JP5372374B2 - 哺乳類における抗腫瘍または抗ウイルス治療を行う目的において設計された要素のキット - Google Patents
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Description
本発明は、透過酵素をコードする核酸配列と、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物またはその前駆体とを含んでなる要素のキットに関する。本発明は、更に１個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の前駆体と、透過酵素をコードする遺伝子を含んでなる核酸配列と、自殺遺伝子を含んでなる核酸配列とを含んでなる要素のキットに関する。本発明は、透過酵素をコードする遺伝子と、自殺遺伝子とを含んでなるベクターにも関する。本発明は、増殖性または感染性疾患の遺伝子療法による治療を行う上で特に有用である。
1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物は、癌またはウイルス感染症の治療に極めて広汎に用いられる薬物である。その中でも、シタラビン、ゲムシタビン、フルダラビン、クラドリビン、トロキサシタビン、およびクロファラビンのようなヌクレオシド類似体は、癌化学療法に現在用いられている。ヌクレオシド類似体は、核酸合成を妨げる代謝拮抗薬である。これらの薬剤は一般的にはS期特異的であり、組込みかつDNAおよびRNA高分子自身を変更することによって、および/または核酸合成に関与する様々な酵素を妨害し、および/または生理的ヌクレオシドの代謝を修正することによって細胞傷害性活性を発揮することができる。
ヌクレオシド類似体は、ウイルス感染症に有効であることが示された最初の化合物の中にもあった。例えば、承認されている最初の四種類の抗HIV薬であるAZT、ddI、ddC、およびD4Tはヌクレオシド類似体であった。これらの薬物の4種全て、および他のヌクレオシド類似体は、同様なHIV阻害機構を有し、ヌクレオシドは累進的にリン酸化されて5'-三リン酸となり、これは次に逆転写酵素(RT)反応における連鎖停止剤(chain terminator)として作用すると考えられている。
核塩基類似体は、癌の治療にも用いられる。例えば、フルオロウラシル(5-FU)はフッ素化ピリミジンであって、細胞内において代謝されてその活性形であるフルオロデオキシウリジン一リン酸(FdUMP)となる。この活性形は、チミジンの正常な産生を阻害することによってDNA合成を阻害する。フルオロウラシルは、結腸、直腸、乳房、胃、および膵臓癌の治療目的において静脈内投与される。フルオロウラシルは、一部の皮膚癌および性器疣の局所治療の目的においてクリームおよび溶液により用いることもできる。
遺伝子治療の開発により、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の使用に対する新たな可能性が開かれた。「自殺遺伝子治療」と呼ばれる遺伝子治療のこの特定の分野においては、遺伝子の発現生成物が不活性物質(プロドラッグ)を細胞傷害性物質に形質転換することによって細胞死をもたらすことができる遺伝子が用いられる。
単純ヘルペス1型ウイルスチミジンキナーゼ(HSV-1 TK)をコードする遺伝子は、自殺遺伝子の原型(prototype)を構成している(Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028、Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552、Ram et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361)。TKポリペプチドはそれ自体は毒性を持たないが、アシクロビルまたはガンシクロビル(GCV)のようなヌクレオシド類似体の形質転換を触媒する。修飾されたヌクレオシドは、伸長の過程にあるDNA鎖に組込まれ、結果として細胞分裂を阻害する。多数の自殺遺伝子/プロドラッグ対が、現在入手可能である。更に具体的には、Escherichia coli (E. Coli)プリンヌクレオシドホスホリラーゼと6-メチルプリンデオキシリボヌクレオシド(Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1 , 223-238)、E. coliグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼと6-チオキサンチン(Mzoz and Moolten, 1993, Human Gene Therapy 4, 589-595)、およびシトシンデアミナーゼ(CDアーゼ)と5-フルオロシトシン(5FC)が挙げられる。
ヒトにおいては、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の細胞膜を通る輸送は受動的であるか、または専用の膜輸送体によって行われる。例えば、ほとんどのヌクレオシド類似体は親水性分子であり、細胞膜を介するその輸送は膜輸送体によって調節される。哺乳類細胞においては、二種類の主要なヌクレオシド輸送体遺伝子ファミリーである、平衡ヌクレオシド輸送体(ENT)および集中的ヌクレオシド輸送体(CNT)がある。ENTは促進担体タンパク質であり、CNTはNa(+)-依存性の二次的活性輸送体である(Kong et al., 2004, Curr Drug Metab, 5:63-84)。ヌクレオシド輸送体は、抗癌ヌクレオシド類似体に対する耐性に関与している。薬物輸送体における単一ヌクレオチド多形(SNP)は、ヌクレオシド類似体に応じる個人間の差異に寄与することがある(Damaraju et al., Oncogene. 2003, 22:7524-36)。従って、ヌクレオシド輸送体の低いまたは存在しない発現を回避することができる新たな治療法が必要である。更に、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の細胞内濃度は治療効率と相関するので、細胞内濃度を高める必要もある。
本発明の目的の一つは、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の細胞(例えば、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞)中の細胞内濃度を改良することである。この目的は、透過酵素をコードする遺伝子を含んでなる核酸配列による標的細胞のトランスフェクションによって達成される。
本発明の目的は、透過酵素をコードする遺伝子を含んでなる核酸配列と、自殺遺伝子を含んでなる核酸配列とを組み合わせて用いることにより自殺遺伝子治療の効力を向上させることでもある。この特別な使用により、自殺遺伝子によってコードされるタンパク質によって転換することができるプロドラッグ(すなわち、核酸塩基部分を含んでなる薬物の前駆体)の細胞内濃度が向上する。この使用によって、自殺遺伝子によってトランスフェクションされた細胞から透過酵素を発現する細胞への薬物の導入を高めることによる傍観者効果(bystander effect)を向上させることもできる。
これに関して、本発明はより少量の薬物またはプロドラッグを用い、このような治療によって誘発される副作用を減少させることもできる。
この目的のため、本発明は、
1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物またはその前駆体、および
透過酵素をコードする遺伝子を含んでなる核酸配列
を含んでなる要素のキットを提供する。
1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物またはその前駆体、および
透過酵素をコードする遺伝子を含んでなる核酸配列
を含んでなる要素のキットを提供する。
もう一つの態様によれば、本発明は、
1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の前駆体、および
透過酵素をコードする遺伝子を含んでなる核酸配列、および
自殺遺伝子を含んでなる核酸配列
を含んでなる要素のキットも提供する。
1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の前駆体、および
透過酵素をコードする遺伝子を含んでなる核酸配列、および
自殺遺伝子を含んでなる核酸配列
を含んでなる要素のキットも提供する。
好ましい態様においては、本発明による要素のキットは、脊椎動物、更に詳細にはヒトの癌および/またはウイルス疾患の治療に用いるものである。
本明細書において用いられる1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物とは、1個のみの核酸塩基部分をその構造に含んでなる分子である。本発明の好ましい態様によれば、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物は細胞を殺すことができ、更に好ましくは腫瘍細胞を殺すことができる。もう一つの好ましい態様によれば、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物は、細胞におけるウイルスの複製を減少または防止することができる。
本発明によれば、核酸塩基部分は、アデニン、チミン、グアニン、ウラシル、シトシン、およびそれらの類似体からなる群から選択される。
本発明の好ましい態様によれば、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物は、下記を含んでなる群から選択される：
シタラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、フルダルシビン、クラドリビン、トロキサシタビン、クロファラビン、アジドチミジン(AZT)、ジダノシン(ddI)、ザルシタビン(ddC)、スタブジン(d4T)、フルオロメチレンデオキシシチジン(FMdC)およびラミブジン、フロクスウリジン(FUdR)のようなヌクレオシド類似体、
5-フルオロウラシル(5-FU)のようなピリミジン類似体、および
チオグアニン、メルカプトプリン、アシクロビル、バラシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビルのようなプリン類似体。
シタラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、フルダルシビン、クラドリビン、トロキサシタビン、クロファラビン、アジドチミジン(AZT)、ジダノシン(ddI)、ザルシタビン(ddC)、スタブジン(d4T)、フルオロメチレンデオキシシチジン(FMdC)およびラミブジン、フロクスウリジン(FUdR)のようなヌクレオシド類似体、
5-フルオロウラシル(5-FU)のようなピリミジン類似体、および
チオグアニン、メルカプトプリン、アシクロビル、バラシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビルのようなプリン類似体。
本明細書において用いられる1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の前駆体とは、１以上の酵素反応によって1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物に転換することができる分子を表す。
本発明の好ましい態様によれば、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の前駆体は、アジドチミジン(AZT)、ガンシクロビル(GCV)、5-フルオロシトシン(5- FC)、5-フルオロウラシル(5-FU)、6-メチルプリンデオキシリボヌクレオシド、ガンシクロビルエライジン酸エステル、ペンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル、(E)-5-(2-ブロモビニル)-2'-デオキシウリジン、ジドブジン、2'-エキソ-メタノカルバチミジンを含んでなる群から選択される。
本明細書において用いられる透過酵素は、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物またはその前駆体の細胞膜を介する移動に関与する膜貫通タンパク質を表す。
本発明による透過酵素は、特にプリン透過酵素、シトシン透過酵素、およびヌクレオシド輸送体を表す。
本発明の好ましい態様によれば、透過酵素はS. cerevisiaeのプリンまたはシトシン透過酵素である。S. cerevisiaeの核塩基輸送体は、FCY2として知られるプリン-シトシン透過酵素およびFUR4として知られるウラシル透過酵素からなる。本発明の更に好ましい態様によれば、透過酵素は配列番号1および配列番号2を含んでなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
プリン-シトシン透過酵素であるFCY2は、酵母血漿膜を通るプロトンおよびアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、およびシトシンの共輸送(symport)に介在する(Grenson 1969, Jund and Lacroute 1970, Polak and Grenson 1973, Chevallier et al. 1975, Hopkins et al. 1988)。FCY2タンパク質は、シトシンの類似体である5-フルオロシトシンの輸送にも介在する(Grenson 1969, Jund and Lacroute 1970)。FCY2遺伝子は、最初は10-12個(Weber et al. 1990)であり、現在は9個(Ferreira et al. 1999)の膜貫通-スパンニングドメインを有すると予想された533アミノ酸(58 kDa)のタンパク質をコードする。FCY2は、プリン核塩基およびシトシンに対して同様な親和性を示す(Brethes et al. 1992)。S. cerevisiaeへのウラシルの取り込みは、ウラシル透過酵素FUR4によって介在される(Jund and Lacroute 1970, Jund et al. 1977)。FUR4は、10個の膜貫通ドメインと長い細胞質の親水性N-およびC-末端尾を有する633アミノ酸(71.7kDa)のタンパク質(Jund et al. 1988, Gamier et al. 1996)であると予想されたウラシル-プロトン共輸送体(symporter)(Hopkins et al. 1988)である。FUR4タンパク質は、ウラシルの類似体である5-フルオロウラシルの輸送に介在することもできる(Jund and Lacroute 1970)。
これに関して、好ましい態様によれば、透過酵素はFCY2およびFur4およびそれらの類似体を含んでなる群から選択される。FCY2およびFur4のアミノ酸配列は、特にSwiss-Protデータベース(それぞれ受託番号P17064およびP05316)において利用可能である。Fur4およびFCY2の類似体は、親タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも70%を上回り、好都合には80%を上回り、好ましくは90%を上回り、最も好ましくは95%を上回る同一性の程度を有し、かつ1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物を細胞膜を介して輸送する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドを表す。
もう一つの好ましい態様によれば、透過酵素は、hENT1、hENT2、hCNT1、hCNT2、およびhCNT3並びにそれらの類似体を含んでなる群から選択される。これらの透過酵素のアミノ酸配列は、当該技術、特にSwiss-Protデータベースに精通した者には入手可能である。これらのポリペプチドの類似体は、親ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも70%を上回り、好都合には80%を上回り、好ましくは90%を上回り、最も好ましくは95%を上回る同一性の程度を有し、かつ1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物を細胞膜を介して輸送する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドを表す。
当業者であれば、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物または薬物の前駆体と会合する透過酵素を選択することができる。例えば、FCY2およびFur4は、好ましくは5-FCと会合する。
自殺遺伝子は、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の前駆体を、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物へ転換することができるタンパク質をコードする遺伝子を表す。
自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性、および/またはチミジレートキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでなるが、これらに限定されない。
好ましくは、本発明による要素のキットに含まれる自殺遺伝子は、同じ要素のキットに含まれる1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の前駆体を形質転換することができるタンパク質をコードする。自殺遺伝子および1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の対応する前駆体の例を、下表に開示する。
本発明の好ましい態様によれば、本発明による自殺遺伝子は、少なくとも1個のCDアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。CDアーゼは、外来性シトシンが加水分解的脱アミノ化によってウラシルへ形質転換されるピリミジン代謝経路に関与している。CDアーゼ活性は原核生物および低級真核生物において明らかにされているが(Jund and Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102, 607-615、Beck et al., 1972, J. Bacteriol. 110, 219-228、De Haan et al., 1972, Antonie van Leeuwenhoek 38, 257-263、Hoeprich et al., 1974, J. Inf. Dis. 130, 112-118、Esders and Lynn, 1985, J. Biol. Chem. 260, 3915-3922)、それらは哺乳類には存在しない(Koechlin et al., 1966, Biochem Pharmacol. 15, 435-446、Polak et al., 1976, Chemotherapy 22, 137-153)。Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) FCY1およびE. coli codA遺伝子であって、それぞれこれら二種類の生物のCDアーゼをコードするものが知られており、それらの配列が公表されている(欧州特許第402 108号、Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1-6、WO93/01281号)。
CDアーゼはシトシンの類似体、すなわち5-フルオロシトシン(5-FC)も脱アミノ化することによって、5-フルオロウラシル(5-FU)を形成し、これは5-フルオロ-UMP (5-FUMP)に転換されると細胞傷害性の高い化合物となる。CDアーゼ活性を欠く細胞は、酵素をコードする遺伝子を不活性化する突然変異または哺乳類細胞のように天然においては、この酵素を欠いているため、5-FCに対して耐性である(Jund and Lacroute, 1970, J. Bacteriol, 102, 607-615、Kilstrup et al., 1989, J. Bacteriol. 1989 171, 2124-2127)。対照的に、CDアーゼ活性をコードする配列を導入した哺乳類細胞は、5-FCに対して感受性になった(Huber et al., 1993, Cancer Res. 53, 4619-4626、Mullen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 33-37、WO 93/01281号)。更に、近隣の形質転換していない細胞も5-FCに感受性になる(Huber et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8302-8306)。傍観者効果と呼ばれるこの現象は、血漿膜を通る直接拡散によって近隣細胞を興奮させる(intoxicates)5-FUを分泌するCDアーゼ活性を発現している細胞によるものである。受動拡散における5-FUのこの特性は、傍観者効果にはtkを発現している細胞と接触させる必要があるtk/GCVリファレンス系と比較して有利である(Mesnil et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1831- 1835)。従って、遺伝子治療、特に抗癌遺伝子治療の状況においてCDアーゼが提供する全ての利点は、容易に理解することができる。
これに関して、本発明の更に好ましい態様によれば、CDアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、FCY1もしくはCodAまたはそれらの類似体である。これらの遺伝子の類似体は、親遺伝子の核酸配列と少なくとも70%を上回り、好都合には80%を上回り、好ましくは90%を上回り、最も好ましくは95%を上回る同一性の程度を有する核酸配列を有する遺伝子を表す。仏国特許出願第2004/001657号には、CDアーゼ活性が向上したタンパク質をコードする遺伝子が開示されている。このポリペプチドは、1個のアミノ酸配列の付加により未変性CDアーゼから誘導される。本発明のもう一つ好ましいの態様によれば、CDアーゼ活性を有するタンパク質は仏国特許出願第2004/001657号に開示されているポリペプチドであり、更に好ましくは仏国特許出願第2004/001657号の配列アイデンティファイアーの配列番号1に表されるポリペプチドである。
原核生物および低級真核生物においては、ウラシルは、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(UPRTアーゼ)の作用によってUMPに形質転換される。この酵素は、5-FUを5-FUMPに転換する。もう一つ好ましいの態様によれば、本発明による自殺遺伝子は、UPRTアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。
本発明における問題のUPRTアーゼは、任意の起源、特に原核生物、真菌、または酵母起源のものでよい。例えば、E. coli(Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem 204, 51-56)、Lactococcus lactis (Martinussen and Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457-6463)、Mycobacterium bovis (Kim et al., 1997, Biochem Mol. Biol, lnt 41, 1117-1124)、およびBacillus subtilis (Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 777, 271-274)由来のUPRTアーゼをコードする核酸配列を、本発明に関して用いることができる。しかしながら、酵母UPRTアーゼ、特に本明細書においては参考のために紹介されているKernら(1990, Gene 88, 149-157)により配列が開示されているS. cerevisiae FUR1遺伝子によってコードされるものを用いるのが極めて好ましい。参考のため、遺伝子の配列および対応するUPRTアーゼの配列は、文献や専門家のデータバンク(SWISSPROT、EMBL、Genbank、Medlineなど)に見出すことができる。
更に、PCT/FR99/00904号には、35個の最初の残基がN末端位置において欠失されて未変性タンパク質の36位のメチオニンから始まるUPRTアーゼを合成することができるコーディング部の5'における105個のヌクレオチドを欠いているFUR1遺伝子が記載されている。FUR1Δ105と呼ばれる突然変異体遺伝子の発現生成物は、S. cerevisiaeのfur1突然変異体を補足することができる。更に、切断型突然変異体(truncated mutant)は、在来酵素よりも高いUPRTアーゼ活性を示す。従って、特に好都合な態様によれば、本発明による自殺遺伝子によってコードされるポリペプチドは、未変性UPRTアーゼの欠失突然変異体である。欠失は、好ましくは元のUPRTアーゼのN末端領域に位置している。それは、完全(前記N末端領域の全ての残基に影響を及ぼす)または部分的(一次構造の1個以上の連続または不連続な残基に影響を及ぼす)なものであることがある。一般に、ポリペプチドは、N末端、中心、およびC末端部分から成り、それぞれは分子の約3分の1である。例えば、S. cerevisiae UPRTアーゼは251個のアミノ酸を有するので、そのN末端部分は、未変性形態の最初の位置にあるいわゆるイニシエーターメチオニン(initiator methionine)から始まる第一の83残基からなっている。E. coli UPRTアーゼについては、そのN末端部分は、1-69位を包含する。
UPRTアーゼ活性を有する好ましいタンパク質は、実質的にPCT/FR99/00904号の配列アイデンティファイアーの配列番号1に示されている1位のMet残基から始まり216位のVal残基で終わるアミノ酸配列を含んでなる。「実質的に」という用語は、PCT/FR99/00904号の前記配列である配列番号1との同一性の程度が70%を上回り、好都合には80%を上回り、好ましくは90%を上回り、最も好ましくは95%を上回ることを表す。更に一層好ましくは、このタンパク質は、PCT/FR99/00904号の配列アイデンティファイアーの配列番号1に表されるアミノ酸配列を含んでなる。前記のように、これは追加の突然変異を含んでなることがある。特に、2位(未変性UPRTアーゼの37位)のセリン残基の、アラニン残基による置換を挙げることができる。
もう一つの好ましい態様によれば、本発明の自殺遺伝子は、少なくとも1個のCdアーゼと1個のUPRTアーゼ活性とを有するタンパク質をコードする。特許出願WO96/16183号およびPCT/FR99/00904号には、CDアーゼとUPRTアーゼ活性とを有する二つのドメインを有する酵素をコードする融合タンパク質の使用が記載されており、発現プラスミドによって行われるハイブリッド遺伝子codA::upp、FCY1::FUR1、またはFCY1::FUR1Δ105の導入により感染B16細胞の5-FCに対する感受性が増加することが示されている。これらの二つの出願明細書に記載されているタンパク質と核酸配列とは、その開示の一部として本明細書に引用される。
融合は第一のポリペプチドの任意の部位において起こることができるが、NまたはC末端、特にN末端が好ましい。好都合には、同調した融合では、シトシンデアミナーゼ(CDアーゼ)活性を有し、かつ未変性シトシンデアミナーゼに由来する第二のポリペプチドが用いられ、本発明による融合ポリペプチドはCDアーゼとUPRTアーゼ活性とを示すようになる。FCY1::FUR1融合が好ましい。このような二官能価ポリペプチドにより、5-FCおよび5-FUに対する標的細胞の感受性を向上させることができる。
原核生物または低級真核生物起源のCDアーゼが用いられる。更に一層好ましくは、これは酵母CDアーゼであり、特にSaccharomyces cerevisiae FCY1遺伝子によってコードされるものである。様々な供給源由来のCDアーゼをコードする遺伝子のクローニングおよびシークエンシングは、文献および専門家のデータバンクにおいて入手可能である。FCY1遺伝子の配列はErbsら(1997, Curr. Genet. 31, 1-6)の文献に開示されていることを述べておかなければならない。当然、未変性酵素に匹敵する、またはより大きな転換能を有するCDアーゼの突然変異体を用いることができる。
当業者であれば、公表データからCDアーゼまたはUPRTアーゼ配列のクローニング、可能な突然変異を行い、従来技術分野の技術によるまたはPCT/FR99/00904号に示されているプロトコールに基づく無細胞または細胞系における突然変異体形態の酵素活性を試験する。そして、CDアーゼおよびUPRTアーゼ活性を有するポリペプチド、結果として対応する遺伝子の全てまたは一部を、特に同調して融合させることができる。
本発明の更に好ましい態様によれば、自殺遺伝子は、実質的にPCT/FR99/00904号の配列アイデンティファイアーの配列番号2に示されている1位のMet残基から始まり373位のVal残基で終わるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする。「実質的に」という用語は、前記の定義を有する。PCT/FR99/00904号の配列アイデンティファイアーの配列番号2に示されているアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドは、本発明を行うのに最適である。
もう一つの好ましいコードされたポリペプチドはWO96/16183号に開示されており、更に好ましくはcoda::uppまたはFCY1::FUR1によってコードされるポリペプチドである。
核酸配列は、クローニング、PCR、または一般に行われている従来技術による化学合成によって容易に得ることができる。それらは、未変性遺伝子であるか、または1個以上のヌクレオチドの突然変異、欠失、置換、および/または付加によって未変性遺伝子から誘導される遺伝子であることができる。更に、それらの配列は、当業者が検索することができる文献に広汎に記載されている。
本発明は、前記要素のキットであって、前記核酸配列をプラスミドまたはウイルス起源の1個以上の組換えベクターに挿入することを特徴とする要素のキット、および宿主細胞での発現に必要な要素の制御下に置かれた前記ヌクレオチド配列を有する組換えベクターに関する。
更に詳細には、本発明の要素のキットは、透過酵素をコードする遺伝子を含んでなる前記核酸配列、および同一の組換えベクターまたはそれぞれ異なった組換えベクターに挿入された自殺遺伝子を含んでなる前記核酸配列を含んでもよい。好ましい態様によれば、核酸配列は、同一の組換えベクターに包含される。
本発明は、宿主細胞において組換えベクターの発現に必要な要素の制御下に置かれている本発明による少なくとも1個のヌクレオチド配列を有する組換えベクターにも関する。更に詳細には、本発明は透過酵素をコードする核酸配列を含んでなる組換えベクターに関する。
組換えベクターはプラスミドまたはウイルス起源のものであることができ、ベクターのトランスフェクション効率および/または安定性を向上させる一種類以上の物質と適宜組み合わせることができる。これらの物質は、当業者に入手可能な文献に広汎に記載されている(例えば、Feigner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121、Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342、Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654を参照されたい)。非限定的な例としては、物質はポリマー、脂質、特にカチオン性脂質、リポソーム、核タンパク質、または中性脂質であることができる。これらの物質は、単独でもまたは組み合わせて用いることもできる。考えられる組合せは、カチオン性脂質(DOGS、DC-CHOL、スペルミン-chol、スペルミジン-cholなど)、リゾリン脂質(例えば、ヘキサデシルホスホコリン)、および中性脂質(DOPE)と結合している組換えプラスミドベクターの組合せである。
好ましい態様によれば、本発明において用いることができるカチオン性脂質は、欧州特許第901463B1号において記載されているカチオン性脂質であり、更に好ましくはpcTG90である。
本発明に関して用いることができるプラスミドの選択は、厖大なものである。それらは、クローニングベクターおよび/または発現ベクターであることができる。一般的には、それらは当業者に知られており、それらの多数のものが販売されているが、遺伝子操作の手法を用いてそれらを構築したり、またはそれらを修正することもできる。言及できる例は、pBR322 (Gibco BRL)、pUC (Gibco BRL)、pBluescript (Stratagene)、pREP4、pCEP4 (Invitrogene)、またはpPoly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201)である。好ましくは、本発明に関して用いられるプラスミドは、複製をプロデューサー細胞および/または宿主細胞において確実に開始させる複製の起源を含んでいる(例えば、CoIE1起源はE. coliにおいて産生させようとするプラスミドに対して選択され、oriP/EBNA1系は、プラスミドが哺乳類宿主細胞において自己複製であることが所望な場合に選択される（Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542、Yates et al., Nature 313, 812-815)）。前記プラスミドは、更にトランスフェクション細胞を選択または同定することができる選択遺伝子を含んでなることもできる(栄養要求性突然変異の相補性、抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子など)。天然においては、プラスミドは、所定の細胞においてのその維持および/またはその安定性を向上させる追加要素を含むことができる(モノマー性形態のプラスミドの維持を促進させるcer配列(Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103)、細胞ゲノムへ組込む配列)。
ウイルスベクターに関しては、ポックスウイルス(ワクシニアウイルス、特にMVA、カナリアポックスウイルスなど)、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、フォーミーウイルス、またはアデノ随伴ウイルスから誘導されるベクターを想定することができる。複製コンピテントまたは複製欠失ウイルスベクターを用いることができる。組込まれないベクターを用いるのが好ましい。これに関して、アデノウイルスベクターおよびMVAが、本発明の実施に極めて適当である。
好ましい態様によれば、本発明によるウイルスベクターは、改質ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)から誘導される。MVAベクターおよびこのようなベクターを産生する方法は、欧州特許第83286号および欧州特許第206920号、並びにMayrら(1975, Infection 3, 6-14)およびSutterとMoss(1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851)に詳細に記載されている。更に好ましい態様によれば、本発明による配列をMVAベクターの欠失I、II、III、IV、V、およびVI、更に一層好ましくは欠失IIIに挿入してもよい(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038、Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040)。
レトロウイルスは細胞に感染し、ほとんどの場合には組込み、分裂する特性を有し、これに関しては、癌に関連して用いるのに特に適している。本発明による組換えレトロウイルスは、一般にLTR配列、キャプシド化領域、および本発明によるヌクレオチド配列であって、レトロウイルスLTRまたは下記のような内部プロモーターの制御下に置かれているものを含む。組換えレトロウイルスは、任意の起源(ネズミ科の動物、霊長類、ネコ科の動物、ヒトなど)のレトロウイルス、特にMOMuLV(モロニーマウス白血病ウイルス)、MVS(マウス肉腫ウイルス)、またはフレンドマウスレトロウイルス(Fb29)から誘導することができる。これは、ウイルス粒子の構築に必要なウイルスポリペプチドgag、pol、および/またはenvをトランスに供給することができるキャプシド化細胞系において増殖する。これらの細胞系は、文献に記載されている(PA317、Psi CRIP GP + Am-12など)。本発明によるレトロウイルスベクターは、修飾、特にLTR(プロモーター領域の真核プロモーターによる置換)またはキャプシド化領域(異種キャプシド化領域、例えば、VL3O型による置換)の修飾を含むことができる(仏国特許出願第94 08300号および第97 05203号参照)。
複製に本質的であり、かつEl、E2、E4、およびL1-L5領域から選択される少なくとも１個の領域の全てまたは一部を欠いているアデノウイルスベクターを用いて、宿主生物または環境中においてベクターが増殖するのを防止するのが好ましい。El領域の欠失が好ましい。しかしながら、これを、特にE2、E4、および/またはL1-L5領域の全部または一部に影響を与える(1個以上の)他の修飾/欠失と組合せ、欠損した本質的機能が相補性細胞系および/またはヘルパーウイルスによってトランスに補足されるようにすることができる。これに関して、当該技術分野の状態の第二世代ベクターを用いることができる(例えば、国際出願WO-A-94/28I52号およびWO-A-97/04119号を参照されたい)。例えば、El領域の主要部分およびE4転写単位の欠失が、極めて好都合である。クローニング能を増加させるため、アデノウイルスベクターは更に非本質的なE3領域の全部または一部を欠くことができる。もう一つの代替態様によれば、キャプシド化に本質的な配列、すなわち5'および3'ITR(逆方向末端反復配列)と、キャプシド化領域を保持する最少アデノウイルスベクターとを用いることができる。様々なアデノウイルスベクターおよびそれらを調製するための手法が知られている(例えば、Graham and Prevect, 1991 ,in Methods in Molecular Biology, Vol 7, p 109-128、E.J. Murey監修, The Human Press mcを参照されたい)。
更に、本発明によるアデノウイルスベクターの起源は、種の観点および血清型の観点からも変更することができる。ベクターは、ヒトまたは動物(イヌ科の動物、鳥類、ウシ亜科の動物、ネズミ科の動物、ヒツジ、ブタ、類人猿など)起源のアデノウイルスのゲノム、または少なくとも二種類の異なる起源のアデノウイルスゲノム断片を含んでなる混合物(hybrid)から誘導することができる。更に具体的には、イヌ科動物起源のCAV-1またはCAV-2アデノウイルス、鳥類起源のDAVアデノウイルス、またはウシ亜科動物起源のBad 3型アデノウイルスを挙げることができる(Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128:171-176、Spibey and Cavanagh, J. Gen. Virol. 1989, 70:165-172、Jouvenne et al., Gene, 1987, 60:21-28、Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76:93-102)。しかしながら、好ましくは血清型Cアデノウイルス、特に2または5型の血清型Cアデノウイルスから誘導されるヒト起源のアデノウイルスベクターが好ましい。
本明細書において用いられる「複製コンピテント」という用語は、任意のトランス-相補性の非存在下において宿主細胞により複製することができるウイルスベクターを表す。本発明に関して、この用語は、癌または過剰増殖性宿主細胞において一層良好にまたは選択的に複製するように遺伝子工学処理されている複製選択的または条件複製アデノウイルスベクターを表す。
本発明の好ましい態様によれば、複製コンピテントベクターは複製コンピテントアデノウイルスベクターである。これらの複製コンピテントアデノウイルスベクターは、当業者には周知である。これらの中において、ONYX-015ウイルスにおけるような55kDのP53阻害をコードするE1b領域に欠失のあるアデノウイルスベクターが、特に好ましい(Bischoff et al, 1996、Heise et al., 2000、WO 94/18992号)。従って、このウイルスを用いて、p53-欠失腫瘍細胞に選択的に感染して、殺すことができる。当該技術分野において通常の技術を有する者であれば、公表された技術に準じてアデノウイルス5または他のウイルスにおけるp53阻害遺伝子を突然変異させ、崩壊させることもできる。E1A Rb結合領域に欠失のあるアデノウイルスベクターを、本発明において用いることもできる。例えば、E1A領域に24塩基対の欠失を有する突然変異体アデノウイルスであるデルタ24ウイルス(Fueyo et al., 2000)。デルタ24はRb結合領域に欠失を有するが、Rbに結合しない。従って、突然変異体ウイルスの複製は、正常細胞におけるRbによって阻害される。しかしながら、Rbが不活性化され、細胞が腫瘍形成性されると、デルタ24はもはや阻害されない。代わりに、突然変異体ウイルスは効率的に複製し、Rb欠損細胞を溶解する。
本発明によるアデノウイルスベクターは、連結反応または相同組換えにより(例えば、国際特許出願WO-A-96/17070号を参照)、または相補性細胞系における組換えによって、Escherichia coli(E. coli)によりイン・ビトロにおいて生成させることができる。
発現に必要な要素は、ヌクレオチド配列をRNAに転写し、mRNAをポリペプチドに翻訳することができる全ての要素からなる。これらの要素は、特に調節可能または構成的であることがあるプロモーターを含んでなる。当然ながら、プロモーターは、選択したベクターおよび宿主細胞に適している。言及できる例は、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、MT(メタロチオネイン、Mclvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848)、α-1アンチトリプシン、CFTR、界面活性剤、免疫グロブリン、β-アクチン(Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 426-436)およびSRa(Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8, 466-472)遺伝子の真核生物プロモーター、SV40ウイルスの初期プロモーター(シミアンウイルス)、RSVのLTR(ラウス肉腫ウイルス)、HSV-I TKプロモーター、CMVウイルスの初期プロモーター(サイトメガロウイルス)、ワクシニアウイルスのp7.5K pH5R、pK1L、p28、およびp11プロモーター、並びにE1AおよびMLPアデノウイルスプロモーターである。前記プロモーターは、腫瘍または癌細胞において発現を刺激するプロモーターであることもできる。特に、乳房および前立腺癌において過剰発現するMUC-I遺伝子(Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782)、結腸癌において過剰発現するCEA(癌胎児性抗原を表す)遺伝子(Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748)、黒色腫において過剰発現するチロシナーゼ遺伝子(Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864)、乳房および膵臓癌において過剰発現するERBB-2遺伝子(Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175)、および肝臓癌において過剰発現するα-フェトプロテイン遺伝子(Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465)のプロモーターが挙げられる。サイトメガロウイルス(CMV)初期プロモーターが、極めて好ましい。
しかしながら、ワクシニアウイルス由来のベクター(例えば、MVAベクター)を用いる場合には、チミジンキナーゼ7.5K遺伝子のプロモーターが特に好ましい。
必要な要素としては、更に宿主細胞においての本発明によるヌクレオチド配列の発現またはその維持を向上させる追加要素が挙げられる。特に、イントロン配列、分泌シグナル配列、核局在化配列、IRES型の翻訳の再開のための内部部位、転写終結ポリA配列、三連リーダー、および複製の起源が挙げられる。これらの要素は当業者には知られている。
本発明による組換えベクターは、1個以上の関係する(interest)追加遺伝子を含んでなることもでき、これらの遺伝子を同じ調節要素(ポリシストン性カセット)または独立要素の制御下に置くことが可能である。特に言及できる遺伝子は、インターロイキンIL-2、IL-4、IL-7、IL-10、およびIL-12、インターフェロン、腫瘍壊死因子(TNF)、コロニー刺激因子(CSF)、特にGM-CSF、および血管新生に作用する因子(例えば、PAI-1、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を表す)をコードする遺伝子である。一つの具体的態様においては、本発明による組換えベクターは、IL-2をコードする、またはインターフェロンγ(INFγ)をコードする関係する遺伝子を含んでなる。本発明によるヌクレオチド配列をHSV-1 TK遺伝子、リシン遺伝子、コレラ毒素遺伝子などの自殺遺伝子と組み合わせることも予想できる。
本発明は、本発明による組換えベクターを含んでなるウイルス粒子にも関する。このようなウイルス粒子は、当該技術分野においては通常の任意の手法を用いてウイルスベクターから生成させることができる。ウイルス粒子は、ベクターの欠損に適している相補性細胞において増殖する。アデノウイルスベクターに関しては、例えば、ヒト胎児腎細胞を用いて確立し、かつE1機能を効率的に補足する293細胞系(Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72)、A549-E1細胞系(Imler et al., 1996, Gene Therapy 3, 75-84)、または二重相補性が可能な細胞系(Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565、Krougliak and Graham, 1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586、Wang et al., 1995, Gene Therapy 2, 775-783、国際特許出願WO 97/04119号)が用いられる。ヘルパーウイルスを用いて、欠陥機能を少なくとも部分的に補足することも可能である。相補性細胞は、ウイルスキャプシドにおけるウイルスゲノムをキャプシド化するのに必要な初期および/または後期因子をトランスに供給して組換えベクターを含むウイルス粒子を生成できる細胞であると理解される。前記細胞は、それ自身においてはベクターの全ての欠陥機能を補足することができないことがあり、この場合には、追加機能を供給するベクター/ヘルパーウイルスにおいてトランスフェクション/形質導入することができる。
本発明は、ウイルス粒子の調製方法であって、
(i) 本発明による組換えベクターを、前記ベクターをトランスに補足することができる相補性細胞に導入して、トランスフェクションした相補性細胞を得て、
(ii) 前記のトランスフェクション相補性細胞を、前記ウイルス粒子を産生することができる適当な条件下において培養し、
(iii) 前記ウイルス粒子を細胞培養物から回収する
ことを含んでなる、方法にも関する。
(i) 本発明による組換えベクターを、前記ベクターをトランスに補足することができる相補性細胞に導入して、トランスフェクションした相補性細胞を得て、
(ii) 前記のトランスフェクション相補性細胞を、前記ウイルス粒子を産生することができる適当な条件下において培養し、
(iii) 前記ウイルス粒子を細胞培養物から回収する
ことを含んでなる、方法にも関する。
当然、ウイルス粒子は培養上清から回収することができるが、これは細胞から回収することもできる。一般に用いられる方法の一つは、連続的凍結/融解サイクルによって細胞を溶解して、溶解上清のビリオンを集めることである。次に、前記ビリオンを、当該技術分野の手法(クロマトグラフィー法、超遠心法、特に塩化セシウムグラディエントを用いる方法など)を用いて増幅し、精製することができる。
本発明は、要素のキット、組換えベクター、または本発明によるウイルス粒子と、薬学上許容可能な賦形剤とを組み合わせて含んでなる組成物にも関する。
本発明による要素のキットは、更に具体的には、遺伝子治療による疾患の予防的または治療的処置を行おうとするものであり、更に具体的には、増殖性疾患(癌、腫瘍、再狭窄など)および感染性起源、特にウイルス起源の疾患(BまたはC型肝炎ウイルス、HIV、ヘルペスレトロウイルスなどによって誘発される)に対するものである。
本発明による要素のキットは、通常は局所、非経口、または消化経路によって投与する目的で作製することができる。特に、治療または予防薬の治療上有効な量を、薬学上許容可能な賦形剤と組み合わせる。多数の投与経路を考えることが可能である。言及できる例は、胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、腹膜内、腫瘍内、鼻内、肺内、および気管内経路である。これらの三つの後者の態様の場合には、エアゾールによりまたは点滴注入により投与を行うのが好都合である。投与は、単回用量として、または特定の時間間隔を置いた後1回以上反復する用量として行うことができる。適当な投与経路および投薬量は、様々なパラメータ、例えば、個人、治療を行う疾患、または導入を行う目的の(1個以上の)遺伝子によって変化する。本発明によるウイルス粒子に基づく製剤は、104-1014pfu(プラーク形成単位)、好都合には105-1013pfu、好ましくは106-1012pfu、更に好ましくは、アデノウイルス粒子を用いる場合には109-1010、およびMVA粒子を用いる場合には106-107の用量の形態により処方することができる。本発明による組換えベクターに関する限り、DNA 0.01-100mg 、好ましくは0.05-10mg、特に好ましくは0.5-5mgを含んでなる用量を考えることが可能である。
処方物は、希釈剤、アジュバント、または賦形剤であって、薬学上の観点から許容可能なもの、並びに可溶化剤、安定剤、および防腐剤を含むこともできる。注射可能な投与の場合には、水性、非水性、または等張溶液の処方物が好ましい。これは、液体、または乾燥(粉末、凍結乾燥生成物など)形態であって使用時に適当な希釈剤を用いて再構成することができる形態により、単回用量としてまたは複数用量として提供することができる。この処方物は、適当量のプロドラッグを含んでなることもできる。
本発明は、本発明による要素のキット、組換えベクターまたはウイルス粒子の治療もしくは予防使用により、遺伝子治療によるヒトまたは動物体の治療を目的とする薬剤を調製することにも関する。第一の可能性によれば、薬剤をイン・ビボにおいて(例えば、静脈内注射により、接近可能な腫瘍に、エアゾールにより肺に、適当なカテーテルを用いて脈管系へなど)直接投与することができる。エクス・ビボ法であって、患者から細胞(骨髄幹細胞、末梢血リンパ球、筋肉細胞など)を取り出し、それらをイン・ビトロにおいて当該技術分野の手法に準じてトランスフェクションまたは感染を行った後、それらを患者に再投与することからなる方法を採用することもできる。好ましい使用は、癌、腫瘍、および望ましくない細胞増殖から生じる疾患の治療または予防にある。考えられる用途としては、乳房癌、子宮癌(特にパピローマウイルスによって誘発されるもの)、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、中枢神経系の癌(例えば、神経膠芽細胞腫)、および血液の癌(リンパ腫、白血病など)が挙げられる。これは循環器疾患に関して用いて、例えば、血管壁の平滑筋細胞の増殖(再狭窄)を阻害または遅延させることもできる。最後に、感染性疾患の場合には、薬剤のAIDSへの応用を考えることが可能である。
本発明は、遺伝子治療による疾患の治療方法であって、要素のキット、本発明による組換えベクター、ウイルス粒子、または宿主細胞をこのような治療を必要とする宿主生物または細胞に投与することを特徴とする、方法にも及ぶ。
1個の核酸塩基部分またはその前駆体を含んでなる薬物は、標準的実施に従って(例えば、経口、全身)投与することができる。例えば、5-FUに関しては、50-500mg/kg/日の用量を用いることが可能であり、200mg/kg/日の用量が好ましい。本発明に関連して、プロドラッグは、標準的実施に従って(例えば、経口、全身)投与され、投与は、本発明による核酸配列の投与の前に、投与と同時に、または投与後に行う。経口経路が好ましい。プロドラッグの単回用量、または宿主生物もしくは細胞中に毒性代謝物を生成させることができる十分に長い時間をかけて反復される用量を投与することが可能である。
更に、本発明による要素のキットまたは方法を、1個の核酸塩基部分を含んでなる薬物の細胞傷害性効果を増強する一種類以上の物質と組み合わせることができる。特に、ピリミジンのデ・ノボ生合成の経路の酵素を阻害する薬物(例えば、下記の薬物)、5-FU(5-FdUMP)の代謝生成物の存在下において、チミジレートシンターゼの阻害を増加し、プールにおける複製に必要なdTMPを減少させるロイコボリンのような薬物(Waxman et al., 1982, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18, 685-692)、および最後にジヒドロホレートレダクターゼを阻害し、かつPRPP(ホスホリボシルピロホスフェート)のプールを増加させることによって、細胞RNAへの5-FUの取り込みを増加させるメトトレキセートのような薬物(Cadman et al., 1979, Science 250, 1135-1137)を挙げることができる。
本発明による要素のキットまたは方法は、抗癌治療に有効な一種類以上の物質と組み合わせることができる。本発明による要素のキットまたは方法は、放射線療法と組み合わせて用いることができる。
E1領域からFCY2を発現するアデノウイルスの構築
完全酵母プリン-シトシン透過酵素遺伝子(FCY2, 1599bp)を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて鋳型としてのプラスミドpAJ14(Bloch et al. 1992)から増幅した。オリゴヌクレオチド配列番号3 :
5'-TAACGATCTCGAGCCATGGTGGAAGAGGGAAATAATGTTTACG-3'
(OTG14626、FCY2コード配列の5'末端に対応するが、2位のLeuをValに置換しているコザックコンセンサス配列を導入し、開始コドンの上流にXhoI制限部位を組込んでいる)、および配列番号4 :
5'-CCCTAATCACGCGTTCCTAACGACCGAAGTATTTTAAT-3'
(OTG14627、3'末端に対応し、停止コドンの下流にMluI制限部位を挿入している)を、プライマーとして用いた。PCR生成物をXhoIおよびMluIによって消化し、プラスミドpTG15829を生成する哺乳類発現ベクターpCIneo(Promega)の対応する部位にサブクローニングした。pTG15829からの配列は、FCY2遺伝子のオープンリーディングフレームでのヌクレオチド+1272(GからAまで)におけるサイレント突然変異を示した。プラスミドpTG15829から、FCY2遺伝子を含むXhoI-MluI断片を、トランスファーベクターpTG15857を生成する同じ酵素によって開裂したトランスファーベクターpTG13387に挿入した。アデノウイルスベクターAd-FCY2(pTG15895)は、pTG15857の断片Pacl-BstEIIと、ClaIによって線形化したベクターpTG6624との間においてBJ5183 E. coli株における相同組換えによって生成した。最終構築物Ad-FCY2(pTG15895)は、E3(ヌクレオチド28592から30470まで)に欠失を含むが、E1領域(ヌクレオチド459から3510まで)は、5'から3'に向かって、CMV前初期エンハンサー/プロモーター、キメラヒトβ-グロビン/IgGイントロン、FCY2遺伝子、およびbGHポリアデニル化シグナルを含む発現カセットによって置換された。FCY2を発現するアデノウイルス粒子(AdTG15895)は、E1機能を補足する細胞系(例えば、系PERC6)においてトランスフェクションによって生成した。
完全酵母プリン-シトシン透過酵素遺伝子(FCY2, 1599bp)を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて鋳型としてのプラスミドpAJ14(Bloch et al. 1992)から増幅した。オリゴヌクレオチド配列番号3 :
5'-TAACGATCTCGAGCCATGGTGGAAGAGGGAAATAATGTTTACG-3'
(OTG14626、FCY2コード配列の5'末端に対応するが、2位のLeuをValに置換しているコザックコンセンサス配列を導入し、開始コドンの上流にXhoI制限部位を組込んでいる)、および配列番号4 :
5'-CCCTAATCACGCGTTCCTAACGACCGAAGTATTTTAAT-3'
(OTG14627、3'末端に対応し、停止コドンの下流にMluI制限部位を挿入している)を、プライマーとして用いた。PCR生成物をXhoIおよびMluIによって消化し、プラスミドpTG15829を生成する哺乳類発現ベクターpCIneo(Promega)の対応する部位にサブクローニングした。pTG15829からの配列は、FCY2遺伝子のオープンリーディングフレームでのヌクレオチド+1272(GからAまで)におけるサイレント突然変異を示した。プラスミドpTG15829から、FCY2遺伝子を含むXhoI-MluI断片を、トランスファーベクターpTG15857を生成する同じ酵素によって開裂したトランスファーベクターpTG13387に挿入した。アデノウイルスベクターAd-FCY2(pTG15895)は、pTG15857の断片Pacl-BstEIIと、ClaIによって線形化したベクターpTG6624との間においてBJ5183 E. coli株における相同組換えによって生成した。最終構築物Ad-FCY2(pTG15895)は、E3(ヌクレオチド28592から30470まで)に欠失を含むが、E1領域(ヌクレオチド459から3510まで)は、5'から3'に向かって、CMV前初期エンハンサー/プロモーター、キメラヒトβ-グロビン/IgGイントロン、FCY2遺伝子、およびbGHポリアデニル化シグナルを含む発現カセットによって置換された。FCY2を発現するアデノウイルス粒子(AdTG15895)は、E1機能を補足する細胞系(例えば、系PERC6)においてトランスフェクションによって生成した。
E1領域から二シトスロン単位FCY2 IRES FCU1を発現するアデノウイルスの構築
FCY2遺伝子を含むプラスミドpTG15829のNheI-NotI断片を単離し、NheI-NotIにおいて線形化したベクターpTG14347(p53FCU1の特許明細書に記載のプラスミドpTG4369p53FCU1)に導入した。このようにして得たプラスミドpTG16055は、5'から3'に向かってFCY2遺伝子、ECMV(脳心筋炎ウイルス)のIRES(インターナル・リボソーム・エントリー・サイト)配列、およびFCU1遺伝子を含む。プラスミドpTG16055から、NheI-BamIrII断片を同じ酵素により開裂したトランスファーベクターpTG14799(FCU1-8の特許明細書に記載のプラスミド)に挿入し、トランスファーベクターpTG16066を生成した。アデノウイルスベクターAd-FCY2FCU1(pTG16079)を、pTG16066の断片PacI-BstEIIと、ClaIによって線形化したベクターpTG6624との間においてBJ5183 E. coli株における相同組換えによって生成した。最終構築物Ad-FCY2FCU1(pTG16079)は、E3(ヌクレオチド28592から30470まで)に欠失を含むが、E1領域(ヌクレオチド459から3510まで)は、5'から3'に向かって、CMV前初期エンハンサー/プロモーター、キメラヒトβ-グロビン/IgGイントロン、FCY2 IRES FCU1二シトスロン単位、およびbGHポリアデニル化シグナルを含む発現カセットによって置換された。FCY2 IRES FCU1を発現するアデノウイルス粒子(AdTG16079)は、E1機能を補足する細胞系(例えば、系PERC6)においてトランスフェクションによって生成した。
FCY2遺伝子を含むプラスミドpTG15829のNheI-NotI断片を単離し、NheI-NotIにおいて線形化したベクターpTG14347(p53FCU1の特許明細書に記載のプラスミドpTG4369p53FCU1)に導入した。このようにして得たプラスミドpTG16055は、5'から3'に向かってFCY2遺伝子、ECMV(脳心筋炎ウイルス)のIRES(インターナル・リボソーム・エントリー・サイト)配列、およびFCU1遺伝子を含む。プラスミドpTG16055から、NheI-BamIrII断片を同じ酵素により開裂したトランスファーベクターpTG14799(FCU1-8の特許明細書に記載のプラスミド)に挿入し、トランスファーベクターpTG16066を生成した。アデノウイルスベクターAd-FCY2FCU1(pTG16079)を、pTG16066の断片PacI-BstEIIと、ClaIによって線形化したベクターpTG6624との間においてBJ5183 E. coli株における相同組換えによって生成した。最終構築物Ad-FCY2FCU1(pTG16079)は、E3(ヌクレオチド28592から30470まで)に欠失を含むが、E1領域(ヌクレオチド459から3510まで)は、5'から3'に向かって、CMV前初期エンハンサー/プロモーター、キメラヒトβ-グロビン/IgGイントロン、FCY2 IRES FCU1二シトスロン単位、およびbGHポリアデニル化シグナルを含む発現カセットによって置換された。FCY2 IRES FCU1を発現するアデノウイルス粒子(AdTG16079)は、E1機能を補足する細胞系(例えば、系PERC6)においてトランスフェクションによって生成した。
5-フルオロシトシン取り込み分析法
ヒト腫瘍細胞系A549 (ATCC CCL-185)を、Mock、エンプティアデノウイルス (AdTG15149)、アデノウイルス（FCU1 (FCU1-8の特許明細書に記載のAdTG14800)、FCY2 (AdTG15895)、またはFCY2およびFCU1 (AdTG16079)を発現している）に感染させた。細胞(5x106)をMOI 20により感染させ、60mmプレートにおいて培養した。24時間後、5-FCのトランスフェクション細胞への取り込みを通常のトレーサー法によって測定した。5-FCの初期速度(10μM、室温)を1分間のインキュベーション期間を用いて測定し、0.15μCi/mlの濃度の[3H]5-FCによりトレースした。
ヒト腫瘍細胞系A549 (ATCC CCL-185)を、Mock、エンプティアデノウイルス (AdTG15149)、アデノウイルス（FCU1 (FCU1-8の特許明細書に記載のAdTG14800)、FCY2 (AdTG15895)、またはFCY2およびFCU1 (AdTG16079)を発現している）に感染させた。細胞(5x106)をMOI 20により感染させ、60mmプレートにおいて培養した。24時間後、5-FCのトランスフェクション細胞への取り込みを通常のトレーサー法によって測定した。5-FCの初期速度(10μM、室温)を1分間のインキュベーション期間を用いて測定し、0.15μCi/mlの濃度の[3H]5-FCによりトレースした。
簡単に説明すれば、感染の24時間後に、細胞を輸送緩衝液(100mM NaCl、2mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、および10mM HEPES、pH7.5)により1回洗浄した。取り込み分析は、10μMの5-FC(0.15μCi/mlの[3H]5-FC)を含む輸送緩衝液2 mlを添加することによって開始した。インキュベーションの終了時に細胞外標識を、氷冷輸送緩衝液により3回素早く洗浄して除いた。細胞を5%SDS 1mlに可溶化して、液体シンチレーション計数法により放射能を定量した。
表1に示した結果は、FCY2 (AdFCY2およびAdFCY2FCU1)を発現するアデノウイルスに感染した細胞における5-FC輸送の増加を示す。このような結果は、ヒト細胞において発現した酵母FCY2は機能的5-FC輸送体をコードすることを示している。
5-FCに対するイン・ビトロにおいての細胞感受性
様々なアデノウイルスに感染した腫瘍細胞を、5-FCに対するそれらの感受性について比較した。ヒト腫瘍細胞系A549 (ATCC CCL-185)を、Mock、エンプティアデノウイルス(AdTG15149)、アデノウイルス（FCU1(FCU1-8の特許明細書に記載のAdTG14800)、FCY2 (AdTG15895)、またはFCY2およびFCU1 (AdTG16079)を発現している）に感染させた。細胞をMOI 1において感染させた後、様々な濃度の5-FCの存在下にて培養した。6日間培養した後、細胞の生育力をトリパンブルーを用いて測定した。表2に示した5-FCについてのLD50値は、4回の測定値の平均である。
様々なアデノウイルスに感染した腫瘍細胞を、5-FCに対するそれらの感受性について比較した。ヒト腫瘍細胞系A549 (ATCC CCL-185)を、Mock、エンプティアデノウイルス(AdTG15149)、アデノウイルス（FCU1(FCU1-8の特許明細書に記載のAdTG14800)、FCY2 (AdTG15895)、またはFCY2およびFCU1 (AdTG16079)を発現している）に感染させた。細胞をMOI 1において感染させた後、様々な濃度の5-FCの存在下にて培養した。6日間培養した後、細胞の生育力をトリパンブルーを用いて測定した。表2に示した5-FCについてのLD50値は、4回の測定値の平均である。
イン・ビボ実験
この研究の目的は、LoVoヒト結腸腫瘍を有するヌードマウスへの125または50mg/kg/日の5-フルオロシトシン(5-FC)の経口投与と組み合わせた、組換えAd-FCU1およびAd-FCY2FCU1の抗腫瘍活性を比較することである。
この研究の目的は、LoVoヒト結腸腫瘍を有するヌードマウスへの125または50mg/kg/日の5-フルオロシトシン(5-FC)の経口投与と組み合わせた、組換えAd-FCU1およびAd-FCY2FCU1の抗腫瘍活性を比較することである。
LoVo細胞を、スイスヌードマウスの側腹部に皮下(s.c.)注射した。それぞれの動物に、PBS 100mlに懸濁した5x106 LoVo細胞を移植した。腫瘍が30-50mm3に達したならば、マウスを盲検的に無作為化し、1.108IUの用量の前記ベクターにより処理した。ベクター(10mM Tris-HCl、pH7.5、1mM MgCl2 100 mlに懸濁した)を、腫瘍の移植後の12、15、および18日目に腫瘍に直接投与した。12日以降、5-FCは62.5mg/kg/日(0.6ml、0.25% 5-FC/水)または25mg/kg/日(0.6ml、0.1% 5-FC/水)により1日2回経口胃管栄養法によって3週間投与した。腫瘍の大きさを、カリパスを用いて二次元において測定した。腫瘍容積は、式(p6)(長さ x 幅2)を用いてmm3により計算した。
統計分析は、ノンパラメトリックMann-Whitney U検定およびStatistica 6.1ソフトウェア(StatSoft, Inc.)を用いて行った。P<0.05は、統計上有意であると考えた。
125mg/kg/日により5-FCを投与した場合には、Ad-FCU1およびAd-FCY2FCU1は腫瘍増殖を統計上有意に抑制した(図1B, C)。この抗腫瘍効果はFCU1/5-FCに特異的であり、FCU1活性を誘発しない感染Ad-エンプティは5-FCの存在下において腫瘍の大きさを有意に減少しなかったためである(図1A)。低用量の5-FCにおいては(50mg/kg/日)、Ad-FCY2FCU1の送達の後には腫瘍増殖の有意な阻害が見られたが(図1C)、Ad-FCU1を用いた場合には腫瘍増殖に変化は見られなかった。この結果は、FCY2とFCU1との組合せが、FCU1単独より有意に有効であることを示しており、FCY2FCU1/5-FC系が癌遺伝子治療法においてFCU1/5-FC系より効率的であることを示唆している。
これらの結果は、アデノウイルスベクター(AdTG16079)からのFCY2およびFCU1遺伝子の同時発現が、FCU1遺伝子(AdTG14800)の発現より強力に細胞を5-FCに対して感受性にすることを示している。この5-FCに対する感受性の増大は、FCY2遺伝子によってコードされた5-FCの取り込みによって生じる。Ad-FCY2(AdTG15895)に感染した細胞を用いた場合には、増殖防止効果は見られず、これはシトシンデアミナーゼ活性の非存在下においてのFCY2の単独投与は効果的な抗腫瘍治療法には不十分であることを示している。
Claims (15)
- 脊椎動物の癌を治療するための要素のキットであって、
５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）、
透過酵素をコードする遺伝子を含んでなる第１の核酸、ここで、該透過酵素は、Saccharomyces cerevisiae由来のＦＣＹ２であり、並びに
自殺遺伝子を含んでなる第２の核酸（ここで、前記自殺遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae由来のＦＣＹ１のＣ末端に、Saccharomyces cerevisiae由来のＦＵＲ１またはＦＵＲ１Δ１０５が融合した融合タンパク質をコードする遺伝子である）
を含んでなる、キット。 - 前記第１および第２の核酸がプラスミドまたはウイルス起源の１個以上の組換えベクターに挿入されてなるものである、請求項１に記載の要素のキット。
- 前記第１および第２の核酸が同一の組換えベクターに挿入されてなるものである、請求項２に記載の要素のキット。
- 前記第１および第２の核酸がそれぞれ異なった組換えベクターに挿入されてなるものである、請求項２に記載の要素のキット。
- ヒトの癌を治療するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の要素のキット。
- 透過酵素をコードする遺伝子と自殺遺伝子とを含んでなり、
ｉ）前記透過酵素をコードする遺伝子がSaccharomyces cerevisiae由来のＦＣＹ２をコードする遺伝子であり、並びに、
ｉｉ）前記自殺遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae由来のＦＣＹ１のＣ末端に、Saccharomyces cerevisiae由来のＦＵＲ１またはＦＵＲ１Δ１０５が融合した融合タンパク質をコードする遺伝子である、動物またはヒトの癌の治療または予防のための組換えベクター。 - 前記ベクターが、プラスミドおよびウイルスベクターであって、ベクターのトランスフェクション効力および/または安定性を向上させる一種類以上の物質と適宜結合しているものからなる群から選択されるものである、請求項６に記載の組換えベクター。
- 前記ベクターのトランスフェクション効力および/または安定性を向上させる前記物質が、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、リゾリン脂質、およびポリペプチドを含んでなる群から選択されるものである、請求項７に記載の組換えベクター。
- 前記ベクターがポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、フォーミーウイルス、またはアデノ随伴ウイルス由来のウイルスベクターである、請求項７に記載の組換えベクター。
- 前記ベクターが改質ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスに由来する、請求項９に記載の組換えベクター。
- 前記透過酵素をコードする遺伝子と前記自殺遺伝子とが、欠失I、II、III、IV、V、およびVIからなる群から選択されるMVAゲノム内の、天然に存在する欠失の部位に挿入されてなるものである、請求項１０に記載の組換えベクター。
- 前記遺伝子が天然に存在する欠失である欠失IIIに挿入されてなるものである、請求項１０に記載の組換えベクター。
- 前記ベクターが更に非必須Ｅ３領域の全てまたは一部を欠いているアデノウイルスベクターである、請求項９に記載の組換えベクター。
- 請求項１〜５のいずれか一項に記載の要素のキットまたは請求項６〜１３のいずれか一項に記載の組換えベクターを含んでなる、医薬組成物。
- 癌の治療用薬剤の調製のための、請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
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