ES2935745T3 - Adenovirus oncolíticos modificados - Google Patents
Adenovirus oncolíticos modificados Download PDFInfo
- Publication number
- ES2935745T3 ES2935745T3 ES19712178T ES19712178T ES2935745T3 ES 2935745 T3 ES2935745 T3 ES 2935745T3 ES 19712178 T ES19712178 T ES 19712178T ES 19712178 T ES19712178 T ES 19712178T ES 2935745 T3 ES2935745 T3 ES 2935745T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cancer
- ox40l
- cd40l
- cells
- modified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 65
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 title abstract description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 75
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 claims description 96
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 claims description 94
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims description 80
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 78
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 68
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 63
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 21
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 21
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 claims description 20
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- 101100059511 Homo sapiens CD40LG gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101000764263 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000051450 human TNFSF4 Human genes 0.000 claims description 6
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 claims description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 claims description 4
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000002458 carcinoid tumor Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 claims description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 201000000052 gastrinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 claims description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010007270 Carcinoid syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010018404 Glucagonoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006937 Hydatidiform mole Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061523 Lip and/or oral cavity cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010062038 Lip neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015021 Meningeal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005890 Neuroma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010133 Oligodendroglioma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010191 Osteitis Deformans Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000035 Osteochondroma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000027868 Paget disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009565 Pharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010034811 Pharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010036832 Prolactinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004337 Salivary Gland Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061934 Salivary gland cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010041329 Somatostatinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010043515 Throat cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000728 Thymus Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010044002 Tonsil cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006842 Tonsillar Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000023915 Ureteral Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046392 Ureteric cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014070 Vestibular schwannoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004354 Vulvar Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004064 acoustic neuroma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011165 anus cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010918 connective tissue cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 claims description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024519 eye neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015419 gastrin-producing neuroendocrine tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000005459 gum cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010235 heart cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024348 heart neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010022498 insulinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006721 lip cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022006 malignant tumor of meninges Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 claims description 2
- 208000027202 mammary Paget disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005962 mycosis fungoides Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000008106 ocular cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 210000003254 palate Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000021255 pancreatic insulinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002628 peritoneum cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003437 pleural cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000030153 prolactin-producing pituitary gland adenoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010062261 spinal cord neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000009377 thymus cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029387 trophoblastic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006542 von Hippel-Lindau disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005102 vulva cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims 1
- 206010052178 Lymphocytic lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 claims 1
- 210000002990 parathyroid gland Anatomy 0.000 claims 1
- 201000002511 pituitary cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 82
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 33
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 12
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 9
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 9
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 6
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 5
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 4
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000005707 Desmoglein 2 Human genes 0.000 description 3
- 108010045583 Desmoglein 2 Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010004141 HLA-B35 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 3
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 3
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 3
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 3
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 2
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- -1 glycyl-prolyl Chemical group 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101710114790 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010093502 E2F Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000001388 E2F Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 101710199711 Early E1A protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 101000574441 Mus musculus Alkaline phosphatase, germ cell type Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000000763 Survivin Human genes 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 229940126530 T cell activator Drugs 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091005956 Type II transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005904 anticancer immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000037449 immunogenic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 201000003913 parathyroid carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000029610 recognition of host Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 206010046885 vaginal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013139 vaginal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
- A61K35/761—Adenovirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
- A61K39/001186—MAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
- A61K39/001188—NY-ESO
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
- A61K2039/876—Skin, melanoma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10371—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
La invención se refiere a un adenovirus oncolítico competente en replicación modificado; una composición farmacéutica que comprende la misma; y un método para tratar el cáncer usando el mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Adenovirus oncolíticos modificados
Campo de la invención
La invención se refiere a un adenovirus oncolítico, competente para replicación modificado; a una composición farmacéutica que comprende el mismo; y a su uso en un método para tratar cáncer.
Antecedentes de la invención
La percepción del papel de virus oncolíticos en el tratamiento del cáncer ha cambiado drásticamente durante la última década, ya que la inmunoterapia y la estimulación del propio sistema inmunitario del paciente para fijar como diana y atacar el cáncer han ganado popularidad. A principios de siglo, los virus oncolíticos se percibían como agentes activos en el tratamiento del cáncer, actuando únicamente mediante su capacidad inherente para causar lisis de células tumorales mediante oncólisis. Recientemente, su uso como vacunas contra el cáncer ha ganado interés, y su capacidad para liberar antígenos tumorales de células cancerosas tras oncólisis para activar el sistema inmunitario se reconoce como una característica importante en el diseño de inmunoterapia final contra el cáncer. Los adenovirus son virus altamente inmunogénicos que a menudo se usan como vectores en diversos enfoques de vacunas contra enfermedades infecciosas. Es importante destacar que tienen una capacidad excepcional para cebar y estimular respuestas inmunitarias. Además, es probable que la presencia de un adenovirus oncolítico dentro de un tumor y la muerte celular inmunogénica que causa conformen el microentorno tumoral hostil hacia un estado más susceptible para que ocurra una inmunidad antitumoral clínicamente relevante, causando la expresión de inmunomoduladores de tipo TH1 tales como interferón gamma (IFNgamma). La infiltración de células inmunitarias en el tumor es una consecuencia frecuente del tratamiento con virus oncolíticos y, lo que es importante, algunos adenovirus inducen infiltración por linfocitos T CD8+ que son células efectoras fundamentales en la inmunidad contra el cáncer. Los adenovirus causan lisis inmunogénica de las células cancerosas, por lo que algunos antígenos tumorales, incluyendo neoantígenos únicos específicos del paciente, ocultos previamente al sistema inmunitario o no presentados en un contexto inmunogénico, se liberan en el entorno inmunogénico. Esta es la base de una respuesta inmunitaria específica de tumor causada por adenovirus oncolíticos.
Sin embargo, los tumores han desarrollado varios mecanismos inmunosupresores para contrarrestar las células inmunitarias del organismo. Las células inmunitarias expresan moléculas de superficie celular que regulan su activación y funciones efectoras, específicamente moléculas coestimuladoras y coinhibidoras. Las moléculas de retroalimentación negativa, es decir, moléculas de puntos de control, permiten autotolerancia en contextos fisiológicos normales pero, a menudo, las células tumorales las utilizan para causar supresión inmunitaria severa. Las rutas de puntos de control mejor caracterizadas son las rutas de proteína 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y de proteína 1 de muerte celular programada (PD-1/PD-L1). Debido a estos fuertes mecanismos inmunosupresores dentro del tumor, la respuesta inmunitaria antitumoral inducida por virus puede ser débil a menos que se fortalezca por el uso de transgenes inmunoestimuladores. El enfoque actual aborda el problema de la supresión inmunitaria en el sitio tumoral, ya que la presencia del adenovirus oncolítico altamente inmunogénico que codifica transgenes humanos inmunoestimuladores conforma el microentorno tumoral hacia un fenotipo "inflamado inmunitario" que es más susceptible a enfoques de inmunoterapia. Es importante destacar que el virus oncolítico del enfoque actual puede utilizarse en combinación con moduladores de puntos de control tales como moléculas anti-PD1, anti-PD-L1 o anti-CTLA-4 para contrarrestar el entorno tumoral inmunosupresor y causar una fuerte respuesta antiinmunitaria. Exposiciones de la invención
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un adenovirus de tipo natural replicante y modificado de serotipo 5 que tiene actividad lítica en células cancerosas diana que comprende:
a) una deleción génica de E1A en donde la deleción es de pares de bases 923-946;
b) una sustitución quimérica 5/3 de una protuberancia de una proteína de fibra adenoviral en donde la protuberancia de Ad de serotipo 5 está reemplazada por la protuberancia de un Ad de serotipo 3;
c) una deleción génica de 14.7k en donde la deleción es de pares de bases 30446-30460 con respecto al adenovirus de tipo natural y en donde la secuencia GGA GGA GAT GAC TGA (SEQ ID NO: 1) eliminada por deleción está sustituida por GGA GGA GAC GAC TGA (SEQ ID NO: 2); y
d) una deleción génica de gp19k y una deleción génica de 7.1k en donde las deleciones son de pares de bases 28541-29211 con respecto al adenovirus de tipo natural.
En el adenovirus modificado mencionado anteriormente, los aminoácidos 923-946 se eliminan por deleción de la secuencia de Ad5 de tipo natural (wt). Esta deleción es una medida de seguridad ya que la proteína E1A viral no puede unirse a una molécula de retinoblastoma (Rb) y libera el factor de transcripción E2F de Rb para transcripción génica viral. Por tanto, el adenovirus se basa en la presencia de E2F libre en una célula hospedadora y puede replicar su genoma en células normales en división o en células cancerosas, donde E2F libre está disponible
constantemente. Por tanto, la modificación es relativamente protectora de células que no están en división y está dirigida contra células en división o cancerosas.
Además, la sustitución quimérica 5/3, es decir, el reemplazo de la región de protuberancia de fibra adenoviral de serotipo 5 con la región de protuberancia de adenovirus de serotipo 3 permite que el virus eluda al receptor de Coxsackie-adenovirus (CAR) de receptor nativo de Ad5 y, en su lugar, use el receptor nativo de desmogleína 2 (DSG2) de Ad3 para internalización. DSG2 está presente en células cancerosas en abundancia. Por tanto, de nuevo, la modificación es relativamente protectora de células que no están en división y está dirigida contra células en división o cancerosas.
La infección adenoviral comienza con el reconocimiento de receptores de células hospedadoras mediante proteínas especializadas en la superficie viral, es decir, la proteína de fibra de adenovirus y, en particular, el dominio carboxiterminal globular de la proteína de fibra de adenovirus, denominado dominio de protuberancia carboxi-terminal. Por consiguiente, en el presente documento, la referencia a una protuberancia de una proteína de fibra adenoviral se refiere al dominio carboxi-terminal globular de la proteína de fibra de adenovirus.
Además, la deleción génica de 14.7k evita que las células infectadas mueran por citólisis inducida por TNFalfa y, por tanto, la deleción es ventajosa. Es importante destacar que los presentes inventores han observado que hay una superposición corta al comienzo del gen 14.7k y el gen RID beta (14.5k) corriente arriba y, por tanto, se realiza una modificación para permitir la deleción génica de 14.7k sin eliminar por deleción el último aminoácido y el codón de parada del gen RID beta. Específicamente, la secuencia de unión nativa se lee como GGAGGAGATGACTGATTAGGTA (SEQ ID NO: 3) siendo la secuencia subrayada la parte C-terminal del gen RID beta y siendo el resto la parte N-terminal del gen 14.7k. La traducción a aminoácidos se lee como parada G G D D (GGA GGA GAT GAC t Ga ; SEQ ID NO: 1) para el gen RID beta. Por tanto, para anular el ATG dentro del ORF del gen RID beta para que no haya una lectura incorrecta si se inserta un transgén dentro del sitio de deleción, y para asegurarse de que se mantiene la parte C-terminal del RID beta funcional, los presentes inventores han cambiado ligeramente la secuencia de RID beta: GGA GGA GAC GAC TGA (SEQ ID NO: 2). De este modo, la secuencia todavía se lee como parada G G D D, pero no contiene un ATG para cualquier lectura corriente abajo incorrecta que pueda interferir con la expresión del transgén.
Por último, gp19k es un gen que regula por disminución MHCI en la célula infectada, y es redundante para replicación, empaquetamiento, etc., de adenovirus y, por tanto, puede retirarse. Además, como es un gen inmunorregulador que usa el adenovirus para ocultarse del sistema inmunitario, es beneficioso eliminarlo por deleción. 7.1k es un gen relacionado con la degradación del receptor de TRAIL 2 e inhibe la apoptosis inducida por liberación de Ca2+ del retículo endoplásmico (RE). Sin embargo, como el codón de parada del gen 7.1k reside dentro del marco de lectura abierto de gp19k, no se añaden transgenes a este sitio eliminado por deleción.
En una realización preferente de la invención, dicho adenovirus está modificado además por la inserción de una molécula que codifica OX40L, de forma ideal OX40L humano, en la deleción génica de 14.7k. OX40L es un activador de linfocitos T y, por tanto, es ventajoso para el funcionamiento de la invención.
El gen OX40L tiene su propio codón de inicio (ATG) y cuando está insertado en la deleción génica de 14.7k es preferente añadir un emparejamiento de bases CC entre el codón de parada del gen RID beta y el codón de inicio de OX40L para optimizar la traducción (es decir, para generar la secuencia Kozak ACCATGG).
Lo más preferentemente, el OX40L humano está situado en la región E3B, reemplazando la deleción génica de 14.7K. El extremo 3' del gen RID beta y el extremo 5' del 14.7K están superpuestos en el adenovirus de tipo natural y, por tanto, la modificación de T/C explicada anteriormente se realizó en el extremo 3' de RID beta, para permitir la transcripción correcta del transgén.
En otra realización preferente de la invención, dicho adenovirus está modificado, además o alternativamente, por la inserción de CD40L, de forma ideal CD40L humano. El CD40L humano está insertado en la región tardía del virus, específicamente en la región tardía 3 (L3), de forma ideal, corriente abajo del gen 23K, o en la región L5, corriente abajo del gen Fiber. CD40L activa las células presentadoras de antígeno (APC) y, por tanto, es ventajoso para el funcionamiento de la invención.
Preferentemente, el transgén CD40L está situado inmediatamente después de la región codificante del gen 23K adenoviral, precediendo a su sitio de poliadenilación, o inmediatamente después del gen Fiber, precediendo a su sitio de poliadenilación. Habitualmente, pero no exclusivamente, no se realizan deleciones para alojar al gen y, por tanto, la expresión del transgén depende de la maquinaria de corte y empalme alternativa adenoviral y un sitio aceptor de corte y empalme (SAS) que precede al transgén (por ejemplo, SAS adaptado de los documentos de Patente US2006/0292682 A1 y WO2006/012393).
En otra realización preferente de la invención, dicho adenovirus está modificado además por la inserción de un sitio aceptor de corte y empalme (SAS) y/o una secuencia Kozak corriente arriba del transgén CD40L para ayudar a la transcripción de CD40L.
Alternativamente, y además lo más preferentemente, el transgén CD40L está insertado inmediatamente corriente abajo de OX40L usando:
A) un sitio de procesamiento 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A) (por ejemplo, véase Ad5/3-D24-OX40L-F2A-CD40L, constructo C1 en las figuras) o
B) sitio de procesamiento 2A del tescovirus porcino-1 (P2A) (por ejemplo, véase Ad5/3-D24-OX40L-P2A-CD40L, constructo C3 en las figuras).
El sitio de procesamiento 2A está insertado entre los dos transgenes y, de forma ideal, ambos sitios de procesamiento 2A están precedidos por un sitio de escisión (por ejemplo, un sitio de escisión de furina: RKRR) y un conector SGSG para asegurar una escisión eficaz de los transgenes.
Los expertos en la materia entenderán que los sitios de procesamiento 2A son péptidos pequeños de "autoescisión" encontrados en picornavirus. Los ribosomas hospedadores saltan la síntesis del enlace peptídico glicil-prolilo en la parte C-terminal del péptido 2A, conduciendo a la escisión entre un péptido 2A y su péptido corriente abajo inmediato. Como resultado, el péptido corriente abajo escindido tiene prolina en su parte N-terminal, lo que significa que la proteína CD40L producida a partir de los constructos de virus descritos en el presente documento tiene una prolina en su parte N-terminal.
Por consiguiente, en una realización preferente de la invención, dicho adenovirus modificado incluye uno y más preferentemente dos transgenes: OX40L y CD40L. Además, habitualmente, pero no exclusivamente, dicho transgén CD40L está provisto casi inmediatamente o inmediatamente corriente abajo de dicho transgén OX40L o viceversa. El acoplamiento de receptores de linfocitos T por complejos antígeno-MHCI/II constituye la señal principal, señal 1, para la activación de linfocitos T indiferenciados. Sin embargo, la señal 1 no es suficiente para iniciar generación y mantenimiento productivos de linfocitos T efectores. La activación completa de linfocitos T CD8+ requiere señales adicionales dirigidas por moléculas coestimuladoras presentes en APC activadas o en linfocitos T auxiliares pero raramente en tumores. Las moléculas coestimuladoras que los presentes inventores han elegido para usar como transgenes en su invención, es decir, CD40L y OX40L, son miembros de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral (TNF). La mayoría de ligandos de la superfamilia de TNF se expresan predominantemente en células implicadas en el sistema inmunitario, incluyendo linfocitos B, linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos y DC.
El ligando OX40 (OX40L) y el ligando CD40 (CD40L) son proteínas transmembrana de tipo II que tienen un dominio extracelular relativamente largo y una región citoplasmática corta. El dominio extracelular (específicamente, el dominio de homología de TNF) presenta la especificidad de unión a receptor que es esencial para la funcionalidad del ligando. La mayoría de los ligandos de la superfamilia de TNF se expresan como homotrímeros en la superficie celular y son inactivos o poco activos como proteínas de fusión triméricas solubles. Por tanto, una forma soluble sin la región transmembrana no sería aplicable para el enfoque de los presentes inventores. Por tanto, en la presente invención, se utiliza el ADNc completo de cada transgén. De esta forma, los productos de transgén contienen todos los dominios que están presentes de forma natural en la proteína que se produce a partir de una célula, es decir, también un dominio transmembrana que dirige la proteína a la ruta secretora y la retiene en la membrana celular, así como los sitios de origen natural que causan escisión de la superficie celular por proteinasas.
Por consiguiente, en una realización preferente de la invención, se inserta una molécula que codifica la totalidad de al menos uno o cada transgén en dicho adenovirus, de forma ideal ADNc que codifica la totalidad de al menos uno o cada transgén.
En su mayoría, los enfoques que utilizan moléculas coestimuladoras como agente terapéutico para provocar/mejorar inmunidad antitumoral, usan anticuerpos agonistas monoclonales específicos para receptores de los ligandos de TNF, o formas solubles de los ligandos. Este enfoque requiere la administración sistémica de las moléculas terapéuticas. Por el contrario, el enfoque de los presentes inventores se asemeja a la situación natural dentro del organismo, donde los ligandos se presentan a sus receptores afines como proteínas ancladas a membrana producidas por la maquinaria celular de la célula cancerosa infectada.
Los linfocitos T CD4+ desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de una respuesta eficaz de linfocitos T CD8+ en infecciones virales persistentes. El nuevo constructo viral de la invención con transgén coestimulador o transgenes coestimuladores provoca inmunidad antiviral de tipo Th1 dentro del entorno tumoral. La presencia de antígenos tumorales en la superficie del virus y la liberación de otros antígenos tumorales en presencia de inflamación local, así como propagación determinante, conduce a la formación de clones de linfocitos T inmunitarios antitumorales. Para mantener la fase efectora de los linfocitos T citotóxicos CD8+, las moléculas coestimuladoras (concretamente, OX40L y CD40L) poseen características únicas que los presentes inventores quieren aplicar en el tratamiento de cáncer inmunosupresor.
Sorprendentemente, los datos de los presentes inventores indican que la adición de los transgenes
inmunoestimuladores, OX40L humano y CD40L humano, en el locus 14.7K no compromete la eficacia oncolítica de los virus de la presente invención, en comparación con el virus de cadena principal Ad5/3D24 o un virus con un transgén inmunoestimulador, por ejemplo, GM-CSF humano, reemplazando los genes gp19K/7.1K eliminados por deleción. Esto es sorprendente porque los transgenes pueden influir profundamente en la replicación del virus debido al tamaño del transgén y los efectos directos del transgén en las células que están infectadas. Además, la deleción del gen 14.7K no está tan ampliamente estudiada como la deleción de genes gp19K/7.1K y, por tanto, podría tener consecuencias inesperadas para la maquinaria de replicación del virus, especialmente en el contexto de incorporación de transgenes en el sitio de deleción de 14.7K.
Los presentes inventores también muestran que el virus de la presente solicitud puede producir transgenes humanos funcionales desde el locus génico de 14.7K. Esto fue inesperado porque los presentes inventores usaron, en cierto modo inusualmente, un casete de transcripción con un sitio de procesamiento 2A viral entre los dos transgenes. Además, los presentes inventores muestran que el virus de la presente invención puede provocar una respuesta inmunitaria específica de MAGE-A3 y de NY-eSo -1.
Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un adenovirus competente para replicación y lítico de células diana de acuerdo con la invención y un vehículo adecuado.
OX40/OX40L
OX40L se expresa en APC activadas, incluyendo células dendríticas, linfocitos B y macrófagos. Se expresa en la superficie celular como un trímero que le permite unirse a tres moléculas de OX40. Se requiere activación de linfocitos T para la expresión de OX40, el receptor de OX40L, en linfocitos T CD8+ y CD4+. La inducción de OX40 ocurre en 24 horas y alcanza su punto máximo en 48-72 horas después de estimulación inicial de TCR, y dura generalmente 3-4 días. El nivel relativo de receptor de OX40 expresado en linfocitos T está influenciado en gran medida por el entorno local mediante contacto con células presentadoras de antígeno profesionales que expresan CD80 o CD86, o mediante un medio rico en TNFalfa o citoquinas inflamatorias similares. Además, normalmente, la expresión de OX40L se encuentra principalmente en el sitio de inflamación. Por tanto, los linfocitos T que expresan OX40 que se activan mediante señalización de TCR reciben coestimulación mediante OX40L en el sitio de inflamación. Esta especificidad de coestimulación mediante OX40 es análoga a una señal de peligro recibida de un entorno inflamatorio y, de ese modo, añade una capa de seguridad a su uso. Además, la expresión temporal de OX40 en la superficie de linfocitos T después del evento de cebado sugiere su importancia en proliferación tardía y supervivencia de linfocitos T efectores. Se sugiere que la activación de las moléculas antiapoptóticas BCL-2, BCL-xL y survivina en linfocitos T estimulados con OX40 es responsable del aumento de expansión clonal y de un grupo mayor de linfocitos T de memoria.
CD40/CD40L
Además de proporcionar señales coestimuladoras directamente a linfocitos T, también es atractivo promover la activación de las APC que probablemente presenten antígenos tumorales de forma cruzada, de modo que se logre in situ mayor expresión del ligando coestimulador. CD40 es fundamental para la función de linfocitos B y de las DC que lo expresan de forma constitutiva. El ligando CD40 (CD40L) está expresado principalmente en linfocitos auxiliares T activados. Se ha mostrado que el ligamiento de CD40 autoriza a las a Pc y permite que impulsen respuestas de CTL efectoras, en parte mediante inducción de la secreción de IL-12, y también mediante regulación por aumento de miembros de la familia B7 (CD80, CD86). La coestimulación de CD40/CD40L es importante para inducción de respuestas de linfocitos T antitumorales eficaces, y se ha mostrado que la incorporación de CD40L en vacunas basadas en células tumorales mejora significativamente las respuestas inmunitarias a tumores poco inmunogénicos en ratones, subrayando la importancia del efecto indirecto en la inmunidad adaptativa mediante APC en inmunidad antitumoral.
Además, en otra realización preferente de la invención, dicho adenovirus puede ser de cualquier tipo y especie de Adenoviridae, por ejemplo, no limitado a adenovirus humano pero lo más habitualmente es adenovirus humano. Lo más favorablemente, los adenovirus son capaces de replicarse y destruir células cancerosas mientras desvían la respuesta inmunitaria antiviral contra el tumor.
A partir de lo mencionado anteriormente, se desprende que el adenovirus modificado de la invención se ha modificado por ingeniería para estimular una respuesta inmunitaria contra cáncer y específicamente en un entorno tumoral donde, habitualmente, el sistema inmunitario se ve comprometido por los mecanismos evasivos empleados por las células cancerosas.
Además, o aún de forma alternativa, la invención se refiere a al menos un adenovirus modificado competente para replicación y lítico de células diana de acuerdo con la invención para uso para tratar cáncer.
Además, en el presente documento se describe el uso de al menos un adenovirus modificado competente para
replicación y lítico de células diana de acuerdo con la invención en la preparación de un medicamento para tratar cáncer.
Lo más preferentemente, el cáncer mencionado en el presente documento incluye uno cualquiera o más de los siguientes cánceres: cáncer nasofaríngeo, cáncer sinovial, cáncer hepatocelular, cáncer renal, cáncer de tejidos conjuntivos, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer cerebral, cáncer de garganta, cáncer oral, cáncer de hígado, cáncer pancreático, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de linfocitos T, neuroma, enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, cáncer suprarrenal, cáncer anal, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de uréter, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor de médula espinal, cáncer óseo, osteocondroma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, cáncer de sitio primario desconocido, carcinoide, carcinoide de tracto gastrointestinal, fibrosarcoma, cáncer de mama, enfermedad de Paget, cáncer cervicouterino, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de cabeza, cáncer ocular, cáncer de cuello, cáncer de riñón, tumor de Wilms, cáncer de hígado, sarcoma de Kaposi, cáncer de próstata, cáncer testicular, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer pancreático endocrino, glucagonoma, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer de pituitaria, sarcoma de tejidos blandos, retinoblastoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer trofoblástico, mola hidatídica, cáncer uterino, cáncer endometrial, cáncer de vagina, cáncer de vulva, neuroma del acústico, micosis fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, cáncer de encías, cáncer de corazón, cáncer de labios, cáncer de meninges, cáncer de boca, cáncer de nervios, cáncer de paladar, cáncer de glándula paratiroides, cáncer de peritoneo, cáncer de faringe, cáncer pleural, cáncer de glándulas salivales, cáncer de lengua y cáncer de amígdalas.
En el presente documento se describe el uso de un adenovirus modificado, optimizado para seguridad y supervivencia, como adyuvante activo en una terapia de tratamiento de cáncer que usa al menos uno y, de forma ideal, dos agentes inmunoestimuladores, es decir, OX40L y CD40L.
El adenovirus modificado actúa como adyuvante activo porque proporciona las señales de peligro requeridas para una respuesta inmunitaria óptima contra un péptido diana, pero también retiene su capacidad para producir oncólisis de las células cancerosas que infecta y replica su genoma. La destrucción celular oncolítica es inmunogénica por naturaleza, lo que causa cambios en el microentorno tumoral, que probablemente fortalezcan la respuesta inmunitaria a los péptidos/tumor.
En las reivindicaciones posteriores y en la descripción precedente de la invención, excepto cuando el contexto requiera lo contrario debido a lenguaje expreso o implicación necesaria, el término "comprende", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" se usa en un sentido inclusivo, es decir, para especificar la presencia de las características indicadas pero no para excluir la presencia o adición de características adicionales en diversas realizaciones de la invención.
A lo largo de la descripción y reivindicaciones de la presente memoria descriptiva, el singular incluye el plural a menos que el contexto requiera lo contrario. En particular, cuando se usa el artículo indefinido, debe entenderse que la memoria descriptiva contempla tanto el plural como el singular, a menos que el contexto requiera lo contrario. A continuación se describirá una realización de la presente invención a modo de ejemplo únicamente con referencia a lo siguiente, en donde:
Figura 1. Muestra un análisis de electroforesis en agarosa de las reacciones de ensamblaje de Gibson amplificadas por PCR de los fragmentos GA-OX40L/F2A/CD40L y GA-OX40L/P2A/CD40L. En el carril 1, una amplificación por PCR de los fragmentos ensamblados 1,2 y 3 que crea un fragmento GA-OX40L/F2A/CD40L de longitud completa con un tamaño de 3974 pb. En el carril 2, una amplificación por PCR de los fragmentos ensamblados 1, 2 y 3 que crea un fragmento GA-OX40L/P2A/CD40L de longitud completa con un tamaño de 3929 pb. En el carril 3, una amplificación por PCR del plásmido de virus de cadena principal pAd5/3D24 que amplifica un fragmento del tamaño de 3564 pb. Véase que en ambos carriles, 1 y 2, también puede observarse cierta amplificación de la cadena principal viral.
Figura 2. Muestra que la capacidad de la proteína OX40L producida por virus para unirse a su receptor OX40 se confirmó por citometría de flujo. Se usaron un anticuerpo de receptor OX40 (conejo) y un anticuerpo anti-conejo de cabra marcado con Alexa fluor 488 para unir la proteína OX40L expresada a partir de los virus en la superficie celular A549 infectada. Como controles negativos se usaron células no teñidas, células teñidas no infectadas y células teñidas infectadas con virus sin transgén. Los datos se presentan como A) histograma o B) como media de las frecuencias absolutas o proporcionales. MG = Media geométrica de células positivas para la marca de Alexa fluor 488, Frec. parental = proporción de células positivas para la marca de Alexa fluor 488, virus-Cont. = Ad5/3D24, un virus con una cadena principal idéntica y sin transgén, virus-OX40L = virus con OX40L solo como transgén, OX40L/CD40L.C1 y OX40L/CD40L.C3 = virus con OX40L y CD40L como transgenes. Figura 3. Muestra que OX40L capaz de unirse al receptor OX40 se expresa a partir de virus de transgén doble
Ad5/3-D24-OX40L-CD40.C1 (C1 en la figura) y Ad5/3-D24-OX40L-CD40.C3 (C3 en la figura) así como a partir del virus que expresa solo el transgén OX40L (usado como control de expresión). Se usó ELISA sándwich funcional para la detección de la forma nativa de OX40L expresada a partir de los virus en el sobrenadante de células infectadas. El sobrenadante de células no infectadas se usó como control negativo. Las diluciones se representan para cada muestra en la figura.
Figura 4. Muestra la funcionalidad de OX40L expresado en virus determinada usando células HEK-293 que expresan el receptor OX40 con un sistema indicador de luciferasa. Se analizó la capacidad de un virus sin transgén (virus-Cont.), un virus solo con OX40L como transgén (virus-OX40L), virus con OX40L y CD40L como transgenes (OX40L/CD40L.C1 y OX40L/CD40L.C3) para desencadenar la actividad de luciferasa dependiente de interacción de OX40L/OX40. Se detectó una clara actividad de luciferasa con los virus que expresan OX40L, lo que indica que OX40L expresado a partir del genoma del virus es funcional.
Figura 5. Muestra las absorbancias medidas usando el ensayo de células Ramos Blue para determinar niveles de expresión de CD40L funcional. (A) CD40L se expresó a partir de los virus de transgén doble (OX40L/CD40L.C1 y OX40L/CD40L.C3) y como controles negativos se usaron virus sin transgén (virus cont.) u OX40L como un solo transgén (virus-OX40L), o células no infectadas (A549). (B) Mediciones de absorbancia para las células Ramos Blue tratadas con CD40L humano recombinante.
Figura 6. Muestra la frecuencia de linfocitos T en tumor tratado y contralateral, y sin tratar cuando se trata con virus oncolítico sin revestimiento peptídico (VALO-C1), virus onclolítico con revestimiento antigénico peptídico (PeptiCRAd) NYESO-1 o MAGE-A3 o péptido solo. El número de linfocitos T CD3+ (A), linfocitos T c D4+ (B) y linfocitos T CD8+ (C) se representa como células por gramo de tejido tumoral en cada grupo de tratamiento. Los tratamientos dieron como resultado frecuencias de linfocitos T más elevadas en todos los grupos en comparación con la simulación. Los números más elevados se observaron en tumores tratados con VALO-C1 o PeptiCRAd. Figura 7. Muestra la frecuencia de todas las células inmunitarias (células CD45+) en tumor tratado y contralateral, y sin tratar cuando se trata con virus oncolítico sin revestimiento peptídico (VALO-C1), virus oncolítico con revestimiento antigénico peptídico NYESO-1 o MAGE-A3 (PeptiCRAd) o péptido solo. Las frecuencias fueron similares en todos los grupos con un número algo menor en animales tratados de forma simulada.
Figura 8. Muestra que los tratamientos con VALO-C1 y PeptiCRAd disminuyen el porcentaje de linfocitos T reguladores de todos los TIL en tumores tratados.
Figura 9. Muestra que PeptiCRAd (que contiene virus que expresa OX40L y CD40L revestido con proteínas NY-ESO-1 y MAGE-A3) puede detener el crecimiento tumoral en un modelo de melanoma de ratón humanizado incluso si el tratamiento se inicia para tumores grandes y bien establecidos. Diseño experimental: se implantaron 2 x 106 células SK-MEL-2 por vía subcutánea (un tumor por animal) en el costado de ratones inmunodeficientes NOD/Shi-scid/IL-2RYnulo el día 1. El día 13, se inyectaron 5 x l 06 PBMC por vía intravenosa. El día 16, se inyectaron 5x104 células dendríticas plasmocitoides y mieloides por vía intratumoral. Los tratamientos de PeptiCRAd intratumoral a una dosis de 1 x 109 VP se administraron los días 16, 17, 18 (cebado), y el día 25 (refuerzo). La primera dosis de PeptiCRad se administró inmediatamente después de inyección de DC. Se siguió el crecimiento tumoral. Los animales se sacrificaron el día 32. PeptiCRAd = Ad5/3-D24-OX40L-CD40L, adenovirus oncolítico con deleción de 24 pb en E1A, una cápside quimérica de 5/3 y transgenes CD40L y OX40L expresados a partir del locus de 14.7K, revestidos con péptidos NY-eSo -1 y MAGE-A3; OX40L PeptiCRAd = Ad5/3-D24-OX40L, adenovirus oncolítico con deleción de 24 pb en E1A, una cápside quimérica de 5/3 y transgén OX40L expresado a partir del locus de 14.7K, revestido con péptidos NY-ESO-1 y MAGE-A3. Figura 10. Muestra que OX40L(solo)-PeptiCRAd aumentó el número de linfocitos T CD8+ específicos de MAGE-A3 en sangre periférica en comparación con animales tratados de forma simulada. Dos animales tratados con PeptiCRAd también mostraron mayor número de linfocitos T CD8+ específicos de MAGE-A3 en sangre. Se evaluaron linfocitos T anti-MAGE-A3 por citometría de flujo (análisis pentamérico) al final del estudio de crecimiento tumoral mencionado anteriormente el día 32.
Descripción específica
Materiales y métodos:
Creación de un adenovirus oncolítico que tiene una deleción génica de E1A de nucleótidos que codifican aminoácidos 923-946
La deleción de 24 pares de bases se introdujo en la secuencia de cadena principal de Ad5 usando un plásmido lanzadera dirigido a la región de E1A, método de clonación descrito en Kanerva et al., la deleción descrita primero en Fueyo et al.
Creación de un adenovirus oncolítico que tiene una sustitución quimérica 5/3 de una proteína de fibra adenoviral La protuberancia de serotipo 5 se reemplazó con la protuberancia de serotipo 3 usando un plásmido lanzadera con una región de fibra modificada para introducir la secuencia mediante recombinación homóloga en la cadena principal viral. Los métodos de clonación específicos se describen en Kanerva et al.
Creación de un adenovirus oncolítico que tiene una deleción génica de 14.7k de pares de bases 30448-30834 con respecto al adenovirus de tipo natural y en donde la secuencia GGA GGA GAT GAC TGA (SEQ ID NO: 1) está sustituida por GGA GGA GAC GAC t Ga (SEQ ID NO: 2) y creación de un adenovirus oncolítico que tiene una deleción génica de gp19ky una deleción génica de 7.1k de pares de bases 28541-29211 con respecto al adenovirus de tipo natural.
La deleción de 14.7K y la sustitución de GGA GGA GAJ GAC TGA (SEQ ID NO: 1) por GGA GGA GAC GAC TGA (SEQ ID NO: 2) (con la inserción del transgén OX40L en el lugar de 14.7K) y la deleción de genes gp19k/7.1k se introdujeron en un plásmido lanzadera (pShuttle-OX40L) por síntesis química. Basándose en una secuencia virtual diseñada en el programa Vector NTI, se diseñaron oligonucleótidos solapantes en GeneArt (Thermo Fisher Scientific), que comprendían conjuntamente la secuencia completa. La síntesis oligonucleotídica se consiguió por síntesis en fase sólida aplicando vidrio de poro controlado como material sólido. A continuación, los oligonucleótidos se liberaron a una fase líquida y se ensamblaron usando PCR en una estación de ensamblaje totalmente automatizada. La secuencia clonada por vía sintética se introdujo en un vector de clonación pMX, y se verificó por secuenciación.
Clonación de OX40L y CD40L en pAD5/3-D24 para obtener pAd5/3-D24-OX40L/F2A/CD40L y pAd5/3-D24-OX40L/P2A/CD40L
Para crear virus que contienen los genes OX40L y CD40L y uno del sitio de procesamiento 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A) o sitio de procesamiento 2A del tescovirus porcino-1 (P2A) insertado entre los transgenes para procesamiento de traducción conjunta, se amplificaron 3 fragmentos para cada constructo por PCR.
Para constructos que contienen F2A, se amplificaron el fragmento 1 que contiene secuencia de OX40L y una parte del sitio de procesamiento F2A a partir de pShuttle-OX40L usando cebadores Gibson OX40L y F2A inverso OX40L (véase el listado de todos los cebadores usados en la tabla 1), se amplificaron el fragmento 2 que contiene una parte del sitio de procesamiento F2A y la secuencia completa de CD40L a partir de pShuttle-CD40L usando los cebadores F2A directo CD40L y F2A inverso CD40L.
Para constructos que contienen P2A, se amplificaron el fragmento 1 que contiene secuencia de OX40L y una parte del sitio de procesamiento P2A a partir de pShuttle-OX40L usando los cebadores Gibson OX40L y P2A inverso OX40L (véase el listado de todos los cebadores usados en la tabla 1), se amplificaron el fragmento 2 que contiene una parte del sitio de procesamiento de P2A y la secuencia completa de CD40L a partir de pShuttle-CD40L usando los cebadores P2A directo CD40L y P2A inverso CD40L.
Para constructos F2A y P2A, se amplificó el fragmento 3 que contiene secuencia genómica de adenovirus flanqueando el extremo 3' de CD40L a partir de pShuttle-OX40L usando los cebadores F2A directo extremo Adeno sin inserción y Gibson OX40L REV. Todas las reacciones de PCR se realizaron con ADN polimerasa Phusion High-Fidelity (Thermo Fisher, F530) de acuerdo con las instrucciones del fabricante seguido por tratamiento con Dpnl (NEB, R0176). Las reacciones se purificaron con Gel NucleoSpin® y kit de limpieza de pCr (MACHEREY-NAg El , 740609.50). A continuación, los fragmentos purificados se ensamblaron conjuntamente creando fragmentos GA-OX40L/F2A/CD40L y GA-OX40L/P2A/CD40L usando mezcla maestra de ensamblaje de Gibson (NEB, E2611) seguido por amplificación de PCR del fragmento ensamblado usando los cebadores Gibson OX40L DIR. y Gibson OX40L iNv . (véase la figura 1 para análisis en gel de agarosa de los fragmentos finales).
Para ensamblar GA-OX40L/F2A/CD40L o GA-OX40L/P2A/CD40L en la cadena principal viral, se digirió pAd5/3-D24 con Srfl (NEB, R0629L) y Barl (SibEnzyme®, E548) seguido por precipitación en etanol. La cadena principal viral pAd5/3-D24 digerida se ensambló con fragmentos de GA-OX40L/F2A/CD40L o de GA-OX40L/P2A/CD40L usando mezcla maestra de ensamblaje de Gibson (NEB, E2611) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para generar pAd5/3-D24-OX40L/F2A/CD40L y pAd5/3-D24-OX40L/P2A/CD40L. Las reacciones de ensamblaje de Gibson se transformaron en E. coli competente para 5-alfa NEB® (NEB, C2987H) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las colonias positivas se cribaron por PCR y los sucesos de recombinación correctos se confirmaron adicionalmente por secuenciación de los constructos.
Clonación de CD40L y OX40L en pAD5/3-D24 para obtener pAd5/3-D24-CD40L-OX40L
Para crear un fragmento que incluya CD40L (CD40L-GA) a clonar en la cadena principal viral de pAd5/3-D24 por reacción de recombinación homologa específica (nombre de marca Gibson Assembly, New England Biolabs), en primer lugar se ensamblaron tres productos de PCR conjuntamente con reacción de recombinación de ensamblaje de Gibson. Los fragmentos fusionados conjuntamente contenían las siguientes secuencias: Fragmento A que
corresponde a nucleótidos 21376 a 22114 del plásmido pAd5/3-D24. Fragmento B que corresponde a nucleótidos 999 a 2623 del plásmido pShuttle-CD40L. Fragmento C que corresponde a nucleótidos 22820-27107 del plásmido pAd5/3-D24 (véase la tabla 1b-3b para el listado de cebadores y secuencias de cebador usados). Se realizaron reacciones de PCR con ADN polimerasa Phusion High-Fidelity (Thermo Fisher, F530) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las reacciones se purificaron con Gel NucleoSpin® y kit de limpieza de PCR (MACHEREY-NAGEL, 740609.50). A continuación, para crear CD40L-GA, los fragmentos de PCR purificados se ensamblaron conjuntamente por reacción de recombinación de ensamblaje de Gibson de acuerdo con las instrucciones del fabricante (mezcla maestra de ensamblaje de Gibson, NEB E2611). Después de recombinación homóloga, el fragmento de CD40L-GA recién creado se amplificó adicionalmente por PCR usando los cebadores AA y DD (para las secuencias de cebador, véanse las tablas 1b y 3b) usando ADN polimerasa Phusion High-Fidelity de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El CD40L-GA amplificado por PCR se purificó en gel usando Gel NucleoSpin® y kit de limpieza de PCR. Para clonar CD40L-GA en la cadena principal viral, se digirió pAd5/3-D24 con Spel (n Eb , R0133S) y AsiSI (NEB, R0630S) seguido por precipitación en etanol. La cadena principal viral pAd5/3-D24 digerida se ensambló con fragmento de CD40L-GA usando mezcla maestra de ensamblaje de Gibson (NEB, E2611) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para generar pAd5/3-D24-CD40L. La reacción de ensamblaje de Gibson se transformó en E. coli competente para 5-alfa NEB® (NEB, C2987H) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las colonias positivas se cribaron por PCR y la recombinación correcta se confirmó adicionalmente por secuenciación de los constructos. Para crear el constructo final, es decir, virus que contiene genes CD40L y OX40L, se amplificó un fragmento que incluía OX40L (OX40L-GA) usando los siguientes cebadores: Gibson OX40L DIR. y Gibson OX40L INV. (que amplifican la región en pShuttle-OX40L que corresponde a nucleótidos 11 a 3287), véase la tabla 4b para secuencias de cebador. La reacción de PCR se realizó con ADN polimerasa Phusion High-Fidelity (Thermo Fisher, F530) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las reacciones se purificaron con Gel NucleoSpin® y kit de limpieza de PCR (MACHEREY-NAGEL, 740609.50). Para clonar OX40L-GA en la cadena principal viral, se digirió pAd5/3-D24-CD40L con Srfl (NEB, R0629L) y Barl (SibEnzyme®, E548) seguido por precipitación en etanol. La cadena principal viral pAd5/3-D24-CD40L digerida se ensambló con el fragmento OX40L-GA usando mezcla maestra de ensamblaje de Gibson (NEB, E2611) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para generar pAd5/3-D24-CD40L-OX40L. La reacción de ensamblaje de Gibson se transformó en E. coli competente para 5-alfa n Eb® (NEB, C2987H) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las colonias positivas se cribaron por PCR y la recombinación correcta se confirmó adicionalmente por secuenciación de los constructos.
Métodos para ensayo in vitro del adenovirus modificado con un transgén o con dos transgenes
Análisis de citometría de flujo para determinar la interacción de OX40L/OX40
Se realizó un análisis de citometría de flujo para verificar que el OX40L expresado a partir de los virus puede unirse a su receptor nativo, OX40 (Figura 2). Se sembraron células A549 humanas en una placa de 6 pocillos y se infectaron con los virus de transgén doble (Ad5/3-D24-OX40L-CD40L.C1 y Ad5/3-D24-OX40L-CD40L.C3, denominados OX40L/CD40L.C1 y OX40L/CD40L.C3), el virus con OX40L solo (Ad5/3-D24-OX40L, denominado virus-OX40L en las figuras) o un virus sin transgenes (Ad5/3-D24, denominado virus-cont.) con una multiplicidad de infección de 10 (es decir, 10 virus por célula).
Las células se recogieron 72 horas después de la infección, se hizo su recuento, y se sembraron 3 x 105 células por pocillo en una placa de 96 pocillos por duplicado. La placa se centrifugó a 400 g durante 5 minutos y se resuspendió en PBS. Esta etapa se repitió dos veces, y a continuación las células se suspendieron en una mezcla de anticuerpo de receptor de OX40 y anticuerpo anti-conejo de cabra Alexa fluor 488, se incubaron durante 30 minutos, se lavaron 3 veces y a continuación se desarrollaron en un citómetro de flujo BD Accuri para detectar la media geométrica de las células del complejo OX40L/OX40. Los datos se analizaron con el software FlowJo.
ELISA sándwich para verificar la interacción de OX40L/OX40
Para verificar además que el OX40L expresado a partir de los virus puede unirse a su receptor nativo, OX40, se realizó un Elisa sándwich funcional (Figura 3). Una placa de 96 pocillos se revistió con 2 ug/ml de receptor de OX40 en su forma nativa durante la noche y posteriormente se lavó 3 veces con Tween 20 al 0,05 % v/v en PBS. El sobrenadante de las células A549 infectadas con virus se añadió a los pocillos y la placa se incubó a 37 °C durante 1 hora, y posteriormente se lavó de nuevo 3 veces. Los pocillos se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo anti-OX40L humano de ratón (dilución 1:1000 en PBS), se lavaron 3 veces, y se incubaron con un conjugado anti-ratón-HRP (dilución 1:1000 en PBS) durante 1 hora. Después de lavar las placas 3 veces, se añadieron 90 pl de sustrato de TMB y la placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos. La HRP conjugada con el anticuerpo anti-ratón reacciona con el sustrato de TMB colorimétricamente, y se midió la intensidad del color a 450 nm espectrofotométricamente.
Ensayo de funcionalidad con OX40/NF-kB-línea celular recombinante HEK293
Para verificar que el OX40L producido por los virus (los virus de transgén único o los virus de transgén doble) es funcional y puede activar las señales corriente abajo cuando se une a su receptor, OX40, se realizó un ensayo de funcionalidad usando la línea 293 de células de riñón embrionario humano (HEK-293) que expresa OX40 de forma
constitutiva (Figura 4).
El producto de OX40L se produce en el medio de cultivo de un cultivo celular A549 infectado con un virus que expresa el gen OX40L. Se recoge el medio y se añade a un cultivo de indicador de OX40/NF-KB-células HEK293 que expresan de forma constitutiva el receptor OX40. La unión de OX40L al receptor de OX40 desencadena una ruta de señalización intracelular que, mediante la activación de NF-kB, conduce a la expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga. La actividad de luciferasa se mide usando el sistema de ensayo de luciferasa ONE-step y un luminómetro para determinar la bioluminiscencia relativa de una concentración conocida de patrón OX40L. A continuación, puede analizarse la concentración de OX40L de la muestra de virus basándose en las lecturas de luminiscencia y la curva patrón. Antes de poder determinar la concentración de OX40L, debe definirse una curva patrón para OX40L usando concentraciones conocidas de OX40L humano recombinante.
En resumen, se sembraron 1,5 x 104 células A549 en una placa de 96 pocillos en DMEM al 10 %. Al día siguiente, las células A549 se infectaron con una multiplicidad de infección de 10, es decir, 10 virus por célula, con el virus de transgén único (Ad5/3-D24-OX40L, denominado virus-OX40L en las figuras), los virus de transgén doble (Ad5/3-D24-OX40L-CD40L.C1 y Ad5/3-D24-OX40L-CD40L.C3, denominados OX40L/CD40L.C1 y OX40L/CD40L.C3) o un virus sin transgén (Ad5/3-D24, denominado virus-cont.) en DMEM al 2 %.
Algunos pocillos se dejaron sin infectar para usarlos como control negativo. Se centrifugaron las células a 500 g durante 5 minutos, 72 horas después de la infección, se desechó el medio y se añadieron 2 x 105 células OX40/NF-kB-HEK293 en 100 ul de MEM al 10 % sobre las células A549. Después de centrifugar a 400 g durante 1 minuto, las células se incubaron a 37 °C durante 6 horas antes de someter a lisis con un tampón de lisis y añadir 20 ul de cada lisado en una placa transparente de 96 pocillos. Después de añadir 100 ul del reactivo de luciferasa como sustrato, se leyó inmediatamente la luminiscencia en un luminómetro.
Ensayo de funcionalidad para el producto de transgén de CD40L
Para verificar que la proteína CD40L expresada a partir de los virus de transgén doble puede unirse a su receptor nativo CD40 y activar las señales de corriente abajo en las células que expresan CD40, se realizó un ensayo de funcionalidad basado en células Ramos Blue (Figura 5).
Ramos Blue es una línea celular de linfocitos B que expresa de forma estable un gen indicador de SEAP (fosfatasa alcalina embrionaria secretada) inducible por NF-kB. El producto de CD40L se produce en el medio de cultivo de un cultivo celular infectado con un virus PeptiCRAd que expresa el gen de CD40L. El medio se recoge y se añade a un cultivo de células Ramos Blue que expresan constitutivamente el receptor CD40. La unión de CD40L a CD40 desencadena una ruta de señalización intracelular que conduce a la secreción de SEAP que convierte un sustrato en azul y que puede medirse espectrofotométricamente a 620-655 nm. La concentración relativa del CD40L funcional se determina usando una curva patrón para CD40L humano recombinante.
En resumen, se sembraron células A549 humanas en una placa de 6 pocillos y se infectaron con los virus de transgén doble (OX40L/CD40L.C1 o OX40L/CD40L.C3), el virus solo con OX40L (virus-OX40L) como transgén o un virus sin transgenes (virus-Cont.) con una multiplicidad de infección de 10. El sobrenadante se recogió 72 horas después y se retiró cualquier célula y residuo celular por centrifugación a 500 g durante 5 minutos. Se preparó una serie de diluciones 2 veces a partir de los sobrenadantes y de la proteína CD40L recombinante con una concentración inicial de 100 ug/ml. Se añadieron 100 pl de cada sobrenadante a 4 x 105 células Ramos Blue en una placa de 96 pocillos (sembrado en placas en 100 pl) y la placa se incubó a 37 °C durante 18 horas. Después de incubación, las células sedimentaron por centrifugación a 400 g durante 5 minutos y se añadieron 40 pl del sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos. Se añadieron 160 pl del sustrato QUANTI-Blue, se incubó la placa durante 1 hora y el nivel de SEAP se determinó espectrofotométricamente.
Métodos para ensayo in vivo del adenovirus modificado con y sin revestimiento de antígeno peptídico
Se humanizaron ratones inmunodeficientes NOD/Shi-scid/IL-2RYnulo usando células madre hematopoyéticas (CD34+, HLA-B35+) aisladas de sangre de cordón umbilical humano. Se implantaron tumores de melanoma humano A375 por vía subcutánea (2x106 células por 100 ul) y los animales se distribuyeron aleatoriamente en grupos basándose en la tasa de humanización y el tamaño tumoral. Los animales se trataron con virus oncolítico sin revestimiento peptídico (VALO-C1) o virus oncolítico con revestimiento de antígeno peptídico (PeptiCRAd) (dosis de virus 1 x 108 para ambos grupos; también se sometió a ensayo una dosis subóptima de 1 x 107 para PeptiCRAd). Las vacunas peptídicas (0,12 o 30 ug) se administraron por vía intradérmica con Poli-IC como adyuvante.
Los tratamientos comenzaron 25 días después de la aleatorización (D0) con una dosis en bolo de ciclofosfamida (1 mg/ratón i.v.). Los tratamientos se administraron por vía intratumoral (simulado, virus y PeptiCRAd) o por vía intradérmica (control peptídico) los días 1, 2, 3 y 12. Se implantaron tumores secundarios en el costado contralateral dos días después del tercer tratamiento (día 5). No se administraron tratamientos para tumores secundarios.
Se analizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos CD8+ infiltrantes tumorales (TIL) para
detectar antígeno peptídico NY-ESO-1 y linfocitos T CD8+ específicos de MAGE por citometría de flujo con análisis dextramérico. Se evaluaron diferentes subconjuntos de células inmunitarias entre PBMC y TIL. El análisis de citometría de flujo se realizó en el citómetro de flujo Attune NxT (Life Technologies).
Inmunización de modelo de ratón de PBMC
Se injertaron 2.106 células tumorales SKMEL-2 (HLA-B35+) en el costado derecho (Día 0) a 35 ratones inmunodeficientes (NCG) NOD-Prkdcem26Cd52/IL-2RYem26Cd22/NjuCrl de ocho semanas de edad. El día 13, se inyectaron por vía intravenosa 5x106 células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) HLA-B35+ de dos donantes diferentes. Se iniciaron tratamientos intratumorales con cápside 5/3 formando complejo con NYESO-1 y MAGE-A3 y que contenía virus que expresa OX40L ("OX40L PeptiCRAd") o una cápside 5/3 formando complejo con NYESO-1 y MAGE-A3 que contenía virus que expresa OX40L y CD40L ("PeptiCRAd") el Día 16 con una dosis viral de 1 x 109 VP formando complejo con cada péptido. Simultáneamente con el primer tratamiento con PeptiCRAd, se inyectaron por vía intratumoral 50.000 células dendríticas plasmocitoides y mieloides autólogas. Los días 17 y 18 (cebado con el primer tratamiento) y 25 (refuerzo), los tumores se trataron con inyecciones intratumorales de PeptiCRAd sin adición de células dendríticas. El esquema de tratamiento se presenta en la figura 10. Se siguió el crecimiento tumoral. Los animales se sacrificaron el día 32. OX40L-PeptiCRAd y PeptiCRad contienen una deleción de 24 pb en E1A, una región de gp19k/7.1K eliminada por deleción, un transgén OX40L humano expresado a partir del locus de 14.7K y una fibra quimérica 5/3.
Resultados
Funcionalidad del OX40L expresado a partir de los virus
El análisis de citometría de flujo, así como el ELISA sándwich, indican que el producto de transgén OX40L expresado de los virus en la superficie celular de la célula infectada, así como desprendido en cierta medida de la superficie celular, puede unirse a su receptor OX40 (Figuras 2 y 3, respectivamente). Lo que es más importante, al analizar la funcionalidad del OX40L expresado a partir de los virus, se observó una clara activación del gen corriente abajo al utilizar células HEK-293 que expresan de manera estable el receptor OX40 (Figura 4). La unión de OX40L a OX40 desencadena una ruta de señalización intracelular en estas células que, mediante activación de NF-kB, conduce a la expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga. Los niveles de bioluminiscencia obtenidos al usar células A549 infectadas con virus que expresan OX40L indican claramente que la proteína OX40L es funcional y activa la señalización corriente abajo cuando se une a OX40, en comparación con los niveles de bioluminiscencia obtenidos usando un virus sin transgén o controles celulares negativos.
Funcionalidad del CD40L expresado a partir de los virus que expresan OX40L/CD40L
Se observó una clara activación del gen corriente abajo al analizar la funcionalidad de CD40L utilizando células Ramos Blue que expresan de manera estable el receptor CD40 (Figura 5). La unión de CD40L a CD40 desencadena una ruta de señalización intracelular en estas células que, mediante la activación de NF-kB, conduce a la expresión del gen de SEAP. Los niveles de absorbancia obtenidos al usar las células A549 infectadas con virus que expresan CD40L indican claramente que la proteína CD40L es funcional y activa la señalización corriente abajo cuando se une a CD40, en comparación con los niveles de absorbancia obtenidos al usar virus sin CD40L como transgén o controles celulares negativos.
El virus oncolítico modificado con y sin antígeno superficial peptídico provoca una respuesta inmunitaria específica de péptido en un modelo de ratón humanizado
Todos los tratamientos activos (péptido solo, virus sin péptido [VALO-C1] y virus con péptido [PeptiCRAd]) aumentaron el número de células inmunitarias en tumores primarios en comparación con los animales tratados de forma simulada. Los animales tratados con VALO-C1 y PeptiCRAd-1 mostraron más linfocitos T (CD3, CD4, CD8) en tumores primarios en comparación con la vacuna peptídica o animales tratados de forma simulada después del tratamiento, mientras que el número total de células inmunitarias infiltrantes (CD45) fue similar en todos los grupos (Figuras 6 y 7, respectivamente).
Además, el número de linfocitos T reguladores (CD3+/CD4+/FoxP3+) fue menor en tumores primarios tratados con VALO-C1 y PeptiCRAd-1 en comparación con tumores primarios de animales tratados con vacuna peptídica o de forma simulada (Figura 8). Esto sugiere que el adenovirus inmunogénico administrado por vía intratumoral (virus VALO-C1 desnudo o PeptiCRAd-1) modula el microentorno tumoral al reducir la inmunosupresión local.
El adenovirus oncolítico con (PeptiCRAd) o sin (VALO-C1) antígeno peptídico es superior a la vacunación peptídica estándar para desencadenar respuestas sistémicas de linfocitos T c D8+ dirigidas a tumores e infiltración de TIL CD8+ en tumores distantes no tratados. Los datos sugieren que PeptiCRAd mejora la especificidad de fijación como diana tumoral de un virus oncolítico estándar.
PeptiCRAd provoca respuesta inmunitaria específica peptídica en un modelo de ratón de PBMC
Los tratamientos con PeptiCRAd formando complejo con NY-ESO-1 y MAGE-A3 dieron como resultado detención del crecimiento tumoral en un modelo de melanoma de ratón humanizado incluso cuando el tratamiento se inició para tumores grandes y bien establecidos (Figura 9). Los ratones tratados con OX40L-PeptiCRAd mostraron significativamente más linfocitos T CD8+ específicos de MAGE-A3 entre todos los linfocitos T CD8+ de las PBMC que los ratones tratados de forma simulada, lo que indica que el tratamiento con PeptiCRAd pudo provocar una respuesta específica peptídica en ratones humanizados (Figura 10).
Referencias
Kanerva et al. 2003 Mol Ther 12:449-458.
Fueyo et al. 2000. Oncogene 19:2-12.
T l 1. r r fr m n A P R n A D24 m ml .
T l 2. r r fr m n B P R n h l- D4 L m ml .
T l . r r fr m n P R n A -D24 m ml .
Claims (17)
1. Un adenovirus de tipo natural replicante modificado de serotipo 5 que tiene actividad lítica en células cancerosas diana que comprende:
a) una deleción génica de E1A en donde la deleción es de pares de bases 923-946;
b) una sustitución quimérica 5/3 de una protuberancia de una proteína de fibra adenoviral en donde la protuberancia de Ad de serotipo 5 está reemplazada por la protuberancia de un Ad de serotipo 3;
c) una deleción génica de 14.7k en donde la deleción es de pares de bases 30446-30460 con respecto al adenovirus de tipo natural y en donde la secuencia GGA GGA GAT GAC TGA eliminada por deleción está sustituida por g Ga GGA GAC GAC TGA; y
d) una deleción génica de gp19k y una deleción génica de 7.1k en donde las deleciones son de pares de bases 28541-29211 con respecto al adenovirus de tipo natural.
2. El adenovirus modificado de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicho adenovirus está modificado además por la inserción de una molécula que codifica OX40L.
3. El adenovirus modificado de acuerdo con la reivindicación 2 en donde dicho OX40L es OX40L humano.
4. El adenovirus modificado de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3 en donde dicho OX40L está insertado en la región E3B, reemplazando la deleción génica de 14.7K.
5. El adenovirus modificado de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en donde dicho adenovirus está modificado por la inserción de una molécula que codifica CD40L.
6. El adenovirus modificado de acuerdo con la reivindicación 5 en donde dicho CD40L es CD40L humano.
7. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-6 en donde dicha molécula de CD40L está insertada inmediatamente corriente abajo de OX40L usando un sitio de procesamiento 2A.
8. El adenovirus modificado de acuerdo con la reivindicación 7 en donde el sitio de procesamiento 2A está insertado entre los dos transgenes y el sitio de procesamiento 2A está precedido por un sitio de escisión y un conector SGSG para asegurar una escisión eficaz de los transgenes.
9. El adenovirus modificado de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 en donde dicho sitio de procesamiento 2A es un sitio de procesamiento 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A) o un sitio de procesamiento 2A del tescovirus porcino-1.
10. El adenovirus modificado de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6 en donde dicha molécula de CD40L está insertada en la región tardía del virus, específicamente en la región tardía 3 (L3).
11. El adenovirus modificado de acuerdo con la reivindicación 10 en donde dicha molécula de CD40L está insertada corriente abajo del gen 23K que precede a su sitio de poliadenilación.
12. El adenovirus modificado de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11 en donde un sitio aceptor de corte y empalme y/o una secuencia Kozak están provistos o insertados corriente arriba de la molécula de CD40L.
13. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-12 en donde una molécula que codifica el ADNc completo de al menos uno o cada uno de OX40L y CD40L está insertada en dicho adenovirus.
14. Una composición farmacéutica que comprende al menos un adenovirus competente para replicación modificado y lítico de células diana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y un vehículo adecuado.
15. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 en donde dicha composición está formulada para inyección intratumoral, intramuscular, intraarterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intradérmica, intracavitaria o peritoneal, o para una administración oral.
16. Un adenovirus competente para replicación modificado y lítico de células diana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 14-15 para uso en el tratamiento de cáncer.
17. El adenonovirus o composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 16 en donde dicho cáncer se selecciona entre el listado que comprende o que consiste en: cáncer nasofaríngeo, cáncer sinovial, cáncer hepatocelular, cáncer renal, cáncer de tejidos conjuntivos, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer cerebral, cáncer de garganta, cáncer oral, cáncer de hígado, cáncer óseo, cáncer pancreático, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de linfocitos
T, neuroma, enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-ENison, cáncer suprarrenal, cáncer anal, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de uréter, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor de médula espinal, osteocondroma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, cáncer de sitio primario desconocido, carcinoide, carcinoide de tracto gastrointestinal, fibrosarcoma, cáncer de mama, enfermedad de Paget, cáncer cervicouterino, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de cabeza, cáncer ocular, cáncer de cuello, cáncer de riñón, tumor de Wilms, cáncer de hígado, sarcoma de Kaposi, cáncer de próstata, cáncer testicular, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer pancreático endocrino, glucagonoma, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer de pituitaria, sarcoma de tejidos blandos, retinoblastoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer trofoblástico, mola hidatídica, cáncer uterino, cáncer endometrial, cáncer de vagina, cáncer de vulva, neuroma del acústico, micosis fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, cáncer de encías, cáncer de corazón, cáncer de labios, cáncer de meninges, cáncer de boca, cáncer de nervios, cáncer de paladar, cáncer de glándula paratiroides, cáncer de peritoneo, cáncer de faringe, cáncer pleural, cáncer de glándulas salivales, cáncer de lengua y cáncer de amígdalas.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB1804473.5A GB201804473D0 (en) | 2018-03-21 | 2018-03-21 | Modified oncolytic adenoviruses |
| GBGB1814867.6A GB201814867D0 (en) | 2018-03-21 | 2018-09-13 | Modified Oncolytic Adenoviruses |
| PCT/EP2019/056768 WO2019179977A1 (en) | 2018-03-21 | 2019-03-19 | Modified oncolytic adenoviruses |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2935745T3 true ES2935745T3 (es) | 2023-03-09 |
Family
ID=62017873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES19712178T Active ES2935745T3 (es) | 2018-03-21 | 2019-03-19 | Adenovirus oncolíticos modificados |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210017501A1 (es) |
| EP (1) | EP3768305B1 (es) |
| JP (1) | JP7417533B2 (es) |
| KR (1) | KR20200135811A (es) |
| CN (1) | CN112118864B (es) |
| AU (1) | AU2019239033A1 (es) |
| BR (1) | BR112020019303A2 (es) |
| CA (1) | CA3094131A1 (es) |
| DK (1) | DK3768305T5 (es) |
| ES (1) | ES2935745T3 (es) |
| FI (1) | FI3768305T3 (es) |
| GB (2) | GB201804473D0 (es) |
| WO (1) | WO2019179977A1 (es) |
| ZA (1) | ZA202005848B (es) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6576326B2 (ja) | 2013-03-14 | 2019-09-18 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | 腫瘍溶解性アデノウイルス組成物 |
| AU2017223589B2 (en) | 2016-02-23 | 2023-08-03 | Salk Institute For Biological Studies | Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics |
| CA3013637A1 (en) | 2016-02-23 | 2017-08-31 | Salk Institute For Biological Studies | High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics |
| WO2018111767A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Salk Institute For Biological Studies | Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof |
| GB201804468D0 (en) * | 2018-03-21 | 2018-05-02 | Valo Therapeutics Oy | PeptiCRAd Cancer Therapy |
| CN113699122B (zh) * | 2021-08-31 | 2023-10-20 | 中国科学院大学宁波华美医院 | 一种多基因融合溶瘤腺病毒及其构建方法和应用 |
| EP4404947A1 (en) | 2021-09-23 | 2024-07-31 | Sagittarius Bio, Inc. | Adenoviruses and methods for using adenoviruses |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6204052B1 (en) * | 1994-08-16 | 2001-03-20 | Introgene B.V. | Adenoviral vectors with reduced TNF response and partial E3 region deletion |
| US7829329B2 (en) * | 1998-04-24 | 2010-11-09 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Adenoviral vectors for treating disease |
| JP2003501097A (ja) | 1999-06-07 | 2003-01-14 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア | アデノウイルスｅ３／６．７ｋによるアポトーシスの阻害 |
| AU781775B2 (en) * | 1999-07-02 | 2005-06-09 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Adenoviral vectors for treating disease |
| DK2350269T3 (en) * | 2008-10-31 | 2015-12-07 | Univ Pennsylvania | ABE ADENOVIRUS WITH SADV-46 HEXONCAPSIDE PROTEINS AND APPLICATIONS THEREOF |
| CA2748180C (en) * | 2008-12-22 | 2017-06-20 | Oncos Therapeutics Oy | Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto |
| IN2012DN01827A (es) * | 2009-07-31 | 2015-06-05 | Paxvax Inc | |
| WO2012038607A1 (en) * | 2010-09-24 | 2012-03-29 | Oncos Therapeutics Oy | Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto |
| CN105307671B (zh) * | 2013-04-18 | 2020-09-04 | 蒂尔坦生物制药有限公司 | 增强过继细胞疗法 |
| ES2714921T3 (es) * | 2014-05-19 | 2019-05-30 | Valo Therapeutics Oy | Adenovirus oncolíticos recubiertos para vacunas contra el cáncer |
| TWI636271B (zh) * | 2014-11-20 | 2018-09-21 | 力智電子股份有限公司 | 電池模組的電量量測裝置及方法 |
| JP7038065B2 (ja) | 2016-01-08 | 2022-03-17 | レプリミュン リミテッド | 腫瘍溶解性ウイルス株 |
| US11090344B2 (en) * | 2016-05-27 | 2021-08-17 | Dnatrix, Inc. | Adenovirus and immunomodulator combination therapy |
| SI3293201T1 (sl) * | 2016-09-12 | 2021-03-31 | Targovax Oy | Kombinacija zaviralcev adenovirusa in zaviralcev kontrolnih točk za zdravljenje raka |
| US10232053B2 (en) * | 2016-12-30 | 2019-03-19 | Trieza Therapeutics, Inc. | Immunomodulatory oncolytic adenoviral vectors, and methods of production and use thereof for treatment of cancer |
| GB201804468D0 (en) * | 2018-03-21 | 2018-05-02 | Valo Therapeutics Oy | PeptiCRAd Cancer Therapy |
-
2018
- 2018-03-21 GB GBGB1804473.5A patent/GB201804473D0/en not_active Ceased
- 2018-09-13 GB GBGB1814867.6A patent/GB201814867D0/en not_active Ceased
-
2019
- 2019-03-19 AU AU2019239033A patent/AU2019239033A1/en active Pending
- 2019-03-19 KR KR1020207029697A patent/KR20200135811A/ko not_active Application Discontinuation
- 2019-03-19 FI FIEP19712178.3T patent/FI3768305T3/fi active
- 2019-03-19 US US17/040,017 patent/US20210017501A1/en active Pending
- 2019-03-19 DK DK19712178.3T patent/DK3768305T5/da active
- 2019-03-19 EP EP19712178.3A patent/EP3768305B1/en active Active
- 2019-03-19 JP JP2020550115A patent/JP7417533B2/ja active Active
- 2019-03-19 CN CN201980032730.0A patent/CN112118864B/zh active Active
- 2019-03-19 ES ES19712178T patent/ES2935745T3/es active Active
- 2019-03-19 BR BR112020019303-8A patent/BR112020019303A2/pt unknown
- 2019-03-19 WO PCT/EP2019/056768 patent/WO2019179977A1/en unknown
- 2019-03-19 CA CA3094131A patent/CA3094131A1/en active Pending
-
2020
- 2020-09-21 ZA ZA2020/05848A patent/ZA202005848B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112118864A (zh) | 2020-12-22 |
| DK3768305T5 (da) | 2024-08-19 |
| GB201804473D0 (en) | 2018-05-02 |
| EP3768305A1 (en) | 2021-01-27 |
| WO2019179977A1 (en) | 2019-09-26 |
| US20210017501A1 (en) | 2021-01-21 |
| CN112118864B (zh) | 2024-06-25 |
| EP3768305B1 (en) | 2022-11-30 |
| CA3094131A1 (en) | 2019-09-26 |
| DK3768305T3 (da) | 2023-01-23 |
| JP7417533B2 (ja) | 2024-01-18 |
| AU2019239033A1 (en) | 2020-10-08 |
| KR20200135811A (ko) | 2020-12-03 |
| RU2020131337A (ru) | 2022-04-28 |
| GB201814867D0 (en) | 2018-10-31 |
| FI3768305T3 (fi) | 2023-01-31 |
| BR112020019303A2 (pt) | 2021-01-05 |
| ZA202005848B (en) | 2022-01-26 |
| JP2021518126A (ja) | 2021-08-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2935745T3 (es) | Adenovirus oncolíticos modificados | |
| US20210338753A1 (en) | Oncolytic adenovirus encoding a b7 protein | |
| CN108018299B (zh) | 靶向bcma的嵌合抗原受体及其用途 | |
| US10280425B2 (en) | Minicircle DNA recombinant parental plasmid having genetically engineered antibody gene expression cassette, a minicircle DNA having the expression cassette, and applications | |
| US20180369304A1 (en) | Virus encoding an anti-tcr-complex antibody or fragment | |
| CN108004259B (zh) | 靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其用途 | |
| JP2022508942A (ja) | 変異ワクシニア・ウイルスおよびその使用 | |
| JP2021536435A (ja) | 核酸とｃａｒ修飾免疫細胞とを含む治療薬およびその使用 | |
| KR20200135987A (ko) | 암 치료요법 | |
| CN113416260B (zh) | 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 | |
| WO2019129124A1 (zh) | 包含CD40抗体与muc1特异性嵌合抗原受体基因的T细胞及其用途 | |
| US20240092852A1 (en) | Multi-armed myxoma virus | |
| WO2019129173A1 (zh) | 共表达cd40抗体与间皮素特异性嵌合抗原受体的t细胞及其用途 | |
| WO2019128996A1 (zh) | 自表达cd47抗体的间皮素特异性car-t细胞及其用途 | |
| RU2788638C9 (ru) | Модифицированные онколитические аденовирусы | |
| RU2788638C2 (ru) | Модифицированные онколитические аденовирусы | |
| CN109824782B (zh) | 抗cd19抗体和muc1抗原肽的偶联物及其应用 | |
| WO2024153120A1 (zh) | 突变的pd1胞外域片段及含有该片段的car和nk细胞 | |
| CN110938641A (zh) | 靶向april的嵌合抗原受体及其用途 | |
| CN110551741A (zh) | 靶向cd33的嵌合抗原受体及其用途 |