JP5829210B2 - Ｒｓｖｆタンパク質組成物およびそれを作製するための方法 - Google Patents

Ｒｓｖｆタンパク質組成物およびそれを作製するための方法 Download PDF

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Description

（関連出願）
本出願は、２００９年７月１５日に出願された米国特許出願番号６１／２２５，８０５、および２０１０年１月１２日に出願された米国特許出願番号６１／２９４，４２６の利益を主張する。上記米国特許出願の全教示は、参照によって本明細書に援用される。
（発明の背景）
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス属の、エンベロープをもつ非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。これは、生まれてから１年以内の子供の細気管支炎および肺炎の最も一般的な原因である。また、ＲＳＶは、重度の下気道疾患（これは、どの年齢でも起こり得、特に、高齢者または心臓、肺もしくは免疫機構に欠陥を有する人に起こり得る）などの反復感染も引き起こす。
宿主細胞に感染するために、パラミクソウイルス（ＲＳＶなど）は、エンベロープをもつ他のウイルス（インフルエンザウイルスおよびＨＩＶなど）と同様、ウイルスの膜と宿主細胞の膜との融合を必要とする。ＲＳＶでは、保存された融合タンパク質（ＲＳＶ Ｆ）が、不可逆的なタンパク質リフォールディングを膜の並置とカップリングさせることによりウイルス膜と細胞膜を融合させる。パラミクソウイルスの研究に基づいた現在のモデルでは、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、まず、フォールディングして準安定性の「融合前」コンフォメーションになる。細胞への侵入中、融合前コンフォメーションはリフォールディングとコンフォメーション変化を受け、安定な「融合後」コンフォメーションになる。
ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ｍＲＮＡから、およそ５７４個のアミノ酸のＦ０と表示されるタンパク質に翻訳される。Ｆ０の翻訳後プロセッシングとしては、小胞体でのシグナルペプチダーゼによるＮ末端シグナルペプチドの除去が挙げられる。また、Ｆ０は、２つの部位（およそ１０９／１１０とおよそ１３６／１３７）で、トランス−ゴルジ体において細胞内プロテアーゼ（特に、フリン）によって切断される。この切断により、短い介在配列の除去がもたらされ、Ｆ１（約５０ｋＤａ；Ｃ末端；およそ残基１３７〜５７４）およびＦ２（約２０ｋＤａ；Ｎ末端；およそ残基１〜１０９）と表示される２つのサブユニットが生成されるが、これらは互いに会合したままである。Ｆ１は、そのＮ末端に疎水性の融合ペプチドを含み、また、２つの両親媒性の７反復領域（ＨＲＡおよびＨＲＢ）も含む。ＨＲＡは該融合ペプチド付近に存在し、ＨＲＢは膜貫通ドメイン付近に存在する。ビリオン内では、３つのＦ１−Ｆ２ヘテロ二量体がＦ１−Ｆ２のホモ三量体としてアッセンブルされる。
現在入手可能なＲＳＶ感染に対するワクチンはないが、所望されている。ワクチンの作製に対する潜在的アプローチの１つは、精製ＲＳＶ Ｆタンパク質を基にしたサブユニットワクチンである。しかしながら、このアプローチでは、精製ＲＳＶ Ｆタンパク質は、経時的に安定な単一の形態およびコンフォメーションであり、ワクチンのロット間に一貫性があり、かつ簡便に精製されるものであることが望ましい。
ＲＳＶ Ｆタンパク質を、例えば、膜貫通ドメインと細胞質テールの欠失によって切断型にすると、該タンパク質がエクトドメインとして発現されることが可能となり得、これにより可溶性となり得る。また、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、最初は単量体として翻訳されるが、この単量体は切断され、三量体にアッセンブルされる。ＲＳＶ Ｆタンパク質が切断三量体の形態になると、疎水性の融合ペプチドが露出される。異なる三量体（例えば、可溶性のエクトドメインの三量体）上の露出された疎水性の融合ペプチドは互いに会合し、ロゼットの形成がもたらされ得る。また、疎水性の融合ペプチドは、例えば、可溶性の組換えＲＳＶ Ｆタンパク質を発現させるために使用した細胞に由来する脂質およびリポタンパク質とも会合し得る。ＲＳＶ Ｆタンパク質のプロセッシング、構造およびリフォールディングの複雑性のため、精製された均一な免疫原性調製物を得ることは困難である。
したがって、改善されたＲＳＶ Ｆタンパク質組成物およびＲＳＶ Ｆタンパク質組成物の作製方法の必要性が存在している。
（発明の概要）
本発明は、１つ以上のＲＳＶ Ｆポリペプチドを含む免疫原性組成物、ならびに一部の特定の遺伝子操作型ＲＳＶ Ｆタンパク質および該遺伝子操作型ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸に関する。
一態様において、ＲＳＶ Ｆタンパク質は可溶性である。例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、膜貫通領域と細胞質テールが欠失したものであり得る。一部の態様では、可溶性のＲＳＶ Ｆは、１）一方または両方のフリン切断部位に対する１つ以上の変異、２）融合ペプチドに対する１つ以上の変異、３）ｐ２７リンカーに対する１つ以上の変異、４）付加オリゴマー化配列を含むこと、および５）プロテアーゼ切断部位を提供する付加アミノ酸配列を含むこと、のうちの１つ以上を含むものである。付加的または代替的な態様において、ＲＳＶ Ｆタンパク質は単量体、三量体、または単量体と三量体の組合せである。三量体は単分散型またはロゼットの形態であり得る。さらなる付加的または代替的な態様では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は融合前コンフォメーション、中間コンフォメーションまたは融合後コンフォメーションであり得る。
一態様において、免疫原性組成物は、アミノ酸１００〜１５０が配列番号９、配列番号１２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７；配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号９１または配列番号９２のアミノ酸配列で置き換えられた１つ以上のＲＳウイルスＦ（ＲＳＶ Ｆ）ポリペプチドを含むものである。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
別の態様では、免疫原性組成物は、ＲＳＶ Ｆのアミノ酸１００〜１５０が配列番号１２のアミノ酸配列で置き換えられたＲＳＶ Ｆポリペプチドを含むものである。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
また別の態様では、免疫原性組成物は、ＲＳＶ Ｆのアミノ酸１００〜１５０が配列番号９、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７；配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号９２のアミノ酸配列で置き換えられたＲＳＶ Ｆポリペプチドを含むものである。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
別の態様では、免疫原性組成物は、アミノ酸１００〜１５０が配列番号９のアミノ酸配列で置き換えられたＲＳＶ Ｆポリペプチドを含むものである。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
別の態様では、免疫原性組成物は、ＲＳＶ Ｆが配列番号１または配列番号２のアミノ酸２３〜９９および１５１〜５２４を含むＲＳＶ Ｆポリペプチドを含むものである。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
一態様において、免疫原性組成物は、配列番号４９、配列番号６８、配列番号７１、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、および配列番号９３からなる群より選択されるポリペプチドを含むものである。一部の実施形態では、シグナルペプチドおよび／またはＨＩＳタグが削除されている。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
一態様において、免疫原性組成物は、配列番号６８あるいはまたシグナルペプチドおよび任意選択でＨＩＳタグが削除された配列番号６８を含むものである。
別の態様では、免疫原性組成物は、配列番号４９、配列番号７１、ならびにシグナルペプチドおよび任意選択でＨＩＳタグが削除された前述のいずれかの配列からなる群より選択されるポリペプチドを含むものである。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
好ましい実施形態では、免疫原性組成物にアジュバントを含める。アジュバントは、好ましくは、アルミニウム塩、水中スクアレン型エマルジョン（ＭＦ５９など）、ベンゾナフチリジン化合物、リン脂質化合物（Ｅ６０２０など）、小分子免疫増強物質または前述のいずれかの任意の２つ以上の組合せである。
本発明のまた別の態様は組換えＲＳＶ Ｆポリペプチドを含む。ＲＳＶ Ｆは、単量体、三量体、三量体のロゼット、または単量体と三量体の組合せの形態であり得る。組換えポリペプチドは、異種オリゴマー化ドメイン、エピトープまたはシグナルペプチドを含むものであり得る。異種オリゴマー化ドメインは、好ましくは、インフルエンザ血球凝集素由来の三量体化ドメイン、ＳＡＲＳスパイク由来の三量体化ドメイン、またはＨＩＶ ｇｐ４１、ＮａｄＡ、修飾ＧＣＮ４もしくはＡＴＣａｓｅ由来の三量体化ドメインである。
一態様において、組換えＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号９、配列番号１２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号９１または配列番号９２のアミノ酸配列で置き換えられたアミノ酸１００〜１５０を有するものである。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
別の態様では、組換えＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列で置き換えられたＲＳＶ Ｆのアミノ酸１００〜１５０を有するものである。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
別の態様では、組換えＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号９、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７；配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号９２のアミノ酸配列で置き換えられたＲＳＶ Ｆのアミノ酸１００〜１５０を有するものである。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
また別の態様では、組換えＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列で置き換えられたＲＳＶ Ｆのアミノ酸１００〜１５０を有するものである。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
一態様において、該組換えポリペプチドは、配列番号４９、配列番号６８、配列番号７１、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９３、およびその任意の組合せからなる群より選択される。任意選択で、シグナルペプチドおよび／またはＨＩＳタグが削除されている。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは可溶性（例えば、エクトドメイン）である。
さらに別の態様は、前述の任意のポリペプチドをコードする核酸を含む。該核酸は自己複製ＲＮＡ分子であり得る。
本発明の別の態様は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドをコードする自己複製ＲＮＡを含む免疫原性組成物である。免疫原性組成物は送達系を含むものであり得る。
本発明の別の態様は、任意の該免疫原性組成物を投与することにより、ＲＳＶ Ｆに対する免疫応答を誘導する方法を含む。
本発明は、組成物の調製方法、およびＲＳＶ Ｆタンパク質（可溶性のＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドなど）を含む組成物、例えば、免疫原性組成物に関する。ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドは、単一の形態（非切断単量体、非切断三量体、切断三量体、または切断三量体のロゼットなど）であり得る。また、ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドは、２つ以上の形態、例えば、平衡状態（非切断単量体と非切断三量体との平衡など）で存在している２つ以上の形態であってもよい。本発明により、いくつかの利点がもたらされる。例えば、免疫原性組成物中におけるＲＳＶ Ｆの単一の所望の形態の存在により、該組成物を被験体に投与した場合の免疫応答がより予測可能となり、ワクチンに処方した場合の安定性ならびに他の物理的および化学的特性が、より一貫性を有する。
一態様において、本発明は、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物の作製方法である。該方法は、ａ）切断されるとＦ１およびＦ２断片が生成される１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含む非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを準備すること、ならびにｂ）該非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、該プロテアーゼ切断部位（１つまたは複数）を認識するプロテアーゼ（１つまたは複数）で切断することを含む。一般に、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は改変型フリン切断部位を含み、該ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ポリペプチドをアミノ酸１０１〜アミノ酸１６１の位置において非切断の（例えば、１０６〜１０９位および１３１〜１３６位のフリン切断部位で切断されていない）状態で産生する宿主細胞から分泌される。一部の実施形態では、ａ）において準備する非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを精製する。
ａ）において準備する非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、インタクトな融合ペプチドを含むものであっても、改変型融合ペプチド（例えば、欠失型融合ペプチドまたは変異型融合ペプチド）を含むものであってもよい。ａ）において準備する非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドがインタクトな融合ペプチドを含むものである場合、工程ｂ）での切断により、三量体のロゼットの形成がもたらされる。ａ）において準備する非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが改変型融合ペプチドを含むものである場合、工程ｂ）での切断により、三量体の形成がもたらされる。
該方法は、さらに、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの切断によって生成されるロゼットまたは三量体を精製する任意選択の工程を含むものであってもよい。好ましい実施形態では、該方法によって作製される切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドには実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない。
別の態様では、本発明は、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、三量体または単量体と三量体の組合せを含む組成物の作製方法である。該方法は、ａ）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料を準備すること；およびｂ）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体または三量体を該生物学的材料から精製することを含む。一般に、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は改変型フリン切断部位を含み、該ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ポリペプチドをアミノ酸１０１〜アミノ酸１６１の位置において非切断の（例えば、１０６〜１０９位および１３１〜１３６位のフリン切断部位で切断されていない）状態で産生する宿主細胞から分泌される。一部の実施形態では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに改変型トリプシン切断部位を含み、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、アミノ酸１０１とアミノ酸１６１との間の部位でトリプシンによって切断されない。他の実施形態では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに改変型融合ペプチドを含む。
一部の実施形態では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体を精製する。他の実施形態では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体を精製する。さらに他の実施形態では、非切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインの単量体と三量体の混合物（これは動的平衡状態であり得る）を精製する。好ましい実施形態では、該方法によって作製される切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドには実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない。
別の態様では、本発明は、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、三量体または単量体と三量体の組合せを含む組成物の作製方法である。該方法は、ａ）改変型融合ペプチドを含む切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料を準備すること；およびｂ）切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを該生物学的材料から精製することを含む。
一部の実施形態では、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体を精製する。他の実施形態では、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体を精製する。さらに他の実施形態では、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインの単量体と三量体の混合物（これは動的平衡状態であり得る）を精製する。好ましい実施形態では、該方法によって作製される切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドには、好ましくは、実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない。さらに別の実施形態では、改変型融合ペプチドを含む切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインの三量体を精製する。
他の態様では、本発明は、本発明の方法を用いて作製される組成物、例えば、免疫原性組成物を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
アミノ酸１００〜１５０が配列番号９、配列番号１２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７；配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号９１または配列番号９２のアミノ酸配列で置き換えられている１つ以上のＲＳウイルスＦ（ＲＳＶ Ｆ）ポリペプチドを含む免疫原性組成物。
（項目２）
前記ＲＳＶ Ｆのアミノ酸１００〜１５０が配列番号１２のアミノ酸配列で置き換えられている、項目１に記載の免疫原性組成物。
（項目３）
前記ＲＳＶ Ｆのアミノ酸１００〜１５０が、配列番号９、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７；配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３または配列番号９２のアミノ酸配列で置き換えられている、項目１に記載の免疫原性組成物。
（項目４）
アミノ酸１００〜１５０が配列番号９のアミノ酸配列で置き換えられている、項目１に記載の免疫原性組成物。
（項目５）
前記ＲＳＶ Ｆが単量体、三量体、または単量体と三量体の組合せの形態である、項目１または項目２に記載の免疫原性組成物。
（項目６）
ＲＳＶ Ｆが単量体、三量体、ロゼットまたはその任意の組合せの形態である、項目３または４に記載の免疫原性組成物。
（項目７）
前記ＲＳＶ Ｆポリペプチドが、ＲＳＶ−Ｆエクトドメインを含む可溶性ポリペプチドである、項目１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
（項目８）
前記ＲＳＶ Ｆが、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２３〜９９および１５１〜５２４を含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
（項目９）
配列番号４９、配列番号６８、配列番号７１、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９３、シグナルペプチドおよび／またはＨＩＳタグが削除されている前述のいずれかの配列、ならびにその組合せからなる群より選択されるポリペプチドを含む免疫原性組成物。
（項目１０）
前記ポリペプチドが、シグナルペプチドおよび任意選択でＨＩＳタグが削除されている配列番号６８または配列番号６８である、項目９に記載の免疫原性組成物。
（項目１１）
前記ポリペプチドが、配列番号４９、配列番号７１、ならびにシグナルペプチドおよび任意選択でＨＩＳタグが削除されている前述のいずれかの配列からなる群より選択される、項目９に記載の免疫原性組成物。
（項目１２）
アジュバントをさらに含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
（項目１３）
前記アジュバントが、アルミニウム塩、水中スクアレン型エマルジョン、ベンゾナフチリジン化合物、リン脂質化合物、小分子免疫増強物質および前述のものの任意の組合せからなる群より選択される、項目１２に記載の免疫原性組成物。
（項目１４）
アミノ酸１００〜１５０が、配列番号９、配列番号１２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号９１または配列番号９２のアミノ酸配列で置き換えられている、組換えＲＳウイルスＦポリペプチド（ＲＳＶ Ｆ）。
（項目１５）
前記ＲＳＶ Ｆのアミノ酸１００〜１５０が配列番号１２のアミノ酸配列で置き換えられている、項目１４に記載の組換えＲＳＶ Ｆ。
（項目１６）
前記ＲＳＶ Ｆのアミノ酸１００〜１５０が、配列番号９、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７；配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３または配列番号９２のアミノ酸配列で置き換えられている、項目１５に記載の組換えＲＳＶ Ｆ。
（項目１７）
アミノ酸１００〜１５０が配列番号９のアミノ酸配列で置き換えられている、項目１４に記載の組換えＲＳＶ Ｆ。
（項目１８）
単量体、三量体、または単量体と三量体の組合せの形態である、項目１４または１５に記載の組換えＲＳＶ Ｆ。
（項目１９）
単量体、三量体、三量体のロゼットまたはその組合せの形態である、項目１６または１７に記載の組換えＲＳＶ Ｆ。
（項目２０）
配列番号４９、配列番号６８、配列番号７１、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９３、シグナルペプチドおよび／またはＨＩＳタグが削除されている前述のいずれかの配列、ならびにその組合せからなる群より選択される組換えポリペプチド。
（項目２１）
異種オリゴマー化ドメイン、エピトープ、またはシグナルペプチドをさらに含む、項目１４〜２０のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
（項目２２）
前記異種オリゴマー化ドメインが、インフルエンザ血球凝集素由来の三量体化ドメイン、ＳＡＲＳスパイク由来の三量体化ドメイン、またはＨＩＶ ｇｐ４１、ＮａｄＡ、修飾ＧＣＮ４もしくはＡＴＣａｓｅ由来の三量体化ドメインを含む群から選択される、項目２１に記載の組換えポリペプチド。
（項目２３）
項目１４〜２１のいずれかに記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
（項目２４）
自己複製ＲＮＡ分子である、項目２３に記載の単離された核酸。
（項目２５）
項目２４に記載の自己複製ＲＮＡ分子を含む免疫原性組成物。
（項目２６）
送達系をさらに含む、項目２５に記載の免疫原性組成物。
（項目２７）
項目１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体においてＲＳＶ Ｆに対する免疫応答を誘導する方法。
（項目２８）
項目２５に記載の免疫原性組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体においてＲＳＶ Ｆに対する免疫応答を誘導する方法。
（項目２９）
切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物を作製するための方法であって、
ａ）切断されるとＦ １ およびＦ ２ サブユニットが生成されるプロテアーゼ切断部位を含む非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを準備する工程であって、該非切断型の可溶性のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は、改変型フリン切断部位を１０６〜１０９位および１３３〜１３６位に含み、該非切断型の可溶性のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ポリペプチドを非切断型で産生する細胞から得られる、工程；ならびに
ｂ）準備した該可溶性のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、該プロテアーゼ切断部位で切断するプロテアーゼで切断し、それにより、切断型の可溶性のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物を生成させる工程
を含む、方法。
（項目３０）
工程ｂ）において、準備した前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、１０１位付近〜１６１位付近の１つ以上の位置で切断する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
準備した前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、１０６位付近〜１４２位付近の１つ以上の位置で切断する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
ａ）において準備する前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを精製する、項目２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
ａ）において準備する前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドがインタクトな融合ペプチドを含むものである、項目２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
工程ｂ）での切断により、三量体のロゼットの形成がもたらされる、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
ｃ）前記三量体のロゼットを精製する工程をさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記三量体のロゼットの精製がサイズ排除クロマトグラフィーを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
ａ）において準備する前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが改変型融合ペプチドを含むものである、項目２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記融合ペプチドの少なくとも一部分が、前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドにおいて欠失している、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
アミノ酸１３７〜１５３、アミノ酸１３７〜１４６、アミノ酸１３７〜１４５、またはアミノ酸１３７〜１４２が前記融合ペプチドから欠失している、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
工程ｂ）での切断により、三量体の形成がもたらされる、項目３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
ｃ）前記三量体を精製する工程をさらに含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記三量体の精製がサイズ排除クロマトグラフィーを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
ａ）において準備する前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、酵母細胞、テトラヒメナ細胞またはその組合せにおいて発現させる、項目２９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
ａ）において準備する前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを細胞馴化培養培地中で準備する、項目２９〜４３に記載の方法。
（項目４５）
前記細胞馴化培養培地が、昆虫細胞馴化培養培地、哺乳動物細胞馴化培養培地およびその組合せからなる群より選択される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記三量体のロゼットが、ＦｕｒｄｅｌおよびＤｅｌｐ２３ ｆｕｒｄｅｌからなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドのＦ １ およびＦ ２ 断片を含む、項目２９〜３６および４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドに実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない、項目２９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
項目２９〜４７のいずれか１項に記載の方法を用いて作製された切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物。
（項目４９）
免疫原性組成物である、項目４８に記載の組成物。
（項目５０）
非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、三量体または単量体と三量体の組合せを含む組成物を作製するための方法であって、
ａ）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料を準備する工程であって、該非切断型の可溶性のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は改変型フリン切断部位を１０６〜１０９位および１３３〜１３６位に含み、該非切断型の可溶性のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは該ポリペプチドを非切断型で産生する細胞から分泌される、工程；ならびに
ｂ）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体または三量体を該生物学的材料から精製し、それにより該組成物を生成させる工程
を含む、方法。
（項目５１）
前記生物学的材料が、昆虫細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、哺乳動物細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、鳥類細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、酵母細胞の馴化培地または細胞溶解物、テトラヒメナ細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、およびその組合せからなる群より選択される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
ｂ）において、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体を精製する、項目５０または５１に記載の方法。
（項目５３）
ｂ）において、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体を精製する、項目５０または５１に記載の方法。
（項目５４）
ｂ）での精製がサイズ排除クロマトグラフィーを含む、項目５０に記載の方法。
（項目５５）
前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが、改変型融合ペプチドをさらに含むものである、項目５０〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記可溶性の非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが、ｆｕｒｍｔ、ｆｕｒｄｅｌ、Ｄｅｌｐ２１ ｆｕｒｘ、Ｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｘ、Ｄｅｌｐ２１
ｆｕｒｄｅｌ、Ｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｄｅｌ、および第Ｘａ因子構築物からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む、項目５０に記載の方法。
（項目５７）
非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む前記組成物に実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない、項目５０〜５６のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
項目５０〜５７のいずれか１項に記載の方法を用いて作製された可溶性の非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体または三量体を含む組成物。
（項目５９）
免疫原性組成物である、項目５８に記載の組成物。
（項目６０）
非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、三量体または単量体と三量体の組合せを含む組成物を作製するための方法であって、
ａ）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料を準備する工程であって、該非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は改変型フリン切断部位を含み、１０１位付近と１６１位付近との間に存在するリジン残基とアルギニン残基は欠失しているか、あるいはリジンもしくはアルギニンではないアミノ酸で置き換えられており、該ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ポリペプチドを１０１位付近と１６１位付近との間を非切断の状態で産生する宿主細胞から得られ、該ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは１０１位付近と１６１位付近との間が切断されていない、工程；ならびに
ｂ）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、三量体または単量体と三量体の組合せを、該生物学的材料から精製する工程
を含む、方法。
（項目６１）
前記生物学的材料が、昆虫細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、哺乳動物細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、鳥類細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、酵母細胞の馴化培地または細胞溶解物、テトラヒメナ細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、およびその組合せからなる群より選択される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
ｂ）において、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体を精製する、項目６０または６１に記載の方法。
（項目６３）
ｂ）において、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体を精製する、項目６０または６１に記載の方法。
（項目６４）
ｂ）において、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体と非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体を精製する、項目６０または６１に記載の方法。
（項目６５）
ｂ）での精製がサイズ排除クロマトグラフィーを含む、項目６０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが、改変型融合ペプチドをさらに含むものである、項目６０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが、Ｆｕｒｘ、Ｆｕｒｘ Ｒ１１３Ｑ Ｋ１２３Ｎ Ｋ１２４Ｎ、Ｄｅｌｐ２１ ｆｕｒｘおよびＤｅｌｐ２３ ｆｕｒｘからなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６８）
非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む前記組成物に実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない、項目６０〜６７のいずれか１項に記載の方法。
（項目６９）
項目６０〜６８のいずれか１項に記載の方法を用いて作製された可溶性の非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物。
（項目７０）
免疫原性組成物である、項目６９に記載の組成物。
（項目７１）
切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、三量体または単量体と三量体の組合せを含む組成物を作製するための方法であって、
ａ）改変型融合ペプチドを含む切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料を準備する工程；および
ｂ）切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを該生物学的材料から精製する工程
を含む、方法。
（項目７２）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが、アミノ酸１３７〜１５２付近が欠失しているか、アミノ酸１３７〜１５３付近が欠失しているか、アミノ酸１３７〜１４５付近が欠失しているか、アミノ酸１３７〜１４６付近が欠失しているか、またはアミノ酸１３７〜１４２付近が欠失しているアミノ酸配列を含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記生物学的材料が、昆虫細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、哺乳動物細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、鳥類細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、酵母細胞の馴化培地または細胞溶解物、テトラヒメナ細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、およびその組合せからなる群より選択される、項目７１または７２に記載の方法。
（項目７４）
ｂ）において、切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体を精製する、項目７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７５）
ｂ）において、切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体を精製する、項目７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７６）
ｂ）において、切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体と切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体を精製する、項目７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７７）
ｂ）での精製がサイズ排除クロマトグラフィーを含む、項目７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７８）
前記非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが、少なくとも融合ペプチド欠失ポリペプチドを含むものである、項目７１に記載の方法。
（項目７９）
非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む前記組成物に実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない、項目７１〜７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目８０）
項目７１〜７９のいずれか１項に記載の方法を用いて作製された可溶性の非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物。
（項目８１）
免疫原性組成物である、項目８０に記載の組成物。
（項目８２）
ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物を作製するための方法であって、
ａ）改変型フリン切断部位を１３３〜１３６位に含むＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを準備する工程であって、該可溶性のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ペプチドを、１３６／１３７位が切断されていないがＦ １ を含むサブユニットと会合しているＦ ２ 断片の形態で産生する細胞から分泌される、工程；ならびに
ｂ）準備した該ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインを１０１位と１６１位との間の部位で切断するプロテアーゼで切断し、それにより該組成物を生成させる工程
を含む、方法。
（項目８３）
ａ）において準備する前記ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを精製する、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
ａ）において準備する前記ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、酵母細胞、テトラヒメナ細胞またはその組合せにおいて発現させる、項目８２または８３に記載の方法。
（項目８５）
ａ）において準備する前記ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、細胞馴化培養培地、細胞抽出物またはその組合せにおいて準備する、項目８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
（項目８６）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、昆虫細胞馴化培養培地、哺乳動物細胞馴化培養培地、鳥類細胞馴化培養培地、酵母細胞馴化培養培地、テトラヒメナ細胞馴化培養培地およびその組合せからなる群より選択される細胞馴化培養培地において準備する、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが少なくともＣ末端フリンポリペプチドを含む、項目８２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８８）
ｂ）において作製される前記切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドに実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない、項目８２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
（項目８９）
項目８２〜８８のいずれか１項に記載の方法を用いて作製された切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物。
（項目９０）
免疫原性組成物である、項目８９に記載の組成物。
（項目９１）
ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物を作製するための方法であって、
ａ）改変型フリン切断部位を１３３〜１３６位に含むＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料を準備する工程であって、該可溶性のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ペプチドを、１３６／１３７位が切断されていないがＦ １ を含むサブユニットと会合しているＦ ２ 断片の形態で産生する細胞から分泌され、ただし、該改変型フリン切断部位はアミノ酸１３１〜１３４の欠失ではないものとする、工程；ならびに
ｂ）該ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを該生物学的材料から精製し、それにより該組成物を生成させる工程
を含む、方法。
（項目９２）
前記生物学的材料が、昆虫細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、哺乳動物細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、鳥類細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、酵母細胞の馴化培地または細胞溶解物、テトラヒメナ細胞の馴化培養培地または細胞溶解物、およびその組合せからなる群より選択される、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
ｂ）において、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、三量体または単量体と三量体の組合せを精製する、項目９１または９２に記載の方法。
（項目９４）
ｂ）での精製がサイズ排除クロマトグラフィーを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
該ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが少なくともＣ末端フリンポリペプチドを含む、項目９１〜９４のいずれか１項に記載の方法。
（項目９６）
ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む前記組成物に実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない、項目９１〜９５のいずれか１項に記載の方法。
（項目９７）
項目９２〜９６のいずれか１項に記載の方法を用いて作製されたＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物。
（項目９８）
免疫原性組成物である、項目９７に記載の組成物。
図１は、野生型ＲＳＶ Ｆ（図１Ａ）および膜貫通ドメインと細胞質テールを除去し、任意選択のＨＩＳ６−タグをＣ末端に付加したエクトドメイン構築物（図１Ｂ）の概略図を示す。明確にするため、残基の番号付けは、Ｎ末端シグナルペプチドから始まる野生型Ａ２株ＲＳＶ Ｆと関連させており、アミノ酸の欠失を含む構築物において改変されていない。概略図において、シグナル配列またはシグナルペプチドを表示している（ｓｐ）。図１Ａは、ＲＳＶ Ｆタンパク質の概略図であり、シグナル配列またはシグナルペプチド（ＳＰ）、ｐ２７リンカー領域、融合ペプチド（ＦＰ）、ＨＲＡドメイン（ＨＲＡ）、ＨＲＢドメイン（ＨＲＢ）、膜貫通領域（ＴＭ）、および細胞質テール（ＣＴ）を示している。エクトドメインのＣ末端結合部は種々（ｖｅｒｙ）であり得る。図１Ｂは、ＲＳＶ Ｆエクトドメイン構築物の一般的な概略図であり、図１Ａの概略図と共有の特徴を示し、任意選択のＨｌＳ６−タグ（ＨＩＳ ＴＡＧ）を含めている。フリン切断部位はアミノ酸位置１０９／１１０および１３６／１３７に存在している。図１Ｃはまた、ＲＳＶ Ｆ（野生型）（配列番号１０８）、ならびに一方または両方のフリン切断部位および／または融合ペプチド領域が変異または欠失したいくつかのタンパク質（Ｆｕｒｍｔ−配列番号３；Ｆｕｒｄｅｌ−配列番号４；Ｆｕｒｘ−配列番号６；Ｆｕｒｘ Ｒ１１３Ｑ，Ｋ１２３Ｎ，Ｋ１２４Ｎ−配列番号５；Ｆｕｒｘ Ｒ１１３Ｑ，Ｋ１２３Ｑ，Ｋ１２４Ｑ−配列番号９２；Ｄｅｌｐ２１ ｆｕｒｘ−配列番号７；Ｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｘ−配列番号８；Ｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｄｅｌ−配列番号９；Ｎ末端フリン−配列番号１０；Ｃ末端フリン−配列番号１１；融合ペプチド欠失１−配列番号１２；および第Ｘａ因子−配列番号１３）のアミノ酸１００〜１５０のアミノ酸配列を示す。図１Ｃにおいて、符号「−」は、その位置のアミノ酸が欠失していることを示す。 図２は、ＲＳＶ Ｆ（野生型）（配列番号９４）および付加プロテアーゼ切断部位を含むいくつかのタンパク質（配列番号９５〜１００）のアミノ酸４８８位からＴＭ領域の開始点までのカルボキシ末端のアミノ酸配列を示す。図２において、符号「−」は、その位置にアミノ酸がないことを示す。 図３は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いたＲＳＶ Ｆ 単量体（３）の精製を示すクロマトグラムおよび電気泳動ゲルの画像である。 図４Ａ〜４Ｆは、ＲＳウイルスＦ糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）をコードしているｐＴ７−ＴＣ８３Ｒ−ＦＬ．ＲＳＶＦ（Ａ３１７）自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１０１）を示す。ＲＳＶ−Ｆをコードしているヌクレオチド配列に下線を付している。 図４Ａ〜４Ｆは、ＲＳウイルスＦ糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）をコードしているｐＴ７−ＴＣ８３Ｒ−ＦＬ．ＲＳＶＦ（Ａ３１７）自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１０１）を示す。ＲＳＶ−Ｆをコードしているヌクレオチド配列に下線を付している。 図４Ａ〜４Ｆは、ＲＳウイルスＦ糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）をコードしているｐＴ７−ＴＣ８３Ｒ−ＦＬ．ＲＳＶＦ（Ａ３１７）自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１０１）を示す。ＲＳＶ−Ｆをコードしているヌクレオチド配列に下線を付している。 図４Ａ〜４Ｆは、ＲＳウイルスＦ糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）をコードしているｐＴ７−ＴＣ８３Ｒ−ＦＬ．ＲＳＶＦ（Ａ３１７）自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１０１）を示す。ＲＳＶ−Ｆをコードしているヌクレオチド配列に下線を付している。 図４Ａ〜４Ｆは、ＲＳウイルスＦ糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）をコードしているｐＴ７−ＴＣ８３Ｒ−ＦＬ．ＲＳＶＦ（Ａ３１７）自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１０１）を示す。ＲＳＶ−Ｆをコードしているヌクレオチド配列に下線を付している。 図４Ａ〜４Ｆは、ＲＳウイルスＦ糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）をコードしているｐＴ７−ＴＣ８３Ｒ−ＦＬ．ＲＳＶＦ（Ａ３１７）自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１０１）を示す。ＲＳＶ−Ｆをコードしているヌクレオチド配列に下線を付している。 図５は、いくつかのＲＳＶ株に由来するＦタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントである。アラインメントは、Ｃｏｒｐｅｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，１６（２２）：１０８８１−１０８９０に開示されたアルゴリズムを使用し、デフォルトパラメータ（Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２シンボル比較表，ギャップオープンペナルティ：１２、ギャップ伸張ペナルティ）を用いて作製した。Ａ２、Ａ２株（アクセッション番号ＡＦ０３５００６）のＦタンパク質（配列番号１０２）；ＣＰ５２、ＣＰ５２株（アクセッション番号ＡＦ０１３２５５）のＦタンパク質（配列番号１０３）；Ｂ、Ｂ株（アクセッション番号ＡＦ０１３２５４）のＦタンパク質（配列番号１０４）；ｌｏｎｇ、ｌｏｎｇ株（アクセッション番号ＡＹ９１１２６２）株のＦタンパク質（配列番号１０５）、および１８５３７株、１８５３７株（アクセッション番号Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ１３８４３）のＦタンパク質（配列番号１０６）。また、Ｆタンパク質配列のコンセンサスも示す（配列番号１０７）。 図６は、選択したＲＳＶ Ｆ抗原の精製のサイズ排除（ＳＥＣ）クロマトグラムの関連領域を示す。表示した抗原を含む主成分ピークにアスタリスクを示し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐ２００ １６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の保持時間をミリリットルで示す。較正したカラムでは、４７ｍｌ、６５ｍｌおよび７７ｍｌのおおよその保持時間は、それぞれ、カラムのボイドボリューム（ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ）、ＲＳＶ Ｆ三量体の保持、およびＲＳＶ Ｆ単量体の保持に相当する。図６Ａにおいて、非切断Ｄｅｌｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ（Δｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ）構築物は、およそ７７ｍｌにおいて単量体ピークから精製される。非切断Ｄｅｌｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ ＲＳＶ Ｆ抗原をトリプシンで処理すると、タンパク質はロゼットを形成し得、これは、さらに、ＳＥＣで、およそ４７ｍｌにおけるボイドボリューム中に移動する（図６Ｂ）。ＲＳＶ Ｆ融合ペプチド欠失の切断三量体種は、三量体ピークからおよそ６５ｍｌの保持時間において精製される（図６Ｃ）が、非切断Ｄｅｌｐ２１ Ｆｕｒｘ構築物（Δｐ２１ Ｆｕｒｘ）は、単量体ピークからおよそ７７ｍｌにおいて精製される（図６Ｄ）。 図７は、選択したＲＳＶ Ｆ抗原の代表的なＥＭ画像を示す。図７Ａは、トリプシン処理前のＲＳＶ Ｆ Δｐ２３（Ｄｅｌｐ２３）のＥＭ画像を示す。融合後三量体コンフォメーションと整合する図７Ａの松葉杖形状は、常に非切断Δｐ２３（Ｄｅｌｐ２３）Ｆｕｒｄｅｌ構築物で観察されるわけではない。Δｐ２３（Ｄｅｌｐ２３）Ｆｕｒｄｅｌ構築物をトリプシンで処理し、ＳＥＣカラムのボイドボリュームから精製し、ＥＭによって観察すると、該タンパク質にロゼットコンフォメーションが採用されたことがわかる（図７Ｂ）。ＲＳＶ Ｆ融合ペプチド欠失構築物をＳＥＣカラムの三量体ピークから精製すると、単分散型の松葉杖形状が観察され、融合後三量体と整合する（図７Ｃ）。図７Ｄに、Δｐ２１（Ｄｅｌｐ２１）ｆｕｒｘ ＲＳＶ Ｆ（モノマーと表示）、融合ペプチド欠失ＲＳＶ Ｆ（三量体と表示したレーン）および精製ＲＳＶ Ｆロゼット（ロゼットと表示）のいずれかの３つの調製物を示す。ゲルに、ＧＥ Ｆｕｌｌ Ｒａｎｇｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（分子量標準をゲルの左側に表示している）のいくつかのレーンを含めているとともに、ＲＳＶ Ｆ断片のおおよその保持時間をゲルの右側に示している。 図８Ａ〜８Ｃは、ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドの単量体（非切断Δｐ２１（Ｄｅｌｐ２１）ｆｕｒｘ）、三量体のロゼット（切断Δｐ２３（Ｄｅｌｐ２３）Ｆｕｒｄｅｌ）、および三量体（融合ペプチド欠失）がコットンラットにおいて免疫原性であることを示すグラフである。抗ＲＳＶ Ｆ ＩｇＧおよび中和抗ＲＳＶ抗体の血清力価を、１回目のワクチン接種の２週間後（２ｗｐ１）、１回目のワクチン接種の３週間後（３ｗｐ１）、および／または２回目のワクチン接種の２週間後（２ｗｐ２）に測定した。
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＲＳウイルスＦ（ＲＳＶ Ｆ）ポリペプチドおよび／またはタンパク質、ＲＳＶ Ｆポリペプチドおよび／またはタンパク質を含む免疫原性組成物、ＲＳＶ Ｆポリペプチドおよび／またはタンパク質の作製方法、ならびにＲＳＶ Ｆポリペプチドおよび／またはタンパク質を含む組成物、ならびにＲＳＶ Ｆポリペプチドおよび／またはタンパク質をコードする核酸に関する。
一般に、免疫原性組成物は、有益な特徴、例えば、１）融合前または中間（非融合後）コンフォメーションの安定化、２）融合ペプチドの露出の低減または排除、３）安定性の改善（例えば、凝集および／または分解の低減）、ならびに４）活性なＦ１／Ｆ２ウイルスタンパク質により類似すること、のうちの１つ以上をもたらす変異（例えば、アミノ酸の置き換え、欠失または付加）を含むＲＳＶ Ｆポリペプチドおよび／またはタンパク質を含むものである。このような特徴により、免疫原性組成物および免疫原性組成物の製造に対して利点がもたらされる。例えば、本明細書に記載のように、ＲＳＶ Ｆタンパク質の非融合後コンフォメーション（すなわち、融合前コンフォメーション、中間コンフォメーション）は、より良好な免疫原となり得、より良好な中和抗体応答が誘起され得る。例えば、フリン切断部位に変異または欠失を導入することにより融合ペプチドの露出を低減または排除すると、該ポリペプチドの疎水性が低減され、精製が容易になり、また、ＲＳＶ Ｆタンパク質が該タンパク質の投与対象の被験体の細胞膜と会合することが低減または排除される。該タンパク質の安定性の改善により、該タンパク質の凝集傾向または分解傾向が減少した免疫原性組成物の作製が容易になり、これにより、該組成物を被験体に投与した場合、より予測可能な免疫応答がもたらされる。最後に、例えばｐ２７リンカー領域の全部または一部の欠失によりＦ１／Ｆ２ウイルスタンパク質と類似させた変異型ＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質では、より良好な中和抗体応答が誘起され得る。本発明の他の利点は本明細書に記載している。
また、本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質、特にＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドを含む組成物の調製方法、およびＲＳＶ Ｆタンパク質を含む組成物、例えば、免疫原性組成物に関する。好ましくは、ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドは、単一の形態または既知の形態間での動的平衡状態である。
（定義）
本明細書で用いる場合、「集団」とは、組成物において存在している１つより多くのＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質をいう。集団は、実質的に均質であってもよく（この場合、実質的にすべてのＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質が実質的に同じ（例えば、同じアミノ酸配列、同じコンフォメーション））、不均質であってもよく、所望の度合の均一性（ｈｏｍｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を有する（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％のＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質が融合前コンフォメーションであるか、融合後コンフォメーションであるか、単量体であるか、三量体である）ものであってもよい。
ＲＳＶ Ｆタンパク質の「融合後コンフォメーション」は、３つのＨＲＢ領域と３つのＨＲＡ領域を含む６ヘリックスバンドルの存在を特徴とする三量体である。
ＲＳＶ Ｆタンパク質の「融合前コンフォメーション」は、３つのＨＲＢ領域を含む三重らせんを含む三量体を特徴とするコンフォメーションである。
本明細書で用いる場合、「ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチド」は、実質的に成熟ＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞外部分を含み、シグナルペプチド（例えば、アミノ酸１付近〜アミノ酸５２４付近、またはアミノ酸２２付近〜アミノ酸５２４付近）は、ある場合またはない場合があるが、天然に存在するＲＳＶ Ｆタンパク質の膜貫通ドメインと細胞質テールが欠損しているＲＳＶ Ｆタンパク質のポリペプチドをいう。
本明細書で用いる場合、「切断型ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチド」は、１０１／１０２付近〜１６０／１６１付近の１つ以上の位置で切断されて２つのサブユニットが生成されており、一方のサブユニットがＦ１を含み、他方のサブユニットがＦ２を含むものであるＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドをいう。
本明細書で用いる場合、「Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチド」は、１０１／１０２付近〜１３１／１３２付近の１つ以上の位置で切断されているが、１３２／１３３付近〜１６０／１６１付近の１つ以上の位置では切断されずに２つのサブユニットが生成されており、一方のサブユニットがＦ１を含み、他方のサブユニットがＦ２を含むものであるＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドをいう。
本明細書で用いる場合、「非切断型ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチド」は、１０１／１０２付近〜１６０／１６１付近の１つ以上の位置で切断されていないＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドをいう。非切断型ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドは、例えば、単量体または三量体であり得る。
本明細書で用いる場合、「融合ペプチド」はＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸１３７〜１５４をいう。
本明細書で用いる場合、「改変型融合ペプチド」は、１つ以上のアミノ酸が独立して、置き換えられているか、または欠失している融合ペプチドをいう（例えば、１３７〜１５４位の全部のアミノ酸の置き換えまたは欠失）。好ましくは、「改変型融合ペプチド」を含む切断型ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドはロゼットを形成しない。
本明細書で用いる場合、「精製」タンパク質またはポリペプチドは、組換えもしくは合成により作製されたか、またはその天然の宿主によって産生されたタンパク質またはポリペプチドであって、組換え産生系もしくは合成作製系または天然宿主の他の成分から単離されており、組成物中に存在している他の巨大分子成分と比べた該タンパク質の量が、粗製調製物中に存在する量よりも実質的に高くなっているようなタンパク質またはポリペプチドである。一般に、精製タンパク質は、少なくとも約５０％均一、より好ましくは少なくとも約７５％均一、少なくとも約８０％均一、少なくとも約８５％均一、少なくとも約９０％均一、少なくとも約９５％均一または実質的に均一である。
本明細書で用いる場合、「実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない」とは、タンパク質および／またはポリペプチド（例えば、ＲＳＶ Ｆポリペプチド）の純度をＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで観察し、全タンパク質含有量をＵＶ２８０吸光度もしくはＢＣＡ分析のいずれかを用いて測定し、脂質とリポタンパク質含有量をＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃアッセイ（Ｗａｋｏ，コード番号４３３−３６２０１）を用いて測定した場合、組成物、タンパク質およびポリペプチドに質量基準で少なくとも約９５％脂質とリポタンパク質が含まれていないことをいう。
本明細書で用いる場合、「改変型フリン切断部位」は、天然に存在するＲＳＶ Ｆタンパク質では、フリンまたはフリン様プロテアーゼによって認識されて切断されるが、１つ以上のアミノ酸の置き換え、１つ以上のアミノ酸の欠失、または１つ以上のアミノ酸の置き換えと１つ以上のアミノ酸の欠失の組合せを含む非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドではそうではない１０６〜１０９位付近と１３３〜１３６位付近のアミノ酸配列であり、改変型フリン切断部位を含むＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドは、該ポリペプチドを改変型フリン切断部位において非切断の状態で産生する細胞から分泌される。
本発明における使用に適したＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインの特徴を、Ａ２株由来のＲＳＶ Ｆタンパク質の配列（配列番号１）内のアミノ酸の位置で特定した具体的なアミノ酸に関して本明細書に記載している。ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインは、Ａ２株由来のＦタンパク質のアミノ酸配列を有するものであっても、任意の他の所望の株由来のＦタンパク質のアミノ酸配列を有するものであってもよい。Ａ２株以外の株に由来するＦタンパク質のエクトドメインが使用される場合、Ｆタンパク質のアミノ酸は、Ａ２株由来のＦタンパク質の番号付けを参照して番号付けされ、必要に応じてギャップが挿入される。これは、任意の所望のＲＳＶ Ｆタンパク質と、株Ａ２（本明細書にＡ２株由来のＦタンパク質について示したとおり）、ＣＰ５２株、Ｂ株、長鎖株、および１８５３７株のＦタンパク質との配列アラインメントを行なうことにより行なわれ得る。図５参照。配列アラインメントは、好ましくは、Ｃｏｒｐｅｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，１６（２２）：１０８８１−１０８９０に開示されたアルゴリズムを使用し、デフォルトパラメータ（Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２シンボル比較表、ギャップオープンペナルティ：１２、ギャップ伸張ペナルティ：２）を用いて得られる。
本発明は、可溶性のＲＳＶ Ｆポリペプチドおよびタンパク質、ならびに可溶性のＲＳＶ Ｆポリペプチドおよびタンパク質を含む免疫原性組成物、ならびに可溶性のＲＳＶ Ｆポリペプチドおよびタンパク質をコードする核酸（例えば、自己複製ＲＮＡ分子）を含む組成物を提供する。
ＲＳＶ Ｆポリペプチド（例えば、エクトドメインポリペプチド）は任意の所望の形態、例えば、単一の形態（非切断単量体、非切断三量体、切断三量体、または切断三量体のロゼットなど）であり得る。また、ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドは、２つ以上の形態、例えば、平衡状態（非切断単量体と非切断三量体との平衡など）で存在している２つ以上の形態であってもよい。本発明により、いくつかの利点がもたらされる。例えば、免疫原性組成物中におけるＲＳＶの単一の所望の形態の存在、または既知の形態間での動的平衡により、処方、可溶性および安定性がより予測可能となり、該組成物を被験体に投与した場合の免疫応答がより予測可能となる。
好ましくは、ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドは、単一の形態（非切断単量体、非切断三量体、切断三量体、切断三量体のロゼットなど）であるか、またはかかる形態のサブセット間での動的平衡（例えば、非切断単量体と非切断三量体との平衡）状態である。
本発明の一態様において、ＲＳＶ Ｆポリペプチドおよびタンパク質は融合前コンフォメーションである。融合前コンフォメーションのエピトープの方が、天然ビリオンを認識して中和することができる抗体を、より良好に誘起できることがあり得る。
本発明の一実施形態において、免疫原性組成物は、融合前コンフォメーションのＲＳウイルスＦ糖タンパク質の集団を含むものである。本発明の別の態様では、免疫原性組成物は、単離されたＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の集団と比べて、融合後コンフォメーションが不利（ｄｉｓｆａｖｏｒ）であるＲＳウイルスＦ糖タンパク質の集団を含むものである。
また、本発明は、ＲＳウイルスＦ糖タンパク質の融合前または中間融合コンフォメーションでは存在するが、該糖タンパク質の融合後コンフォメーションでは存在しないエピトープをディスプレイするポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。
（Ｆ糖タンパク質）
ＲＳＶのＦ糖タンパク質は、ビリオンのエンベロープと宿主細胞の原形質膜とを融合させることによりウイルス侵入を指向する。これは、４つの一般的なドメイン：Ｎ末端ＥＲトランスロケーションシグナル配列（ＳＳ）、エクトドメイン（ＥＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、および細胞質テール（ＣＴ）を有するＩ型の１回貫通内在性膜タンパク質である。ＣＴは、パルミトイル化システイン残基を１つ含む。Ｆタンパク質の配列は、ＲＳＶ単離株間で高度に保存されているが、常に進化している（７）。ほとんどのパラミクソウイルスとは異なり、ＲＳＶのＦタンパク質は、その他のウイルスタンパク質とは独立して侵入と合胞体形成を媒介し得る（通常、他のパラミクソウイルスではＦに加えてＨＮが必要である）。
ｈＲＳＶ Ｆ ｍＲＮＡは、Ｆ０と表示される５７４個のアミノ酸の前駆タンパク質に翻訳され、これは、Ｎ末端に、小胞体でシグナルペプチダーゼによって除去されるシグナルペプチド配列を含む。Ｆ０は、トランス−ゴルジ体で細胞内プロテアーゼ（特に、フリン）によって２つの部位（ａ．ａ．１０９／１１０と１３６／１３７）で切断されて短いグリコシル化介在配列が除去され、Ｆ１（約５０ｋＤａ；Ｃ末端；残基１３７〜５７４）およびＦ２（約２０ｋＤａ；Ｎ末端；残基１〜１０９）と表示される２つのサブユニットが生成する（例えば、図１参照）。Ｆ１は、そのＮ末端に疎水性の融合ペプチドを含み、また、２つの疎水性の７反復領域（ＨＲＡとＨＲＢ）も含む。ＨＲＡは該融合ペプチド付近に存在し、ＨＲＢは膜貫通ドメイン付近に存在する（例えば、図１参照）。ビリオン内では、Ｆ１−Ｆ２ヘテロ二量体がホモ三量体としてアッセンブルされる。
ＲＳＶは、単一の血清型として存在しているが、２つの抗原性の亜群：ＡとＢを有する。この２つの群のＦ糖タンパク質は約９０％同一である。Ａ亜群、Ｂ亜群または両者の組合せもしくはハイブリッドが本発明において使用され得る。一例の配列は、Ａ亜群のものは配列番号１であり（Ａ２株；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ：１３８２５１；Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ０３４２０）、Ｂ亜群のものは配列番号２である（１８５３７株；ＧＩ：１３８２５０；Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ１３８４３）。配列番号１および配列番号２は、ともに５７４個のアミノ酸の配列である。Ａ２株のシグナルペプチドはａ．ａ．１〜２１であるが、１８５３７株では１〜２２である。どちらも配列も、ＴＭドメインは約ａ．ａ．５３０〜５５０であるが、別の例では５２５〜５４８であると報告されている。
本発明では、任意の所望のＲＳＶ Ｆアミノ酸配列（配列番号１もしくは２のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは２と同一性を有する配列など）が使用され得る。典型的には、該配列は、配列番号１または２と少なくとも７５％の同一性を有するもの、例えば、配列番号１または２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するものである。該配列は、ＲＳＶに天然に見られるものであってもよい。
本発明で、全体または一部においてＦタンパク質のエクトドメインが使用される場合、これは、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸２２〜５２５付近を含むポリペプチド
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２３〜５２５付近を含むポリペプチド
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）と少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の断片を含むポリペプチド（ここで、該断片は少なくとも１つのＦタンパク質エピトープを含む。該断片は、通常、少なくとも約１００アミノ酸長、例えば、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０アミノ酸長である）
を含むものであり得る。
エクトドメインは、Ｆ０形態（シグナルペプチドを有するか、または有しない）であってもよく、互いに会合している２つの別個のペプチド鎖（例えば、Ｆ１サブユニットとＦ２サブユニット）（例えば、該サブユニットはジスルフィド結合によって連結されたものであり得る）を含むものであってもよい。したがって、アミノ酸１０１〜約１６１付近の全体または一部（アミノ酸１１０〜１３６など）がエクトドメインに存在していなくてもよい。したがって、エクトドメインは、全体または一部に、
（ｖ）第１のペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸２２付近〜アミノ酸１０１付近、または配列番号２のアミノ酸２３付近〜アミノ酸１０１付近と少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらに１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含み、第２のペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸１６２付近〜５２５付近、または配列番号２のアミノ酸１６２〜５２５付近と少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらに１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む、第１のペプチド鎖、およびこの第１のポリペプチド鎖と会合している第２のペプチド鎖
（ｖｉ）第１のペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸２２付近〜アミノ酸１０１付近、または配列番号２のアミノ酸２３付近〜アミノ酸１０９付近の断片を含むアミノ酸配列を含み、第２のペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸１６２付近〜アミノ酸５２５付近、または配列番号２のアミノ酸１６１付近〜アミノ酸５２５付近の断片を含む、第１のペプチド鎖、およびこの第１のポリペプチド鎖と会合している第２のペプチド鎖（該断片の一方または両方が少なくとも１つのＦタンパク質エピトープを含む。第１のペプチド鎖の断片は、通常、少なくとも２０アミノ酸長、例えば、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０アミノ酸長である。第２のペプチド鎖の断片は、通常、少なくとも１００アミノ酸長、例えば、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０アミノ酸長である）
（ｖｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のフリン消化によって得られ得る分子
を含むものであり得る。
したがって、本発明で使用されるアミノ酸配列は、ＲＳＶ Ｆタンパク質において天然に見られるものであってもよく（例えば、ＴＭとＣＴ（配列番号１または２のアミノ酸５２２〜５７４付近）が欠損している可溶性ＲＳＶ Ｆタンパク質）、および／または天然ＲＳＶ配列と比べて１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個）の単一アミノ酸変異（挿入、欠失もしくは置換）を有するものであってもよい。例えば、Ｆタンパク質を、そのフリン切断配列が排除されるように変異させると、それにより細胞内プロセッシングが抑制されることが知られている。一部の特定の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＴＭとＣＴ（配列番号１または２のアミノ酸５２２〜５７４付近）が欠損しており、天然ＲＳＶ配列と比べて１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個）の単一アミノ酸変異（挿入、欠失もしくは置換）を含むものである。
（フリン切断、トリプシン切断および融合ペプチドの変異）
ＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質は、フリン切断部位（すなわち、配列番号１および２のアミノ酸１０９と１３６）の一方または両方での切断を妨げる１つ以上の変異を含むものであり得る。該変異により、可溶性の該ポリペプチドまたはタンパク質の凝集が抑制され、それにより精製が容易となり得、ＲＳＶ Ｆタンパク質が細胞表面上で発現される場合（ウイルスレプリコン（例えば、アルファウイルスレプリコン粒子）からの発現によって）、またはＲＳＶ Ｆタンパク質がウイルス様粒子の一成分である場合は、細胞−細胞融合が抑制され得る。このような変異はまた、単独または本明細書に記載の他の変異との組合せで、融合前コンフォメーションの該タンパク質を安定化させ得る。
好適なフリン切断変異の例としては、配列番号１または２のアミノ酸残基１０６〜１０９を、ＲＡＲＫ（配列番号７７）、ＲＡＲＱ（配列番号７８）、ＱＡＱＮ（配列番号７９）、またはＩＥＧＲ（配列番号８０）で置き換えることが挙げられる。あるいはまたさらに、配列番号１または２のアミノ酸残基１３３〜１３６を、ＲＫＫＫ（配列番号８１）、ΔΔΔＲ、ＱＮＱＮ（配列番号８２）、ＱＱＱＲ（配列番号８３）またはＩＥＧＲ（配列番号８０）で置き換えてもよい（Δは、アミノ酸残基が欠失していることを示す）。このような変異を、所望により、ｐ２７領域（配列番号１または２のアミノ酸１１０〜１３６）における変異、例えば、ｐ２７領域の全体または一部の欠失などの本明細書に記載の他の変異と組み合わせてもよい。
このようなフリン切断変異を、所望により、トリプシン切断変異および融合ペプチドの変異などの本明細書に記載の他の変異と組み合わせてもよい。好適なトリプシン切断変異の例としては、配列番号１もしくは２の１０１位〜１６１位付近の任意のリジンもしくはアルギニン残基の欠失、またはかかる任意のリジンもしくはアルギニン残基のリジンもしくはアルギニン以外のアミノ酸での置き換えが挙げられる。例えば、ｐ２７領域（配列番号１または２のアミノ酸１１０〜１３６付近）内のリジンおよび／またはアルギニン残基を置換してもよく、欠失させてもよい（ｐ２７領域の全体または一部の欠失など）。
フリン切断変異に対して代替的または付加的に、ＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質は、融合ペプチド領域（配列番号１または２のアミノ酸１３７〜１５３）に１つ以上の変異を含んでいてもよい。例えば、この領域の全体を欠失させてもよく、一部を欠失させてもよい。
具体的な実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質（配列番号１、配列番号２など）のアミノ酸残基１００〜１５０またはその可溶性エクトドメインの配列は、
（ここで、符号「−」は、その位置のアミノ酸が欠失していることを示す）
である。
フリン切断および融合ペプチドの変異に対して付加的または代替的に、可溶性ＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質（膜貫通領域と細胞質テールが欠損しているものなど）は、１つ以上のオリゴマー化配列を含むものであってもよい。オリゴマー化配列を存在させる場合、これは、好ましくは三量体化配列である。好適なオリゴマー化配列は、当該技術分野でよく知られており、例えば、酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパータンパク質のコイルドコイル、バクテリオファージＴ４のフィブリチン（ｆｉｂｒｉｔｉｎ）由来の三量体化配列（「フォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）」）、およびインフルエンザＨＡの三量体ドメインが挙げられる。これらおよび他の好適なオリゴマー化配列を、本明細書において、より詳細に説明する。
具体的な実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質のカルボキシ末端の配列は（４８０位から始まる）、
である。
フリン切断変異、融合ペプチドの変異およびオリゴマー化配列の付加の任意の組合せに対して付加的または代替的に、膜貫通領域を含むＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質は、プロテアーゼ切断部位を提供する付加アミノ酸配列を含むものであってもよい。この型のＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質は、細胞表面上での発現によって作製され、適切なプロテアーゼを用いて該細胞表面から切断した後、可溶性形態で収集され得る。一般的に、プロテアーゼ切断部位を提供するアミノ酸配列は、膜貫通ドメインのアミノ末端（配列番号１または２のアミノ酸５２５）の約６０アミノ酸以内、約５０アミノ酸以内、約４０アミノ酸以内、約３０アミノ酸以内、約２０アミノ酸以内、約１０アミノ酸以内に、または実質的に隣接させて存在させる。市販のプロテアーゼによって切断される多くの適当なアミノ酸配列が当該技術分野でよく知られている。例えば、トロンビンは配列ＬＶＰＲ（配列番号７５）を切断し、第Ｘａ因子は配列ＩＥＧＲを切断し、エンテロキナーゼは配列ＤＤＤＤＫ（配列番号７６）を切断する。このようなアミノ酸配列がＲＳＶ Ｆポリペプチドに導入され得る。具体的な実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドまたはタンパク質の配列は（４８８位から始まり、ＴＭ領域まで）、図２に示す配列である。
本発明に従って使用される免疫原性ポリペプチドは、通常、単離されたもの、または精製されたものである。したがって、該ポリペプチドは、通常（あてはまる場合）自然界では一緒に見られる分子と会合していない。例えば、本発明で使用されるＦタンパク質は、ＲＳＶビリオンの形態ではない（しかし、ビロソームまたはＶＬＰなどの人工ビリオンの形態であってもよい）。
ポリペプチドは、通常、組換え宿主系内での発現によって調製される。一般的に、該ポリペプチド（例えば、ＲＳＶエクトドメイン）は、該エクトドメインをコードする組換え構築物を適当な組換え宿主細胞内で発現させることによって作製されるが、任意の適当な方法が使用され得る。好適な組換え宿主細胞としては、例えば、昆虫細胞（例えば、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、および齧歯類（例えば、ハムスター））、鳥類細胞（例えば、ニワトリ、アヒル、およびガチョウ）、細菌（例えば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびストレプトコッカス種）、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、テトラヒメナ細胞（例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）またはその組合せが挙げられる。多くの適当な昆虫細胞および哺乳動物細胞が当該技術分野でよく知られている。好適な昆虫細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞、およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（親Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４細胞系統に由来するクローン単離物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））が挙げられる。好適な哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞、典型的には、剪断アデノウイルス５型ＤＮＡで形質転換されたもの）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、２９３−Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７５）、アカゲザル胎仔肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ−１６０）、マディン−ダービーウシ腎（「ＭＤＢＫ」）細胞、マディン−ダービーイヌ腎（「ＭＤＣＫ」）細胞（例えば、ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４；またはＭＤＣＫ ３３０１６、ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）、乳仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞）などが挙げられる。好適な鳥類細胞としては、例えば、ニワトリ胚性幹細胞（例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、アヒル細胞（例えば、ＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞系統（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ）、これらは、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：４９７５−４９８２（２００９）およびＷＯ２００５／０４２７２８に記載されている）、ＥＢ６６細胞などが挙げられる。
好適な昆虫細胞発現系（バキュロウイルス系など）は当業者に知られており、例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されている。バキュロウイルス／挿入（ｉｎｓｅｒｔ）細胞発現系のための材料および方法はキットの形態で、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）から市販されている。また、鳥類細胞発現系も当業者に知られており、例えば、米国特許第５，３４０，７４０号；同第５，６５６，４７９号；同第５，８３０，５１０号；同第６，１１４，１６８号；および同第６，５００，６６８号；欧州特許番号ＥＰ０７８７１８０Ｂ；欧州特許出願番号ＥＰ０３２９１８１３．８；ＷＯ０３／０４３４１５；ならびにＷＯ０３／０７６６０１に記載されている。また、同様に、細菌発現系および哺乳動物細胞発現系も当該技術分野で知られており、例えば、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編，１９８９）（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）に記載されている。
ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインをコードする組換え構築物は、適当なベクターにおいて慣用的な方法を用いて調製され得る。昆虫細胞または哺乳動物細胞での組換えタンパク質の発現のためのいくつかの適当なベクターは、よく知られており、当該技術分野で慣用的である。好適なベクターは、いくつかの成分、例えば限定されないが、以下：複製起点；選択可能なマーカー遺伝子；１つ以上の発現制御エレメント（例えば、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１つ以上の翻訳シグナル）；ならびに選択した宿主細胞（例えば、哺乳動物起源のもの、または異種哺乳動物種もしくは非哺乳動物種由来のもの）の分泌経路への標的化のためのシグナル配列またはリーダー配列のうちの１つ以上を含むものであり得る。例えば、昆虫細胞での発現のためには、適当なバキュロウイルス発現ベクター（ｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など）が組換えバキュロウイルス粒子の作製に使用される。バキュロウイルス粒子を増幅させ、組換えタンパク質を発現させるための昆虫細胞の感染に使用する。哺乳動物細胞での発現のためには、所望の哺乳動物宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）での該構築物の発現を駆動するベクターが使用される。
ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、任意の適当な方法を用いて精製され得る。例えば、イムノアフィニティクロマトグラフィーによるＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチド精製方法は、当該技術分野で知られている。Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８５：３６７７−３６８７（２００４）。所望のタンパク質の好適な精製方法、例えば、沈降および種々の型のクロマトグラフィー（疎水性相互作用、イオン交換、アフィニティ、キレートおよびサイズ排除など）は、当該技術分野でよく知られている。好適な精製スキームは、これらまたは他の適当な方法の２つ以上を用いて作成されたものであり得る。所望により、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドに、エピトープタグまたはＨＩＳタグなどの精製を容易にする「タグ」を含めてもよい。かかるタグ化ポリペプチドは、例えば、馴化培地から、キレートクロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製され得る。
また、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、インサイチュで、該ポリペプチドをコードする核酸を被験体の細胞内で発現させることによっても作製され得る。例えば、本明細書に記載の自己複製ＲＮＡの発現による。
ポリペプチドは、ＲＳＶ配列に加えて、さらなる配列を含んでいてよい。例えば、ポリペプチドには、精製を容易にする配列（例えば、ポリ−Ｈｉｓ配列）が含められ得る。同様に、発現の目的で、Ｆタンパク質の天然リーダーペプチドを異なるペプチドで置換してもよい。例えば、参考文献６では、天然のペプチドの代わりにミツバチメリチンリーダーペプチドが使用されている。
（ポリペプチドの形態とコンフォメーション）
本発明は、本明細書に開示したＲＳＶ Ｆポリペプチドおよびタンパク質の任意の形態およびコンフォメーションを含む免疫原性組成物を含む（本明細書に開示したＲＳＶ Ｆポリペプチドおよびタンパク質の形態およびコンフォメーションの任意の所望の組合せを含む）。ＲＳＶ Ｆポリペプチドは単量体であり得るか、またはＲＳＶ Ｆタンパク質は、３つの該単量体ポリペプチドを含む三量体であり得る。三量体は、単分散型であってもよく、例えば個々の三量体（ｔｉｍｅｒ）の融合ペプチド間の相互作用のため、ロゼットの形態であってもよい。免疫原性組成物は、単量体、三量体、単量体と三量体の組合せ（例えば、動的平衡状態）、三量体のロゼット、および前述のものの任意の組合せであるポリペプチドを含むものであり得る。また、本明細書においてさらに記載するように、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合後コンフォメーション、融合前コンフォメーション、または中間コンフォメーションであり得る。
ＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前コンフォメーション、融合後コンフォメーションまたは中間コンフォメーションであり得る。ＲＳＶ Ｆタンパク質の「融合後コンフォメーション」は、天然ＲＳＶ Ｆの低エネルギーコンフォメーションであると考えられており、３つのＨＲＢ領域と３つのＨＲＡ領域を含む６ヘリックスバンドルの存在を特徴とする三量体である。融合後コンフォメーションは、電子顕微鏡検査によると、特徴的な「松葉杖」または「ゴルフのティー」形状を有する。ＲＳＶ Ｆタンパク質の「融合前コンフォメーション」は、３つのＨＲＢ領域を含むコイルドコイルを含む三量体を特徴とするコンフォメーションである。融合ペプチドは、融合前コンフォメーションでは露出されず、したがって、融合前コンフォメーションは、一般的にロゼットを形成せず、電子顕微鏡検査によると、「棒つきキャンディ」または「軸付きのボール」形状を有する。
一部の態様では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は融合後コンフォメーションである。例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合後コンフォメーションの単分散三量体の形態、または融合後三量体で構成されたロゼットの形態であり得る。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは単量体である。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは三量体である。
他の態様では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は融合前コンフォメーションである。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションまたは中間形態には、天然のＲＳＶ ビリオン上に発現されたＲＳＶ Ｆタンパク質のものと同じエピトープが含まれ得、したがって、中和抗体の誘起に利点をもたらすと考えられる。
本発明の一部の態様では、Ｆタンパク質の融合後コンフォメーションを不利にするポリペプチドが使用される。好ましくは、該ポリペプチド（全体または一部において）は、融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへの変換において、融合前Ｆタンパク質のエピトープまたは中間コンフォメーションのエピトープをディスプレイする。このようなポリペプチドは、融合前状態の天然もしくは変異型Ｆタンパク質であってもよく、中間コンフォメーションの天然もしくは変異型Ｆタンパク質であってもよく、融合後コンフォメーションが不利になったか、もしくは優先的に排除された天然もしくは変異型タンパク質の集団であってもよい。一部の特定の場合では、該天然もしくは変異型タンパク質は、該ポリペプチドを前述の状態のうちの１つに維持することを補助する１つ以上のさらなる分子（融合前コンフォメーションまたは中間コンフォメーションに優先的に結合するモノクローナル抗体など）と合わされ得る。また、該ポリペプチドは天然Ｆタンパク質の誘導体であってもよい。かかる誘導体としては、天然Ｆタンパク質の１つ以上の断片を含むポリペプチド、天然Ｆタンパク質（またはその断片）と異種配列を含む融合ポリペプチド、および１つ以上の変異を有する天然Ｆタンパク質配列を含むポリペプチドが挙げられる。このような（または他の）修飾は融合後コンフォメーションを不利にするものであり得る。融合後コンフォメーションを不利にするための例示的なアプローチとしては、融合前コンフォメーションの安定化、中間コンフォメーションの安定化、融合後コンフォメーションの不安定化または融合後コンフォメーションをもたらす１つ以上の工程の活性化障壁の増大が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、融合前コンフォメーションのＦタンパク質または中間コンフォメーションのＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープをディスプレイするポリペプチドである。融合前コンフォメーションのＦタンパク質または中間コンフォメーションのＦタンパク質に特異的なエピトープは、融合後コンフォメーションでは提示されないエピトープである。該エピトープの少なくとも１つは安定的に提示されることが好ましく、例えば、該エピトープは、溶液中で、少なくとも１２時間、少なくとも１日、少なくとも２日間、少なくとも４日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、または少なくとも６週間、安定的に提示される。
かかるポリペプチドは、融合前状態、中間状態、または融合後状態が過少提示（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）状態もしくは単離された天然Ｆタンパク質の場合よりも割合が少ない集団状態の、天然もしくは変異型Ｆタンパク質であってもよく、天然Ｆタンパク質の誘導体であってもよい。かかる誘導体としては、天然Ｆタンパク質の１つ以上の断片を含むポリペプチド、天然Ｆタンパク質（またはその断片）と異種配列を含む融合ポリペプチド、および１つ以上の変異を有する天然Ｆタンパク質配列を含むポリペプチドが挙げられる。このような（または他の）修飾は、Ｆタンパク質のアミノ酸配列をその融合前コンフォメーションで安定化させるもの、Ｆタンパク質のアミノ酸配列を中間コンフォメーションで安定化させるもの、Ｆタンパク質のアミノ酸配列の融合後コンフォメーションを不安定化させるもの、Ｆタンパク質のアミノ酸配列の融合後コンフォメーションをもたらす遷移のエネルギー障壁を増大させるもの、または前述のものの２つ以上の組合せであり得る。
Ｆタンパク質のＴＭおよび／またはＣＴドメインは融合前コンフォメーションの安定性に重要である（８）。したがって、これらのドメインは本発明の免疫原に有用に保持され得る。しかしながら、膜貫通ドメインを可溶性免疫原に含めないことが望ましい場合があり得るため、ＴＭの機能性効果を他の手段によって得てもよい。例えば、パラインフルエンザウイルス５のＦタンパク質の融合前および融合後の挙動がある程度詳細に試験されており（６）、著者は、ＥＤの融合前構造を、異種三量体化ドメインをＥＤのＣ末端と融合させることにより安定化させた。
（オリゴマー化ドメイン）
本発明の別の実施形態において、該組成物は、第１のドメインと第２のドメインを含み、（ｉ）第１のドメインがＲＳＶ Ｆタンパク質（例えば、全体または一部におけるＲＳＶエクトドメイン）を含み、（ｉｉ）第２のドメインが異種オリゴマー化ドメインを含むポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド）を含むものであり得る。第２のドメインは該ポリペプチドのオリゴマー化を可能にし、それにより、第１のドメインが融合前状態または中間状態になることが助長される。該ポリペプチドは、好ましくはオリゴマーとして、特に三量体として存在する。
種々のオリゴマー化ドメインが当業者に利用可能である。これは、複数のポリペプチドが会合して（通常、非共有結合により）オリゴマー（例えば、三量体）を形成できるように、他のポリペプチド（同じであれ異なるものであれ）のオリゴマー化ドメイン（同じであれ異なるものであれ）と相互作用し得る構造が形成され得るアミノ酸配列である。例えば、ＨＩＶのＦタンパク質（すなわち、ｇｐ１６０）の三量体化は、これを、天然で安定な三量体である大腸菌アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ（ＡＴＣａｓｅ）の触媒性サブユニットと融合させることにより行なわれる（９）。したがって、ＡＴＣａｓｅのこのサブユニットは本発明で使用され得る。同様に、ＨＩＶ（１０）およびＰＩＶ５（６）のＦタンパク質の三量体化は、そのエクトドメインをＧＣＮｔと融合させることにより得られている。したがって、本発明で使用されるオリゴマー化ドメインは、酵母ＧＣＮ４のロイシンジッパータンパク質のコイルドコイルを含むものであってもよい（１１）。インフルエンザＡウイルス由来のＨＡタンパク質のエクトドメインの三量体化は、バクテリオファージＴ４のフィブリチンの三量体化配列（「フォルドン」）（ＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱ ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ−配列番号１９）を使用することにより行なわれている（１２）。したがって、本発明で使用されるオリゴマー化ドメインは、かかるフォルドンを含むものであってもよい。
天然に存在するタンパク質オリゴマーは（ヘテロ−オリゴマーおよびホモ−オリゴマーのどちらも）、さまざまな異なる様式で、例えば、種々の単量体のβ−シートの会合、種々の単量体のα−らせんの会合、疎水性表面パッチの会合などによって会合している。タンパク質のオリゴマー化に関与している共通の構造モチーフの一例はコイルドコイルドメインである。コイル状のα−らせん構造モチーフは、それ自体がコイルを形成することができ、２つ、３つ、４つ、または５つのα−らせんが互いに巻き付いて、「コイルドコイル」として知られる左巻き超らせんが形成され得るが、人工の右巻き超らせんも設計されている（１３〜１９）。コイルドコイルドメインの単純さのため、該ドメインは、規定のオリゴマー化状態を有するキメラタンパク質の設計によく使用される選択肢となっている（１６）。
コイルドコイル構造では、α−らせん同士が、各らせんの一方側に沿って無極性のストライプ（ｓｔｒｉｐｅ）を形成する疎水性残基を介して相互作用するが、このストライプのどちらかの側で側鎖間の静電相互作用が安定化されることもあり得る。α−らせんのａｂｃｄｅｆｇ７反復内では、該無極性ストライプは残基ａとｄの疎水性側鎖によって規定され、静電相互作用（あれば）は主に残基ｅとｇに存在する。位置ａは、最も高頻度にはＬｅｕ、ＩｌｅまたはＡｌａであり、位置ｄは、通常、ＬｅｕまたはＡｌａである。残基ｅおよびｇは、多くの場合、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、また、位置ｇにはＡｒｇとＬｙｓもよく見られる。荷電残基は、一般的には位置ｂ、ｃおよびｆである。それは、これらの残基が溶媒と接触しているからである。しかしながら、この一般的な７パターンには例外があり、場合によっては、この７つの中にＰｒｏ残基が存在する。かかる例外は、通常、機能的有意性（例えば、一例として、Ｆタンパク質で起こるものなどのリフォールディングと再編成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を可能にするオリゴマー化ドメインの不安定化）を有するものである。
数百のコイルドコイルドメイン配列が当該技術分野で知られており、任意の適当な配列がオリゴマー化ドメインとして本発明で使用され得るが、該配列は、他のコイルドコイルドメインとオリゴマー化する能力を保持しているものであること、およびポリペプチド内において他のドメインの機能を破壊しないものであることを条件とする。細胞外に見られ（２０）、かつ天然でオリゴマー化ドメインとしての機能を果たすコイルドコイルドメインを使用することが好ましい。天然のコイルドコイルドメインの使用の代替法として、人工のコイルドコイルドメインが使用され得る（２１，２２）。コイルドコイルドメインが高度に反復性の構造であることによって、該ドメインは、各アミノ酸残基の主鎖部分がパラメータ化され得るため（残基の各主鎖部分を、独自の変数を有する一意的な単位として扱うのではなく）、特にコンピュータでのモデル設計を行ない易い。ドメイン（ｂ）には、ロイシンジッパー配列またはアラニンジッパー配列が含まれ得る（２３）。
本発明のポリペプチドに使用されるコイルドコイルドメインは、好ましくは、本発明のポリペプチドも三量体にアッセンブルされ得るように、三量体を形成するものである。好ましいコイルドコイルドメインは、細菌の膜貫通タンパク質から得られるものである。膜貫通タンパク質の好ましいサブセットは、アドヘシン（すなわち、他の細胞または表面への接着を媒介する細胞表面タンパク質）、特に、非線毛アドヘシン（例えば、オリゴマー化コイルドコイルアドヘシンまたは「Ｏｃａ」ファミリーのもの）である。本発明で使用される具体的な配列としては、参考文献２４に開示されたもの（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａアドヘシンＹａｄＡ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓアドヘシンＮａｄＡ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ表面タンパク質ＵｓｐＡ２）、および他のアドヘシン（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂｉｏｇｒｏｕｐ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ由来のＨａｄＡアドヘシンなど）（参考文献２４の配列番号２８〜３１および４２〜５８）が挙げられる。また、真核生物の熱ショック転写因子は、別個に発現させることができるコイルドコイル三量体化ドメインを有し、したがって本発明で使用される。
コイルドコイル領域を有するポリペプチドのアミノ酸配列において、α−らせんの７反復の性質は、コイルドコイルドメインの境界は、ある程度の精度を伴って決定され得るが、コイルドコイル配置の終わりと言える厳密な残基は、絶対的な正確さを伴って知ることはできないであろうことを意味する。しかし、絶対的精度の欠如は、常套的な試験によって、コイルドコイルに、必要かもしれない任意の特定のアミノ酸残基が必要とされるかどうかが実証され得るため、本発明を実施するのに問題ではない。そうであっても、本発明の基本的要件は、該ポリペプチドが他のコイルドコイルドメインと、該ポリペプチドにおける他のドメインの機能を破壊することなくオリゴマー化することが可能であるような様式で、コイルドコイルドメインが機能を果たすべきであるということのみであるため、本発明では、境界を絶対的精度を伴って知ることは必要とされない。
本発明で使用され得る別の類型のオリゴマー化ドメインは、コラーゲンヘリックスとして知られる左巻き三重らせんに見られるものである（２５）。この三重らせん形成配列は、基本のトリペプチド反復配列１Ｇｌｙ−２Ｘａａ−３Ｘａａを含み、ここで、２Ｘａａは、多くの場合、Ｐｒｏであり、３Ｘａａは、多くの場合、４−ヒドロキシプロリンである。このモチーフは「コラーゲン」らせんとして知られているが、コラーゲンだけでなく、多くのタンパク質にみられる。したがって、オリゴマー化ドメインは、複数の反復配列モチーフ１Ｇｌｙ−２Ｘａａ−３Ｘａａを含む配列であってもよく、該モチーフがフォールディングして、他のポリペプチド鎖の対応するらせん構造とオリゴマー化し得るらせん構造が形成される。
また、コラーゲンにより、別の類型のオリゴマー化ドメインも得られる。参考文献２６には、Ｘ型コラーゲンの非コラーゲン性ドメイン１（ＮＣ１）にみられるモチーフが記載されており、このモチーフは、三重らせんなしの三量体および高次多量体の形成に使用され得る。この三量体会合体は、分子間ジスルフィド結合なしで高度に熱安定性である。したがって、オリゴマー化ドメインはＮＣ１配列を含むものであってもよい。
他のオリゴマー化ドメインは、オリゴマーＴＭタンパク質の膜貫通ドメインに由来するものであり得る。このようなものは、通常、親油性であるため、ＴＭ領域の外側に位置する疎水性残基が荷電残基と置換され、可溶性ドメインがもたらされることがあり得る。かかるタンパク質工学による膜貫通ドメインの可溶化方法は当該技術分野で知られている（例えば、参考文献２７）。
また、この方法は、ＧＣＮ４にも使用されており、ここでは、７反復の「ａ」および「ｄ」の位置がイソロイシン（１１）で置き換えられている：ＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＧＥＡ（配列番号２０）。オリゴマー化ドメインにおける使用に好適なコイルドコイル配列は、通常、２０〜３５アミノ酸長、例えば、２３〜３０アミノ酸残基長のものである。
本発明で使用されるオリゴマー化ドメインでは、一般的に、単量体間ジスルフィド結合の形成の必要なくオリゴマー構造が維持され得るが、本発明では、ジスルフィド連結単量体を含むオリゴマーを除外しない。
融合前コンフォメーションのＦタンパク質を安定化させるためのオリゴマー化ドメインの使用に対する代替法として、または該使用に加えて、変異が使用され得る。例えば、参考文献２８には、シミアンウイルス５またはヘンドラウイルスのＦタンパク質のＦ２サブユニットの保存領域における変異は、融合前コンフォメーションの安定性に影響し得ることが報告されている。
また、一部の状況では、融合前コンフォメーションが有利となるように低ｐＨが使用され得る。
（ＨＲＢドメインの三量体の安定化）
本発明の別の好ましい態様では、Ｆタンパク質の融合後コンフォメーションは、ＨＲＢドメインの三量体の安定化によって不利となり得る。ＨＲＢドメインは、融合前形態およびおそらく中間形態の三重コイルドコイルを形成する。先のセクションで論考したように、コイルドコイルは、その単純さのため、タンパク質間の分子間相互作用のモデル系として、およびより広範な分子内相互作用（すなわち、三次フォールディング相互作用）のモデル系として広く研究されている。このような研究は、三量体コイルドコイル形態のＨＲＢドメインを安定化させるために使用され得る方法の教示に有用である。一例として、７反復のａ位および／またはｄ位の１つ以上の残基を、安定な三量体コイルドコイルの形成を有利にする残基（Ｉｌｅ残基など）で置き換えてもよい。また、好ましさは低いが、ｅ位とｇ位における不利であり得るイオン性相互作用を欠失させてもよく、またはｅ位とｇ位において有利となり得るイオン性相互作用を付加してもよい。
操作するのに好ましいＨＲＢドメインの領域は、Ｐ４８４〜Ｎ５１７間の７反復である。変異の標的とするａ残基とｄ残基の好ましい例は、Ｆ４８８、Ｉ４９２、Ｖ４９５、Ｉ４９９、Ｓ５０２、Ｉ５０６、Ｓ５０９、Ｌ５１２、およびＶ５１６である。セリン残基は、親水性残基が疎水性残基で置き換えられるとコイルドコイルの疎水性コアが安定化されるため特に好ましい。別の好ましい標的は、フェニルアラニンのコア内により良好に入れられる小さい疎水性残基（イソロイシンなど）での置き換えであり得る。
（ＨＲＡドメインの三量体の不安定化）
本発明の別の好ましい態様では、Ｆタンパク質の融合後コンフォメーションは、ＨＲＡドメインの三量体の不安定化によって不利となり得る。ＨＲＡドメインは、融合後形態および場合によっては１つ以上の中間形態の三重コイルドコイルを形成する。一例として、７反復のａ位および／またはｄ位の１つ以上の残基を、安定な三量体コイルドコイルの形成を不利にする残基で置き換えてもよい。また、好ましさは低いが、ｅ位とｇ位における有利であり得るイオン性相互作用を欠失させてもよく、またはｅ位とｇ位において不利となり得るイオン性相互作用を付加してもよい。好ましくは、融合前形態および融合後形態のＰＩＶ５ Ｆタンパク質の入手可能な結晶構造に基づいてモデル設計され得るような、融合前コンフォメーションのＨＲＡドメインの安定性に対する影響が最小限であるような変異が選択される。
（他の修飾）
前述の修飾に加え、修飾は、さらに、融合前形態および融合後形態のＰＩＶ５ Ｆタンパク質の入手可能な結晶構造に基づいたｈＲＳＶ Ｆタンパク質の分子モデル設計に基づいて設計され得る。融合後コンフォメーション（ＨＲＡおよびＨＲＢドメインの６ＨＢフォールド体など）を不安定化させる変異、または融合前コンフォメーション（融合前コンフォメーションのＨＲＡフォールド体など）を安定化させる変異が行なわれ得る。また、融合後コンフォメーションに至る遷移のエネルギー障壁を増大させてもよい。当業者は、最初のコンフォメーションの安定化または最後のコンフォメーションの不安定化は、エネルギー障壁の増大効果を有することがあり得ることを認識するが、遷移自体に影響を及ぼす他の修飾を導入してもよい。
さらなる一例として、ＨＲＢドメインのＮ末端のアミノ酸（ａ．ａ．４４９〜４８２付近、好ましくは、Ｖ４５９−Ｆ４８３）は、ＨＲＢドメインが融合後コンフォメーションの６ＨＢに関与し得るように、ＨＲＢドメインがＦタンパク質三量体の一方側から他方側にシフトすることを可能にする「テザー（ｔｅｔｈｅｒ）」としての機能を果たす。このようなアミノ酸の１つ以上を欠失させると、Ｆタンパク質の融合後コンフォメーションの６ＨＢフォールド体へのＨＲＢドメインの関与が障害または明白に抑制される（図３参照）。また、テザーと融合前コンフォメーションのＦタンパク質との間の相互作用を安定化すると、ＨＲＢドメインが６ＨＢフォールド体に関与することが可能となるようにテザーが引き離されることが抑制され得る。行なわれ得る安定化変異の例は、テザーと、該テザーが融合前コンフォメーションで接触するＦタンパク質部分との間のシステインブリッジである。
また別の例は、融合前コンフォメーションのＨＲＡ（残基Ｔ５０〜Ｙ３０６）の安定化である。この場合も、相同Ｆタンパク質の結晶構造に基づいて、疎水性コアは、埋もれた親水性またはイオン性の残基を類似した大きさの疎水性残基で置き換えることにより安定化され得る。また、システインブリッジを表面またはコア内に導入してもよい。また、リゾチーム変異型での広範な結晶構造分析で示されたように、その疎水性コアまたはタンパク質は比較的堅く、したがって、細孔の導入により予測どおりにリゾチーム変異型は不安定化された。同様に、融合前コンフォメーションのＦタンパク質のコアを作り変えて（ｒｅｐａｃｋｉｎｇ）任意の天然の細孔をなくすと、融合前形態または中間形態のＦタンパク質が安定化され得、したがって、融合後コンフォメーションが不利となり得る。
（組成物の調製方法）
本発明は、組成物の調製方法、およびＲＳＶ Ｆタンパク質を含む組成物、特に、可溶性のＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドを含む組成物、例えば、免疫原性組成物に関する。好ましくは、ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドは、単一の形態（非切断単量体、非切断三量体、切断三量体、切断三量体のロゼットなど）であるか、またはかかる形態のサブセット間での動的平衡（例えば、非切断単量体と非切断三量体との平衡）状態である。本発明により、いくつかの利点がもたらされる。例えば、本明細書に記載のように、本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の優性である所望の形態、もしくはＲＳＶ Ｆタンパク質の単一の所望の形態（非切断単量体、非切断三量体、切断三量体、切断三量体のロゼットなど）、かかる形態のサブセット間での動的平衡（例えば、非切断単量体と非切断三量体との平衡）、またはＲＳＶ Ｆタンパク質の所望の形態の混合物を含む組成物の作製方法を提供する。このような型の組成物は、ワクチンの作製に使用され得る免疫原性組成物の作製など、さまざまな目的に使用され得る。免疫原性組成物中におけるＲＳＶ Ｆの単一の所望の形態の存在、または既知の形態間での動的平衡の存在により、処方、可溶性および安定性がより予測可能となり、該組成物を被験体に投与した場合の免疫応答がより予測可能となる。
ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを慣用的な組換え発現によって宿主細胞内で産生させた場合、該ポリペプチドは、培養培地中に分泌される前に、宿主細胞内での産生中に、１０９／１１０位付近と１３６／１３７位付近のフリン切断部位で切断される。宿主細胞によって該ポリペプチドが切断されると、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのリフォールディングが許容され、これにより、疎水性の融合ペプチドの露出がもたらされる。したがって、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、露出された融合ペプチドの存在によって、ロゼットを形成し、宿主細胞および培養培地に由来する脂質およびリポタンパク質と会合する。実際、昆虫細胞において産生され、ＨＩＳ６−タグによって精製された切断型ＲＳＶ Ｆエクトドメインの電子顕微鏡検査では、該ポリペプチドが、融合後形態と整合する松葉杖形状を有し、残留細胞残屑と思われるものに結合していることが示された。したがって、ロゼットおよび他の形態の高純度調製物ならびにＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの確認は、宿主細胞での慣用的な組換え発現では容易に得られないだろう。
（切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの作製方法）
一態様において、本発明は、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物の調製方法である。一般に、該方法は、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを準備すること、次いで該ポリペプチドを切断し、Ｆ１サブユニットとＦ２サブユニットを生成させることを伴う。本明細書に記載のように、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、夾雑している脂質とリポタンパク質から、適当な方法（サイズ排除クロマトグラフィーなど）を用いて容易に精製および分離され得る。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、疎水性の融合ペプチドは、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドでは露出されておらず、したがって、非切断型ポリペプチドは、脂質／リポタンパク質夾雑物と会合しないと考えられる。本明細書においてさらに記載するように、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインは、切断されるとＦ１およびＦ２サブユニットが生成され得、これらは、三量体、三量体のロゼット、または三量体と三量体のロゼットの混合物として精製され得る。
非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、任意の適当な方法を用いて作製され得る。例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが産生されている時点では活性なフリンまたはフリン様プロテアーゼを含まない宿主細胞での組換え産生による。この産生方法を行なうのに、さまざまな方法、例えば、フリンまたはフリン様プロテアーゼの発現が抑制されるように変異した（条件付きで、または完全に「ノックアウト」の）組換え宿主細胞での産生、および例えば、ＲＮＡ干渉または他の同様の方法を用いて、あるいは宿主細胞におけるフリンまたはフリン様プロテアーゼ活性を該プロテアーゼのインヒビターを用いて阻害し、宿主細胞でのフリンまたはフリン様プロテアーゼの発現を低減または抑制する種々の方法が使用され得る。
非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、好ましくは、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが該ポリペプチドを非切断型で産生する宿主細胞によって分泌されるように、フリン切断部位のアミノ酸配列が改変されたＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインをコードする構築物の組換え発現によって作製される。非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、任意の適当な宿主細胞（昆虫細胞（例えば、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、および齧歯類（例えば、ハムスター））、鳥類細胞（例えば、ニワトリ、アヒル、およびガチョウ）、細菌（例えば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびストレプトコッカス種）、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、テトラヒメナ細胞（例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）など、またはその組合せ）を用いて作製され得る。多くの適当な昆虫細胞および哺乳動物細胞が当該技術分野でよく知られている。好適な昆虫細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞、およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（親Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４細胞系統に由来するクローン単離株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））が挙げられる。好適な哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞、典型的には、剪断アデノウイルス５型ＤＮＡで形質転換されたもの）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、２９３−Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７５）、アカゲザル胎仔肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ−１６０）、マディン−ダービーウシ腎（「ＭＤＢＫ」）細胞、マディン−ダービーイヌ腎（「ＭＤＣＫ」）細胞（例えば、ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４；またはＭＤＣＫ ３３０１６、ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）、乳仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞）などが挙げられる。好適な鳥類細胞としては、例えば、ニワトリ胚性幹細胞（例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、アヒル細胞（例えば、ＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞系統（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ）、これらは、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：４９７５−４９８２（２００９）およびＷＯ２００５／０４２７２８に記載されている）、ＥＢ６６細胞などが挙げられる。
好適な昆虫細胞発現系（バキュロウイルス系など）は当業者に知られており、例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されている。バキュロウイルス／挿入細胞発現系のための材料および方法はキットの形態で、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）から市販されている。また、鳥類細胞発現系も当業者に知られており、例えば、米国特許第５，３４０，７４０号；同第５，６５６，４７９号；同第５，８３０，５１０号；同第６，１１４，１６８号；および同第６，５００，６６８号；欧州特許番号ＥＰ０７８７１８０Ｂ；欧州特許出願番号ＥＰ０３２９１８１３．８；ＷＯ０３／０４３４１５；ならびにＷＯ０３／０７６６０１に記載されている。また、同様に、細菌発現系および哺乳動物細胞発現系も当該技術分野で知られており、例えば、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編，１９８９）（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）に記載されている。
一般的に、非切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインのアミノ酸配列は、１０９／１１０位付近と１３６／１３７位付近のフリン切断部位での切断は抑制されるように改変されているが、切断されるとＦ１サブユニットとＦ２サブユニットが生成される天然に存在するかまたは導入のプロテアーゼ切断部位を含む。例えば、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、１０９／１１０位付近と１３６／１３７位付近のフリン切断部位での切断が抑制されるように改変されたアミノ酸配列を有するが、１０１位付近〜１６１位付近に１つ以上の天然に存在するかまたは導入のプロテアーゼ切断部位を含むものであり得る。
非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが宿主細胞によって産生および発現されることを可能にするさまざまな具体的なアミノ酸配列（例えば、１０９／１１０位付近と１３６／１３７位付近のフリン切断部位で切断されないアミノ酸配列）が、当業者に容易に設計され、想定され得よう。一般に、１０９／１１０位付近と１３６／１３７位付近のフリン切断部位の一部であるか、または該部位付近に存在している１つ以上のアミノ酸が独立して、置き換えられているか、または欠失している。ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの切断を抑制するのに適したアミノ酸置換および欠失がいくつか知られている。例えば、置換Ｒ１０８Ｎ、Ｒ１０９Ｎ、Ｒ１０８Ｎ／Ｒ１０９Ｎ（これらにより１０９／１１０での切断が抑止される）、および置換Ｋ１３１Ｑまたは１３１〜１３４位のアミノ酸の欠失（これらにより１３６／１３７での切断が抑止される）が、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｅｙｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：９８５９−９８６４（２００１）に記載されている。アミノ酸置換Ｒ１０８Ｎ／Ｒ１０９Ｎ／Ｋ１３１Ｑ／Ｒ１３３Ｑ／Ｒ１３５Ｑ／Ｒ１３６Ｑを含む非切断型ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドも記載されている。Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８５：３６７７６８７（２００４）。本明細書において詳細に記載しているように、宿主細胞から非切断型でのＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドの分泌をもたらすさらなるＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列は、改変型フリン切断部位を含むもの、例えば、１０６〜１０９位付近と１３３〜１３６位付近のアミノ酸配列が改変されたものである。改変型フリン切断部位には、１０６〜１０９位付近での少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失、および１３３〜１３６位付近での少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失が含まれる。
同様に、切断されるとＦ１を含む第１のサブユニットとＦ２を含む第２のサブユニットが生成されるプロテアーゼ切断部位（例えば、天然に存在するかまたは導入）を含む非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのさまざまな具体的なアミノ酸配列が可能であり、容易に設計され、想定され得る。例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質の１０１位付近〜１６１位付近のアミノ酸配列にトリプシン切断部位を含めて、該トリプシン切断部位の１つ以上をトリプシンによって切断し、Ｆ１およびＦ２サブユニットを生成させ得る。所望により、１つ以上の適当なプロテアーゼ認識部位を、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドに導入してもよい（例えば、１０１位付近〜１６１位付近）。導入されたプロテアーゼ認識部位は、Ｆ１およびＦ２サブユニットが生成されるように、適切なプロテアーゼを用いて切断され得る。プロテアーゼ認識部位を非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列に導入する場合、該部位は、天然に存在するＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインは切断しないプロテアーゼによって認識されるものであることが好ましい。
本発明のこの態様の方法は、ａ）切断されるとＦ１およびＦ２サブユニットが生成されるプロテアーゼ切断部位を含む非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを準備すること、ならびにｂ）該非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、該プロテアーゼ切断部位を認識するプロテアーゼで切断することを含む。一般に、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は改変型フリン切断部位を含み、該ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ポリペプチドを１０６〜１０９位付近と１３１〜１３６位付近のフリン切断部位において非切断の状態で産生する宿主細胞から分泌される。
準備した非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを所望の度合まで精製してもよい。例えば、準備した非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、実質的に未加工処理（例えば、未加工処理、もしくは清澄化のみ）のの細胞溶解物、細胞ホモジネートまたは細胞馴化培養培地として、または一部もしくは実質的に精製された形態において、準備したものであり得る。具体的な例では、準備した非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、昆虫細胞馴化培地、哺乳動物細胞馴化培地、鳥類細胞馴化培地、酵母細胞馴化培地、テトラヒメナ細胞馴化培地、およびその組合せからなる群より選択される細胞馴化培養培地において準備したものである。
一般的に、準備した非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを精製すること、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または実質的に均質になるまで精製することが好ましい。本明細書に記載のように、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは脂質とリポタンパク質から容易に精製され得、一方で、慣用的に生成されるＲＳＶ Ｆタンパク質の切断型形態は、脂質およびリポタンパク質夾雑物とともに共精製される（ｃｏ−ｐｕｒｉｆｙ）。したがって、精製された非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを準備した場合、該方法を用いて、実質的に脂質またはリポタンパク質が含まれていない切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインを含む組成物が容易に作製され得る。
プロテアーゼを用いてポリペプチドを切断するための好適な方法は、よく知られており、当該技術分野で慣用的である。一般的に、切断対象のポリペプチドを十分な量のプロテアーゼと、該ポリペプチドの切断に適した条件（例えば、ｐＨ、ポリペプチドおよびプロテアーゼの濃度、温度）下で合わせる。多くの好適なプロテアーゼが市販されており、ポリペプチドの切断を行なうための好適な条件は、多くのプロテアーゼについてよく知られている。所望により、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、プロテアーゼでの切断後に精製してもよい。
該方法の一例では、インタクトな融合ペプチドを含む非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド（１３７〜１５４位のアミノ酸のいずれも置換または欠失されていない非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドなど）を準備する。一部の実施形態では、準備した非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを精製する。インタクトな融合ペプチドを含む準備した非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを切断すると、切断により、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体のロゼットの形成がもたらされる。所望により、ロゼットを、任意の適当な方法（サイズ排除クロマトグラフィーなど）を用いてさらに精製してもよい。
該方法の別の例では、改変型融合ペプチドを含む非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド（アミノ１３７〜１５２付近、アミノ酸１３７〜１５３付近、アミノ酸１３７〜１４５付近またはアミノ酸１３７〜１４２付近が欠失している非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドなど）を準備する。また、他の適当な融合ペプチドの欠失も記載されている（１３７〜１４６位のアミノ酸の欠失など）。Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８５：３６７７−３６８７（２００４）。
一部の実施形態では、準備した非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを精製する。準備した非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを切断すると、切断により、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの三量体の形成がもたらされる。所望により、三量体を、任意の適当な方法（サイズ排除クロマトグラフィーなど）を用いてさらに精製してもよい。
該方法の具体的な例では、準備した非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、ｆｕｒｄｅｌおよびｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｄｅｌ（例えば、均質なトリプシン切断性ｆｕｒｄｅｌ、均質なトリプシン切断性ｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｄｅｌ、またはトリプシン切断性ｆｕｒｄｅｌとトリプシン切断性ｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｄｅｌの混合物）からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドを含むものである。準備した非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、例えばトリプシンで切断すると、切断により、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの切断三量体、切断三量体のロゼット、または切断三量体と切断三量体のロゼットの組合せの形成がもたらされる。所望により、切断三量体および／または切断三量体のロゼットを、任意の適当な方法（サイズ排除クロマトグラフィーなど）を用いてさらに精製してもよい。
（非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの作製方法）
別の態様では、本発明は、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物の調製方法である。一般に、該方法は、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料（細胞溶解物、細胞ホモジネートまたは細胞馴化培養培地など）を準備すること、および次いで、該非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを精製することを伴う。本明細書に記載のように、精製された非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体は自己会合して非切断三量体を形成することができること、および非切断単量体と非切断三量体の混合物または非切断単量体と非切断三量体との平衡が存在することを見い出した。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、該平衡は、単量体に有利に働くが、濃縮溶液中では三量体に該平衡がシフトすると考えられる。
本発明のこの態様の方法は、ａ）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料（細胞溶解物、細胞ホモジネートまたは細胞馴化培養培地など）を準備すること；およびｂ）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、三量体または単量体と三量体の組合せを、該生物学的材料から精製することを含む。一部の実施形態では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体を精製するか、または非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体を精製するか、または単量体と三量体を精製する。
一般に、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は改変型フリン切断部位を含み、該ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ポリペプチドを１０１位付近〜１６１位付近（例えば、１０６〜１０９位および１３１〜１３６位のフリン切断部位）において非切断の状態で産生する宿主細胞から分泌される。より具体的な例では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料は、ｆｕｒｍｔ、ｆｕｒｄｅｌ、ｄｅｌｐ２１ ｆｕｒｘ、ｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｘ、ｄｅｌｐ２１ ｆｕｒｄｅｌ、ｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｄｅｌ、および第Ｘａ因子構築物（これは第Ｘａ因子を用いて切断され得る）からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は改変型フリン切断部位を含み、１０１位付近と１６１位付近との間の他のプロテアーゼ切断部位（例えば、トリプシン切断部位）は、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）切断が抑制されるように改変されているか、または欠失している。例えば、トリプシンは、リジン残基およびアルギニン残基の後を切断することがよく知られている。一部の特定の好ましい実施形態では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は改変型フリン切断部位を含み、１０１位付近と１６１位付近との間に存在している１つ以上のリジンおよび／またはアルギニン残基（例えば、すべてのリジン残基とアルギニン残基）が欠失しているか、あるいはリジンもしくはアルギニンではないアミノ酸で置き換えられており、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ポリペプチドを１０１位付近と１６１位付近との間を非切断の状態で産生する宿主細胞から分泌され、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドはトリプシンによって１０１位付近と１６１位付近との間が切断されない。好ましくは、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ ＮａＣｌ中で希釈）を、１対１０００容積のトリプシン溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ ＮａＣｌ中で１ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈したウシ血漿由来のトリプシン；消化反応物中の最終質量比は、トリプシン：ＲＳＶ Ｆエクトドメインが０．００１：１である；トリプシンは１０〜１５ ＢＡＥＥ単位／ｍｇタンパク質で使用）で３７℃にて１時間処理した場合、トリプシンによって切断されない。
所望により、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド（例えば、改変型（ａｌｔｅｒ）フリン切断部位を含む該ポリペプチド、および改変型フリン切断部位と改変型トリプシン切断部位を含むポリペプチド）は、さらに、改変型融合ペプチド（例えば、アミノ酸１３７〜１５２付近が欠失しているか、アミノ酸１３７〜１５４付近が欠失しているか、アミノ酸１３７〜１４５付近が欠失しているか、またはアミノ酸１３７〜１４２付近が欠失している非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドなど）を含むものであってもよい。また、他の適当な融合ペプチドの欠失も記載されている（１３７〜１４６位のアミノ酸の欠失など）。Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８５：３６７７−３６８７（２００４）。
具体的な実施形態では、該方法は、ａ）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料（細胞溶解物、細胞ホモジネートまたは細胞馴化培養培地など）を準備すること（ここで、該非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列は改変型フリン切断部位を含み、１０１位付近と１６１位付近との間に存在するリジン残基とアルギニン残基が欠失しているか、あるいはリジンもしくはアルギニンではないアミノ酸で置き換えられており、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ポリペプチドを１０１位付近と１６１位付近との間を非切断の状態で産生する宿主細胞から分泌され、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドはトリプシンによって１０１位付近と１６１位付近との間が切断されない）；およびｂ）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、三量体または単量体と三量体の組合せを、該生物学的材料から精製することを含む。
より具体的な例では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料は、Ｆｕｒｘ、Ｆｕｒｘ Ｒ１１３Ｑ Ｋ１２３Ｎ Ｋ１２４Ｎ、ｄｅｌｐ２１ ｆｕｒｘおよびｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｘからなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む。
他の具体的な実施形態では、該方法は、ａ）融合ペプチドが変異した（例えば、該融合ペプチドの少なくとも一部分が欠失している）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料（細胞溶解物、細胞ホモジネートまたは細胞馴化培養培地など）を準備すること；およびｂ）非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを該生物学的材料から精製することを含む。非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは改変型フリン切断部位を含むものであり得、該ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ポリペプチドを１０１位付近〜１６１位付近（例えば、１０６〜１０９位および１３１〜１３６位のフリン切断部位）において非切断の状態で産生する宿主細胞から分泌される。所望により、改変型フリン切断部位を有する非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、さらに、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）切断が抑制されるように、１０１位付近と１６１位付近との間の他のプロテアーゼのための部位（例えば、トリプシン切断部位）の改変または欠失を含んでいる。例えば、１０１位付近と１６１位付近との間に存在している１つ以上のリジンおよび／またはアルギニン残基（例えば、すべてのリジン（ｌｙｓｉｎｇ）残基とアルギニン残基）が欠失しているか、あるいはリジンもしくはアルギニンではないアミノ酸で置き換えられており、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドはトリプシンによって１０１位付近と１６１位付近との間が切断されない。
非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、三量体および単量体と三量体の組合せを、所望の度合まで精製してもよい。一般的に、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体または三量体を、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または実質的に均質になるまで精製することが好ましい。本明細書に記載のように、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは脂質とリポタンパク質から、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって容易に精製され得る。したがって、該方法を用いて、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、三量体、または単量体と三量体の組合せを含み、実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない組成物が容易に作製され得る。
一例では、該方法は、昆虫細胞馴化培養培地、哺乳動物細胞馴化培養培地、鳥類細胞馴化培地、酵母細胞馴化培地、テトラヒメナ細胞馴化培地、またはその組合せを準備することを含む。一部の実施形態では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体を精製する。他の実施形態では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体を精製する。他の実施形態では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体と三量体を精製する。
（改変型融合ペプチドを有する切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの作製方法）
一態様において、本発明は、改変型融合ペプチドを含む切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物の調製方法である。改変型フリン切断部位を含まないＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを宿主細胞で発現させると、該ポリペプチドは一部において、宿主細胞が該ポリペプチドを１０９／１１０位付近と１３６／１３７位付近のフリン部位で切断し、Ｆ１およびＦ２サブユニットを生成させることによってプロセッシングされる。プロセッシングされたポリペプチドは培地中に分泌され、会合したＦ１−Ｆ２サブユニット（例えば、ジスルフィド結合性Ｆ１およびＦ２サブユニット）として収集され得、該サブユニットは、露出した融合ペプチドの凝集によって三量体のロゼットを形成することがあり得る。改変型融合ペプチドを含むＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、宿主細胞中で、会合したＦ１−Ｆ２サブユニットとして産生および分泌され得、好ましくは、ロゼットに凝集しないか、または脂質もしくはリポタンパク質夾雑物と凝集しないものである。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、該ポリペプチドは、改変型融合ペプチドが凝集を媒介しないため、ロゼットを形成しないか、または脂質およびリポタンパク質夾雑物と会合しないと考えられる。
本発明のこの態様の方法は、ａ）改変型融合ペプチド（例えば、該融合ペプチドの少なくとも一部分が欠失している）を含む切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料（細胞溶解物、細胞ホモジネートまたは細胞馴化培養培地など）を準備すること；およびｂ）切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを該生物学的材料から精製することを含む。精製された切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、切断三量体、切断三量体のロゼット、または切断三量体と切断三量体のロゼットの混合物として精製されたものであり得る。改変型融合ペプチドを含む好適なＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、１０９／１１０付近と１３６／１３７付近に切断可能なフリン切断部位を含み、さらに、本明細書に記載の改変型融合ペプチドを含むものである。例えば、アミノ酸１３７〜１５２付近が欠失しているか、アミノ酸１３７〜１５３付近が欠失しているか、アミノ酸１３７〜１４５付近が欠失しているか、アミノ酸１３７〜１４６付近が欠失しているか、またはアミノ酸１３７〜１４２付近が欠失しているＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが、該方法において使用され得る。具体的な例では、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料は、少なくとも融合ペプチド欠失１を含む。
切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド（例えば、切断三量体または切断三量体と切断三量体のロゼットの混合物）を所望の度合まで精製してもよい。一般的に、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または実質的に均質になるまで精製することが好ましい。本明細書に記載のように、改変型融合ペプチドを含む切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは脂質とリポタンパク質から、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって容易に精製され得る。したがって、該方法を用いて、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの三量体、切断三量体のロゼット、または切断三量体と切断三量体のロゼットの組合せを含み、実質的に脂質とリポタンパク質が含まれていない組成物が容易に作製され得る。
（Ｃ末端側フリン変異を有するＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの作製方法）
別の態様では、本発明は、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶエクトドメインポリペプチドを含む組成物の調製方法、および切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの調製方法である。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該タンパク質を産生する細胞によって、１０９／１１０位（ｐｏｓｔｉｏｎ）付近のフリン切断部位で切断されるが１３６／１３７位付近のフリン切断部位では切断されず、培地中に、Ｆ２サブユニットと会合したＦ１サブユニットとして分泌されると考えられる。さらに、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドでは疎水性の融合ペプチドは露出されず、したがって、このＣ末端側非切断型のポリペプチドは脂質およびリポタンパク質夾雑物と会合しないと考えられる。本明細書においてさらに記載するように、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインをさらに切断し、アミノ末端が１１０位〜１６１位付近であり、Ｆ２サブユニットと会合しているＦ１サブユニットを生成させてもよい。かかるＦ１およびＦ２サブユニットは、三量体、三量体のロゼット、または三量体と三量体のロゼットの混合物として精製され得る。
一般的に、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインのアミノ酸配列は、１３６／１３７位付近のフリン切断部位での切断が抑制されるように改変されているが、切断されるとＦ１サブユニット（そのアミノ末端は１１０位〜１６１位付近である）とＦ２サブユニットが生成される天然に存在するかまたは導入のプロテアーゼ切断部位を含む。例えば、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、１３６／１３７位付近のフリン切断部位での切断は抑制されるが、１０１位付近〜１６１位付近に１つ以上の天然に存在するかまたは導入のプロテアーゼ切断部位を含むように改変されたアミノ酸配列を有するものであり得る。具体的な一例では、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインのアミノ酸配列は、１３６／１３７位付近のフリン切断部位での切断は抑制されるように改変されているが、１０９／１１０位付近に天然に存在するフリン切断部位を含む。
Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが宿主細胞によって産生および発現されることを可能にするさまざまな具体的なアミノ酸配列（例えば、１３６／１３７位付近のフリン切断部位で切断されないアミノ酸配列）が、当業者に容易に設計され、想定され得よう。一般に、１３６／１３７位付近のフリン切断部位の一部であるか、または該部位付近に存在している１つ以上のアミノ酸が独立して、置き換えられているか、または欠失している。１３６／１３７位付近での切断を抑制する好適なアミノ酸置換および欠失は、本明細書において記載している。例えば、置換Ｋ１３１Ｑ、１３１〜１３４位のアミノ酸の欠失、または置換Ｋ１３１Ｑ／Ｒ１３３Ｑ／Ｒ１３５Ｑ／Ｒ１３６Ｑ（これらは各々、１３６／１３７での切断を抑止するものである）が使用され得る。一部の特定の実施形態では、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、１３３〜１３６位付近に少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失を含むものである。
同様に、切断されるとＦ１を含む第１のサブユニットとＦ２を含む第２のサブユニットが生成されるプロテアーゼ切断部位（例えば、天然に存在するかまたは導入）を含むＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのさまざまな具体的なアミノ酸配列が可能であり、容易に設計され、想定され得る。例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質の１０１位付近〜１６１位付近のアミノ酸配列にトリプシン切断部位を含め、該トリプシン切断部位の１つ以上をトリプシンによって切断し、Ｆ１およびＦ２サブユニットを生成させ得る。所望により、１つ以上の適当なプロテアーゼ認識部位を、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドに導入してもよい（例えば、１０１位付近〜１６１位付近）。導入されたプロテアーゼ認識部位は、Ｆ１およびＦ２サブユニットが生成されるように、適切なプロテアーゼを用いて切断され得る。プロテアーゼ認識部位をＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列に導入する場合、該部位は、天然に存在するＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインは切断しないプロテアーゼによって認識されるものであることが好ましい。
Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、任意の適当な方法を用いて作製され得る。好ましい方法は、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが、該ポリペプチドを１３６／１３７位付近のフリン切断部位において非切断の状態で産生する宿主細胞によって分泌されるように、１３６／１３７位付近のフリン切断部位のアミノ酸配列が改変されたＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインをコードする構築物の組換え発現によるものである。好ましくは、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ポリペプチドをＦ２サブユニットと会合しているＦ１サブユニットとして産生する宿主細胞によって分泌させ、ここで、Ｆ１サブユニットのアミノ末端は１３７位ではなく１３２位〜１６１位付近である。Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、本明細書に記載の任意の適当な宿主細胞を用いて作製され得る。
本発明のこの態様の方法の１つは、ａ）１３６／１３７位に改変型フリン切断部位を含むＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを準備すること（前記Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ペプチドを、１３６／１３７位において切断されていないがＦ１を含むサブユニットと会合しているＦ２断片の形態で産生する細胞から分泌される）、およびｂ）準備したＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインを１０１位と１６１位との間の部位で切断するプロテアーゼで切断し、それにより前記組成物を生成させることを含むものである。具体的な実施形態では、工程ｂ）は、準備したＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインを１０１〜１３２位付近の間、または１３２〜１６１位付近の間、または１１０〜１３２位付近の間の部位で切断するプロテアーゼで切断することを含む。あるいはまたさらに、一部の実施形態では、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、１３６／１３７位に改変型フリン切断部位を含むものである（ただし、該改変型フリン切断部位はアミノ酸１３１〜１３４の欠失ではないものとするものとする）。具体的な例では、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料は、少なくともＮ末端（−ｔｅｒｍ）フリンポリペプチドを含む。
準備したＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを所望の度合まで精製してもよい。例えば、準備したＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、実質的に未加工処理（例えば、未加工処理、もしくは清澄化のみ）の細胞溶解物、細胞ホモジネートまたは細胞馴化培養培地において、または一部もしくは実質的に精製された形態において、準備したものであり得る。具体的な例では、準備したＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、昆虫細胞馴化培地、哺乳動物細胞馴化培地、鳥類細胞馴化培地、酵母細胞馴化培地、テトラヒメナ細胞馴化培地、およびその組合せからなる群より選択される細胞馴化培養培地中において準備する。
一般的に、準備したＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを精製すること、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または実質的に均質になるまで精製することが好ましい。本明細書に記載のように、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは脂質とリポタンパク質から容易に精製され得、一方で、慣用的に生成されるＲＳＶ Ｆタンパク質の切断型形態は脂質およびリポタンパク質夾雑物とともに共精製される。したがって、精製されたＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを準備した場合、該方法を用いて、実質的に脂質またはリン脂質が含まれていない切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインを含む組成物が容易に作製され得る。
プロテアーゼを用いてポリペプチドを切断するための好適な方法は、よく知られており、当該技術分野で慣用的である。一般的に、切断対象のポリペプチドを十分な量のプロテアーゼと、該ポリペプチドの切断に適した条件（例えば、ｐＨ、ポリペプチドおよびプロテアーゼの濃度、温度）下で合わせる。多くの好適なプロテアーゼが市販されており、ポリペプチドの切断を行なうための好適な条件は、多くのプロテアーゼについてよく知られている。所望により、該ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、プロテアーゼでの切断後に精製してもよい。
該方法の一例では、インタクトな融合ペプチドを含むＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド（１３７〜１５４位のアミノ酸のいずれも置換または欠失されていないＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドなど）を準備する。該方法の別の例では、改変型融合ペプチドを含むＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド（アミノ１３７〜１５２付近、アミノ酸１３７〜１５３付近、アミノ酸１３７〜１４５付近またはアミノ酸１３７〜１４２付近が欠失しているＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドなど）を準備する。また、他の適当な融合ペプチドの欠失も記載されている（１３７〜１４６位のアミノ酸の欠失など）。Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８５：３６７７−３６８７（２００４）。
一部の実施形態では、準備したＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを精製する。準備した非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを切断すると、切断により、切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの三量体の形成がもたらされる。所望により、三量体を、任意の適当な方法（サイズ排除クロマトグラフィーなど）を用いてさらに精製してもよい。
該方法の具体的な例では、準備したＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、少なくともＮ末端側のフリンポリペプチドを含むものである（図１）。準備したＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを、例えばトリプシンで切断すると、切断により、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの切断三量体、切断三量体のロゼット、または切断三量体と切断三量体のロゼットの組合せの形成がもたらされる。所望により、切断三量体および／または切断三量体のロゼットを、任意の適当な方法（サイズ排除クロマトグラフィーなど）を用いてさらに精製してもよい。
本発明のこの態様の別の方法は、ａ）１３６／１３７位に改変型フリン切断部位を含むＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料（細胞溶解物、細胞ホモジネートまたは細胞馴化培養培地など）を準備すること（前記可溶性のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、該ペプチドを、１３６／１３７位において切断されていないがＦ１を含むサブユニットと会合しているＦ２断片の形態で産生する細胞から分泌される（ただし、該改変型フリン切断部位はアミノ酸１３１〜１３４の欠失ではないものとする））；およびｂ）Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを該生物学的材料から精製し、それにより組成物を生成させることを含む。好ましくは、Ｆ１サブユニットのアミノ末端は１１０位付近〜１３２位付近である。より好ましくは、Ｆ１サブユニットのアミノ末端は１１０位付近である。Ｆ１サブユニットのアミノ末端が１３７位ではないことが特に好ましい。具体的な例では、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料は、少なくともＮ末端側のフリンポリペプチドを含む。
所望により、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、さらに、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）切断が抑制されるように、１０１位付近と１６１位付近との間の他のプロテアーゼのための部位（例えば、トリプシン切断部位）の改変または欠失を含んでいる。例えば、１０１位付近と１６１位付近との間に存在している１つ以上のリジンおよび／またはアルギニン残基（例えば、すべてのリジン残基とアルギニン残基）が欠失しているか、あるいはリジンもしくはアルギニンではないアミノ酸で置き換えられており、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドはトリプシンによって１０１位付近と１６１位付近との間が切断されない。Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、インタクトな融合ペプチドまたは改変型融合ペプチド（本明細書に記載している）を含むものであり得る。
Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド（例えば、単量体、三量体および単量体と三量体の組合せ）を、所望の度合まで精製してもよい。一般的に、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体または三量体を、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または実質的に均質になるまで精製することが好ましい。本明細書に記載のように、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは脂質およびリポタンパク質から、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって容易に精製され得る。したがって、該方法を用いて、実質的に脂質およびリポタンパク質が含まれていないＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド（例えば、単量体、三量体、または単量体と三量体の組合せ）を含む組成物が容易に作製され得る。該方法の具体的な例では、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、少なくともＮ末端側のフリンポリペプチドを含むものである（図１）。
一例では、該方法は、昆虫細胞馴化培養培地、哺乳動物細胞馴化培養培地、鳥類細胞馴化培地、酵母細胞馴化培地、テトラヒメナ細胞馴化培地またはその組合せを準備することを含む。一部の実施形態では、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質（ｐｒｏｔｅａｎ）のエクトドメインポリペプチド三量体を精製する。他の実施形態では、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体を精製する。他の実施形態では、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体と三量体を精製する。
（自己複製ＲＮＡ）
本明細書に記載のＲＳＶ−Ｆポリペプチドは、該ポリペプチドをコードする組換え核酸を被験体の細胞で発現させることによって作製され得る。ＲＳＶ−Ｆポリペプチドの生成をもたらすために被験体に投与され得る好ましい（ｐｒｅｆｅｒｅｅｄ）核酸は自己複製ＲＮＡ分子である。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡを基礎としているが、１つ以上の構造タンパク質をコードする遺伝子が欠損している。自己複製ＲＮＡ分子は、翻訳されると、該自己複製ＲＮＡにコードされたＲＮＡウイルスの非構造タンパク質と異種タンパク質を生成し得るものである。
自己複製ＲＮＡは、一般的に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼおよび他の非構造ウイルスタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を含み、また、５’−および３’末端シス活性複製配列、ならびに所望により、所望のアミノ酸配列（例えば、タンパク質、抗原）をコードする異種配列も含む。該異種配列の発現を指令するサブゲノムプロモーターを自己複製ＲＮＡに含めてもよい。所望により、該異種配列を、インフレームで他のコード領域と自己複製ＲＮＡ内で融合させてもよく、および／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の制御下にしてもよい。
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、該自己複製ＲＮＡ分子によって感染性ウイルス粒子の生成が誘導されない場合があるように設計され得る。これは、例えば、自己複製ＲＮＡ内のウイルス粒子の生成に必要な構造タンパク質をコードしている１つ以上のウイルス遺伝子を削除することによりなされ得る。例えば、自己複製ＲＮＡ分子がアルファウイルス（シンドビス（Ｓｉｎｅｂｉｓ）ウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）など）を基礎としているものである場合、ウイルスの構造タンパク質（キャプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質など）をコードする１つ以上の遺伝子が削除され得る。所望により、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、弱毒化されたか、もしくはビルレントな感染性ウイルス粒子の生成、または１ラウンドの後の感染が行なわれ得るウイルス粒子の生成が誘導されるように設計されることがあり得る。
自己複製ＲＮＡ分子は、脊椎動物細胞に送達されると、なんらタンパク質がなくても、自身（または自身のアンチセンスコピー）からの転写によって複数の娘ＲＮＡの生成をもたらすことができるものである。自己複製ＲＮＡは細胞への送達後、直接翻訳され得、この翻訳によりＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがもたらされ、次いで、これにより、送達されたＲＮＡから転写物が生成される。したがって、送達されたＲＮＡにより、複数の娘ＲＮＡの生成がもたらされる。この転写物は、送達されたＲＮＡに対してアンチセンスであり、これ自体を翻訳して遺伝子産物のインサイチュ発現をもたらしてもよく、またはコードされたＲＳＶ−Ｆポリペプチドのインサイチュ発現をもたらすように翻訳される、送達ＲＮＡと同じセンスであるさらなる転写物を得るために転写されてもよい。
自己複製を行なうのに適当な系の一例は、アルファウイルス系ＲＮＡレプリコンの使用である。このような＋鎖レプリコンは、細胞への送達後に翻訳され、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ−トランスクリプターゼ）が生成される。このレプリカーゼは自己切断して＋鎖の送達ＲＮＡのゲノム−鎖コピーを生成させる複製複合体をもたらすポリタンパク質として翻訳される。このような−鎖転写物は、自身が転写されて、さらなる＋鎖親ＲＮＡコピーがもたらされ、また、ＲＳＶ−Ｆポリペプチドをコードするサブゲノム転写物ももたらされることもあり得る。したがって、サブゲノム転写物の翻訳により、感染細胞によるＲＳＶ−Ｆポリペプチドのインサイチュ発現がもたらされる。好適なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼが使用されたものであり得る。
したがって、好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと、（ｉｉ）ＲＳＶ−Ｆポリペプチドをコードしているものである。該ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ４を含むアルファウイルスのレプリカーゼであり得る。
天然のアルファウイルスのゲノムは、非構造レプリカーゼポリタンパク質に加えて構造ビリオンタンパク質をコードしているが、アルファウイルス系の本発明の自己複製ＲＮＡ分子はアルファウイルスの構造タンパク質をコードしていないことが好ましい。したがって、自己複製ＲＮＡは、細胞内で自身のゲノムＲＮＡコピーの生成はもたらし得るが、ＲＮＡ含有アルファウイルスのビリオンの生成はもたらさないものである。このようなビリオンが生成できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、自己複製ＲＮＡ分子が感染性形態で永続的に存在しないであろうことを意味する。野生型ウイルスの永続的存在に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡには存在せず、代わりに、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子（１つまたは複数）が採用されており、そのため、サブゲノム転写物は、アルファウイルスの構造ビリオンタンパク質ではなく所望の遺伝子産物をコードしている。
したがって、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有するものであり得る。第１（５’）のオープンリーディングフレームはレプリカーゼをコードしており；第２（３’）のオープンリーディングフレームはＲＳＶ−Ｆポリペプチドをコードしている。一部の実施形態では、該ＲＮＡは、例えば、さらなる所望の遺伝子産物をコードするさらなる（下流）オープンリーディングフレームを有するものであり得る。自己複製ＲＮＡ分子は、コードされたレプリカーゼと適合性である５’配列を有するものであってもよい。
一態様において、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルスに由来するもの、またはアルファウイルスが基礎であるものである。他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくは、プラス鎖のＲＮＡウイルス、より好ましくは、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパチウイルス、カリシウイルス、またはコロナウイルスに由来するもの、または該ウイルスが基礎であるものである。好適な野生型アルファウイルス配列は、よく知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）などの配列寄託機関から入手可能である。適当なアルファウイルスの代表的な例としては、アウラ（ＡＴＣＣ ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６００，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４０）、カバソウ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６４，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６５，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３６９，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４３）、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ ＶＲ−６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−１２７７）、ミドルバーグ（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８０，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７２，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４５）、ロス川ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６８，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４８）、トネート（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２５）、トリニチ（Ｔｒｉｎｉｔｉ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−４６９）、ウナ（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ ＶＲ−６９，ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０ ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４９，ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ ＶＲ−７０，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５１，ＡＴＣＣ ＶＲ−６２２，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７５）が挙げられる。
自己複製ＲＮＡを送達系と結合させてもよい。自己複製ＲＮＡはアジュバントとともに、またはなしで投与され得る。
（ＲＮＡ送達系）
本発明の自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡでの送達、または脂質、ポリマーもしくは細胞内への侵入を容易にする他の化合物との組合せなどのさまざまなモダリティでの送達に適している。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は標的細胞または被験体に、任意の適当な手法を用いて、例えば、直接注射、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、粒子銃（ｂｉｏｌｙｓｔｉｃ）などによって導入され得る。また、自己複製ＲＮＡ分子は細胞内に、受容体媒介性エンドサイトーシスによっても導入され得る。例えば、米国特許第６，０９０，６１９号；ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１（１９８８）；ならびにＣｕｒｉｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８８５０（１９９１）を参照のこと。例えば、米国特許第６，０８３，７４１号には、外因性核酸を哺乳動物細胞に、該核酸をポリカチオン部分（例えば、３〜１００個のリジン残基を有するポリ−Ｌ−リジン）（該部分自体はインテグリン受容体結合部分（例えば、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを有する環状ペプチド）にカップリングされている）に会合させることにより導入することが開示されている。
本発明の自己複製ＲＮＡ分子を細胞内に両親媒性物質によって送達してもよい。例えば、米国特許第６，０７１，８９０号を参照のこと。典型的には、核酸分子はカチオン性両親媒性物質と複合体を形成し得る。該複合体は、哺乳動物細胞と接触すると該細胞に容易に取り込まれ得る。
自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡとして（例えば、単にＲＮＡの水溶液として）送達してもよいが、細胞内への進入、また、その後の細胞間効果を向上させるため、自己複製ＲＮＡは、好ましくは、送達系（粒状またはエマルジョンの送達系など）と組み合わせて投与する。数多くの送達系がよく当業者に知られている。かかる送達系としては、例えば、リポソーム系送達（ＤｅｂｓおよびＺｈｕ（１９９３）ＷＯ９３／２４６４０；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２−６９１；Ｒｏｓｅ 米国特許第５，２７９，８３３号；Ｂｒｉｇｈａｍ（１９９１）ＷＯ９１／０６３０９；およびＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１４）、ならびにウイルスベクターの使用（例えば、アデノウイルス系（例えば、概説については、Ｂｅｒｎｓら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：９５−１０４；Ａｌｉら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：３６７−３８４；およびＨａｄｄａｄａら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９（Ｐｔ ３）：２９７−３０６参照）、パピローマウイルス系、レトロウイルス系（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）２７３１−２７３９；Ｊｏｈａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら，（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌら，ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００、ならびにＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＦａｕｃｉ（１９９３），Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版 Ｐａｕｌ（編）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびそこに挙げられた参考文献、ならびにＹｕら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）（上掲）参照）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクターの概要については、Ｗｅｓｔら（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７；Ｃａｒｔｅｒら（１９８９）米国特許第４，７９７，３６８号；Ｃａｒｔｅｒら ＷＯ９３／２４６４１（１９９３）；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．９４：１３５１およびＳａｍｕｌｓｋｉ（上掲）参照；また、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（ｌｌ）：３２５１−３２６０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：２０７２−２０８１；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６−６４７０；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）ならびにＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：０３８２２−３８２８も参照のこと））などが挙げられる。
特に有用な３つの送達系は、（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）非毒性で生分解性のポリマー微粒子、（ｉｉｉ）カチオン性のサブミクロン水中油型エマルジョンである。
（リポソーム）
種々の両親媒性脂質は、水性環境において二重層を形成し、リポソームとしてＲＮＡ含有水性コアを被包し得るものである。このような脂質は、アニオン性、カチオン性または両性イオン性の親水性頭基を有するものであり得る。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は１９６０年代に始まっているが、カチオン性のリポソーム形成脂質は１９９０年代から研究されている。リン脂質はアニオン性のものもあれば、両性イオン性のものもある。好適な類型のリン脂質としては、限定されないが、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロールが挙げられ、有用なリン脂質の一例を表２０に示す。有用なカチオン性脂質としては、限定されないが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）が挙げられる。両性イオン性脂質としては、限定されないが、アシル系両性イオン性脂質およびエーテル系両性イオン性脂質が挙げられる。有用な両性イオン性脂質の例は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣおよびドデシルホスホコリンである。脂質は飽和型であっても不飽和型であってもよい。
リポソームは、単一の脂質で形成されたものであってもよく、脂質混合物で形成されたものであってもよい。該混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物、（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物、（ｉｉｉ）両性イオン性脂質の混合物、（ｉｖ）アニオン性脂質とカチオン性脂質の混合物、（ｖ）アニオン性脂質と両性イオン性脂質の混合物、（ｖｉ）両性イオン性脂質とカチオン性脂質の混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質、カチオン性脂質および両性イオン性脂質の混合物を含むものであり得る。同様に、該混合物は、飽和型の脂質と不飽和型の脂質の両方を含むものであってもよい。例えば、該混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性、飽和型）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和型）、および／またはＤＭＰＧ（アニオン性、飽和型）を含むものであり得る。脂質混合物を使用する場合、混合物中のすべての成分脂質が両親媒性である必要はなく、例えば、１つ以上の両親媒性脂質がコレステロールと混合され得る。
脂質の親水性部分をペグ化（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって修飾）してもよい。この修飾により、リポソームの安定性が増大され、非特異的吸着が抑制され得る。例えば、脂質はＰＥＧに、Ｈｅｙｅｓら（２００５）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６−２８７に開示されたものなどの手法を用いて結合体化され得る。
本実施例では、ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＰＧおよびコレステロールの混合物を使用している。本発明の別の態様は、ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧおよびコレステロールを含むリポソームである。このリポソームは、好ましくは、例えば、免疫原をコードするＲＮＡ（自己複製ＲＮＡなど）を被包する。
リポソームは、通常、３つの群：多重層小胞（ＭＬＶ）；小型単層小胞（ＳＵＶ）；および大型単層小胞（ＬＵＶ）に分けられる。ＭＬＶは、各小胞内に複数の二重層を有し、いくつかの個別の水性区画を形成している。ＳＵＶとＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有し；ＳＵＶは、典型的には≦５０ｎｍの直径を有し、ＬＵＶは＞５０ｎｍの直径を有する。本発明で有用なリポソームは、理想的には、５０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。異なる直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物では：（ｉ）少なくとも８０％（個数で）は２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するものであるのがよい、（ｉｉ）集団の平均直径（Ｚａｖ，強度で）は理想的には４０〜２００ｎｍの範囲である、および／または（ｉｉｉ）該直径は、＜０．２の多分散度指数を有しているのがよい。
好適なリポソームを調製するための手法は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第１巻：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．（Ｗｅｉｓｓｉｇ編）．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００９．ＩＳＢＮ １６０３２７３５９Ｘ；Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ，ＩＩ ＆ ＩＩＩ巻（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編）．Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２００６；およびＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ 第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ＆ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ ＆ Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ Ｂｏｏｋｓ，２００２を参照されたい。有用な方法の一例は、（ｉ）脂質のエタノール性溶液（ｉｉ）核酸の水溶液および（ｉｉｉ）バッファーを混合した後、混合、平衡化、希釈および精製を行なうことを伴うものである（Ｈｅｙｅｓら（２００５）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６−８７）。
ＲＮＡは、好ましくはリポソーム内に被包されており、そのため、リポソームは水性のＲＮＡ含有コア周囲の外側層を構成している。この被包により、ＲＮＡがＲＮａｓｅ消化から保護されることがわかった。リポソームには、一部のＲＮＡを外的に含めてもよいが（例えば、リポソームの表面上）、少なくとも半分（理想的には、全部）のＲＮＡを被包する。
（ポリマー微粒子）
種々のポリマーは、微粒子を形成してＲＮＡを被包または吸着することができる。実質的に非毒性のポリマーの使用は、レシピエントが安全に該粒子を受容できることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、該粒子が送達後に代謝され、長期間の残存が回避され得ること意味する。また、有用なポリマーは滅菌性であり、医薬等級処方物の調製の一助となる。
好適な非毒性で生分解性のポリマーとしては、限定されないが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（例えば、ポリカプロラクトン）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来ポリカーボネート、ポリビニル−ピロリジノンまたはポリエステル−アミド、およびその組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、該微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）（ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）など）、ラクチドとグリコリドのコポリマー（ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）など）、およびＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンのコポリマーで形成されたものである。有用なＰＬＧポリマーとしては、例えば、２０：８０〜８０：２０の範囲（例えば、２５：７５、４０：６０、４５：５５、５５：４５、６０：４０、７５：２５）のラクチド／グリコリドモル比を有するものが挙げられる。有用なＰＬＧポリマーとしては、例えば、５，０００〜２００，０００Ｄａ（例えば、１０，０００〜１００，０００、２０，０００〜７０，０００、４０，０００〜５０，０００Ｄａ）の分子量を有するものが挙げられる。
該微粒子は、理想的には、０．０２μｍ〜８μｍの範囲の直径を有するものである。異なる直径を有する微粒子の集団を含む組成物では、少なくとも８０％（個数で）が０．０３〜７μｍの範囲の直径を有しているのがよい。
好適な微粒子を調製するための手法は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ 第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ＆ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ ＆ Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ Ｂｏｏｋｓ，２００２；Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．（Ｕｃｈｅｇｂｕ ＆ Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ編）．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００６．（特に、第７章）およびＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ編）．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照されたい。ＲＮＡの吸着を助長するため、微粒子に、例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎら（２００１）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５：９０３７−９０４３；およびＳｉｎｇｈら（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：２４７−２５１に開示されているようなカチオン性の界面活性剤および／または脂質を含めてもよい。ポリマー微粒子の代替的な作製様式は、例えばＷＯ２００９／１３２２０６に開示されているような、成形と硬化によるものである。
本発明の微粒子は４０〜１００ｍＶのゼータ電位を有するものであり得る。ＲＮＡは微粒子に吸着され得、吸着は、該微粒子にカチオン性物質（例えば、カチオン性脂質）を含めることにより助長される。
（水中油型のカチオン性エマルジョン）
水中油型エマルジョンは、インフルエンザワクチンのアジュバントに関して知られている（例えば、ＦＬＵＡＤＴＭ製品中のＭＦ５９ＴＭアジュバント、およびＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸＴＭ製品中のＡＳ０３アジュバント）。本発明によるＲＮＡ送達では水中油型エマルジョンが利用され得る（ただし、該エマルジョンは１つ以上のカチオン性分子を含むものであるとする）。例えば、カチオン性脂質は、負電荷のＲＮＡが結合され得るプラスの液滴表面を提供するために該エマルジョンに含められ得る。
該エマルジョンには１つ以上の油が含まれる。好適な油（１つまたは複数）としては、例えば、動物（魚類など）または植物供給源に由来するものが挙げられる。油は、理想的には、生分解性（代謝可能）で生体適合性である。植物油の供給源としては堅果、種子および穀類が挙げられる。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油およびオリーブ油は、最も一般的に入手可能であり、堅果油の例示である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油も使用され得る。種子油としては、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀類の群では、コーン油が最も容易に入手可能であるが、他の穀粒（例えば、コムギ、オートムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなど）の油も使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの炭素数６〜１０の脂肪酸エステルは、種子油に天然に存在するものではないが、堅果油および種子油から出発する適切な物質の加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。哺乳動物の乳汁由来の脂肪および油は代謝可能であり、そのため使用され得る。分離、精製、ケン化および動物供給源から純粋な油を得るのに必要な他の手段のための手順は当該技術分野でよく知られている。
ほとんどの魚は代謝可能な油を含んでおり、これは容易に収集され得る。例えば、タラ肝油、サメ肝油およびクジラ油（鯨ろうなど）は、本明細書において使用され得るいくつかの魚油の例示である。いくつかの分枝鎖の油は、炭素数５のイソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドと称される。また、スクアラン（スクアレンの飽和型類似体）も使用され得る。魚油（スクアレンおよびスクアランを含む）は、市販の供給元から容易に入手可能であるか、または当該技術分野で知られた方法によって得られ得る。
他の有用な油はトコフェロール（特に、スクアレンとの組合せ）である。エマルジョンの油相にトコフェロールを含める場合、α、β、γ、δ、εまたはξトコフェロールのいずれも使用され得るが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロールとＤＬ−α−トコフェロールのどちらも使用することができる。好ましいα−トコフェロールはＤＬ−α−トコフェロールである。スクアレンとトコフェロール（例えば、ＤＬ−α−トコフェロール）を含む油類の組合せを使用してもよい。
好ましいエマルジョンは、スクアレン（分枝型不飽和テルペノイドのサメ肝油（Ｃ３０Ｈ５０；［（ＣＨ３）２Ｃ［＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）］２＝ＣＨＣＨ２−］２；２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン；ＣＡＳ ＲＮ ７６８３−６４−９））を含むものである。
エマルジョンの油は、例えば、スクアレンと少なくとも１つのさらなる油の油類の組合せを含むものであってもよい。
エマルジョンの水性成分は、ただの水（ｐｌａｉｎ ｗａｔｅｒ）（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）であってもよく、さらなる成分（例えば、溶質）を含むものであってもよい。例えば、該水性成分は、バッファーを形成するための塩（例えば、クエン酸塩またはリン酸塩（ナトリウム塩など））を含むものであり得る。典型的なバッファーとしては、リン酸バッファー；Ｔｒｉｓバッファー；ホウ酸バッファー；コハク酸バッファー；ヒスチジンバッファー；またはクエン酸バッファーが挙げられる。緩衝化された水相が好ましく、バッファーは、典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含める。
また、該エマルジョンにはカチオン性脂質も含まれる。好ましくは、この脂質は、エマルジョンの形成と安定化が助長され得るように界面活性剤である。有用なカチオン性脂質は、一般的に、生理学的条件下で正電荷の窒素原子を含むものである（例えば、第３級または第４級アミンとして）。この窒素は、両親媒性界面活性剤の親水性頭基に存在するものであり得る。有用なカチオン性脂質としては、限定されないが、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３’−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシル−アンモニウム（ＤＤＡ，例えば、臭化物）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチル−アンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）が挙げられる。他の有用なカチオン性脂質は、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトラミド（ｃｅｔｒａｍｉｄｅ）（これは、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドと、場合によっては、少量のドデシル（ｄｅｄｅｃｙｌ）トリメチルアンモニウムブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含む）、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−獣脂−１，３−ジアミノプロパン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド、混合型アルキル−トリメチル−アンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシル−アンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、塩化メチルベンゼトニウム、塩化デカメトニウム、メチル混合型トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタ−ナミニウムクロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチル（ｄｉｍｅｔｙｌ）アンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート）、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（例えば、セチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、二カチオン性のボラフォーム電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２ＢＵ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リゾレシチン、Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン、例えば限定されないが、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノール−アミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリ−Ｌ（またはＤ）−リジン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、ポリ（Ｌ（またはＤ）−リジンがＮ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンに結合体化されたもの、ペンダントアミノ基を有するグルタミン酸ジドデシルエステル（ＣΛＧｌｕＰｈＣｎＮ）、ペンダントアミノ基を有するグルタミン酸ジテトラデシルエステル（Ｃ１４ＧＩｕＣｎＮ＋）、コレステロールのカチオン性誘導体、例えば限定されないが、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレン−ジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、およびコレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミンである。他の有用なカチオン性脂質は、ＵＳ２００８／００８５８７０およびＵＳ２００８／００５７０８０（これらは引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
カチオン性脂質は、好ましくは生分解性（代謝可能）で生体適合性である。
油とカチオン性脂質に加え、該エマルジョンに、非イオン性界面活性剤および／または両性イオン性界面活性剤を含めてもよい。かかる界面活性剤としては、限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル系界面活性剤（一般的に、Ｔｗｅｅｎと称される）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸＴＭの商標名で販売、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど）；オクトキシノール（これは、反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が種々であり得、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質（ホスファチジルコリン（レシチン）など）；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）（トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）など）；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；ならびにソルビタンエステル（一般的に、Ｓｐａｎとして知られている）（ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートなど）が挙げられる。該エマルジョンに含めるのに好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。
このような界面活性剤の混合物をエマルジョンに含めてもよい（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５の混合物、またはＴｗｅｅｎ ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の混合物）。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）など）とオクトキシノール（ｔ−オクチルフェノキシ−ポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）など）の組合せも好適である。別の有用な組合せは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、１０〜２０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えば、１５．０のＨＬＢを有するポリソルベート８０）と、１〜１０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えば、１．８のＨＬＢを有するソルビタントリオレエート）を含むものであり得る。
最終エマルジョン中の油の好ましい量（容積％）は２〜２０％、例えば、５〜１５％、６〜１４％、７〜１３％、８〜１２％である。約４〜６％または約９〜１１％のスクアレン含有量が特に有用である。
最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量（重量％）は０．００１％〜８％である。例えば：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリソルベート８０など）では、０．２〜４％、特に、０．４〜０．６％、０．４５〜０．５５％、約０．５％または１．５〜２％、１．８〜２．２％、１．９〜２．１％、約２％、または０．８５〜０．９５％、または約１％であり；ソルビタンエステル（ソルビタントリオレエートなど）では、０．０２〜２％、特に、約０．５％または約１％であり；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００など）では、０．００１〜０．１％、特に、０．００５〜０．０２％であり；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）では、０．１〜８％、好ましくは０．１〜１０％、特に、０．１〜１％または約０．５％である。
油と界面活性剤の絶対量ならびにその比率は、エマルジョンが形成されていれば、広範な制限値の範囲内で種々であり得る。当業者は、所望のエマルジョンが得られるように成分の相対割合を容易に変化させることができるが、油と界面活性剤が４：１〜５：１の重量比が典型的である（油が過剰）。
特に大型の動物において、エマルジョンの免疫賦活活性を確保するために重要なパラメータは油の液滴サイズ（直径）である。最も有効なエマルジョンはサブミクロン範囲の液滴サイズを有するものである。好適には、液滴サイズは５０〜７５０ｎｍの範囲である。最も有用には、平均液滴サイズは２５０ｎｍ未満、例えば２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満である。平均液滴サイズは、有用には８０〜１８０ｎｍの範囲である。理想的には、該エマルジョンの油の液滴の少なくとも８０％（個数で）、好ましくは少なくとも９０％が２５０ｎｍ未満の直径である。エマルジョンの平均液滴サイズおよびサイズ分布を測定するための装置は市販されている。典型的には、動的光散乱および／または単一粒子光学的検知の手法が使用される（例えば、ＡｃｃｕｓｉｚｅｒＴＭおよびＮｉｃｏｍｐＴＭシリーズ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＵＳＡ）から入手可能な機器）、またはＺｅｔａｓｉｚｅｒＴＭ機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）製）、またはＰａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ機器（Ｈｏｒｉｂａ（京都，日本）製））。
理想的には、液滴サイズ分布（個数で）は、極大値を２つ有するのではなく最大値を１つだけ有する、すなわち、平均（モード）の周囲に分布した液滴の単一の集団がみられるものである。好ましいエマルジョンは、＜０．４（例えば、０．３、０．２またはそれ未満）の多分散性を有するものである。
サブミクロン液滴および狭いサイズ分布を有する好適なエマルジョンは、マイクロフルイダイゼーションの使用によって得られ得る。この手法では、投入成分の流れを幾何学的に固定されたチャネルを介して高圧および高速度で推進させることにより平均油滴サイズが低減される。この流れはチャネル壁、チャンバ壁および互いに接触する。その結果の剪断力、衝撃力およびキャビテーション力により、液滴サイズの低減が引き起こされる。マイクロフルイダイゼーション工程の反復は、所望の平均液滴サイズおよびサイズ分布を有するエマルジョンが得られるまで行なわれ得る。
マイクロフルイダイゼーションに対する代替法として、転相を引き起こす熱的方法が使用され得る。この方法でも、密集したサイズ分布を有するサブミクロンエマルジョンが得られ得る。
好ましいエマルジョンは濾過滅菌されたものであり得、すなわち、その液滴を２２０ｎｍフィルターに通したものであり得る。滅菌がもたらされるとともに、この手順により、該エマルジョン中の大きな液滴（あれば）も除去される。
一部の特定の実施形態では、該エマルジョン中のカチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。このカチオン性の水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含むものであり得る。例えば、該カチオン性の水中油型エマルジョンはＤＯＴＡＰを、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１．８ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌなどで含むものであり得る。例示的な実施形態では、該カチオン性の水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ（０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌまたは１．６ｍｇ／ｍｌなど）のＤＯＴＡＰを含むものである。
一部の特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＣコレステロールである。このカチオン性の水中油型エマルジョンはＤＣコレステロールを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ ＤＣコレステロールで含むものであり得る。例えば、該カチオン性の水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約４．９２ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含むものであり得る。例示的な実施形態では、該カチオン性の水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ（２．４６ｍｇ／ｍｌなど）のＤＣコレステロールを含むものである。
一部の特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＤＡである。このカチオン性の水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含むものであり得る。例えば、該カチオン性の水中油型エマルジョンは、ＤＤＡを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌなどで含むものであり得る。あるいはまた、該カチオン性の水中油型エマルジョンは、ＤＤＡを、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２１．５ｍｇ／ｍｌ、約２１．６ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌで含むものであり得る。例示的な実施形態では、該カチオン性の水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ（１．４５ｍｇ／ｍｌなど）のＤＤＡを含むものである。
カテーテルまたは同様のデバイスを使用し、本発明の自己複製ＲＮＡ分子を裸のＲＮＡとして、または送達系と組み合わせて標的の器官または組織に送達してもよい。好適なカテーテルは、例えば、米国特許第４，１８６，７４５号；同第５，３９７，３０７号；同第５，５４７，４７２号；同第５，６７４，１９２号；および同第６，１２９，７０５号（これらはすべて、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
本発明は、ＲＳＶ−Ｆポリペプチドをコードする自己複製ＲＮＡ分子を送達し、例えば、単独または別の巨大分子との組合せで免疫応答を誘起させるための、該自己複製ＲＮＡを被包したかまたは吸着したリポソーム、ポリマー微粒子またはサブミクロンエマルジョン微粒子などの適当な送達系の使用を含む。本発明は、吸着および／または被包された自己複製ＲＮＡ分子を有するリポソーム、微粒子およびサブミクロンエマルジョン、ならびにその組合せを含む。
本実施例でさらに実証するように、リポソームおよびサブミクロンエマルジョン微粒子と会合させた自己複製ＲＮＡ分子は、宿主細胞に有効に送達され得、自己複製ＲＮＡにコードされたタンパク質に対する免疫応答が誘導され得る。
（免疫原性組成物）
本発明は免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、単一の活性な免疫原性因子を含むものであってもよく、いくつかの免疫原性因子を含むものであってもよい。例えば、免疫原性組成物は、単一の形態（例えば、単量体、三量体もしくはロゼット）または２つ以上の形態（例えば、単量体と三量体の混合物もしくは単量体と三量体の動的平衡）であるＲＳＶ Ｆポリペプチドを含むものであり得る。免疫原性組成物は、ＲＳＶ−Ｆポリペプチドをコードする自己複製ＲＮＡを含むものであり得、また、好ましくは、適当な送達系（リポソーム、ポリマー微粒子、水中油型エマルジョン、およびその組合せなど）も含む。
また、本発明の免疫原性組成物に１つ以上の免疫調節剤を含めてもよい。好ましくは、１つ以上の免疫調節剤は、１つ以上のアジュバント（例えば、２、３、４つまたはそれ以上のアジュバント）を含むものである。アジュバントとしては、ＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバント（以下にさらに論考する）が挙げられ得る。
別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質の融合前または中間コンフォメーションで存在するエピトープをディスプレイするが、糖タンパク質の融合後コンフォメーションではディスプレイしないポリペプチドを含むものである。
別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、全体または一部においてＲＳＶ Ｆタンパク質を含み、第２のポリペプチドは異種オリゴマー化ドメインを含むものである。第１のポリペプチドはＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインを含むものであってもよい。第２のポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素由来の三量体化ドメイン、ＳＡＲＳスパイク由来の三量体化ドメイン、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＮａｄＡ、修飾ＧＣＮ４またはＡＴＣａｓｅ由来の三量体化ドメインであり得る。
一態様において、本発明は、本明細書に記載のように、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド、またはＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを準備し、該ポリペプチドを切断してＦ１およびＦ２サブユニットを生成させることにより作製される切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のように、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料を準備し、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、非切断三量体、または非切断単量体と非切断三量体の組合せ（例えば、混合物もしくは動的平衡）を該生物学的材料から精製することにより作製される非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体および／または単量体を含む組成物である。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、１０６〜１０９位付近と１３３〜１３６位付近に改変型フリン切断部位を含み、所望により、さらに改変型融合ペプチドを含んでいてもよい。他の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインは、１０６〜１０９位付近と１３３〜１３６位付近に改変型フリン切断部位、および１０１位付近と１６１位付近との間に改変型トリプシン切断部位を含み、所望により、さらに改変型融合ペプチドを含んでいてもよい。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のように、Ｃ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料を準備し、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの単量体、非切断三量体、または非切断単量体と非切断三量体の組合せ（例えば、混合物もしくは動的平衡）を該生物学的材料から精製することにより作製されるＣ末端側非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体および／または単量体を含む組成物である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のように、改変型融合ペプチド（例えば、融合ペプチドの少なくとも一部分が欠失している）を含む切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料を準備し、切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド三量体を該生物学的材料から精製することにより作製される切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のように、改変型融合ペプチド（例えば、融合ペプチドの少なくとも一部分が欠失している）を含む非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む生物学的材料を準備し、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド単量体を該生物学的材料から精製することにより作製される非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを含む組成物である。
本発明の組成物は、好ましくは、ヒトなどの哺乳動物被験体への投与に適したものであり、１つ以上の薬学的に許容され得るキャリアおよび／または賦形剤、例えば、アジュバントを含む。かかる成分の十分な論考は参考文献２９において得られ得る。該組成物は、一般的に水性形態である。該組成物が免疫原性組成物である場合、ヒトなどの哺乳動物に投与すると免疫応答が誘起される。免疫原性組成物は、哺乳動物を免疫化するためのワクチン処方物を調製するために使用され得る。
免疫原性組成物は、単一の活性な免疫原性因子を含むものであってもよく、いくつかの免疫原性因子を含むものであってもよい。例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、単一の形態（例えば、非切断単量体、切断単量体、非切断三量体、切断三量体、もしくは切断三量体のロゼット）または２つ以上の形態（例えば、非切断単量体と非切断三量体の混合物もしくは非切断単量体と非切断三量体との動的平衡）であり得る。また、該組成物は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドと、１つ以上の他のＲＳＶタンパク質（例えば、Ｇタンパク質および／またはＭタンパク質）を含むものであってもよく、および／または他の病原体由来の免疫原と合わせたものであってもよい。
該組成物に、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存料を含めてもよい。しかしながら、好ましくは、ワクチンは水銀系物質を実質的に含まない（すなわち、５μｇ未満／ｍｌ）ようにすべきである（例えば、チオメルサールを含まない）。水銀を含まない免疫原性組成物がより好ましい。保存料を含まない免疫原性組成物は特に好ましい。
張度を制御するため、ナトリウム塩などの生理学的塩を含めることが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在させ得る。存在させ得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム脱水物（ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
該組成物は、一般的に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に含まれる。
該組成物は、１つ以上のバッファーを含むものであってもよい。典型的なバッファーとしては、リン酸バッファー；Ｔｒｉｓバッファー；ホウ酸バッファー；コハク酸バッファー；ヒスチジンバッファー（特に、水酸化アルミニウムアジュバントと一緒に）；またはクエン酸バッファーが挙げられる。バッファーは、典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含める。該組成物のｐＨは、一般的に５．０〜８．１、より典型的には６．０〜８．０、例えば６．５〜７．５、または７．０〜７．８である。したがって、本発明の方法に、パッケージング前のバルクワクチンのｐＨを調整する工程を含めてもよい。
該組成物は好ましくは滅菌されたものである。該組成物は、好ましくは非発熱性である（例えば、＜１ＥＵ（エンドトキシン単位，標準的尺度）／用量、好ましくは＜０．１ＥＵ／用量を含む）。該組成物は、好ましくはグルテンを含まない。ヒト用ワクチンは、典型的には約０．５ｍｌの投薬容積で投与されるが、小児には半分の用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）で投与され得る。
（アジュバント）
ＲＳＶ−Ｆ ポリペプチド（ｐｅｐｔｉｄ）またはＲＳＶ−Ｆ ポリペプチドをコードする核酸を含む本発明の組成物にはまた、該組成物を受ける患者において誘起される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強する機能を果たし得る１つ以上のアジュバント（例えば、２、３、４つまたはそれ以上のアジュバント）を含めてもよい。アジュバントとしては、ＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントが挙げられ得る。本発明の組成物に使用され得るアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
・無機質含有組成物。本発明におけるアジュバントとしての使用に適した無機質含有組成物は、カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはその混合物）などの無機塩類を含むものである。本発明は、無機塩類（例えば、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など）または異なる無機質化合物の混合物を含み、該化合物は任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶性、非晶質など）をとり、吸着が好ましい。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献３８に開示された「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられる。また、無機質含有組成物は、金属塩の粒子として処方されてもよい（３９）。アルミニウム塩アジュバントは、以下に、より詳細に記載する。
・油エマルジョン組成物（さらなる詳細は下記参照）。本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン、例えば、ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％Ｓｐａｎ，マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に処方）が挙げられる。
・サイトカイン誘発剤（さらなる詳細は下記参照）。本発明における使用に適したサイトカイン誘発剤としては、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニスト（例えば、ＷＯ２００９／１１１３３７に開示されたベンゾナフチリジン化合物）が挙げられる。
・サポニン（参考文献７４第２２章）、これは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花にも見られるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。樹木Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。また、サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート）から市販品として入手することもできる。サポニンアジュバント処方物としては、精製処方物（ＱＳ２１など）、ならびに脂質処方物（ＩＳＣＯＭなど）が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（ＴＭ）として市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されたものである。このような手法が使用された具体的な精製画分は同定されている（例えば、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃ）。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の作製方法は参考文献４０に開示されている。また、サポニン処方物に、コレステロールなどのステロールを含めてもよい（４１）。サポニンとコレステロールの組合せは、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）を呼ばれる特殊な粒子を形成するために使用され得る（参考文献７４の第２３章）。また、ＩＳＣＯＭには、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含まれる。任意の既知のサポニンがＩＳＣＯＭに使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含むものである。ＩＳＣＯＭは、参考文献４１〜４３にさらに記載されている。任意選択で、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗浄剤を含まないものであり得る（４４）。サポニンベースのアジュバントの開発の概説については参考文献４５および４６を見るとよい。
・脂肪アジュバント（さらなる詳細は下記参照）、例えば、水中油型エマルジョン、腸内細菌リポ多糖から誘導した修飾型天然リピドＡ、リン脂質化合物（合成リン脂質二量体Ｅ６０２０など）など。
・細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）ならびにその無毒化誘導体（ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２として知られている変異型毒素（４７）など）。無毒化ＡＤＰ−リボシル化毒素の粘膜用アジュバントとしての使用は参考文献４８に、非経口用アジュバントとしての使用は参考文献４９に記載されている。
・生体付着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜付着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）、例えば、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフィア（５０）またはキトサンおよびその誘導体（５１）。
・生分解性で非毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましい）で形成されており、任意選択で、負電荷の表面を有するように処理されたか（例えば、ＳＤＳで）または正電荷の表面を有するように処理された（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性洗浄剤で）微粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、または約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）。
・リポソーム（参考文献７４の第１３章および第１４章）。アジュバントとしての使用に適したリポソーム処方物の例は、参考文献５２〜５４に記載されている。
・ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル（５５）。かかる処方物は、さらに、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤とオクトキシノールの組合せ（５６）ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤と少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（オクトキシノールなど）の組合せ（５７）を含むものである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。
・ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル（ｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」または「ＴｈｅｒａｍｉｄｅＴＭ」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）。
・第１のグラム陰性細菌から調製された外膜タンパク質プロテオソーム調製物と第２のグラム陰性細菌由来のリポ糖（ｌｉｐｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）調製物の組合せ。ここで外膜タンパク質プロテオソームとリポ糖調製物は、安定な非共有結合性アジュバント複合体を形成する。かかる複合体としては、「ＩＶＸ−９０８」（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜とリポ多糖で構成された複合体）が挙げられる。
・ポリオキシドニウムポリマー（５８，５９）または他のＮ−酸化型ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
・メチルイノシン５’−一リン酸（「ＭＩＭＰ」）（６０）。
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物（６１）、例えば、式：
（式中、Ｒは、水素、直鎖または分枝鎖の非置換または置換された飽和型または不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基を含む群から選択される）
を有するもの、またはその薬学的に許容され得る塩もしくは誘導体。例としては、限定されないが、カスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが挙げられる。
・ＣＤ１ｄリガンド、例えば、α−グリコシルセラミド（６２〜６９）（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３”−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど。
・γイヌリン（７０）またはその誘導体、例えば、アルガンムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）。
・ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）。これらの構造物は、一般的に、ウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む（任意選択で、リン脂質と組合せられるかまたは処方される）。これらは、一般的に、非病原性および非複製性であり、一般的に、天然ウイルスゲノムを全く含まない。該ウイルスタンパク質は、組換え産生させたものであってもよく、完全なウイルスから単離したものであってもよい。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用に適したこのようなウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアまたはキャプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（コートタンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）由来のタンパク質が挙げられる。
これらおよび他のアジュバント活性物質は参考文献７４および７５に、より詳細に論考されている。
組成物は、２、３、４つまたはそれ以上のアジュバントを含むものであってもよい。例えば、本発明の組成物は、好都合には、水中油型エマルジョンとサイトカイン誘発剤の両方、もしくは無機質含有組成物とサイトカイン誘発剤の両方、もしくは２つの水中油型エマルジョンアジュバント、もしくは２つのベンゾナフチリジン化合物などを含むものであり得る。
組成物中の抗原およびアジュバントは、典型的には混合された状態である。
（油エマルジョンアジュバント）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン、例えば、ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％Ｓｐａｎ ８５、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に処方）が挙げられる。また、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も使用され得る。
種々の水中油型エマルジョンが知られており、これらは、典型的には少なくとも１つの油と少なくとも１つの界面活性剤を含み、油（１つまたは複数）および界面活性剤（１つまたは複数）は生分解性（代謝可能）で生体適合性である。該エマルジョン中の油滴は、一般的に５μｍ未満の直径であり、さらにはサブミクロン直径を有するものであってもよく、このような小サイズはマイクロフルイダイザーによって達成され、安定なエマルジョンが得られる。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供することができるため好ましい。
本発明は、動物（例えば、魚）由来または植物供給源のものなどの油とともに使用され得る。植物油の供給源としては堅果、種子および穀類が挙げられる。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油およびオリーブ油は、最も一般的に入手可能であり、堅果油の例示である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油も使用され得る。種子油としては、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀類の群では、コーン油が最も容易に入手可能であるが、他の穀粒（例えば、コムギ、オートムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなど）の油も使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの炭素数６〜１０の脂肪酸エステルは、種子油に天然に存在するものではないが、堅果油および種子油から出発する適切な物質の加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。哺乳動物の乳汁由来の脂肪および油は代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用され得る。分離、精製、ケン化および動物供給源から純粋な油を得るのに必要な他の手段のための手順は当該技術分野でよく知られている。ほとんどの魚は代謝可能な油を含んでおり、これは容易に収集され得る。例えば、タラ肝油、サメ肝油およびクジラ油（鯨ろうなど）は、本明細書において使用され得るいくつかの魚油の例示である。いくつかの分枝鎖の油は、炭素数５のイソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドと称される。サメ肝油は、スクアレンとして知られている分枝型の不飽和テルペノイド、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンを含み、これは本明細書において特に好ましい。また、スクアラン（スクアレンの飽和型類似体）も好ましい油である。魚油（スクアレンおよびスクアランを含む）は、市販の供給元から容易に入手可能であるか、または当該技術分野で知られた方法によって得られ得る。他の好ましい油はトコフェロールである（下記参照）。油の混合物を使用してもよい。
界面活性剤は、その「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有するものである。本発明は、界面活性剤、例えば限定されないが：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的に、Ｔｗｅｅｎと称される）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸ（ＴＭ）商標名で販売、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど）；オクトキシノール（これは、反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が種々であり得、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質（ホスファチジルコリン（レシチン）など）；ノニルフェノールエトキシラート（ＴＥＲＧＩＴＯＬ（ＴＭ）ＮＰシリーズなど）；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）（トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）など）；ならびにソルビタンエステル（一般的に、ＳＰＡＮとして知られている）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートとともに使用され得る。非イオン性界面活性剤が好ましい。該エマルジョンに含めるのに好ましい界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ）（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。
界面活性剤の混合物（例えば、ＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ）／Ｓｐａｎ ８５の混合物）を使用してもよい。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ））など）とオクトキシノール（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）など）の組合せも好適である。別の有用な組合せは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ）など）では０．０１〜１％、特に、約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００など、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗浄剤）では０．００１〜０．１％、特に、０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）では０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に、０．１〜１％または約０．５％である。
本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
・スクアレン、ＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ）およびＳｐａｎ ８５のサブミクロンエマルジョン。該エマルジョンの組成（容積で）は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％Ｓｐａｎ ８５であり得る。重量の観点では、この比率は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％Ｓｐａｎ ８５となる。このアジュバントは「ＭＦ５９」として知られており（７１〜７３）、参考文献７４の第１０章および参考文献７５の第１２章に、より詳細に記載されている。ＭＦ５９エマルジョンは、好都合には、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー）を含む。
・スクアレン、トコフェロールおよびＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ）のエマルジョン。該エマルジョンにリン酸緩衝生理食塩水を含めてもよい。また、Ｓｐａｎ ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンを含めてもよい。このエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ）を有するものであり得、スクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは＜１である（この比率で、より安定なエマルジョンが得られるため）。スクアレンとＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ）は約５：２の容積比で存在させ得る。かかるエマルジョンの一例は、ＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ）をＰＢＳに溶解させて２％溶液を得、次いで、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールと５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いで、この混合物をマイクロフルイダイズすることにより作製されるものであり得る。得られるエマルジョンは、サブミクロン油滴（例えば、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径）を有するものであり得る。
・スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。また、該エマルジョンに３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）を含めてもよい。該エマルジョンにリン酸バッファーを含めてもよい。
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。該エマルジョンは、これらの３成分を約７５：１１：１０の質量比で含むものであり得（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌのα−トコフェロールスクシネート）、これらの濃度は、抗原に由来する該成分の任意の寄与を含むはずである。また、該エマルジョンにスクアレンを含めてもよい。また、該エマルジョンに３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）を含めてもよい。水相はリン酸バッファーを含むものであり得る。
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（ＴＭ）Ｌ１２１」）のエマルジョン。該エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で処方されたものであり得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドのための有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−Ｉ」アジュバント（７６）（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のプルロニックＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）においてトレオニル−ＭＤＰとともに使用されている。また、該エマルジョンは、「ＡＦ」アジュバント（７７）（５％のスクアラン、１．２５％のプルロニックＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）の場合のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしで使用してもよい。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル（ソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）または「Ｓｐａｎ ８０」など））を含むエマルジョン。該エマルジョンは、好ましくは熱可逆性であり、および／または少なくとも９０％（容積で）が２００ｎｍ未満のサイズを有する油滴を有するものである。また、該エマルジョンに、アルジトール；凍結防止剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖類）；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１つ以上を含めてもよい。かかるエマルジョンは凍結乾燥させたものであってもよい。
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献７８に記載のように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが好都合である。
・代謝可能ではない油（軽油など）と少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、ＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ）またはＳｐａｎ ８０など）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤を含めてもよい（ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性物質結合体（参考文献７９に記載された、脂肪族アミンをデスアシルサポニンにグルクロン酸のカルボキシル基を介して付加することによって作製されるＧＰＩ−０１００など）、ジメチル（ｄｉｍｅｔｈｙｉ）ジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなど）。
・鉱油、非イオン性の親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性の親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン。
・鉱油、非イオン性の親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性の親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン。
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えば、コレステロール）がらせん状ミセルとして会合しているエマルジョン（８０）。
該エマルジョンは、送達時に抗原と即席で混合され得る。したがって、アジュバントと抗原は、パッケージングまたは分配されたワクチンにおいて別々に維持され、使用時に最終処方物とするように準備されたものであり得る。抗原は、一般的に、２つの液体を混合することによって最終的にワクチンが調製されるように水性形態である。混合する２つの液体の容積比は種々であり得る（例えば、５：１〜１：５）が、一般的には約１：１である。
（サイトカイン誘発剤）
本発明の組成物に含めるためのサイトカイン誘発剤は、患者に投与されると、免疫機構によるサイトカイン（例えば、インターフェロンおよびインターロイキン）の放出を誘起させることができるものである。好ましい薬剤は、インターフェロン−γ；インターロイキン−１；インターロイキン−２；インターロイキン−１２；ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；およびＧＭ−ＣＳＦの１つ以上の放出を誘起し得るものである。好ましい薬剤は、Ｔｈ１−型免疫応答に関連するサイトカイン、例えば、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、インターロイキン−２の放出を誘起するものである。インターフェロン−γとインターロイキン−２の両方の刺激が好ましい。
したがって、本発明の組成物を受ける結果、患者は、ＲＳＶ Ｆタンパク質で刺激されると所望のサイトカイン（１つまたは複数）を抗原特異的様式で放出するＴ細胞を有することになる。例えば、該患者の血液から精製したＴ細胞は、インビトロでＦタンパク質に曝露するとγ−インターフェロンを放出する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてかかる応答を測定するための方法が当該技術分野で知られており、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリーおよびリアルタイムＰＣＲが挙げられる。例えば、参考文献８１には、破傷風トキソイドに対する抗原特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答（具体的には、γ−インターフェロン応答）をモニタリングする試験が報告されており、抗原特異的ＴＴ誘発性応答を自発的応答と識別するにはＥＬＩＳＰＯＴが最も感度のよい方法であるが、再刺激効果を検出するには、フローサイトメトリーによる細胞質内サイトカインの検出が、最も効率的な方法であることが見い出されている。
好適なサイトカイン誘発剤としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
・免疫賦活性オリゴヌクレオチド、例えば、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むもの、または二本鎖ＲＮＡ、またはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチド。
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「３ｄＭＰＬ」，「ＭＰＬ（ＴＭ）」としても知られている）（８２〜８５）。
・イミダゾキノリン化合物、例えば、ＩＭＩＱＵＩＭＯＤ（ＴＭ）（「Ｒ−８３７」）（８６，８７）、ＲＥＳＩＱＵＩＭＯＤ（ＴＭ）（「Ｒ−８４８」）（８８）、およびその類似体；ならびにその塩（例えば、塩酸塩）。免疫賦活性イミダゾキノリンに関するさらなる詳細は、参考文献８９〜９３を見るとよい。
・ベンゾナフチリジン化合物、例えば：（ａ）式：
を有する化合物（式中：
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）、−Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＨＮ（Ｒ９）２、−ＳＲ７、−（ＣＨ２）ｎＯＲ７、−（ＣＨ２）ｎＲ７、−ＬＲ８、−ＬＲ１０、−ＯＬＲ８、−ＯＬＲ１０、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルから選択され、ここで、Ｒ４のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、独立して、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ７、−ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、および−ＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８から選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されており；
各Ｌは、独立して、結合、−（Ｏ（ＣＨ２）ｍ）ｔ−、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレンおよびＣ２〜Ｃ６アルキニレンから選択され、ここで、ＬのＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレンおよびＣ２〜Ｃ６アルキニレンは各々、独立して、ハロゲン、−Ｒ８、−ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換されており；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルから選択され、ここで、Ｒ７のＣ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、１〜３個のＲ１３基で任意選択的に置換されており；
各Ｒ８は、独立して、Ｈ、−ＣＨ（Ｒ１０）２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキルおよびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシから選択され、ここで、Ｒ８のＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキルおよびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシ基は各々、独立して、−ＣＮ、Ｒ１１、−ＯＲ１１、−ＳＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＮＲ９Ｒ１０、−ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＲ９、−ＯＲ１０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１１）２から選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されており；
各Ｒ９は、独立して、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１０、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキルおよびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択されるか、または各Ｒ９は、独立して、結合しているＮと一緒にＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルを形成するＣ１〜Ｃ６アルキルであり、該Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル環は、任意選択で、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるさらなるヘテロ原子を含み、ここで、Ｒ９のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、またはＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、独立して、−ＣＮ、Ｒ１１、−ＯＲ１１、−ＳＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１１）２から選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されており；
各Ｒ１０は、独立して、アリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールから選択され、該アリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリール基は、ハロゲン、−Ｒ８、−ＯＲ８、−ＬＲ９、−ＬＯＲ９、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２から選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されており；
Ｒ１１とＲ１２は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルから選択され、ここで、Ｒ１１とＲ１２のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、独立して、ハロゲン、−ＣＮ、Ｒ８、−ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ８Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ８Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシから選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されているか；
あるいは、Ｒ１１とＲ１２は各々、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、これらが結合しているＮ原子と一緒になって、任意選択でＮ、ＯおよびＳから選択されるさらなるヘテロ原子を含む任意選択的に置換されたＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル環を形成しており；
各Ｒ１３は、独立して、ハロゲン、−ＣＮ、−ＬＲ９、−ＬＯＲ９、−ＯＬＲ９、−ＬＲ１０、−ＬＯＲ１０、−ＯＬＲ１０、−ＬＲ８、−ＬＯＲ８、−ＯＬＲ８、−ＬＳＲ８、−ＬＳＲ１０、−ＬＣ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＬＣ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＣ（Ｏ）Ｒ１０、−ＬＯＣ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１１、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ８、−ＬＮ（Ｒ９）２、−ＬＮＲ９Ｒ８、−ＬＮＲ９Ｒ１０、−ＬＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＬＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＬＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ８ＯＨ、−ＬＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＮＲ９Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＬＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＬＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９ＬＮ（Ｒ９）２、−ＬＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＬＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＬＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２および−ＯＬＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２から選択され；
各ＲＡは、独立して、−Ｒ８、−Ｒ７、−ＯＲ７、−ＯＲ８、−Ｒ１０、−ＯＲ１０、−ＳＲ８、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９Ｃ（Ｓ）Ｒ８、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−ＮＲ９ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｓ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ８）Ｒ８、−Ｃ（ＮＯＲ８）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）３Ｒ８、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＳＯ２Ｒ８、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−Ｎ（ＯＲ８）Ｒ８、−ＣＨ＝ＣＨＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（Ｒ９）２、および−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８から選択されるか；あるいは環Ａ上の２つの隣接するＲＡ置換基が、２個までのヘテロ原子を環構成員として含む５〜６員環を形成しており；
ｎは、各出現において独立して、０、１、２、３、４、５、６、７または８であり；
各ｍは、独立して、１、２、３、４、５および６から選択され、
ｔは、１、２、３、４、５、６、７または８である）；（ｂ）式：
を有する化合物（式中：
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）、−Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＨＮ（Ｒ９）２、−ＳＲ７、−（ＣＨ２）ｎＯＲ７、−（ＣＨ２）ｎＲ７、−ＬＲ８、−ＬＲ１０、−ＯＬＲ８、−ＯＬＲ１０、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルから選択され、ここで、Ｒ４のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、独立して、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ７、−ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、および−ＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８から選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されており；
各Ｌは、独立して、結合、−（Ｏ（ＣＨ２）ｍ）ｔ−、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレンおよびＣ２〜Ｃ６アルキニレンから選択され、ここで、ＬのＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレンおよびＣ２〜Ｃ６アルキニレンは各々、独立して、ハロゲン、−Ｒ８、−ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換されており；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルから選択され、ここで、Ｒ７のＣ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、１〜３個のＲ１３基で任意選択的に置換されており；
各Ｒ８は、独立して、Ｈ、−ＣＨ（Ｒ１０）２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキルおよびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシから選択され、ここで、Ｒ８のＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキルおよびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシ基は各々、独立して、−ＣＮ、Ｒ１１、−ＯＲ１１、−ＳＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＮＲ９Ｒ１０、−ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＲ９、−ＯＲ１０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１１）２から選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されており；
各Ｒ９は、独立して、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１０、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキルおよびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択されるか、または各Ｒ９は、独立して、結合しているＮと一緒にＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルを形成するＣ１〜Ｃ６アルキルであり、該Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル環は、任意選択で、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるさらなるヘテロ原子を含み、ここで、Ｒ９のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、またはＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、独立して、−ＣＮ、Ｒ１１、−ＯＲ１１、−ＳＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、
−ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１１）２から選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されており；
各Ｒ１０は、独立して、アリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールから選択され、該アリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリール基は、ハロゲン、−Ｒ８、−ＯＲ８、−ＬＲ９、−ＬＯＲ９、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２から選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されており；
Ｒ１１とＲ１２は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルから選択され、ここで、Ｒ１１とＲ１２のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、独立して、ハロゲン、−ＣＮ、Ｒ８、−ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ８Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ８Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシから選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されているか；
あるいは、Ｒ１１とＲ１２は各々、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、これらが結合しているＮ原子と一緒になって、任意選択でＮ、ＯおよびＳから選択されるさらなるヘテロ原子を含む任意選択的に置換されたＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル環を形成しており；
各Ｒ１３は、独立して、ハロゲン、−ＣＮ、−ＬＲ９、−ＬＯＲ９、−ＯＬＲ９、−ＬＲ１０、−ＬＯＲ１０、−ＯＬＲ１０、−ＬＲ８、−ＬＯＲ８、−ＯＬＲ８、−ＬＳＲ８、−ＬＳＲ１０、−ＬＣ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＬＣ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＣ（Ｏ）Ｒ１０、−ＬＯＣ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１１、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ８、−ＬＮ（Ｒ９）２、−ＬＮＲ９Ｒ８、−ＬＮＲ９Ｒ１０、−ＬＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＬＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＬＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ８ＯＨ、−ＬＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＮＲ９Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、ＬＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＬＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＬＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９ＬＮ（Ｒ９）２、−ＬＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＬＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＬＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２および−ＯＬＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２から選択され；
各ＲＡは、独立して、−Ｒ８、−Ｒ７、−ＯＲ７、−ＯＲ８、−Ｒ１０、−ＯＲ１０、−ＳＲ８、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９Ｃ（Ｓ）Ｒ８、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−ＮＲ９ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｓ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ８）Ｒ８、−Ｃ（ＮＯＲ８）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）３Ｒ８、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＳＯ２Ｒ８、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−Ｎ（ＯＲ８）Ｒ８、−ＣＨ＝ＣＨＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（Ｒ９）２、および−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８から選択され；
ｎは、各出現において独立して、０、１、２、３、４、５、６、７または８であり；
各ｍは、独立して、１、２、３、４、５および６から選択され、
ｔは、１、２、３、４、５、６、７または８である）；または（ｃ）任意の（ａ）もしくは（ｂ）の薬学的に許容され得る塩。他のベンゾナフチリジン化合物およびベンゾナフチリジン化合物の作製方法は、ＷＯ２００９／１１１３３７に記載されている。ベンゾナフチリジン化合物またはその塩は、単独で、または１つ以上のさらなる化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、ベンゾナフチリジン化合物は、水中油型エマルジョンまたは無機質含有組成物と組み合わせて使用され得る。具体的な一実施形態では、ベンゾナフチリジン化合物は、水中油型エマルジョン（例えば、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン）または無機質含有組成物（例えば、アルミニウム塩もしくはカルシウム塩などの無機塩（ｓａｌｄ））と組み合わせて使用される。
・チオセミカルバゾン化合物（参考文献９４に開示されたものなど）。また、活性化合物の処方、製造およびスクリーニングの方法が参考文献９４に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
・トリプタントリン化合物（参考文献９５に開示されたものなど）。また、活性化合物の処方、製造およびスクリーニングの方法が参考文献９５に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
・ヌクレオシド類似体、例えば：（ａ）イサトラビン（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献９６〜９８に開示された化合物；（ｆ）式：
を有する化合物（式中：
Ｒ１とＲ２は各々、独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、Ｃ１〜６アルキル、または置換Ｃ１〜６アルキルであり；
Ｒ３は、非存在、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
Ｒ４とＲ５は各々、独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキルであるか、または一緒に結合して、Ｒ４−５のような５員環を形成しており：
結合は
で示す結合において行なわれ、
Ｘ１とＸ２は各々、独立して、Ｎ、Ｃ、ＯまたはＳであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルまたはＲ９ａであり、ここで、Ｒ９ａは：
であり、
結合は
で示す結合において行なわれ、
Ｒ１０とＲ１１は各々、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、または−ＯＨであり；
ＲａとＲｂは各々、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６〜１０アリールであり；
各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１〜６アルキル、または置換Ｃ１〜６アルキルであり；
各Ｒｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１〜６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１〜６アルキル）２、Ｃ６〜１０アリール、またはヘテロシクリルであり；
各Ｒｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
各Ｒｆは、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートであり；
各ｎは、独立して、０、１、２または３であり；
各ｐは、独立して、０、１または２である）；または（ｇ）任意の（ａ）〜（ｆ）の薬学的に許容され得る塩、任意の（ａ）〜（ｆ）互変異性体、もしくは該互変異性体の薬学的に許容され得る塩。
・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）（９９）。
・参考文献１００に開示された化合物、例えば：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンゾイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物（１０１，１０２）、ヒドラフタルアミド（ｈｙｄｒａｐｔｈａｌａｍｉｄｅ）化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物（１０３）、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物、およびベンゾアゾール化合物（１０４）。
・参考文献１０５に開示された化合物。
・リン酸アミノアルキルグルコサミニド誘導体、例えば、ＲＣ−５２９（１０６，１０７）。
・ホスファゼン、例えば、参考文献１０８および１０９に記載のポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）など。
・小分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）例えば：
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミンＮ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール
酢酸２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチル
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−ＩＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−［４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン。
本発明における使用のためのサイトカイン誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のモデュレータおよび／またはアゴニストであり得る。例えば、該誘発剤は、ヒトＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９タンパク質のうちの１つ以上のアゴニストであり得る。好ましい薬剤は、ＴＬＲ４のアゴニスト（例えば、腸内細菌リポ多糖から誘導した修飾型天然リピドＡ、リン脂質化合物（合成リン脂質二量体Ｅ６０２０など））、ＴＬＲ７のアゴニスト（例えば、ベンゾナフチリジン、イミダゾキノリン）および／またはＴＬＲ９のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）である。このような薬剤は先天性免疫経路の活性化に有用である。
サイトカイン誘発剤は該組成物に、作製中の種々の段階で添加され得る。例えば、該誘発剤を抗原組成物中に存在させ、次いで、この混合物を水中油型エマルジョンに添加してもよい。代替法として、該誘発剤を水中油型エマルジョン中に存在させてもよく、この場合、該薬剤は、乳化前に該エマルジョン成分に添加され得るか、または乳化後に該エマルジョンに添加され得るかのいずれかである。同様に、該薬剤は該エマルジョンの液滴においてコアセルベート化してもよい。最終組成物中のサイトカイン誘発剤の位置および分布は、その親水性／親油性特性に依存し、例えば、該薬剤は、水相中、油相中および／または油と水の界面に存在し得る。
サイトカイン誘発剤を別の薬剤（抗原（例えば、ＣＲＭ１９７）など）に結合体化させてもよい。小分子のコンジュゲーション手法の一般的な概説は、参考文献１１０に示されている。代替法として、アジュバントをさらなる薬剤と、疎水性相互作用またはイオン性相互作用などによって非共有結合させてもよい。
好ましいサイトカイン誘発剤は、（ａ）ベンゾナフチリジン化合物；（ｂ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよび（ｃ）３ｄＭＰＬである。
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾体などのヌクレオチドの修飾体／類似体を含むものであり得、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい（ＲＮＡを除く）。参考文献１１１、１１２および１１３に、可能な類似体置換（例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでの置き換え）が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は参考文献１１４〜１１９に、さらに論考されている。ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど）に指向され得る（１２０）。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的なものであってもよく（ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチドなど））、Ｂ細胞応答の誘導に、より特異的なものであってもよい（ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなど）。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは参考文献１２１〜１２３に論考されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識に利用可能となるように構築される。任意選択で、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をその３’末端で結合し、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成してもよい。例えば、参考文献１２０および１２４〜１２６を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９である（ＰＲＯＭＵＮＥ（ＴＭ）としても知られている（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．））。
ＣｐＧ配列の使用の代替法として、または該使用に加えてＴｐＧ配列が使用され得る（１２７）。このようなオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないものであり得る。
免疫賦活性オリゴヌクレオチドはピリミジンリッチであり得る。例えば、これは、１つより多くの連続するチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献１２７に開示されているようなＴＴＴＴ）を含むものであり得、および／または＞２５％チミジン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のヌクレオチド組成を有するものであり得る。例えば、これは、１つより多くの連続するシトシンヌクレオチド（例えば、参考文献１２７に開示されているようなＣＣＣＣ）を含むものであり得、および／または＞２５％シトシン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のヌクレオチド組成を有するものであり得る。このようなオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないものであり得る。
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも２０個のヌクレオチドを含むものである。該オリゴヌクレオチドは１００個より少ないヌクレオチドを含むものであり得る。
３ｄＭＰＬ（３ 脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしても知られている）は、モノホスホリルリピドＡの還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されているアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａの無ヘプトース（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）変異型から調製されたものであり、リピドＡと化学的に類似しているが、酸不安定性のホスホリル基と塩基不安定性のアシル基が欠損している。これは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、いくつかのサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦ）の放出を刺激する（参考文献１２８も参照のこと）。３ｄＭＰＬの調製は、最初に参考文献１２９で報告された。
３ｄＭＰＬは、アシル化が異なる（例えば、３、４、５または６個のアシル鎖（これらは異なる長さのものであってもよい）を有する）関連分子の混合物の形態となり得る。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても知られている）単糖は、その２位の炭素（すなわち、２位と２’位）でＮ−アシル化されており、また、３’位にもＯ−アシル化がみられる。炭素２に結合している基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合している基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合している基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は：
である。
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々、独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは８〜１６、より好ましくは９〜１２、最も好ましくは１０である。
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は各々、独立して、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４であり得、ここで、Ｒ４は、−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ｍの値は、好ましくは８〜１６、より好ましくは１０、１２または１４である。２位では、ｍは好ましくは１４である。２’位では、ｍは好ましくは１０である。３’位では、ｍは好ましくは１２である。したがって、基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’がすべて−Ｈである場合、３ｄＭＰＬは３個だけアシル鎖を有する（２位、２’位および３’位の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち２つだけが−Ｈである場合、３ｄＭＰＬは４個のアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち１つだけが−Ｈである場合、３ｄＭＰＬは５個のアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれも−Ｈではない場合、３ｄＭＰＬは６個のアシル鎖を有し得る。本発明に従って使用される３ｄＭＰＬアジュバントは、３〜６個のアシル鎖を有するこれらの形態の混合物であってもよいが、６個のアシル鎖を有する３ｄＭＰＬを混合物中に含めることが好ましく、特に、該ヘキサアシル鎖形態が全３ｄＭＰＬの少なくとも１０重量％（例えば、＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％またはそれ以上）を構成することを確実にすることが好ましい。６個のアシル鎖を有する３ｄＭＰＬは、最も活性な形態のアジュバントであることがわかっている。
したがって、本発明の組成物に含めるための３ｄＭＰＬの最も好ましい形態は、以下に示す式（ＩＶ）を有するものである。
３ｄＭＰＬを混合物の形態で使用する場合、本発明の組成物における３ｄＭＰＬの量または濃度に対する言及は、該混合物中の３ｄＭＰＬ種を合わせたものをいう。
水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズ、例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを有するミセル状の凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれかまたは両方が本発明で使用され得、よりよい粒子が常套的なアッセイによって選択され得る。小粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁物が得られるのに十分小さい）は、活性が優れているため（１３０）本発明による使用に好ましい。好ましい粒子は、２２０ｎｍ未満、より好ましくは、２００ｎｍ未満または１５０ｎｍ未満または１２０ｎｍ未満の平均直径を有するものであり、さらには１００ｎｍ未満の平均直径を有するものであってもよい。しかしながら、ほとんどの場合、平均直径が５０ｎｍより小さいことはない。このような粒子は、濾過滅菌に適するのに十分小さい。粒子の直径は、平均粒子直径が示される常套的な動的光散乱手法によって評価され得る。粒子がｘ ｎｍの直径を有するという場合、一般的に、この平均付近に粒子の分布がみられるが、粒子の少なくとも５０％（個数で）（例えば、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％またはそれ以上）はｘ＋２５％の範囲内の直径を有する。
３ｄＭＰＬは、好都合には、水中油型エマルジョンと組み合わせて使用され得る。実質的にすべての３ｄＭＰＬが該エマルジョンの水相中に存在し得る。
３ｄＭＰＬは、単独で、または１つ以上のさらなる化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、３ｄＭＰＬは、ＱＳ２１サポニン（１３１）（例えば、水中油型エマルジョン中で（１３２））、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ＱＳ２１と免疫賦活性オリゴヌクレオチドの両方、リン酸アルミニウム（１３３）、水酸化アルミニウム（１３４）、またはリン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムの両方と組み合わせて使用されることが知られている。
（脂肪アジュバント）
本発明で使用され得る脂肪アジュバントとしては、上記の水中油型エマルジョンが挙げられ、また、例えば、以下のものが挙げられる。
・式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩのリン脂質化合物またはその塩：
（参考文献１３５に、「ＥＲ ８０３０５８」、「ＥＲ ８０３７３２」、「ＥＲ ８０４０５３」、「ＥＲ ８０４０５８」、「ＥＲ ８０４０５９」、「ＥＲ ８０４４４２」、「ＥＲ ８０４６８０」、「ＥＲ ８０４７６４」、ＥＲ ８０３０２２または「ＥＲ ８０４０５７」、例えば：
などが規定されている）。ＥＲ８０４０５７はＥ６０２０とも称されている。式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩのリン脂質化合物またはその塩は、単独で、または１つ以上のさらなる化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物は、水中油型エマルジョンまたは無機質含有組成物と組み合わせて使用され得る。具体的な一実施形態では、Ｅ６０２０は、水中油型エマルジョン（例えば、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン）または無機質含有組成物（例えば、アルミニウム塩もしくはカルシウム塩などの無機塩）と組み合わせて使用される。
・ＯＭ−１７４などの大腸菌由来のリピドＡの誘導体（参考文献１３６および１３７に記載）。
・カチオン性脂質と（通常、中性の）コリピド（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）の処方物、例えば、アミノプロピル−ジメチル−ミリストオレイルオキシ−プロパンアミニウムブロミド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（ＴＭ）」）またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパンアミニウムブロミド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）。（＋）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパンアミニウム塩を含む処方物が好ましい（１３８）。
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（上記参照）。
・リン酸含有非環式主鎖に連結された脂質を含む化合物、例えば、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４：
（１３９，１４０）。
・リポペプチド（すなわち、１つ以上の脂肪酸残基と２つ以上のアミノ酸残基を含む化合物）、例えば、グリセルシステインが基礎であるリポペプチド。かかるペプチドの具体例としては、下記の式：
の化合物が挙げられ、式中、Ｒ１およびＲ２は各々、８〜３０、好ましくは１１〜２１個の炭素原子（これも、酸素官能基で任意選択的に置換されている）を有する飽和または不飽和の脂肪族または脂肪族−脂環式混合型の炭化水素ラジカルを表し、Ｒ３は、水素またはラジカルＲ１−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−（式中、Ｒ１は、上記のものと同じ意味を有する）を表し、Ｘは、ペプチド結合によって結合され、かつ遊離のエステル化またはアミド化されたカルボキシ基を有するアミノ酸、または末端カルボキシ基が遊離のエステル化もしくはアミド化された形態である２〜１０個のアミノ酸のアミノ酸配列を表す。一部の特定の実施形態では、該アミノ酸配列は、Ｄ−アミノ酸、例えば、Ｄ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌｕ）またはＤ−γ−カルボキシ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌａ）を含む。
細菌リポペプチドは、一般的に、ＴＬＲ６の関与を必要とすることなくＴＬＲ２を認識する（ＴＬＲは、協働的に機能を果たして種々の誘発因子の特異的認識をもたらし、ＴＬＲ２＋ＴＬＲ６は一緒になってペプチドグリカンを認識するが、ＴＬＲ２はＴＬＲ６なしでリポペプチドを認識する）。該リポペプチドは、場合によっては、天然リポペプチドと合成リポペプチドに分類される。合成リポペプチドは、類似した挙動を示す傾向にあり、主にＴＬＲ２によって認識される。
アジュバントとしての使用に適したリポペプチドとしては、式：
を有する化合物が挙げられ、式中、＊を表示したキラル中心と＊＊＊を表示したものは、ともにＲ配置であり；
＊＊を表示したキラル中心は、Ｒ配置またはＳ配置のいずれかであり；
各Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立して、７〜２１個の炭素原子を有し、酸素官能基で任意選択的に置換された脂肪族もしくは脂環式−脂肪族の炭化水素基であるか、またはＲ１ａとＲ１ｂの一方（両方ではない）がＨであり；
Ｒ２は、１〜２１個の炭素原子を有し、酸素官能基で任意選択的に置換された脂肪族または脂環式の炭化水素基であり；
ｎは、０または１であり；
Ａｓは、−Ｏ−Ｋｗ−ＣＯ−または−ＮＨ−Ｋｗ−ＣＯ−（式中、Ｋｗは、１〜１２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基である）のいずれかを表し；
Ａｓ１は、Ｄ−またはＬ−α−アミノ酸であり；
Ｚ１およびＺ２は各々、独立して、−ＯＨを表すか、あるいはアミノ−（低級アルカン）−スルホン酸のＤ−もしくはＬ−αアミノ酸、またはＤ−およびＬ−αアミノカルボン酸ならびにアミノ−低級アルキル−スルホン酸から選択される６個までのアミノ酸を有するペプチドのＮ末端ラジカルを表し；
Ｚ３は、Ｈまたは−ＣＯ−Ｚ４であり、ここで、Ｚ４は、−ＯＨであるか、あるいは、アミノ−（低級アルカン）−スルホン酸のＤ−もしくはＬ−αアミノ酸、またはＤ−およびＬ−αアミノカルボン酸ならびにアミノ−低級アルキル−スルホン酸から選択される６個までのアミノ酸を有するペプチドのＮ末端ラジカル；またはかかる化合物のカルボン酸から形成されるエステルもしくはアミドであり、好適なアミドとしては、−ＮＨ２およびＮＨ（低級アルキル）が挙げられ、適当なエステルとしては、Ｃ１−Ｃ４アルキルエステルが挙げられる（低級アルキルまたは低級アルカンは、本明細書で用いる場合、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルをいう）。
かかる化合物はＵＳ４，６６６，８８６に、より詳細に記載されている。具体的な一実施形態では、該リポペプチドは、式：
を有する。
リポペプチド種の別の例は、ＬＰ４０と称されるものであり、ＴＬＲ２のアゴニストである。Ａｋｄｉｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３３：２７１７−２６（２００３）。
これは、ムレインリポタンパク質と称される大腸菌由来の既知の類型のリポペプチドに関連している。ムレインリポペプチド（ｌｉｐｏｐｅｔｉｄｅ）と称される該タンパク質の一部の特定の部分分解生成物が、Ｈａｎｔｋｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４：２８４−２９６（１９７３）に記載されている。これは、Ｎ−アセチルムラミン酸に連結されたペプチドを含むものであり、したがって、ムラミルペプチド（これは、Ｂａｓｃｈａｎｇら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４５（２０）：６３３１−６３６０（１９８９）に記載されている）に関連している。
（アルミニウム塩アジュバント）
「水酸化アルミニウム」および「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントが使用され得る。この名称は慣用的であるが、便宜上、使用されているにすぎず、いずれも、存在している実際の化学物質の化合物の厳密な記述を示すものではない（例えば、参考文献７４の第９章参照）。本発明では、一般にアジュバントとして使用されている任意の「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントが使用され得る。
「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも一部が結晶性である。オキシ水酸化アルミニウムは、式ＡｌＯ（ＯＨ）で表され得、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３などの他のアルミニウム化合物と、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸着バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１における強いショルダー（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）の存在によって識別され得る（参考文献７４第９章）。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半分の高さにおける回折バンド幅（ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｂａｎｄ ａｔ ｈａｌｆ ｈｅｉｇｈｔ（ＷＨＨ））に反映され、結晶性が不十分な粒子は、結晶子の大きさが小さいため、大きな線の広がりを示す。表面積は、ＷＨＨが増大するにつれて増大し、高いＷＨＨ値を有するアジュバントほど、大きな抗原吸着能を有することがわかっている。繊維状の形態構造（例えば、透過電子顕微鏡写真において見られるようなもの）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には約１１であり、すなわち、アジュバント自体が生理学的ｐＨで正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントでは、１．８〜２．６ｍｇタンパク質／ｍｇ Ａｌ＋＋＋（ｐＨ７．４）の吸着能が報告されている。
「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）も含まれる。これは沈降によって得られ得、沈降中の反応条件および濃度は、該塩におけるホスフェートでのヒドロキシルの置換の度合に影響を及ぼす。ヒドロキシリン酸塩は、一般的に０．３〜１．２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在によって、厳密なＡｌＰＯ４と識別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃まで加熱した場合）は、構造のヒドロキシルの存在を示す（参考文献７４の第９章）。
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般的に０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは０．９５＋０．１である。リン酸アルミニウムは、一般的に非晶質である（特に、ヒドロキシリン酸塩の場合）。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである（０．６ｍｇ Ａｌ３＋／ｍｌで含まれる）。該リン酸アルミニウムは、一般的に粒状である（例えば、透過電子顕微鏡写真において見られるようなプレート様形態構造）。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後において０．５〜２０μｍの範囲（例えば、約５〜１０μｍ）である。リン酸アルミニウムアジュバントでは、０．７〜１．５ｍｇタンパク質／ｍｇ Ａｌ＋＋＋（ｐＨ７．４）の吸着能が報告されている。
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ホスフェートでのヒドロキシルの置換の度合に反比例し、この置換の度合は、沈降による塩の調製に使用される反応条件および反応物の濃度に応じて異なり得る。また、ＰＺＣは、溶液中の遊離リン酸イオン濃度を変えること（より多くのホスフェート＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジンバッファーなどのバッファーを添加すること（ＰＺＣは、より塩基性となる）によっても変更される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般的に４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有する。
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁物には、バッファー（例えば、リン酸またはヒスチジンまたはＴｒｉｓバッファー）を含めてもよいが、これは必ずしも必要なことではない。該懸濁物は、好ましくは滅菌されており、パイロジェンフリーである。該懸濁物は、例えば、１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性リン酸イオンを含むものであり得る。また、該懸濁物に塩化ナトリウムを含めてもよい。
本発明では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用してもよい。この場合、リン酸アルミニウムを水酸化物よりも多く、例えば、少なくとも２：１（例えば、＞５：１、＞６：１、＞７：１、＞８：１、＞９：１など）の重量比で存在させるのがよい。
患者への投与のための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ未満／ｍｌ（例えば、＜５ｍｇ／ｍｌ、＜４ｍｇ／ｍｌ、＜３ｍｇ／ｍｌ、＜２ｍｇ／ｍｌ、＜１ｍｇ／ｍｌなど）である。好ましい範囲は０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
１つ以上のアルミニウム塩アジュバントを含むとともに、アジュバント成分は、１つ以上のさらなるアジュバントまたは免疫賦活剤を含んでいてもよい。かかるさらなる成分としては、限定されないが、ベンゾナフチリジン化合物、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバント（「３ｄ−ＭＰＬ」）；および／または水中油型エマルジョンが挙げられる。３ｄ−ＭＰＬは、３ 脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡとも呼ばれている。この名称は、モノホスホリルリピドＡの還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されていることを示す。これは、Ｓ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａの無ヘプトース変異型から調製されたものであり、リピドＡと化学的に類似しているが、酸不安定性のホスホリル基と塩基不安定性のアシル基が欠損している。これは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、いくつかのサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦ）の放出を刺激する。３ｄＭＰＬの調製は、最初に参考文献１２９で報告され、製品は、Ｃｏｒｉｘａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからＭＰＬ（ＴＭ）の名称で製造および販売されている。さらなる詳細は、参考文献８２〜８５を見るとよい。
水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は、特に小児に有用であり、抗原は、一般的に該塩に吸着させる。また、水中スクアレン型エマルジョンは、特に高齢者に好ましい。有用なアジュバントの組合せとしては、ＣｐＧとアラム（ａｌｕｍ）、またはレシキモドとアラムなどのＴｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントの組合せが挙げられる。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬの組合せが使用され得る。使用され得る他の組合せとしては、アラムおよびベンゾナフチリジン化合物またはＳＭＩＰ、水中スクアレン型エマルジョン（ＭＦ５９など）およびベンゾナフチリジン化合物またはＳＭＩＰ、ならびにＥ６０２０および水中スクアレン型エマルジョン（ＭＦ５９など）またはアラムが挙げられる。
本発明の組成物は、細胞媒介性免疫応答ならびに体液性免疫応答の両方を誘起するものであってもよい。
細胞媒介性免疫および体液性免疫を起こすか、および／または増強するためには、一般的に、Ｔ細胞、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の２つの型が必要であると考えられている。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現し得るものであり、一般的に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と称される。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上にディスプレイされた抗原を認識すること、または該抗原と相互作用することができる。
ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現し得るものであり、一般的に、Ｔヘルパー細胞と称される。ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合された抗原性ペプチドを認識することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用すると、ＣＤ４細胞は、サイトカインなどの因子を分泌し得る。分泌されたこのようなサイトカインにより、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫応答に関与する他の細胞が活性化され得る。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、さらに、２つの機能的に相違するサブセット：ＴＨ１表現型とＴＨ２表現型（これらは、サイトカインおよびエフェクター機能が異なる）に分けられ得る。
活性化型ＴＨ１細胞は、細胞性免疫を増強し（例えば、抗原特異的ＣＴＬ生成の増大）、したがって、細胞内感染に対する応答に特に重要である。活性化型ＴＨ１細胞により、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βのうちの１つ以上が分泌され得る。ＴＨ１免疫応答により、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が活性化されることによって局所炎症反応がもたらされ得る。また、ＴＨ１免疫応答は、ＩＬ−１２によってＢ細胞およびＴ細胞の増殖を刺激することによって免疫応答を拡張する機能を果たし得る。ＴＨ１に刺激されたＢ細胞によりＩｇＧ２ａが分泌され得る。
活性化型ＴＨ２細胞は抗体産生を増強し、したがって、細胞外感染に対する応答に重要である。活性化型ＴＨ２細胞により、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０のうちの１つ以上が分泌され得る。ＴＨ２免疫応答により、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび記憶Ｂ細胞（将来の防御のため）の生成がもたらされ得る。
増強された免疫応答は、増強されたＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答のうちの１つ以上を含むものであり得る。
ＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増大、ＴＨ１免疫応答と関連している１つ以上のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−βなど）の増大、活性化マクロファージの増大、ＮＫ活性の増大、またはＩｇＧ２ａ生成の増大のうちの１つ以上を含むものであり得る。好ましくは、増強されたＴＨ１免疫応答は、ＩｇＧ２ａ生成の増大を含むものである。
ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを用いて誘起され得る。ＴＨ１アジュバントは、一般的に、アジュバントなしでの抗原での免疫化と比べて、ＩｇＧ２ａ生成のレベルの増大を誘起するものである。本発明における使用に適したＴＨ１アジュバントとしては、例えば、サポニン処方物、ビロソームおよびウイルス様粒子、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドが挙げられ得る。免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドなど）は、本発明における使用に好ましいＴＨ１アジュバントである。
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答と関連している１つ以上のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０など）の増大、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび記憶Ｂ細胞の生成の増大のうちの１つ以上を含むものであり得る。好ましくは、増強されたＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１生成の増大を含むものである。
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを用いて誘起され得る。ＴＨ２アジュバントは、一般的に、アジュバントなしでの抗原での免疫化と比べて、ＩｇＧ１生成のレベルの増大を誘起するものである。本発明における使用に適したＴＨ２アジュバントとしては、例えば、無機質含有組成物、油エマルジョン、ならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体が挙げられる。無機質含有組成物（アルミニウム塩など）は、本発明における使用に好ましいＴＨ２アジュバントである。
組成物は、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントの組合せを含むものであってもよい。好ましくは、かかる組成物により、アジュバントなしでの免疫化と比べて、ＴＨ１の増強およびＴＨ２応答の増強、すなわち、ＩｇＧ１生成とＩｇＧ２ａ生成の両方の増大が誘起される。さらにより好ましくは、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントの組合せを含む組成物により、単一のアジュバントでの免疫化と比べて（すなわち、ＴＨ１アジュバント単独での免疫化、またはＴＨ２アジュバント単独での免疫化と比べて）ＴＨ１の増大および／またはＴＨ２免疫応答の増大が誘起される。
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答とＴＨ２応答の一方であっても両方であってもよい。好ましくは、免疫応答により、ＴＨ１応答の増強とＴＨ２応答の増強の一方または両方がもたらされる。
増強される免疫応答は、全身性免疫応答と粘膜免疫応答の一方であっても両方であってもよい。好ましくは、免疫応答により、全身性免疫応答の増強と粘膜免疫応答の増強の一方または両方がもたらされる。好ましくは、粘膜免疫応答はＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答はＩｇＡ生成の増大を含むものである。
（処置方法および投与）
本発明の組成物は哺乳動物への投与に適しており、本発明は、本発明の組成物（例えば、免疫原性組成物）を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法を提供する。該組成物（例えば、免疫原性組成物）は、哺乳動物を免疫化するためのワクチン処方物を作製するために使用され得る。哺乳動物は、典型的にはヒトであり、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインは、典型的にはヒトＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインである。しかしながら、哺乳動物は、ＲＳＶに感染し易い任意の他の哺乳動物（ウシＲＳＶに感染し得るウシなど）であり得る。例えば、免疫応答は、精製ＲＳＶ Ｆタンパク質、アルファウイルス粒子または自己複製ＲＮＡの投与後に生じ得る。
また、本発明は、医薬としての使用のための、例えば、ＲＳＶ感染に対する患者の免疫化における使用のための本発明の組成物を提供する。
また、本発明は、患者において免疫応答を起こすための医薬の製造における上記のポリペプチドの使用を提供する。
このような方法および使用によって生じた免疫応答は、一般的に抗体応答、好ましくは防御的抗体応答を含むものである。ＲＳＶワクチン接種後の抗体応答の評価方法は当該技術分野でよく知られている。
本発明の組成物は、いくつかの適当な様式で、例えば、筋肉内注射（例えば、腕または脚に）、皮下注射、鼻腔内投与、経口投与、皮内投与、経皮投与（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、経皮投与（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）などで投与され得る。適切な投与経路は、哺乳動物の年齢、健康状態および他の特徴に依存する。医師は、これらおよび他の要素に基づいて適切な投与経路を決定することができよう。
免疫原性組成物およびワクチン処方物は、小児と成人（妊娠女性を含む）のどちらを処置するためにも使用され得る。したがって、被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。該ワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢者（例えば、＞５０歳、＞６０歳、好ましくは＞６５歳）、幼若者（例えば、＜６歳、例えば４〜６歳、＜５歳）、および妊娠女性である。該ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているのではなく、集団においてより一般的に使用され得る。
処置は、単一用量スケジュールによるものであっても複数用量スケジュールによるものであってもよい。複数用量は、初回免疫化スケジュールおよび／または追加免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールでは、種々の用量が同じかまたは異なる経路で与えられ得る（例えば、非経口での初回免疫と粘膜での追加免疫、粘膜での初回免疫と非経口での追加免疫など）。１より多くの用量（典型的には、２用量）での投与が、免疫学的にナイーブな患者に特に有用である。複数用量は、典型的には、少なくとも１週間あけて投与する（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）。
本発明の組成物を用いて作製されるワクチン処方物を患者に、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、同じ診察時、または医療専門家もしくはワクチン接種施設を訪れたとき）投与してもよい。
（本発明のさらなる態様）
また、本発明は、第１のドメインと第２のドメインを含み、（ｉ）第１のドメインが全体または一部においてＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のエクトドメインを含み、（ｉｉ）第２のドメインが異種オリゴマー化ドメインを含むポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド）を提供する。さらなる詳細は上記に示している。オリゴマー化ドメインに７配列（例えば、上記のＧＣＮに由来する配列）が含まれている場合、これは、好ましくは、エクトドメインのＨＲ２配列（存在する場合）と共に７反復相にある。
また、本発明は、このポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を提供する。また、本発明は、かかる核酸を含むベクター、およびかかるベクターを含む宿主細胞を提供する。該ベクターは、例えば、組換え発現目的、核酸での免疫化などに使用され得る。
また、本発明は、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のエクトドメインを含む分子であって、該分子の少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％）のエクトドメインが融合前コンフォメーションで存在している分子を含む組成物を提供する。
（他のウイルス）
ヒトＲＳＶで使用されるのと同様に、本発明は、肺炎ウイルス科およびパラミクソウイルス科の他の構成員、例えば限定されないが、ウシＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、およびパラインフルエンザウイルス５で使用され得る。
したがって、本発明は、肺炎ウイルス科またはパラミクソウイルス科由来のＦ糖タンパク質を含み、該Ｆ糖タンパク質が融合前コンフォメーションである免疫原性組成物を提供する。
また、本発明は、肺炎ウイルス科またはパラミクソウイルス科のＦ糖タンパク質の融合前コンフォメーションでは存在するが、該糖タンパク質の融合後コンフォメーションでは存在しないエピトープをディスプレイするポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。
また、本発明は、第１のドメインと第２のドメインを含み、（ｉ）第１のドメインが全体または一部において肺炎ウイルス科またはパラミクソウイルス科のＦ糖タンパク質のエクトドメインを含み、（ｉｉ）第２のドメインが異種オリゴマー化ドメインを含むポリペプチドを提供する。
また、本発明は、免疫化などにおける使用のための、このようなポリペプチドおよび組成物を提供する。
また、本発明は、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のエクトドメインを含む分子であって、該分子の少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％）のエクトドメインが融合前コンフォメーションまたは中間コンフォメーションで存在している分子を含む組成物を提供する。
（ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド）
本発明の一部の実施形態において、特定のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドを使用するか、含めている。一部の該特定のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、１００位付近〜１６１位付近に改変されたアミノ酸配列を含むものである。いくつかの特定のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの１００位〜１５０位のアミノ酸配列を図１Ｃに示す。いくつかの特定のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのアミノ酸配列を本明細書に（例えば、実施例１に）示している。
（一般）
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および「本質的に、〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を包含し、例えば、Ｘ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなるものであってもよく、さらなる何かを含むもの（例えば、Ｘ＋Ｙ）であってもよい。
語句「実質的に」は「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まないものであってもよい。必要な場合、語句「実質的に」は本発明の定義から削除され得る。
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
具体的な記載のない限り、２つ以上の成分を混合する工程を含む方法は、なんら特定の混合順を必要としない。したがって、成分は任意の順序で混合され得る。成分が３つある場合、２つの成分が互いに合わされ得、次いで、この合わせたものが、第３の成分と合わされ得るなどである。
動物（特に、ウシ）材料を細胞の培養に使用する場合、該材料は、伝染性の海綿状脳症（ＴＳＥ）を有さない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を有さない供給源から得たものであるべきである。概して、細胞を動物由来の物質の完全な非存在下で培養することが好ましい。
化合物を身体に組成物の一部として投与する場合、該化合物を、代替的に適当なプロドラッグで置き換えてもよい。
細胞基質を再集合（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）または逆遺伝学手順に使用する場合、これは、好ましくは、ヒト用ワクチン作製における使用に承認されたものである（例えば、Ｐｈ Ｅｕｒ概説５．２．３章）。
ポリペプチド配列間の同一性は、好ましくは、ギャップオープンペナルティ＝１２およびギャップ伸張ペナルティ＝１のパラメータでアフィンギャップ検索を使用し、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって判定する。
（実施例）
（実施例１−ＲＳＶ Ｆポリペプチド）
この実施例では、ポリペプチド（例えば、シグナル配列を含むもの）のいくつかの例の配列、および本発明のＲＳＶ Ｆポリペプチドを発現するために使用され得る核酸配列を示す。ここに示すアミノ酸配列は、シグナルペプチドを含み、任意選択のＣ末端リンカーおよびＨｉｓタグ（ＧＧＳＡＧＳＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号９０））を含むものである。このようなポリペプチドを宿主細胞において産生させると、該ポリペプチドは、通常、該細胞によってプロセッシングされてシグナルペプチドが除去され、本明細書に記載のように、一部の該ポリペプチドは、例えば、非修飾フリン切断部位で切断される。本発明は、本明細書に開示した具体的なＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのあらゆる形態、例えば、シグナルペプチドが欠損している成熟形態、Ｆ１とＦ２を含むサブユニットに切断され得る形態、および任意選択のＣ末端のＨｉｓタグが欠損している形態を含む組成物を含む。以下の例は、本発明の範囲の例示にすぎず、したがって、なんら本発明の範囲を限定することを意図しない。
野生型フリン切断の一例はＲＳＶ Ｆ野生型切断型ＨＩＳ（配列番号８４）である。
単量体として作製され得るポリペプチドの例としては、ＲＳＶ Ｆ Ｆｕｒｘ（配列番号４５）；ＲＳＶ Ｆ ｏｌｄ ｆｕｒｘ切断型ＨＩＳ（配列番号８８）；ＲＳＶ Ｆ Ｆｕｒｘ Ｒ１１３Ｑ Ｋ１２３Ｎ Ｋ１２４Ｎ切断型ＨＩＳ（配列番号８９）；ＲＳＶ Ｆ ｄｅｌｐ２１ ｆｕｒｘ切断型ＨＩＳ（配列番号４７）；およびＲＳＶ Ｆ ｄｅｌＰ２３ ｆｕｒｘ切断型ＨＩＳ（配列番号４８）が挙げられる。
三量体として作製され得るポリペプチドの例としては、ＲＳＶ Ｆ Ｎ末端フリン切断型ＨＩＳ（配列番号８５）；ＲＳＶ Ｆ融合欠失切断型ＨＩＳ（配列番号６７）；およびＲＳＶ Ｆ融合欠失２切断型ＨＩＳ（配列番号６８）が挙げられる。
単量体または三量体のロゼットとして作製され得るポリペプチドの例としては、：ＲＳＶ Ｆ ｆｕｒｍｔ切断型ＨＩＳ（配列番号５０）；ＲＳＶ Ｆ ｆｕｒｄｅｌ切断型ＨＩＳ（配列番号５１）；ＲＳＶ Ｆ ｄｅｌＰ２１ ｆｕｒｄｅｌ切断型ＨＩＳ（配列番号８６）；およびＲＳＶ Ｆ ｄｅｌＰ２３ ｆｕｒｄｅｌ切断型ＨＩＳ（配列番号４９）、ならびにＲＳＶ Ｆ第Ｘａ因子切断型ＨＩＳ（配列番号５２）が挙げられる。
ロゼット形成がもたらされると思われる野生型切断の一例は、ＲＳＶ Ｆ Ｃ末端フリン切断型ＨＩＳ（配列番号８７）である。
（完全）
下記のポリペプチドは完全長のＲＳＶ Ｆポリペプチドである。
下記の核酸配列は、前述のポリペプチド配列の最適化されたコード配列である。
（完全ＨＩＳ）
下記のポリペプチドは、完全長のＲＳＶ Ｆポリペプチド、続いてヘキサ−ヒスチジンタグを含む。
下記の核酸配列は、前述のポリペプチド配列の最適化されたコード配列である。
（完全プレＨＩＳ）
下記のポリペプチドは、ＲＳＶ ＦポリペプチドのＣ末端に結合されたＧＣＮ４（下線）の三量体化ドメインを有する完全長のＲＳＶ Ｆポリペプチド、続いてヘキサ−ヒスチジンタグを含む。
下記の核酸配列は、前述のポリペプチド配列の最適化されたコード配列である。
（完全プレＨＩＳ ２）
下記のポリペプチドは、ＲＳＶ ＦポリペプチドのＣ末端に結合されたＧＣＮ４（下線）の三量体化ドメインを有する完全長のＲＳＶ Ｆポリペプチド、続いてヘキサ−ヒスチジンタグを含む。
下記の核酸配列は、前述のポリペプチド配列の最適化されたコード配列である。
（エクトＨＩＳ）
下記のポリペプチドは、ＲＳＶ Ｆポリペプチドのエクトドメイン、続いてヘキサ−ヒスチジンタグを含む。
下記の核酸配列は、前述のポリペプチド配列の最適化されたコード配列である。
（エクトプレＨＩＳ）
下記のポリペプチドは、ＲＳＶタンパク質のＴＭドメインが存在していた（ａ．ａ．５１７から始まる）箇所の上流のＲＳＶ Ｆポリペプチド内に挿入されたＧＣＮ４（下線）の三量体化ドメインを有するＲＳＶ Ｆポリペプチドのエクトドメイン、続いてヘキサ−ヒスチジンタグを含む。
下記の核酸配列は、前述のポリペプチド配列の最適化されたコード配列である。
（完全プレＨＡ ＨＩＳ）
下記のポリペプチドは、ＲＳＶ ＦポリペプチドのＣ末端に結合されたインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド（下線）の融合後三量体化ドメインを有する完全長のＲＳＶ Ｆポリペプチド、続いてヘキサ−ヒスチジンタグを含む。
下記の核酸配列は、前述のポリペプチド配列の最適化されたコード配列である。
（エクトプレＨＡ ＨＩＳ）
下記のポリペプチドは、ＲＳＶタンパク質のＴＭドメインが存在していた（ａ．ａ．５１７から始まる）箇所の上流のＲＳＶ Ｆポリペプチド内に挿入されたインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド（下線）の融合後三量体化ドメインを有するＲＳＶ Ｆポリペプチドのエクトドメイン、続いてヘキサ−ヒスチジンタグを含む。
下記の核酸配列は、前述のポリペプチド配列の最適化されたコード配列である。
（完全ΔＨＲＢ ＨＩＳ）
下記のポリペプチドは、ＨＲＢドメインを欠失させた完全長のＲＳＶ Ｆポリペプチド、続いてヘキサ−ヒスチジンタグを含む。
下記の核酸配列は、前述のポリペプチド配列の最適化されたコード配列である。
（エクト）
下記のポリペプチドは、ＲＳＶ Ｆポリペプチドのエクトドメインのみを含む。
下記の核酸配列は、前述のポリペプチド配列の最適化されたコード配列である。
（実施例２−ＲＳＶ Ｆ構築物の発現および精製）
膜貫通ドメインと細胞質テール領域が欠損しており、野生型フリン切断部位を有するか、またはフリン切断部位にノックアウト変異を有するかのいずれかであり、融合前安定化変異を有するか、または有しないかのいずれかである、ＲＳＶ Ｆ ＥＣＴＯおよび切断型の構築物を、ｐＦａｓｔＢａｃバキュロウイルス発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。これらの構築物のいくつかは、Ｃ末端フレキシブルリンカー、続いて、キレート精製で使用するＨｉｓ６−タグ配列を含むものである。高力価バキュロウイルスストックの作製物はＳｆ９昆虫細胞において継代した。Ｓｆ９、Ｔｎ５またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅいずれかの昆虫細胞を必要とされるバキュロウイルスに感染させることによりタンパク質を発現させ、感染の２〜３日後に培地の上清を収集し、抗ＲＳＶ Ｆまたは抗６ＨＩＳ抗体を用いてウエスタンブロットでモニタリングした。
昆虫細胞培地中に存在するフェリチンの有害効果によってキレート樹脂が損なわれることを排除するための２つの一般的なストラテジーのうちの１つにより、大規模発現培地を濃縮／精製した。第１のアプローチは、およそ１０〜２０リットルの昆虫発現培地をおよそ３００ｍｌまで、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｈｏｌｌｏｔｕｂｅファイバー濃縮カラムを用いて濃縮することであった。この濃縮混合物に硫酸銅を終濃度５００μＭまで添加し、得られた溶液を５ｍｌのＨｉＴｒａｐキレートカラムにロードした。次いで、結合されたＨＩＳ−タグ化タンパク質をカラムから、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌおよびイミダゾール勾配で溶出させた。
第２の精製ストラテジーでは、ＣｕＣｌ２を培地の上清に終濃度５００μＭまで添加した。１リットルの各培地に、４ミリリットルのキレート樹脂（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ，ＢｉｏＲａｄ）を添加し、スラリーを、セ氏４度で少なくとも３０分間振盪させ、樹脂と培地を重力カラムによって分離した。樹脂を、カラムの１０倍容積の平衡化バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、Ｆタンパク質を、カラムの１０倍容積の溶出バッファー（２５０ｍＭのイミダゾールを含む平衡化バッファー）で溶出させた。溶出物を２５ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５）に対して透析し、得られた溶液を、ＮｉＳＯ４を充填した５ｍｌのＨｉｔｒａｐキレートカラムにロードし、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌおよびイミダゾール勾配で溶出させた。
イミダゾール勾配での溶出物は、いずれの場合も、抗６ＨＩＳウエスタンおよびクマシーゲルを用いて評価した。純粋な構築物を含む画分を収集し、種々のバッファー／生理食塩水溶液に対して透析し、その後の分析のために、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓおよび／またはＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮ユニットを用いて濃縮した。また、本発明者らは、単分散（ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｃｅｄ）ＲＳＶ三量体がロゼットからさらに精製され得るサイズ排除精製プロトコルを開発した（後述）。
（ＲＳＶ Ｆタンパク質のＳＥＣ分析）
融合前コンフォメーションで安定化される他のパラミクソウイルス融合タンパク質の文献に記載された特徴は、融合ペプチドが露出するように切断された場合であっても、融合後コンフォメーションで観察されるようなロゼットを形成しないことである。単純なサイズ排除クロマトグラフィー分析により、タンパク質の同定、およびタンパク質がロゼットを形成しているかどうかの判定が可能である。効率的な精製工程としても機能する２つの方法、ＨＰＬＣ−ＳＥＣとＦＰＬＣ−ＳＥＣを開発した。
ＨＰＬＣ−ＳＥＣは、Ｂｉｏｒａｄ ＳＥＣカラム（１８ｍｍ）を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ移動相とともに用いて行なった。Ｂｉｏｒａｄ ＨＰＬＣ−ＳＥＣ標準物を用いて系を較正すると、本発明者らは、ＲＳＶロゼット（切断された融合後コンフォメーションを示す）は分析のカラムのボイドボリューム中に溶出されるが、ＲＳＶ単分散三量体（その後のＥＭ分析により三量体と推定）は、およそ１００ｋＤａの見かけ分子量で溶出されることを見い出した。
ＦＰＬＣ−ＳＥＣは、１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ移動相とともに用いてＧＥ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ ＦＰＬＣにおいて行なった。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ高分子量標準物を用いて系を較正すると、本発明者らは、ＲＳＶロゼットは分析のカラムのボイドボリューム中に溶出されるが、ＲＳＶ単分散三量体は、およそ１００ｋＤａの見かけ分子量で溶出されることを見い出した。
（ＲＳＶ Ｆタンパク質の電子顕微鏡検査（ＥＭ））
およそ５０マイクログラム／ｍｌのＲＳＶ Ｆ構築物のタンパク質溶液を、グロー放電炭素コートグリッド上に吸収させ、２％リンタングステン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）または０．７５％ギ酸ウラニル（非定量低ｐＨ）でネガティブ染色した。グリッドをＴｅｃｈｎａｉ ＳｐｉｒｉｔまたはＪＯＥＬ １２３０透過電子顕微鏡にて、必要とされる解像度に応じて、８０〜１２０ｋＶで２０，０００〜１５０，０００の倍率で操作して観察した。
（実施例３−融合前および融合後ＲＳＶ Ｆの検出）
ＲＳＶ Ｆポリペプチドに対する修飾または付加分子によって融合後コンフォメーションが不利になるかどうかをアッセイするためにＲＳＶ Ｆタンパク質のコンフォメーションを調べるには、いくつかの方法が利用可能である。例としては、リポソーム会合、コンフォメーション特異的モノクローナル抗体（例えば、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡで使用されるものなど）、電子顕微鏡検査、コンフォメーション間のプロテアーゼ感度の差、ゲル濾過クロマトグラフィー、分析用超遠心分離、動的光散乱、重水素交換ＮＭＲ実験、質量分析、円偏光二色性分光法、等温滴定型熱量測定、トリプトファン分光法、およびＸ線結晶学が挙げられる。
（リポソーム会合）
リポソーム会合は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のコンフォメーションをアッセイするために使用され得る。ＲＳＶ Ｆタンパク質の可溶性形態は、融合前コンフォメーションではリポソームと会合しないが、融合後コンフォメーションはリポソームと会合する。
リポソームは、以下のようにして調製され得る：クロロホルム中、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、およびコレステロール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから入手可能）を８：２：５のモル比で混合する。クロロホルムをアルゴン下で蒸発させる。脂質フィルムが形成され、これを一晩真空乾燥させ、ＰＢＳ中に総脂質４０ｍＭで再懸濁させる。５回の凍結−解凍サイクル後、脂質をボルテックスし、ミニエクストルーダー（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから入手可能）を使用することにより、２つの１００μｍフィルターから２１回押し出す。
リポソームが調製されたら、リポソーム会合アッセイが行なわれ得る。試験対象の各試料について、試験する２μｇのＲＳＶ Ｆポリペプチドを２５ミリ単位のトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能）で、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．１）中にて２５℃で３０分間切断する。切断後、４０ｐｇのダイズトリプシンインヒビター（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能）を各試料に添加し、反応を終了させる。試料を６０℃で３０分間前処理し、これにより単離された天然ＲＳＦ Ｆタンパク質において融合前形態から融合後形態へのコンフォメーションのシフトを誘導する。リポソーム（４０μｌ／試料）とＰＢＳを添加し（８０μｌの終容積）、試料を６０℃で３０分間インキュベートする。スクロースを５０％の終濃度（５００μｌの終容積）まで添加する。試料に、各々５００μｌの４０％スクロース、２５％スクロースおよびＰＢＳを重層し、ＴＬＳ５５ローターにて、４９，０００ｒｐｍで３時間、２５℃にてスピンさせる。画分（５００μｌ）を勾配の上部から収集する。タンパク質を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で可溶化させ、１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌのトリクロロ酢酸を使用することにより沈殿させる。ポリペプチドをＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移す。ブロットを抗ＲＳＶ Ｆモノクローナル抗体で調べる。
（電子顕微鏡検査）
電子顕微鏡検査を使用し、ＲＳＶ Ｆポリペプチドのコンフォメーションの分布をアッセイした。融合前形態のＲＳＶ Ｆポリペプチドは、長さが約１２ｎｍの「軸付きのボール」形状を有する。対照的に、融合後形態のＲＳＶ Ｆポリペプチドは、長さが約１６ｎｍの「ゴルフのティー」形状を有する。また、「ゴルフのティー」の細い末端における融合ペプチドは、凝集してロゼット構造を形成する。このように、電子顕微鏡検査は、形状が容易に識別可能なため、ＲＳＶ Ｆポリペプチドの試料におけるコンフォメーションの分布をアッセイするために使用され得る。
（実施例４ ＲＳＶ Ｆエクトドメインの三量体およびロゼット）
膜貫通ドメインと細胞質テール領域が欠損しており、野生型フリン切断部位を有するか、あるいはフリン切断部位にノックアウト変異および／または融合ペプチドの変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を有するかのいずれかである、ポリペプチドをコードするＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメイン構築物を、ｐＦａｓｔＢａｃバキュロウイルス発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。これらの構築物のいくつかは、Ｃ末端フレキシブルリンカー、続いて、キレート精製で使用するＨｉｓ６−タグ配列を含むものである。高力価バキュロウイルスストックの作製はＳｆ９昆虫細胞での継代によって達成した。Ｓｆ９、Ｔｎ５またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅいずれかの昆虫細胞を必要とされるバキュロウイルスに感染させることによりタンパク質を発現させ、感染の２〜３日後に馴化培地の上清を収集した。タンパク質の産生を、抗ＲＳＶ Ｆまたは抗ＨＩＳ６抗体を用いてウエスタンブロットでモニタリングした。
昆虫細胞培地中に存在するフェリチン（これは、キレート樹脂を損ない得る）の有害効果を排除するための２つの一般的なストラテジーのうちの１つを用いて、大規模発現培地を濃縮／精製した。第１のアプローチは、およそ１０〜２０リットルの昆虫発現培地をおよそ３００ｍｌまで、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｈｏｌｌｏｔｕｂｅファイバー濃縮カラムを用いて濃縮することであった。この濃縮混合物に硫酸銅を終濃度５００μＭまで添加し、得られた溶液を５ｍｌのＨｉＴｒａｐキレートカラムにロードした。次いで、結合されたＨＩＳ−タグ化タンパク質をカラムから、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌおよびイミダゾール勾配で溶出させた。
第２の精製ストラテジーでは、ＣｕＣｌ２を培地の上清に終濃度５００μＭまで添加した。１リットルの各培地に、およそ４〜１０ミリリットルのキレート樹脂（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ，ＢｉｏＲａｄ）を添加し、スラリーを、セ氏４度で少なくとも３０分間振盪させ、樹脂と培地を重力カラムによって分離した。樹脂を、カラムのおよそ１０倍容積の平衡化バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、Ｆタンパク質のエクトドメインを、カラムのおよそ１０倍容積の溶出バッファー（２５０ｍＭのイミダゾールを含む平衡化バッファー）で溶出させた。溶出物を２５ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５）に対して透析し、得られた溶液を、ＮｉＳＯ４を充填した５ｍｌ容Ｈｉｔｒａｐキレートカラムにロードした。結合されたタンパク質を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌおよびイミダゾール勾配で溶出させた。
イミダゾール勾配での溶出物は、いずれの場合も、抗ＨＩＳ６ウエスタンブロットおよび／またはクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて評価した。純粋な構築物を含む画分を収集し、種々のバッファー／生理食塩水溶液に対して透析し、その後の分析のために、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器および／またはＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮ユニットを用いて濃縮した。一部の場合では、単量体、三量体またはロゼットを、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。
（ＲＳＶ ＦエクトドメインのＳＥＣ分析および精製）
サイズ排除クロマトグラフィーを用いてＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインの単量体、三量体およびロゼットを精製し、分析した。また、この方法は、非切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインが、宿主細胞または培地に由来する脂質／リポタンパク質夾雑物から精製されることを可能にした。効率的な精製工程としても機能し得る２つの方法、ＨＰＬＣ−ＳＥＣとＦＰＬＣ−ＳＥＣを開発した。
ＨＰＬＣ−ＳＥＣは、Ｂｉｏｒａｄ ＳＥＣカラム（１８ｍｍ）を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ移動相とともに用いて行なった。Ｂｉｏｒａｄ ＨＰＬＣ−ＳＥＣ標準物を用いて系を較正すると、本発明者らは、ＲＳＶロゼット（切断された融合後コンフォメーションを示す）は分析のカラムのボイドボリューム中に溶出されるが、ＲＳＶ Ｆ単量体は、およそ７５〜８５ｋＤａの見かけ分子量で溶出されることを見い出した。
ＦＰＬＣ−ＳＥＣは、１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ移動相とともに用いてＧＥ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ ＦＰＬＣにおいて行なった。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ高分子量標準物を用いて系を較正すると、本発明者らは、ＲＳＶロゼットは分析のカラムのボイドボリューム中に溶出されるが、ＲＳＶ単分散三量体は、およそ１４０〜１６０ｋＤａの見かけ分子量で溶出され、ＲＳＶ Ｆ単量体は、およそ７５〜８５ｋＤａの見かけ分子量で溶出されることを見い出した。
精製には、ＦＰＬＣ−ＳＥＣ法を使用し、１ｍｌの画分を収集した。
（ＦｕｒｄｅｌまたはＤｅｌｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ構築物のトリプシン切断による融合後ロゼットの形成）
一般に、Ｄｅｌｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ単量体のトリプシン消化は、重量で１：１０００のトリプシン：ＲＳＶ Ｆまたは１ｍｇのＲＳＶ Ｆ抗原に対して１０〜１５ ＢＡＥＥ単位のトリプシンを用いて行なう。典型的な反応において、ウシ血漿由来のトリプシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ８８０２：１０，０００〜１５，０００ ＢＡＥＥ単位／ｍｇのトリプシン）を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ ＮａＣｌ中で１ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈した。ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ ＮａＣｌ中で希釈）を、１マイクロリットルのトリプシン溶液（最終質量比が０．００１：１のトリプシン：ＲＳＶ Ｆ、または各１ミリグラムのＲＳＶ Ｆに対しておよそ１０〜１５ ＢＡＥＥ単位のトリプシン）で、３７℃にて１時間処理した。典型的には、切断反応の進行はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによってモニタリングした。トリプシンインヒビターを用いて切断反応を停止させた。切断されたＲＳＶ Ｆタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。
場合によっては、１：１００容積の固定化トリプシンインヒビター（Ｓｉｇｍａ）または１マイクロリットルの１ｍＭダイズトリプシンインヒビターを切断溶液に添加し、混合物を静かに振盪しながら室温でおよそ１５〜３０分間インキュベートし、トリプシン反応を停止させた。マイクロ遠心分離機カラムを用いてインヒビター樹脂をタンパク質溶液から分離した。得られた溶液をＳＥＣ精製によって精製した。
（ＲＳＶ Ｆタンパク質の電子顕微鏡検査（ＥＭ））
ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチド（およそ５０マイクログラム／ｍｌ）を、グロー放電炭素コートグリッド上に吸収させ、２％リンタングステン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）または０．７５％ギ酸ウラニル（非定量低ｐＨ）でネガティブ染色した。グリッドをＴｅｃｈｎａｉ ＳｐｉｒｉｔまたはＪＯＥＬ １２３０透過電子顕微鏡にて、必要とされる解像度に応じて、８０〜１２０ｋＶで２０，０００〜１５０，０００の倍率で操作して観察した。
（リン脂質アッセイ）
このアッセイは、Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．のアッセイであるリン脂質Ｃコリンオキシダーゼ−ＤＡＯＳ法（カタログ番号４３３−３６２０１）に基づいたものである。このアッセイプロトコルは、単に、該製造業者の一般的なプロトコルと比べて、アッセイで使用する物質の量が少なくなるように、および反応における試料の希釈が低減されるように変形したものである。ＲＳＶ Ｆ試料の脂質含有量を測定するため、一瓶の着色試薬を一瓶のバッファーに溶解させることにより、着色試薬を作製する（着色試薬は４℃で１週間安定である）。３００ｍｇ／ｄＬ（３ｍｇ／ｍｌ）のリン脂質標準物を蒸留水で１．５、１．０、０．７５、０．５および０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈する。標準物、水ブランクおよび試料反応物の各々について、マイクロ遠心分離機のチューブに、１０μｌの着色試薬と２μｌの標準物、蒸留水（０ｍｇ／ｍｌ標準物）または試料のいずれかを添加する。反応物を短時間で遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）して適正な混合を確実にし、チューブを３７℃で１５分間インキュベートする。各標準点について５９５ｎｍにおける吸光度を記録し、標準曲線を作成する。各試料の５９５ｎｍの吸光度を記録し、作成した較正曲線からリン脂質濃度を計算する。
（コットンラットにおける免疫原性）
単量体（非切断ｄｅｌｐ２１ ｆｕｒｘ）、三量体のロゼット（切断ｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｄｅｌ）、および三量体（融合ペプチド欠失）の形態のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの免疫原性を、コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）において２つの試験で決定した。試験１（図８Ａおよび８Ｂ）では、１０匹のコットンラット／群に、１０μｇの単量体またはロゼット（各々、水酸化アルミニウムに吸着させたもの）を筋肉内に、０日目と２１日目にワクチン接種した。血清抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ＩｇＧおよびＲＳＶ中和抗体の力価を、１回目のワクチン接種の２週間後（２ｗｐ１）と２回目のワクチン接種の２週間後（２ｗｐ２）、または１回目のワクチン接種の３週間後（３ｗｐ１）と２回目のワクチン接種の２週間後（２ｗｐ２）に測定した。抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ＩｇＧ（図８Ａ）は、ＥＬＩＳＡによって、ＲＳＶ Ｆタンパク質コートプレートおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化ニワトリ抗コットンラットＩｇＧ検出抗体を用いて測定した。データを、個々のコットンラットのｌｏｇ１０幾何平均力価（ＧＭＴ）＋標準偏差で示す。ＲＳＶの中和力価（図８Ｂ）は、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって測定した。簡単には、熱不活性化した血清の希釈物をＲＳＶ Ｌｏｎｇとともにプレインキュベートし、次いで、１２ウェルプレート内のＨＥｐ−２細胞に接種した。２時間の感染後、接種材料を除去し、細胞にアガロースを重層した。５日後、ニュートラルレッド染色によってプラークを計数した。中和力価は、対照（血清なし）と比べて、ウェル１つ当たり少なくとも６０％のプラーク数の減少をもたらす血清希釈度の逆数と定義する。データを、５匹のコットンラット／群の２つのプールのｌｏｇ１０ＧＭＴ＋標準誤差で示す。
試験２（図８Ｃ）では、９匹のコットンラット／群を、筋肉内に、表示した用量の単量体、三量体またはロゼット（各々、水酸化アルミニウムに吸着させたもの）で免疫化した。血清抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ＩｇＧの力価を２ｗｐ１に上記のようにして測定した。
（結果）
可溶性のＲＳＶ Ｆエクトドメイン（非変異型フリン切断部位を有する）は発現されたが、宿主細胞または培養培地に由来する脂質およびリポタンパク質不純物からサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製できなかった。このようなＲＳＶ ＦエクトドメインポリペプチドはＳＥＣカラムのボイドボリューム内に脂質およびリポタンパク質夾雑物とともに溶出される。
フリン切断部位に変異を含むＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドを作製するための、いくつかの構築物（例えば、Ｆｕｒｄｅｌ構築物）を調製した。図１参照。Ｆｕｒｄｅｌ構築物の発現によって産生されたポリペプチドは細胞から、約６５ｋＤａの非切断種として分泌された。また、Ｆｕｒｄｅｌ変異により、融合ペプチドの露出が抑制され、これによりロゼット形成が抑制される。その結果、可溶性のＲＳＶ Ｆ Ｆｕｒｄｅｌは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００分取用（ｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ）カラムの包含ボリューム（ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）中に移動し、脂質残屑（これは、ボイドボリューム中に溶出される）と昆虫タンパク質不純物の両方からの分離がもたらされる。このような結果は、フリン切断部位が変異したＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドが、ＳＥＣによって精製され得る非切断ポリペプチドとして産生されることを示す。また、非切断型ＲＳＶ Ｆの保持時間の分析は、該ポリペプチドが三量体ではなく単量体であることと整合した。
ＲＳＶ Ｆ ｆｕｒｄｅｌポリペプチドが単量体、三量体または単量体と三量体の混合物のいずれであるかを、分析用超遠心分離を用いてさらに評価した。ＳＥＣ精製の単量体ピークから精製したタンパク質を使用し、分析用超遠心分離試験を行なった。非切断型ＲＳＶ Ｆの沈降速度データにより、溶液中に２つの種を示唆するステップパターンが示された。沈降速度実験の分析により、非切断型ＲＳＶ Ｆエクトドメインが、溶液中で単量体の大きな集団と見かけ上三量体の小さな集団を有することが示された。平衡実行データ（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｒｕｎ ｄａｔａ）を収集し、データを理想的な単量体モデルまたは単量体−三量体平衡モデルのいずれかにフィットさせる試行を行なった。しかしながら、フィットの残差は不十分であり、特にタンパク質濃度が高いセルの底部に対して不十分であった。このような観察により、非切断型ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドは、高濃度で主に単量体であり、自己会合する少数集団（場合によっては三量体として）または凝集体を伴うことが示唆された。
選択したＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドのさらなる分析を、サイズ排除（ＳＥＣ）クロマトグラフィーを用いて行なった。図６Ａ〜６Ｄ。図６Ａ〜６Ｄにおいて、単量体、三量体または三量体のロゼットを含む主成分ピークをアスタリスクで示し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐ２００ １６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の保持時間をミリリットルで示す。較正したカラムでは、４７ｍｌ、６５ｍｌおよび７７ｍｌのおおよその保持時間は、それぞれ、カラムのボイドボリューム、Ｆ三量体の保持、および単量体の保持に相当する。図６Ａにおいて、非切断Ｄｅｌｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ（Δｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ）構築物を単量体ピークから精製した。非切断Ｄｅｌｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ ＲＳＶ Ｆ抗原をトリプシンで処理すると、タンパク質はロゼットを形成し、これは、ＳＥＣでボイドボリューム中に移動した（図６Ｂ）。ＲＳＶ Ｆ融合ペプチド欠失の切断三量体種は、三量体ピークからおよそ６５ｍｌの保持時間において精製された（図６Ｃ）が、非切断Ｄｅｌｐ２１ Ｆｕｒｘ構築物（Δｐ２１ Ｆｕｒｘ）は、単量体ピークからおよそ７７ｍｌにおいて精製された（図６Ｄ）。
非切断形態の、またはトリプシン切断後のいくつかのＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドをＥＭによって評価した。ＲＳＶ Ｆ Ｆｕｒｄｅｌおよびｄｅｌｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ構築物は、フリン切断部位内に残っているアルギニン残基を有する。このようなアルギニンはトリプシン切断を受け易い。切断されると、非切断型Ｆ０種は、融合ペプチドが露出されるＦ１／Ｆ２種に変換された。ＥＭ分析により、トリプシン切断後、非切断型ＲＳＶエクトドメインは、その融合ペプチドのため、関連融合タンパク質で観察されたように三量体のロゼットを形成することが確認された。結果を表３に示すが、これは、非切断型のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドが切断されて三量体のロゼットを形成し得ることを示す。融合ペプチド欠失型構築物（これは、フリンによって切断される）では単分散三量体が形成された。図７Ａ〜７Ｄも参照のこと。好都合なことに、このようにして三量体のロゼットが生成すると、実質的に脂質残屑およびリポタンパク質が含まれていない三量体のロゼットがもたらされる。
免疫原性試験の結果により、単量体（非切断ｄｅｌｐ２１ ｆｕｒｘ）、三量体のロゼット（切断ｄｅｌｐ２３ ｆｕｒｄｅｌ）、および三量体（融合ペプチド欠失）の形態のＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドは、コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）において免疫原性であり、中和抗体が誘導されることが示された。図８Ａ〜８Ｃ。
（実施例５−昆虫細胞またはＣＨＯ細胞でのＲＳＶ Ｆサブユニット抗原の作製方法）
（昆虫細胞からのＲＳＶ Ｆ抗原の精製）
ＲＳＶ Ｆエクトドメインサブユニット、例えば、Ｄｅｌｐ２１ Ｆｕｒｘ、Ｄｅｌｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌおよび融合ペプチド欠失の構築物を、ＨｉＦｉｖｅ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、ｐＦＡＳＴ Ｂａｃバキュロウイルス系を用いて発現させた。ＲＳＶ Ｆサブユニットを大規模発現（１０〜２５リットル）から、昆虫細胞培地中に存在するフェリチン夾雑物（これは、キレート樹脂を損ない得る）の有害効果を少なくする２工程のキレート方法によって精製した。ＣｕＳＯ４を培地の上清に終濃度５００μＭまで添加した。およそ１０〜２０ミリリットルのキレート樹脂（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ，ＢｉｏＲａｄ）を１リットルの各培地に添加し、スラリーを４℃で少なくとも３０分間振盪させ、重力カラムを用いて樹脂と培地を分離した。樹脂を、この樹脂のおよそ２倍容積の平衡化バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、Ｆタンパク質のエクトドメインを、カラムのおよそ２倍容積の溶出バッファー（２５０ｍＭのイミダゾールを含む平衡化バッファー）で溶出させた。溶出物を２５ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５），３００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析し、得られた溶液を、ＮｉＳＯ４を充填した５ｍｌのＨｉｔｒａｐキレートカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合されたタンパク質を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌおよびイミダゾール勾配で溶出させた。
イミダゾール勾配での溶出物は、どちらの場合も、抗ＨＩＳ６ウエスタンブロットおよび／またはクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて評価した。純粋な構築物を含む画分を収集し、その後のサイズ排除クロマトグラフィーによる分析／精製のために、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器および／またはＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮ユニットを用いておよそ１ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
（ＲＳＶ ＦエクトドメインのＳＥＣ分析および精製）
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインの非切断単量体および切断三量体を精製し、分析した。また、この方法により、非切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインが、宿主細胞または培地に由来する脂質およびリポタンパク質夾雑物から精製されることを可能にした。不純物のないロゼットを生成する場合、まず、非切断Ｄｅｌｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ構築物を単量体として精製し、続いて、プロテアーゼ処理し、ＳＥＣを用いて再度精製して、均一なロゼットを精製した（下記参照）。効率的な精製工程としても機能し得る２つの方法、ＨＰＬＣ−ＳＥＣとＦＰＬＣ−ＳＥＣを、ＲＳＶ Ｆオリゴマー化の分析のために開発した。
ＨＰＬＣ−ＳＥＣは、Ｂｉｏｒａｄ ＳＥＣカラム（１８ｍｍ）を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ移動相とともに用いて行なった。Ｂｉｏｒａｄ ＨＰＬＣ−ＳＥＣ標準物を用いて系を較正すると、本発明者らは、ＲＳＶロゼット（切断された融合後コンフォメーションを示す）は分析のカラムのボイドボリューム中に溶出されるが、ＲＳＶ Ｆ単量体は、およそ７５〜８５ｋＤａの見かけ分子量で溶出されることを見い出した。
ＦＰＬＣ−ＳＥＣは、１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ移動相とともに用いてＧＥ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ ＦＰＬＣにおいて行なった。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ高分子量標準物を用いて系を較正すると、本発明者らは、ＲＳＶロゼットは分析のカラムのボイドボリューム中に溶出されるが、ＲＳＶ単分散三量体は、およそ１４０〜１６０ｋＤａの見かけ分子量で溶出され、ＲＳＶ Ｆ単量体は、およそ７５〜８５ｋＤａの見かけ分子量で溶出されることを見い出した。ＲＳＶ 非切断Ｄｅｌｐ２１ ＦｕｒｘまたはＤｅｌｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ（単量体）または融合ペプチド欠失（三量体）の精製では、０．５〜２ｍｌのおよそ１ｍｇ／ｍｌのキレート精製物質を、平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐ２００ １６／６０カラムに０．５〜２ｍｌ／分の流速でロードし、適切な画分を収集した。
（Ｄｅｌｐ２３ Ｆｕｒｄｅｌ構築物のトリプシン切断による融合後ロゼットの形成）
ウシ血漿由来のトリプシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ８８０２：１０，０００〜１５，０００ ＢＡＥＥ単位／ｍｇのトリプシン）を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ ＮａＣｌ中で１ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈した。ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインポリペプチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ ＮａＣｌ中で希釈）を、１マイクロリットルのトリプシン溶液（最終質量比が０．００１：１のトリプシン：ＲＳＶ Ｆ、または各１ミリグラムのＲＳＶ Ｆに対しておよそ１０〜１５ ＢＡＥＥ単位のトリプシン）で、３７℃にて１時間処理した。切断反応の進行はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによってモニタリングした。トリプシンインヒビター（Ｇｉｂｃｏ製ダイズトリプシンインヒビター，トリプシンに対して等質量のインヒビターを使用）を用いて切断反応を停止させた。より高い効率で単量体をロゼットに変換させるためには、切断工程と、その後のロゼット精製との間にインキュベーション期間が必要であることがわかった。３７℃で１〜６時間のインキュベーション期間により、高いロゼット形成効率がもたらされることが示された。切断ＲＳＶ Ｆタンパク質を、未変換単量体種からサイズ排除クロマトグラフィー（上記）を用いてさらに精製し、その場合、均一なロゼットがカラムのボイドボリューム画分中にて収集され得る。
（ＣＨＯ細胞からのＲＳＶ Ｆ抗原の精製）
ＲＳＶ Ｆ融合ペプチド欠失構築物（これはＨＩＳ−タグを含まない）をカチオン精製によって精製した。発現させたＲＳＶ Ｆ三量体抗原を含むＣＨＯ材料を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製中空糸カートリッジ濃縮システム（ＭＷＣＯ １０，０００ｋＤａ）にて、元の容積のおよそ１０分の１まで濃縮した。次いで、この濃縮液を、等容積の２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０），２５ｍＭ ＮａＣｌで４回バッファー交換した。得られた溶液（酢酸／生理食塩水バッファー中に濃縮ＲＳＶ Ｆ三量体を含むもの）を、酢酸／生理食塩水バッファーで平衡化しておいた充填済ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉＴｒａｐ ＣＭカラムにロードした。タンパク質をカラムから、２５、１５０、２５０、５００または１０００ｍＭいずれかのＮａＣｌを含む２５ｍＭ酢酸バッファーの段階的勾配を用いて溶出させた（２５０ｍＭおよび５００ｍＭのＮａＣｌ画分はバルク溶出物質を含む）。この物質を、上記のプロトコルと同様のＳＥＣ精製を用いてさらに精製してもよい。
（実施例６−コットンラットにおけるＲＳＶ Ｆサブユニットの免疫原性）
各々、アラムまたはＭＦ５９を用いて処方したＲＳＶ−Ｆ三量体（ＲＳＶ−Ｆ−融合−ペプチド−欠失−ｔｒｕｎ）およびロゼット（ＲＳＶ−Ｆ−ｄｅｌｐ２３−ｆｕｒｄｅｌ−ｔｒｕｎｃ，切断）サブユニットの免疫原性および防御能を、コットンラットモデルにおいて評価した。この試験でのＥＬＩＳＡに使用した抗原は、ＲＳＶ−Ｆ−融合−ペプチド−欠失−ｔｒｕｎｃとした（表４）。中和は、感染性ＲＳＶであるＬｏｎｇ株に対するものとした（表５）。組合せはすべて免疫原性であり、高力価のＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＧおよびＲＳＶ中和抗体の応答が誘起され、これは、２回目のワクチン接種で高められ、経鼻ＲＳＶチャレンジからの防御がもたらされた。
（方法）
（コットンラットのワクチン接種およびチャレンジ）
雌性コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｉｓ）をＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得した。動物群を筋肉内にて（ｉ．ｍ．，１００μｌ）、表示したワクチンで０日目と２１日目に免疫化した。血清試料を、最初の免疫化の３週間後（３ｗｐ１）と２回目の免疫化（ｉｍｍｕｎｚｉａｔｉｏｎ）の２週間後（２ｗｐ２）に収集した。免疫化した動物またはワクチン接種していない対照動物に、鼻腔内にて（ｉ．ｎ．）、１×１０５ｐｆｕのＲＳＶ Ｌｏｎｇで、最後の免疫化の４週間後にチャレンジした。血液採取およびＲＳＶチャレンジは、精密気化器を用いた３％イソフルランでの麻酔下で行なった。
（ＲＳＶ Ｆ特異的ＥＬＩＳＡ）
個々の血清試料を、ＲＳＶ Ｆ特異的ＩｇＧの存在について酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイした。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェル，Ｎｕｎｃ）を、１μｇ／ｍｌの精製ＲＳＶ Ｆ（融合−ペプチド欠失−ｔｒｕｎｃ）（ＰＢＳ中）で、４℃にて一晩コートした。洗浄後（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）、プレートをＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ中）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、３７℃にて少なくとも１．５時間ブロックした。次いで、このプレートを洗浄し、実験コットンラットまたは対照コットンラットの血清のアッセイ希釈剤（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０と５％ヤギ血清含有ＰＢＳ）での連続希釈物を添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ニワトリ抗コットンラットＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ，アッセイ希釈剤中で１：５，０００に希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を各ウェルに添加した。１００μｌの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４の添加によって反応を停止し、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。各血清試料について、血清希釈度の逆数の対数に対する光学密度（ＯＤ）のプロットを非線形回帰（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）によって作成した。力価は、およそ０．５のＯＤでの血清希釈度の逆数と定義した（プレートごとに含めた、規定の力価１：２５００を有するＲＳＶ感染コットンラット由来のプールした標準血清に対して標準化）。
（マイクロ中和アッセイ）
血清試料を、中和抗体の存在についてマイクロ中和アッセイによって試験した。熱不活化（ＨＩ）−血清の２倍連続希釈物（５％ＨＩ−ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ＰＢＳ中）を、等容積のＲＳＶ Ｌｏｎｇ株に添加した（事前におよそ１１５ ＰＦＵ／２５μｌをもたらす力価にした）。血清／ウイルス混合物を３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートしてウイルス中和を行なわせ、次いで、２５μｌのこの混合物（およそ１１５ ＰＦＵを含む）を、二連で、９６ウェルプレート内のＨＥｐ−２細胞のウェルに接種した。３７°および５％ＣＯ２で２時間後、細胞に０．７５％メチルセルロース／ＥＭＥＭ ５％ＨＩ−ＦＢＳを重層し、４２時間インキュベートした。感染性ウイルス粒子の数を、免疫染色した後、自動計測することによるシンシチウム形成の検出によって測定した。中和力価は、対照（血清なし）と比べて、ウェル１つ当たり少なくとも６０％のシンシチウム（ｓｙｎｃｔｉａ）数の減少をもたらす血清希釈度の逆数と定義する。
（ウイルス負荷）
肺内のウイルス負荷を、プラークアッセイによって測定した。具体的には、ＲＳＶ感染の５日後に肺を収集し、右側の肺葉の１つを、２５％スクロースを含む２．５ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れ、組織ホモジナイザーで破壊した。この試料の無細胞上清を−８０℃で保存した。感染性ウイルスについてアッセイするため、清澄化した肺ホモジネートの希釈物（５％ＨＩ−ＦＢＳ含有ＰＢＳ中）を、１２ウェルプレート内のコンフルエントＨＥｐ−２細胞の単層に２００μｌ／ウェルの容積で接種した。定期的に静かに振盪しながら２時間後（３７℃，５％ＣＯ２）、接種材料を除去し、細胞に、１．５ｍｌの１．２５％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース（Ｌｏｎｚａ）含有イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ，Ｌｏｎｚａ）（５％ＨＩ−ＦＢＳ、グルタミンおよび抗生物質を補給）を重層した。３〜４日間のインキュベーション後、細胞に、再度、１ｍｌの１．２５％アガロース含有ＥＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）（０．１％ニュートラルレッド（Ｓｉｇｍａ）を含有する）を重層した。１日後、ライトボックスの補助を伴ってプラーク計数した。
ウイルス負荷を測定するための代替的な方法は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。ウイルス負荷は、既報（Ｉ．Ｂｏｒｇら，Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２００３；２１：９４４−５１）のＲＳＶ−Ｆ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて（一部修正を伴って）ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定され得る。簡単には、ＲＮＡを、１４０μｌの清澄化肺ホモジネート、または既知のプラーク形成単位（ＰＦＵ）数のＲＳＶ（プラークアッセイによって測定し、非感染動物由来の肺ホモジネート中で希釈する）から、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を最終溶出容積１００μｌのＨ２Ｏとともに用いて単離する。ｃＤＮＡの合成とＰＣＲを単一のチューブにおいて行ない、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、５μＬの溶出ＲＮＡ、１０μＭの各プライマーおよび５０μＭのプローブとともに使用する（プライマーおよびプローブはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）。フォワードプライマー：ＴＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡ（配列番号７２）。リバースプライマー：ＣＴＴＴＴＧＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴ（配列番号７３）。プローブ：５’−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）−ＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＴＡＴＣＴＡＡＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＴ−テトラメチルカルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号７４）。増幅および検出は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴまたは７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行なう。サイクル閾値（Ｃｔ）は、各試料について、蛍光シグナルが、設定された閾値より上で最初に検出可能となるサイクル数と定義する。次いで、ウイルスＲＮＡの規定コピー数の対数に対するＣｔの標準曲線に基づいて各試料のＰＦＵ当量を求める。
（結果）
モデルとしてのコットンラットは、コットンラットとヒトとのＲＳＶ誘発性疾患における多くの類似性のため、ＲＳＶの病因および免疫の試験において広く使用されている。２つの重要な類似点は、中和抗体の有効性、およびホルマリン不活化ＲＳＶワクチン接種と関連する肺組織病理の増強である。また、コットンラットは、マウスなどの他の小動物よりもＲＳＶ感染に感染性である。
本発明者らのＲＳＶ−Ｆサブユニットワクチンの免疫原性を評価するため、雌性コットンラット群に、各々、アラムまたはＭＦ５９のいずれかを用いて処方した種々の用量の三量体（ＲＳＶ−Ｆ−融合−ペプチド−欠失−ｔｒｕｎｃ）またはロゼット（ＲＳＶ−Ｆ−ｄｅｌｐ２３−ｆｕｒｄｅｌ−ｔｒｕｎｃ，切断）を筋肉内にワクチン接種した。すべての場合において、血清中でＦ特異的抗体と中和抗体の両方を誘導するのに、１回の免疫化で十分であった（最初のワクチン接種の３週間後（３ｗｐ１）に測定する場合）。初回から３週間後、すべてのコットンラットに同種の追加免疫化を施し、これにより、２週間後（２ｗｐ２）に測定した場合、Ｆ特異的ＩｇＧおよび中和抗体の有意な増大がもたらされた。一般的に、ロゼットの免疫原性は三量体のものと同等かまたはそれ以上であり、ＭＦ５９処方物の方がアラム処方物よりも力価が高く、タンパク質用量が高いほど高い力価がもたらされるが、一部例外もみられた。
該サブユニットワクチンの防御能を調べるため、２回目のワクチン接種の４週間後、すべてのコットンラットを経鼻経路によってＲＳＶに感染させ、５日後、プラークアッセイによって肺内のウイルス負荷を測定した。すべての場合において、ワクチン接種したコットンラットの肺内ウイルス負荷は、免疫化せずにチャレンジした対照動物よりも３桁超低減されており、サブユニットワクチン接種によりチャレンジからの防御がもたらされた。
ａ 個々のコットンラット（７〜８匹／群）の幾何平均力価
三量体免疫原はＲＳＶ−Ｆ−融合−ペプチド−欠失−ｔｒｕｎｃとした
ロゼット免疫原はＲＳＶ−Ｆ−ｄｅｌｐ２３−ｆｕｒｄｅｌ−ｔｒｕｎ，切断とした。
ａ １×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＲＳＶ Ｌｏｎｇで鼻腔内チャレンジ
ｂ チャレンジの５日後のｐｆｕ／グラム肺
７〜８匹の個々のコットンラット／群の幾何平均力価
個々の動物が＜２０３（検出限界）の力価を有した場合、力価１００を割り当てた。
ａ シンシチウムが６０％減少する中和力価
３〜４匹のコットンラット／群の２つのプールの幾何平均力価。
（実施例７−ＲＳＶ ＲＮＡワクチン）
（ＲＮＡ合成）
アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドＤＮＡ（図４，配列番号７７）を、インビトロでのＲＮＡ合成のための鋳型として供した。この実験では、ＲＳＶの完全長の表面融合糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）を使用した（図４）。レプリコンが真核生物の細胞に送達されると、プラス鎖のＲＮＡが翻訳されて４つの非構造タンパク質が生成され、これらが一緒になってゲノムＲＮＡを複製させ、異種遺伝子産物をコードする大量のサブゲノムｍＲＮＡを転写した。アルファウイルスの構造タンパク質の発現の欠損のため、レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導することができない。アルファウイルスのｃＤＮＡの上流のバクテリオファージ（Ｔ７またはＳＰ６）プロモーターにより、インビトロでのレプリコンＲＮＡの合成が助長され、ポリ（Ａ）−テイルのすぐ下流のデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムにより、その自己切断活性によって正しい３’末端が生成される。
ＨＤＶリボザイムの下流で適当な制限エンドヌクレアーゼによってプラスミドＤＮＡを線形化した後、Ｔ７またはＳＰ６バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写物を合成した。７．５ｍＭ（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）または５ｍＭ（ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）の各ヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）の存在下、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）によって提供された使用説明書に従い、３７℃にて２時間転写を行なった。転写後、鋳型ＤＮＡをＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）で消化した。レプリコンＲＮＡをＬｉＣｌにより沈殿させ、ヌクレアーゼを含まない水中で再構成させた。転写後、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をユーザーマニュアルの概説どおりに使用し、無キャップＲＮＡにＶａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ（ＶＣＥ）でキャッピングした。転写後にキャッピングしたＲＮＡをＬｉＣｌにより沈殿させ、ヌクレアーゼを含まない水中で再構成させた。２６０ｎｍにおける光学密度を測定することにより、ＲＮＡ試料の濃度を求めた。インビトロ転写物の完全性を、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。
（脂質ナノ粒子（リポソーム）処方物ＲＶ０１（０１））
１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤｌｉｎＤＭＡ）を、以前に公開された手順を用いて合成した［Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．，Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．，ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７：２７６−２８７（２００５）］。１，２−ジアステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）は、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレステロールはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）から取得した。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＰＥＧ ＤＭＧ ２０００）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から取得した。
脂質の新鮮ストック溶液（エタノール中）を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ ＤＭＧ ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノールに溶解させた。調製したこの脂質の新鮮ストック溶液を３７℃で約１５分間、静かに振盪し、均質な混合物を形成した。次いで、７５５μＬのストックを１．２４５ｍＬのエタノールに添加し、２ｍＬの作業用脂質ストック溶液にした。この量の脂質を用いて、２５０μｇのＲＮＡを有する８：１のＮ：Ｐ（窒素対ホスフェート）比のＬＮＰを形成した。ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性脂質）上のプロトン化性（ｐｒｏｔｏｎａｔａｂｌｅ）窒素とＲＮＡ上のホスフェートがこの計算に使用される。１μｇの各自己複製ＲＮＡ分子は３ｎｍｏｌのアニオン性ホスフェートを含むものとし、１μｇの各ＤｌｉｎＤＭＡは１．６ｎｍｏｌのカチオン性窒素を含むものとした。また、２ｍＬの作業用ＲＮＡ溶液を、１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６）（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）中約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。使用前に、バイアルのＲＮＡｓｅ汚染を除去するため、３つの２０ｍＬのガラスバイアル（撹拌バーを入れる）をＲＮａｓｅ Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ですすぎ洗浄し、大量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄した。バイアルの１つを作業用ＲＮＡ溶液に、その他を脂質およびＲＮＡミックスの収集に使用した（後述どおり）。作業用の脂質溶液およびＲＮＡ溶液を３７℃で１０分間加熱した後、３ｃｃのルアーロック式シリンジ（ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）内に充填した。２ｍＬのクエン酸バッファー（ｐＨ６）を別の３ｃｃのシリンジ内に充填した。ＲＮＡおよび脂質を内包したシリンジをＴミキサー（ＰＥＥＫＴＭ ５００μｍ ＩＤ連結，Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）に、ＦＥＰチューブ（［フッ素化エチレン−プロピレン］ ２ｍｍ ＩＤ×３ｍｍ ＯＤ，Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）を用いて連結した。また、Ｔミキサーの排出口もＦＥＰチューブ（２ｍｍ ＩＤ×３ｍｍ）とした。クエン酸バッファーを内包する３つ目のシリンジは、別のチューブ片（２ｍｍ ＩＤ×３ｍｍ ＯＤ）に連結した。次いで、シリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，型番ＫＤＳ−２２０，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、すべてのシリンジを７ｍＬ／分の流速で作動させた。チューブの排出口は、混合物が２０ｍＬのガラスバイアル内（撹拌を伴う）に収集されるように配置した。撹拌バーを取り出し、エタノール／水溶液を室温まで１時間、平衡化させた。４ｍｌの混合物を５ｃｃのシリンジ（ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ）内に充填し、該シリンジをＦＥＰチューブ片（２ｍｍ ＩＤ×３ｍｍ ＯＤ，Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）に連結し、等しい長さのＦＥＰチューブに連結した別の５ｃｃのシリンジ内に、等量の１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６）を充填した。この２つのシリンジを、シリンジポンプを用いて７ｍＬ／分の流速で作動させ、最終混合物を２０ｍＬのガラスバイアル内（撹拌を伴う）に収集した。次に、第２の混合工程から収集された混合物（リポソーム）をムスタングＱメンブレン（アニオン性分子に結合して除去するアニオン交換支持体，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡから入手可能）に通した。リポソームを通す前、ムスタングメンブレンに、逐次、４ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６）を通した。このムスタングフィルターに通す前、リポソームを３７℃で１０分間昇温させた。次に、リポソームを２ｍＬまで濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）に対して透析した（タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムを使用）後、最終生成物を収集した。ＴＦＦシステムおよび中空糸濾過膜は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ（Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ）から購入し、製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤの孔径カットオフおよび８ｃｍ２の表面積を有するポリスルホン中空糸濾過膜（品番Ｐ／Ｎ：Ｘ１ＡＢ−１００−２０Ｐ）を使用した。インビトロおよびインビボ実験では、処方物を、必要とされるＲＮＡ濃度まで１×ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）で希釈した。
（カチオン性エマルジョン１７（ＣＮＥ１７）の調製方法）
スクアレン、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）、およびポリオキシ−エチレンソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｏｌｅａｔｅ）（Ｔｗｅｅｎ ８０）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から取得した。１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、Ｌｉｐｏｉｄ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。カチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）は、既報（Ｏｔｔら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，７９（１−３）：１−５（２００２））の荷電ＭＦ５９と同様にして、軽微な修正を伴って調製した。簡単には、油溶性成分（すなわち、スクアレン、ｓｐａｎ ８５、カチオン性脂質、脂質界面活性剤）をビーカー内で合わせ、脂質成分をクロロホルム（ＣＨＣｌ３）またはジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解させた。得られた脂質溶液を油＋ｓｐａｎ ８５に直接添加した。溶媒を換気フード内で室温にて２時間蒸発させた後、水相と合わせ、均一な供給材料を得るため、ＩＫＡ Ｔ２５ホモジナイザーを用いて２４Ｋ ＲＰＭで試料をホモジナイズした。一次エマルジョンを、氷浴冷却コイルを有するＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｅｚｅｒ Ｍ１１０ＳまたはＭ１１０ＰＳホモジナイザーに、およそ１５ｋ〜２０ｋ ＰＳＩのホモジナイゼーション圧で３〜５回通した（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）。該ユニットから２０ｍｌのバッチ試料を取り出し、４℃で保存した。以下の表には、ＣＮＥ１７の組成が記載されている。
（ＲＮＡの複合体化）
溶液中の窒素数をカチオン性脂質の濃度から計算した（例えば、ＤＯＴＡＰは１分子当たり、プロトン化され得る１個の窒素を有する）。ＲＮＡ濃度を使用し、ＲＮＡ１マイクログラム当たり３ｎｍｏｌのホスフェートの概算値を用いて溶液中のホスフェートの量を計算した。ＲＮＡ：脂質の量を変更することによりＮ／Ｐ比が修正され得る。ＲＮＡをＣＮＥ１７と、１０：１の窒素／ホスフェート（Ｎ／Ｐ）比で複合体形成させた。このような値を用いて、ＲＮＡをＲＮａｓｅを含まない水中で適切な濃度に希釈し、軽くボルテックスしながら直接、等容積のエマルジョンに添加した。この溶液を室温でおよそ２時間放置した。複合体が形成されたら、得られた溶液を、投与前に必要とされる濃度に希釈した。
（エレクトロポレーション）
エレクトロポレーションは、ｐＤＮＡワクチンの送達に非常に有効な方法であり、この手法を用いて自己複製ＲＮＡを送達した。マウスをイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）下で麻酔し、両後脚を念入りに剃って処置対象の肢部領域を露出させた。３０ｕｌ用量のワクチンを後肢の腓腹筋に、１／２ｃｃのインスリンシリンジを用いて注射した。この筋肉を、Ｅｌｇｅｎ（登録商標）ＤＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｏｖｉｏ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いてエレクトロポレーションした。機器パラメータは以下のとおり：６０Ｖ，６０ｍｓ毎に２パルスである。別の用量を第２肢に同様に送達した後、エレクトロポレーションした。
（ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ））
ＲＮＡワクチンを、レポーター遺伝子または抗原のインビボ発現を行なうための従来のＲＮＡベクター系アプローチと比較するため、本発明者らは、ＢＨＫ細胞において、Ｐｅｒｒｉらに記載の方法によって産生させたウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を用いた。この系では、抗原（またはレポーター遺伝子）レプリコンは、シンドビスウイルスの３’末端配列（３’ＵＴＲ）とシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）を含むように操作されたベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）ゲノム由来のアルファウイルスキメラレプリコン（ＶＣＲ）からなるものとした（Ｐｅｒｒｉらの図２参照）。このレプリコンを、乳仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞にシンドビスウイルスキャプシドと糖タンパク質の遺伝子をコードする欠陥性ヘルパーＲＮＡとともに共エレクトロポレーションすることにより、ＶＲＰ内にパッケージングした（Ｐｅｒｒｉらの図２参照）。次いで、ＶＲＰを収集し、標準的な方法によって力価測定し（ｔｉｔｒａｔｅ）、動物に、培養液または他の等張性バッファー中にて接種した。Ｐｅｒｒｉ Ｓ，Ｇｒｅｅｒ ＣＥ，Ｔｈｕｄｉｕｍ Ｋ，Ｄｏｅ Ｂ，Ｌｅｇｇ Ｈ，Ｌｉｕ Ｈ，Ｒｏｍｅｒｏ ＲＥ，Ｔａｎｇ Ｚ，Ｂｉｎ Ｑ，Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ＴＷ，Ｊｒ．ら（２００３）。ベネズエラウマ脳炎ウイルスおよびシンドビスウイルスに由来するアルファウイルスレプリコン粒子キメラは、強力な遺伝子ベースのワクチン送達ベクターである。Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：１０３９４−１０４０３。
（ＲＳＶ Ｆ三量体サブユニットワクチン）
ＲＳＶ Ｆ三量体は、ＲＳＶ Ｆエクトドメインを含み、融合ペプチド領域が欠失した（他の三量体との会合が抑制される）組換えタンパク質である。得られた構築物は、サイズ排除クロマトグラフィーによって観察されるように、均一な三量体を形成し、電子顕微鏡検査によって観察される融合後Ｆコンフォメーションと整合する、予測される表現型を有する。該タンパク質を昆虫細胞において発現させ、該構築物のＣ末端に融合させたＨＩＳタグによる精製、続いて、慣用的な手法を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。得られるタンパク質試料は９５％より高い純度を示す。Ｆ−サブユニットワクチンのインビボ評価のため、１００μｇ／ｍＬの三量体タンパク質を、１０ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．３）を用いて２ｍｇ／ｍＬのアラムに吸着させ、１５０ｍＭまで、塩化ナトリウムで等張に調整した。Ｆ−サブユニットタンパク質はアラムに、２〜８℃で静かに撹拌しながら一晩吸着させた。最終ワクチンのｐＨおよび重量オスモル濃度は、６．５〜７．５および２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇを標的とした。ワクチンを、タンパク質吸着についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）によって、およびエンドトキシン含有量についてＬＡＬアッセイ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）によって特性評価した。免疫化前、ワクチンを静かに反転することによって混合した。
（マウスでの免疫原性試験）
１０匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（８〜１０週齢および体重約２０グラム）を０日目と２１日目に免疫化し、１４、３５および４９日目に血液を採取した。すべての動物に対し、２つの後脚の四頭筋で注射し、各々、等容積（５０μｌ／部位）で合計１００μｌのワクチンを与えた（１０μｇの抗原用量を送達）。Ｔ細胞応答の測定が必要なときは、３５日目または４９日目に脾臓を収集した。
（コットンラットのワクチン接種およびチャレンジ）
雌性コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｉｓ）をＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得した。実験はすべて、Ｎｏｖａｒｔｉｓ動物保護使用委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を得ており、上記委員会に従って行なった。動物の群を筋肉内にて（ｉ．ｍ．，１００μｌ）、表示したワクチンで０日目と２１日目に免疫化した。血清試料を、各免疫化の２週間後に収集した。免疫化した動物またはワクチン接種していない対照動物を、鼻腔内にて（ｉ．ｎ．）、１×１０５ＰＦＵのＲＳＶで、最後の免疫化の４週間後にチャレンジした。血液採取およびＲＳＶチャレンジは、精密気化器を用いた３％イソフルランでの麻酔下で行なった。
（マウスＴ細胞機能アッセイ）
（細胞内サイトカイン免疫蛍光アッセイ）
同一にワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスの２〜５個の脾臓をプールし、培養のための単一の細胞懸濁物を調製した。各脾細胞プールについて、２つの抗原刺激培養物と２つの非刺激培養物を樹立した。抗原刺激培養物は、１×１０６個の脾細胞、ＲＳＶ Ｆペプチド８５−９３（１×１０−６Ｍ）、ＲＳＶ Ｆペプチド２４９−２５８（１×１０−６Ｍ）、ＲＳＶ Ｆペプチド５１−６６（１×１０−６Ｍ）、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（１ｍｃｇ／ｍＬ）、およびブレフェルジンＡ（１：１０００）を含むものとした。非刺激培養物は、ＲＳＶ Ｆペプチドを含めなかったこと以外は、刺激培養物と同一とした。３７℃で６時間の培養後、培養物を免疫蛍光のために処理した。細胞を洗浄し、次いで、蛍光標識抗ＣＤ４および抗ＣＤ８ モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で染色した。細胞を再度洗浄し、次いで、Ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍで２０分間固定した。次いで、固定された細胞をＰｅｒｍ洗浄バッファーで洗浄し、次いで、ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−２およびＩＬ−５に特異的な蛍光標識ｍＡｂで染色した。染色細胞を洗浄し、次いで、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用し、取得データを分析した。ＣＤ４＋８−Ｔ細胞サブセットおよびＣＤ８＋４−Ｔ細胞サブセットを、別々に分析した。所与の試料の各サブセットについて、サイトカイン陽性細胞の％を決定した。ＲＳＶ Ｆ抗原特異的Ｔ細胞の％は、抗原刺激培養物でのサイトカイン陽性細胞の％と非刺激培養物でのサイトカイン陽性細胞の％との差として計算した。標準的な方法（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，第７版．Ｇ．Ｗ．ＳｎｅｄｅｃｏｒおよびＷ．Ｇ．Ｃｏｃｈｒａｎ）を使用し、抗原特異的細胞の％の９５％信頼限界を決定した。
（分泌サイトカインアッセイ）
分泌サイトカインアッセイのための培養物は、ブレフェルジンＡを除いたこと以外は細胞内サイトカイン免疫蛍光アッセイのものと同様とした。３７℃で一晩培養後に培養上清を収集し、複数のサイトカインについて、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製のマウスＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットを用いて分析した。培養物ごとの各サイトカインの量を、製造業者により供給された精製組換えサイトカインを用いて作成された標準曲線から決定した。
（ＲＳＶ Ｆ特異的ＥＬＩＳＡ）
個々の血清試料を、ＲＳＶ Ｆ特異的ＩｇＧの存在について酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイした。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェル，Ｎｕｎｃ）を、１μｇ／ｍｌの精製ＲＳＶ Ｆ（ｄｅｌｐ２３−ｆｕｒｄｅｌ−ｔｒｕｎｃ 非切断）（ＰＢＳ中）で、４℃にて一晩コートした。洗浄後（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）、プレートをＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ中）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、３７℃にて少なくとも１．５時間ブロックした。次いで、このプレートを洗浄し、実験コットンラットまたは対照コットンラットの血清のアッセイ希釈剤（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０と５％ヤギ血清含有ＰＢＳ）での連続希釈物を添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ニワトリ抗コットンラットＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ，アッセイ希釈剤中で１：５，０００に希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を各ウェルに添加した。１００μｌの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４の添加によって反応を停止し、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。各血清試料について、血清希釈度の逆数の対数に対する光学密度（ＯＤ）のプロットを非線形回帰（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）によって作成した。力価は、およそ０．５のＯＤでの血清希釈度の逆数と定義した（プレートごとに含めた、規定の力価１：２５００を有するＲＳＶ感染コットンラット由来のプールした標準血清に対して標準化）。
（マイクロ中和アッセイ）
血清試料を、中和抗体の存在についてプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって試験した。ＨＩ−血清の２倍連続希釈物（５％ＨＩ−ＦＢＳ含有ＰＢＳ中）を等容積のＲＳＶ Ｌｏｎｇに添加した（事前におよそ１１５ ＰＦＵ／２５μｌをもたらす力価にした）。血清／ウイルス混合物を３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートしてウイルス中和を行なわせ、次いで、２５μｌのこの混合物（およそ１１５ ＰＦＵを含む）を、二連で、９６ウェルプレート内のＨＥｐ−２細胞のウェルに接種した。３７℃および５％ＣＯ２で２時間後、細胞に０．７５％メチルセルロース／ＥＭＥＭ ５％ＨＩ−ＦＢＳを重層し、４２時間インキュベートした。感染性ウイルス粒子の数を、免疫染色した後、自動計測することによるシンシチウム形成の検出によって決定した。中和力価は、対照（血清なし）と比べて、ウェル１つ当たり少なくとも６０％のシンシチウム数の減少をもたらす血清希釈度の逆数と定義する。
（ウイルス負荷）
肺内のウイルス負荷を、プラークアッセイによって測定した。具体的には、ＲＳＶ感染の５日後に肺を収集し、右側の肺葉の１つを、２５％スクロースを含む２．５ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れ、組織ホモジナイザーで破壊した。この試料の無細胞上清を−８０℃で保存した。感染性ウイルスについてアッセイするため、清澄化した肺ホモジネートの希釈物（５％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＨＩ−ＦＢＳ）含有ＰＢＳ中）を、１２ウェルプレート内のコンフルエントＨＥｐ−２細胞の単層に２００μｌ／ウェルの容積で接種した。定期的に静かに振盪しながら２時間後（３７℃，５％ＣＯ２）、接種材料を除去し、細胞に、１．５ｍｌの１．２５％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース（Ｌｏｎｚａ）含有イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ，Ｌｏｎｚａ）（５％ＨＩ−ＦＢＳ、グルタミンおよび抗生物質を補給）を重層した。３〜４日間のインキュベーション後、細胞に、再度、１ｍｌの１．２５％アガロース含有ＥＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）（０．１％ニュートラルレッド（Ｓｉｇｍａ）を含有する）を重層した。１日後、ライトボックスの補助を伴ってプラーク計数した。
（コットンラット肺病理）
ＲＳＶチャレンジの５日後、肺を収集し、各動物から４つの肺葉を収集し、穏やかな気管内滴注の後、液浸固定によって１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で固定した。組織を、顕微鏡検査のために常套的に処理し、ヘマトキシリン＆エオシン染色切片を調製した。所見を、以前に公開された基準［Ｐｒｉｎｃｅ ＧＡら，２００１］の変形を用いて以下のパラメータ：細気管支周囲炎、肺胞炎、気管支炎、脈管周囲細胞浸潤および間質性肺炎について評価した。病変を４点の半定量的スケールで評価した。最小（＋）変化は、１つまたは数個の小病巣を含むものとした；軽度（＋＋）変化は、小〜中くらいの大きさの病巣で構成されたものとした；中等度（＋＋＋）変化は、いくつものおよび／または中等度の大きさの病巣を含むものとした；顕著な（＋＋＋＋）変化は、広範にコンフルエントな病巣を示し、組織の大部分／全部が影響を受けたものとした。
（実施例７）
（Ａ−コットンラットＲＳＶチャレンジ試験（ＣＲＩＳ１４））
ＲＳＶの表面融合糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）を発現するＡ３１７レプリコンをこの実験に使用した。コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）（８匹の動物／群）に、裸の自己複製ＲＮＡ（Ａ３１７，１μｇもしくは１０μｇ）、ＬＮＰにおいて処方した自己複製ＲＮＡ（ＲＶ０１（０１），Ａ３１７，０．１μｇもしくは１μｇ）、ＲＳＶ−Ｆを発現するＶＲＰ（５×１０６ＩＵ）、Ｆ−三量体／アラムサブユニット（１０μｇ）、またはホルマリン不活化ＲＳＶワクチン（５２００ ＦＩ−ｐｆｕ）で、０日目と２１日目に、両側に筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を行なった。抗体分析のため、１４日目（２ｗｐ１）と３５日目（２ｗｐ２）に血清を収集した。すべての動物を、１×１０５ｐｆｕのＲＳＶで、鼻腔内に４９日目にチャレンジし、ウイルス負荷および肺病理の決定のため、肺を５４日目（５ｄｐｃ）に収集した。
（結果）
表７．０日目と２１日目の筋肉内ワクチン接種後のコットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）（８匹の動物／群）のＦ特異的血清ＩｇＧの力価。抗体分析のため、１４日目（２ｗｐ１）と３５日目（２ｗｐ２）に血清を収集し、４９日目に、すべての動物を１×１０５ｐｆｕのＲＳＶで鼻腔内にチャレンジした。ウイルス負荷および肺病理の決定のため、５４日目（５ｄｐｃ）に肺を収集した。データを、８匹の個々のコットンラット／群の幾何平均力価で示す。個々の動物が＜２５（検出限界）の力価を有した場合、力価５を割り当てた。
表８．０日目と２１日目の筋肉内ワクチン接種後のコットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）（８匹の動物／群）のＲＳＶ血清中和力価。分析のため、１４日目（２ｗｐ１）と３５日目（２ｗｐ２）に血清を収集した。データを６０％プラーク減少中和力価で示す。４匹のコットンラット／群の２つのプールの幾何平均力価。個々の動物が＜２５（検出限界）の力価を有した場合、力価５を割り当てた。
表９：０日目と２１日目の筋肉内ワクチン接種後のコットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）（８匹の動物／群）のＲＳＶチャレンジ５日後の肺のウイルス力価。４９日目、すべての動物を１×１０５ｐｆｕのＲＳＶで鼻腔内にチャレンジした。ウイルス負荷および肺病理の決定のため、５４日目（５ｄｐｃ）に肺を収集した。データを、プラークアッセイによって決定されたプラーク形成単位／グラム肺で示す。８匹の個々のコットンラット／群の幾何平均力価。個々の動物が＜２００（検出限界）の力価を有した場合、力価１００を割り当てた。
表１０．０日目と２１日目の筋肉内ワクチン接種後のコットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）（８匹の動物／群）のＲＳＶチャレンジ５日後の肺の肺胞炎。４９日目、すべての動物を１×１０５ｐｆｕのＲＳＶで鼻腔内にチャレンジした。ウイルス負荷および肺病理の決定のため、５４日目（５ｄｐｃ）に肺を収集した。病変を４点の半定量的スケールで評価した。最小（１）変化は、１つまたは数個の小病巣を含むものとした；軽度（２）変化は、小〜中くらいの大きさの病巣で構成されたものとした；中等度（３）変化は、いくつものおよび／または中等度の大きさの病巣を含むものとした；顕著な（４）変化は、広範にコンフルエントな病巣を示し、組織の大部分／全部が影響を受けたものとした。
（結論）
この試験の目的の１つは、コットンラットＲＳＶモデルにおけるレプリコンＲＮＡの免疫原性と防御能を調べることであった。別の目的は、ワクチンの免疫原性および有効性に対するリポソームおよびＣＮＥ１７処方の効果を評価することであった。非処方レプリコンＲＮＡでは、１回のワクチン接種後、血清Ｆ特異的ＩｇＧおよびＲＳＶ中和抗体が誘導され、この応答は２回目のワクチン接種により高まった。リポソームおよびＣＮＥ１７処方物は、このモデルにおいて同様に有効であり、２回目のワクチン接種後、１μｇのレプリコンＲＮＡに対するＦ特異的ＩｇＧの力価はおよそ８倍、および中和力価は４〜１０倍高まった（それぞれ、ＣＮＥ１７およびリポソーム）。レプリコンＲＮＡワクチンはすべて、経鼻ＲＳＶチャレンジからの防御をもたらし、５日後に測定したとき、肺のウイルス負荷が３桁超低減された。リポソームを用いて処方された１μｇのレプリコンＲＮＡによって生じる免疫応答の大きさおよび防御能は、５×１０６個のＶＲＰによって誘起される応答の２倍以内であった。アラムアジュバント含有三量体サブユニットでは、最も高い全抗Ｆ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価が誘起され、最も高い中和力価が誘起され、この試験で試験したいずれのワクチン調製物でチャレンジしたときも、肺においてＲＳＶ力価からの最も大きな度合の防御が誘起された。
（実施例７Ｂ−ＲＳＶ−Ｆ免疫原性試験（１０−１００１））
ＲＳＶの表面融合糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）を発現するＡ３１７レプリコンをこの実験に使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹の動物／群）に、ＲＳＶ−Ｆ発現ＶＲＰ（１×１０６ＩＵ）、裸の自己複製ＲＮＡ（Ａ３１７，１μｇ）、エレクトロポレーションを用いて送達する自己複製ＲＮＡ（Ａ３１７，１０μｇ）、リポソームにおいて処方した自己複製ＲＮＡ（ＲＶ０１（０１），Ａ３１７，０．１μｇもしくは１μｇ）およびＣＮＥ１７を用いて処方した自己複製ＲＮＡ（Ａ３１７，０．１μｇもしくは１μｇ）で、０日目と２１日目に、両側に筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を行なった。抗体分析のため、血清を、１４日目（２ｗｐ１）、３５日目（２ｗｐ２）および４９日目（４ｗｐ２）に収集した。Ｔ細胞分析のため、４９日目（４ｗｐ２）に５匹のマウス／群から脾臓を収集した。
（結果）
表１１．（１０−１００１）筋肉内ワクチン接種の１４日後のマウス（１０匹の動物／群）のＦ特異的血清ＩｇＧの力価。データを、個々のマウスの力価および１０匹の個々のマウス／群の幾何平均力価で示す。個々の動物が＜２５（検出限界）の力価を有した場合、力価５を割り当てた。
表１２．（１０−１００１）０日目と２１日目の筋肉内ワクチン接種後のマウス（１０匹の動物／群）のＦ特異的血清ＩｇＧの力価。抗体分析のため、血清を３５日目（２ｗｐ２）に収集した。データを、個々のマウスの力価および１０匹の個々のマウス／群の幾何平均力価で示す。個々の動物が＜２５（検出限界）の力価を有した場合、力価５を割り当てた。
表１３．（１０−１００１）０日目と２１日目の筋肉内ワクチン接種後のマウス（１０匹の動物／群）のＦ特異的血清ＩｇＧの力価。抗体分析のため、血清を４９日目（４ｗｐ２）に収集した。データを、個々のマウスの力価および１０匹の個々のマウス／群の幾何平均力価で示す。個々の動物が＜２５（検出限界）の力価を有した場合、力価５を割り当てた。
表１４：（１０−１００１）０日目と２１日目の筋肉内ワクチン接種後のマウス（１０匹の動物／群）のＲＳＶ血清中和力価。分析のため、３５日目（２ｗｐ２）に血清を収集した。データを、個々のマウスの６０％プラーク減少中和力価および１０匹の個々のマウス／群の幾何平均力価で示す。個々の動物が＜４０（検出限界）の力価を有した場合、力価２０を割り当てた。ＮＡ＝アッセイせず。
表１５：（１０−１００１）０日目と２１日目の筋肉内ワクチン接種後のマウス（１０匹の動物／群）のＲＳＶ血清中和力価。分析のため、４９日目（４ｗｐ２）に血清を収集した。データを、個々のマウスの６０％プラーク減少中和力価および１０匹の個々のマウス／群の幾何平均力価で示す。個々の動物が＜４０（検出限界）の力価を有した場合、力価２０を割り当てた。ＮＡ＝アッセイせず。
表１６．（１０−１００１）４９日目（４ｗｐ２）のＲＳＶ Ｆ特異的ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞の頻度。正味の（抗原特異的）サイトカイン陽性頻度（％）±９５％信頼半区間（ｈａｌｆ−ｉｎｔｅｒｖａｌ）を示す。太字で示した正味の頻度は、統計学的に有意に＞０であった刺激応答を示す。
表１７．（１０−１００１）４９日目（４ｗｐ２）のＲＳＶ Ｆ特異的ＣＤ８＋脾臓Ｔ細胞の頻度。正味の（抗原特異的）サイトカイン陽性頻度（％）±９５％信頼半区間を示す。太字で示した正味の頻度は、統計学的に有意に＞０であった刺激応答を示す。
（結論）
リポソーム処方物では、裸のＲＮＡ対照と比べて、免疫原性（Ｆ特異的ＩｇＧの力価の増大によって決定（８〜３０倍の増大））、中和力価、ならびにＣＤ４ Ｔ細胞応答およびＣＤ８ Ｔ細胞応答が有意に増強された。驚いたことに、ＲＶ０１（０１）のＦ特異的ＩｇＧの力価と中和力価は、０．１および１．０μｇの両方の用量において、ＶＲＰ（１×１０６ＩＵ）と同等であった。ＬＮＰ処方物でのＴ細胞応答は、高用量ではＶＲＰ（１×１０６ＩＵ）と同等であった。ＣＮＥ１７を用いた自己複製ＲＮＡの処方物では、裸のＲＮＡ対照と比べて、免疫原性（Ｆ特異的ＩｇＧの力価の増大によって決定（２〜５倍の増大））、中和力価、ならびにＣＤ４ Ｔ細胞応答およびＣＤ８ Ｔ細胞応答が有意に増強された。ＲＮＡのエレクトロポレーションにより、裸のＲＮＡ対照と比べて免疫原性が増強されたが、リポソーム送達よりは有意に低かった。
（実施例７Ｃ−ＲＳＶ−Ｆ免疫原性試験（１０−１０１８））
ＲＳＶの表面融合糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）を発現するＡ３１７レプリコンをこの実験に使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（８匹の動物／群）に、ＲＳＶ−Ｆ発現ＶＲＰ（１×１０６ＩＵ）、裸の自己複製ＲＮＡ（Ａ３０６，１、０．１、０．０１μｇ）およびリポソームにおいて処方した自己複製ＲＮＡ（ＲＶ０１（０１），方法１（Ａ３１７，１０．０、１．０、０．１、０．０１μｇ）を使用）で、０日目と２１日目に、両側に筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を行なった。抗体分析のため、血清を１４日目（２ｗｐ１）および（２ｗｐ２）に収集した。Ｔ細胞分析のため、４９日目（４ｗｐ２）に５匹のマウス／群から脾臓を収集した。
（結果）
ＲＶ０１（０１）リポソーム処方物は、多分散度指数が０．１４で１５８ｎｍのＺ平均粒子直径を有するものであり、被包効率は９６％であった。１４日目と３５日目のＦ特異的血清ＩｇＧの力価を表１８と１９に示し、４９日目のＴ細胞応答を表２０と２１に示す。
表１８：（１０−１０１８）０日目と２１日目の筋肉内ワクチン接種後のマウス（８匹の動物／群）のＦ特異的血清ＩｇＧの力価。抗体分析のため、血清を１４日目（２ｗｐ１）と３５日目（２ｗｐ２）に収集した。データを、個々のマウスおよび８匹の個々のコットンラット／群の幾何平均力価で示す。個々の動物が＜２５（検出限界）の力価を有した場合、力価５を割り当てた。
表１９：２３Ａから継続。（１０−１０１８）０日目と２１日目の筋肉内ワクチン接種後のマウス（８匹の動物／群）のＦ特異的血清ＩｇＧの力価。抗体分析のため、血清を１４日目（２ｗｐ１）と３５日目（２ｗｐ２）に収集した。データを、個々の動物および８匹の個々のコットンラット／群の幾何平均力価（ＧＭＴ）で示す。個々の動物が＜２５（検出限界）の力価を有した場合、力価５を割り当てた。
表２０．４９日目（実験１０−１０１８，４ｗｐ２）のＲＳＶ Ｆ特異的ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞の頻度。正味の（抗原特異的）サイトカイン陽性頻度（％）±９５％信頼半区間を示す。太字で示した正味の頻度は、統計学的に有意に＞０であった刺激応答を示す。
表２１．４９日目（実験１０−１０１８，４ｗｐ２）のＦ特異的脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度。正味の（抗原特異的）サイトカイン陽性頻度（％）±９５％信頼半区間を示す。太字で示した正味の頻度は、統計学的に有意に＞０であった刺激応答を示す。
（結論）
リポソーム処方物では、裸のＲＮＡ対照と比べて、免疫原性（Ｆ特異的ＩｇＧの力価の増大によって判定）およびＴ細胞の頻度が有意に増強された。ＲＶ０１（０１）についてのＦ特異的ＩｇＧの力価およびＣＤ８ Ｔ細胞の頻度は、１０μｇのＲＮＡ用量で、ＶＲＰ群（１×１０６ＩＵ）と比べて増強された。
（さらなる参考文献）
以下の参考文献は、その全ての教示が、参照によって本明細書に援用される。
本明細書に引用された全ての文書の全教示は、本明細書により、参照によって本明細書に援用される。

Claims (12)

  1. 配列番号１または配列番号２におけるアミノ酸１００〜１５０に対応するアミノ酸が、配列番号９のアミノ酸配列で置き換えられている、組換えＲＳウイルスＦポリペプチド（ＲＳＶ Ｆ）。
  2. モノマー、三量体、三量体のロゼット、または、これらの組み合わせの形態である、請求項１に記載のＲＳＶ Ｆ。
  3. 配列番号４９、および、配列番号６０、シグナルペプチドおよび／またはＨＩＳタグが削除されている前述のいずれかの配列、ならびにその組合せからなる群より選択される組換えポリペプチド。
  4. 異種オリゴマー化ドメイン、またはシグナルペプチドをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  5. 前記異種オリゴマー化ドメインが、インフルエンザ血球凝集素由来の三量体化ドメイン、ＳＡＲＳスパイク由来の三量体化ドメイン、またはＨＩＶ ｇｐ４１、ＮａｄＡ、修飾ＧＣＮ４もしくはＡＴＣａｓｅ由来の三量体化ドメインを含む群から選択される、請求項４に記載の組換えポリペプチド。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
  7. 免疫原性組成物であって、以下：
    （ａ）請求項１に記載の１つ以上のＲＳウイルスＦポリペプチド（ＲＳＶ Ｆ）；あるいは
    （ｂ）配列番号４９、配列番号６０、配列番号７１、ならびにシグナルペプチドが削除されている前述のいずれかの配列からなる群より選択されるポリペプチドであって、ここで、該シグナルペプチドが、配列番号１のアミノ酸１〜２１に対応する、ポリペプチド；を含む、免疫原性組成物。
  8. 請求項１に記載の１つ以上の組換えＲＳウイルスＦポリペプチド（ＲＳＶ Ｆ）を含む免疫原性組成物であって、ここで：
    （ｉ）該ＲＳＶ Ｆポリペプチドが、ＲＳＶ−Ｆエクトドメインを含む可溶性ポリペプチドであるか；または
    （ｉｉ）該ＲＳＶ Ｆが、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸２３〜９９および１５１〜５２４を含む；
    免疫原性組成物。
  9. 免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物は、配列番号４９、配列番号６０、配列番号７１、ならびにシグナルペプチドおよびＨＩＳタグが削除されている前述のいずれかの配列からなる群より選択されるポリペプチドを含み、ここで、該シグナルペプチドが、配列番号１のアミノ酸１〜２１に対応し、ここで、ＨＩＳタグが配列番号１１０に対応する、免疫原性組成物。
  10. アジュバントをさらに含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  11. 前記アジュバントが、アルミニウム塩、水中スクアレン型エマルジョン、小分子免疫増強物質および前述のものの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
  12. 被験体において免疫応答を誘導するための、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
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