施例如下：
实施例1：利用Ph.D.-12TM噬菌体多肽文库，针对IL-10蛋白进行四轮筛选。
1)包被IL-10蛋白：将150μL IL-10蛋白溶液加入24孔板中，将孔板放入湿盒，在4℃的摇床上孵育过夜；
2)封闭：将板子中的液体吸掉，将板倒置在无菌纸巾上用力甩拍取出残余溶液。再在孔板中加满5％ BSA封闭液，室温轻摇2小时；
3)去背景：取一个新的24孔板，加入Ph.D.-12TM噬菌体多肽文库，室温下在摇床中孵育1小时；
4)洗涤：吸除封闭液，将板倒置在无菌纸巾上用力甩拍取出残余溶液，再用PBST缓冲液快速洗板6次，每次均旋转以使孔板底部和边缘均被洗到。倾倒去除缓冲液，将板倒置在无菌纸巾上用力甩拍取出残余溶液；
5)结合：将步骤3)中的噬菌体溶液加入到步骤4)中处理后的孔板里，在摇床上孵育1小时；
6)洗涤：倾倒除去未结合的噬菌体，将板倒置在无菌纸巾上用力甩拍取出残余溶液。按照步骤4)中所述方法用PBST缓冲液洗涤孔板10次，每次置于摇床上轻摇10分钟，并在每次洗涤后用干净的纸巾甩拍以避免交叉污染；
7)洗脱：先加入100μL洗脱液，室温轻摇8分钟后，再加入15μL中和液，将混合液收集到EP管中；
8)涂板：提前将配制好的LB/IPTG/Xgal平板于37℃恒温箱预热。将步骤7)收集到的噬菌体溶液取一部分稀释至合适倍数，取10μL稀释后的噬菌体溶液与200μL活化的E.coil、ER2738菌液孵育15分钟。将孵育后的噬菌体/细菌混合液转移至LB/IPTG/Xgal平板上，用一次性无菌涂布棒旋涂均匀后，在37℃培养箱中培养过夜，次日计数噬菌体蓝斑数目；
9)扩增形成子库：将步骤7)中剩余的噬菌体溶液加入到20mL处于对数生长期的E.coil、ER2738菌液中，孵育20分钟后，置于37℃的摇床中在220rpm的转速下振摇4.5小时。将噬菌体/细菌混合液离心除菌后，在上清中加入五分之一体积的PEG/NaCl溶液，在4℃条件下过夜沉降。次日，离心后保留沉淀，用无菌PBS重悬沉淀，即完成一次噬菌体的纯化。重复两次纯化过程，形成的噬菌体子库用于下一轮扩增；
10)以上步骤1)至步骤9)重复4次，保证每一轮的噬菌体投入量一致，完成筛选过程。
测试1：计算投入产出比
步骤8)中计数的噬菌体蓝斑数目除以投入的噬菌体数目，即可得到每一轮筛选的投入产出比。图1为IL-10亲和多肽筛选的投入产出比结果图，图中将投入产出比取对数使柱形图更为可观。根据筛选结果，每轮的投入产出比逐轮递增，说明展示有IL-10亲和肽的噬菌体产生了明显的富集。
测试2：对筛选得到的噬菌体进行DNA测序与翻译
1)特异性亲和IL-10的噬菌体保存与扩增：将第四轮筛选涂布的平板中，随机挑取80个蓝斑，加入到含有LB培养基的摇菌管中进行扩增。24小时后，取一部分菌液保存菌种于-80℃冰箱，剩下的菌液用于DNA测序；
2)测序结果分析：在DNA测序结果中，找到插入的外源基因序列，将密码子翻译为氨基酸序列，统计重复的多肽序列与出现的频次，结果如图2所示。
测试3：通过酶联免疫吸附实验检验筛选所得噬菌体的IL-10亲和能力。
1)IL-10亲和噬菌体的扩增与纯化：将保存的五种噬菌体样品和野生型噬菌体样品在室温下融化后，取200μL加入到20mL处于对数生长期的E.coil、ER2738菌液中，孵育20分钟后，置于37℃的摇床中在220rpm的转速下振摇4.5小时。将噬菌体/细菌混合液离心除菌后，在上清中加入五分之一体积的PEG/NaCl溶液，在4℃条件下过夜沉降。次日，离心后保留沉淀，用无菌PBS重悬沉淀，即完成一次噬菌体的纯化。重复两次纯化过程，得到的噬菌体溶液用于IL-10亲和能力验证；
五种亲和噬菌体具体分别为展示有HSGSSVFAQPVM序列、FPWPTPHWWHRS序列、HPSRRRDGNLPL序列、GHWKHHFRPPAP序列、EMFRELKNWTAA序列的噬菌体。
2)包被IL-10蛋白：将50μL浓度为4μg/mL蛋白加入96孔酶标板中，将酶标板放入湿盒，在4℃的摇床上孵育过夜；
3)封闭：将孔板中的液体吸掉，将酶标板倒置在无菌纸巾上用力甩拍取出残余溶液。再在孔板中加200μL 5％ BSA封闭液，孵育1小时；
4)洗涤：弃掉封闭液，将酶标板倒置在无菌纸巾上用力甩拍取出残余溶液。加入200μL PBST缓冲液洗涤孔板6次，每次置于摇床上孵育6分钟后，在无菌纸巾上用力甩拍取出残余溶液。
5)结合：加入50μL步骤1)中扩增的噬菌体，每种噬菌体的浓度保持一致。室温孵育1小时，同时设计加入PBS和野生型噬菌体的组别用于对照；
6)洗涤：吸出噬菌体溶液，用PBST缓冲液按照步骤4)重复洗涤6次；
7)加入一抗：加入100μL稀释至合适倍数的抗噬菌体外壳蛋白g8p抗体，在室温下孵育1小时；
8)洗涤：吸出一抗，用PBST缓冲液按照步骤4)重复洗涤3次；
9)加入二抗：加入100μL稀释至合适倍数的HRP偶联的羊抗鼠二抗，在室温下孵育1小时；
10)洗涤：吸出二抗，用PBST缓冲液按照步骤4)重复洗涤3次；
11)加入TMB显色液：加入100μL的TMB显色液，在37℃条件下孵育10-20分钟；
12)加入终止液：等到步骤11)后显示出蓝色，加入100μL的终止液2MH2SO4中止反应；
13)测量吸光度：通过酶标仪测量450nm处的吸光度。
针对本实施例结果进行实验，实验过程如下：
测试：通过酶联免疫吸附实验检验筛选所得噬菌体的IL-10亲和能力。
1)IL-10亲和噬菌体的扩增与纯化：将保存的五种噬菌体样品和野生型噬菌体样品在室温下融化后，取200μL加入到20mL处于对数生长期的E.coil、ER2738菌液中，孵育20分钟后，置于37℃的摇床中在220rpm的转速下振摇4.5小时。将噬菌体/细菌混合液离心除菌后，在上清中加入五分之一体积的PEG/NaCl溶液，在4℃条件下过夜沉降。次日，离心后保留沉淀，用无菌PBS重悬沉淀，即完成一次噬菌体的纯化。重复两次纯化过程，得到的噬菌体溶液用于IL-10亲和能力验证；
五种亲和噬菌体具体分别为展示有HSGSSVFAQPVM序列、FPWPTPHWWHRS序列、HPSRRRDGNLPL序列、GHWKHHFRPPAP序列、EMFRELKNWTAA序列的噬菌体。
2)包被IL-10蛋白：将50μL浓度为4μg/mL蛋白加入96孔酶标板中，将酶标板放入湿盒，在4℃的摇床上孵育过夜；
3)封闭：将孔板中的液体吸掉，将酶标板倒置在无菌纸巾上用力甩拍取出残余溶液。再在孔板中加200μL 5％ BSA封闭液，孵育1小时；
4)洗涤：弃掉封闭液，将酶标板倒置在无菌纸巾上用力甩拍取出残余溶液。加入200μL PBST缓冲液洗涤孔板6次，每次置于摇床上孵育6分钟后，在无菌纸巾上用力甩拍取出残余溶液。
5)结合：加入50μL步骤1)中扩增的噬菌体，每种噬菌体的浓度保持一致。室温孵育1小时，同时设计加入PBS和野生型噬菌体的组别用于对照；
6)洗涤：吸出噬菌体溶液，用PBST缓冲液按照步骤4)重复洗涤6次；
7)加入一抗：加入100μL稀释至合适倍数的抗噬菌体外壳蛋白g8p抗体，在室温下孵育1小时；
8)洗涤：吸出一抗，用PBST缓冲液按照步骤4)重复洗涤3次；
9)加入二抗：加入100μL稀释至合适倍数的HRP偶联的羊抗鼠二抗，在室温下孵育1小时；
10)洗涤：吸出二抗，用PBST缓冲液按照步骤4)重复洗涤3次；
11)加入TMB显色液：加入100μL的TMB显色液，在37℃条件下孵育10-20分钟；
12)加入终止液：等到步骤11)后显示出蓝色，加入100μL的终止液2MH2SO4中止反应；
13)测量吸光度：通过酶标仪测量450nm处的吸光度。如图3所示，5种筛选所得的噬菌体与IL-10蛋白的结亲和能力均高于野生型噬菌体和PBS阴性对照组，其中展示有HSGSSVFAQPVM序列的噬菌体对IL-10蛋白的亲和能力明显强于其他噬菌体，与两个对照组产生了显著性差异(***p＜0.001)。
结果说明：ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)是一种常用于检测蛋白质、抗体、抗原等生物分子含量的实验技术。ELISA技术利用酶标记和抗体结合的原理，可以定量或定性地检测特定分子在样本中的存在量。在本实验中，利用抗体结合噬菌体的外壳蛋白g8p，通过检测450nm处的吸光度，能够反应展示有不同多肽序列的噬菌体对于IL-10蛋白的结合量。吸光度数值越高，即说明与IL-10蛋白结合牢固的特异性多肽噬菌体数目越多，该多肽的亲和能力越强。如图3所示，5种筛选所得的噬菌体与IL-10蛋白的亲和能力均高于野生型噬菌体和PBS阴性对照组，其中展示有HSGSSVFAQPVM序列的噬菌体对IL-10蛋白的亲和能力明显强于其他噬菌体，与两个对照组产生了显著性差异(***p＜0.001)。
其中展示有FPWPTPHWWHRS序列的噬菌体对IL-10蛋白的亲和能力比较突出，与两个对照组产生了显著性差异(**p＜0.01,***p＜0.001)。
由此如图3所示，5种筛选所得的噬菌体与IL-10蛋白的结亲和能力均高于野生型噬菌体和PBS阴性对照组，其中展示有HSGSSVFAQPVM序列的噬菌体对IL-10蛋白的亲和能力明显强于其他噬菌体。
本发明涉及的氨基酸序列如下：
SEQ ID No.1；
名称：亲和多肽1的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
HSGSSVFAQPVM
ID No.2；
名称：亲和多肽2的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
FPWPTPHWWHRS
ID No.3；
名称：亲和多肽3的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
HPSRRRDGNLPL
ID No.4；
名称：亲和多肽4的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GHWKHHFRPPAP
ID No.5；
名称：亲和多肽5的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
EMFRELKNWTAA。
Claims (6)
1.一种亲和白介素-10的多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.2。
2.一种生物活性物质，其特征在于，包含权利要求1中的多肽，包括但不限于化学偶联的化合物，改性的药物等。
3.一种多聚核苷酸，其特征在于，能够编码权利要求1所述的多肽，或者能够编码权利要求2所述的生物活性物质。
4.一种复合材料，其特征在于，包含权利要求1中的多肽，也为但不限于纳米颗粒、工程化的噬菌体、高分子材料等接枝多肽的载体材料。
5.权利要求1所述亲和多肽、权利要求2所述生物活性片段、权利要求3所述多聚核苷酸序列或者权利要求4所述复合材料的应用，其特征在于：在制备用于炎症的生物医学材料和药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在制备用于特异性亲和抗炎细胞因子IL-10的生物医学材料和药物中的应用。
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