PT1814907E - Estojo de elementos projectado para implementar um tratamento antitumoral ou antiviral num mamífero - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ESTOJO DE ELEMENTOS PROJECTADO PARA IMPLEMENTAR UM TRATAMENTO ANTITUMORAL OU ANTIVIRAL NUM MAMÍFERO 0 presente invento refere-se a um estojo de elementos compreendendo um precursor de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases, uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um gene que codifica uma permease e uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um gene suicida. 0 presente invento refere-se também a um vector compreendendo um gene que codifica uma permease e um gene suicida. 0 presente invento é particularmente útil no contexto de levar a cabo um tratamento de terapia génica de doenças proliferativas ou infecciosas.

Os fármacos compreendendo uma região de nucleobases são os fármacos mais amplamente usados para o tratamento de cancro ou infecção virai. Entre eles os análogos de nucleósidos tais como citarabina, gemcitabina, fludarabina, cladribina, troxacitabina e clofarabina são actualmente usados em quimioterapia do cancro. Os análogos de nucleósidos são antimetabolitos que interferem com a síntese de ácidos nucleicos. Estes agentes são geralmente específicos da fase S, e podem exercer actividade citotóxica ou por serem incorporados e alterando as próprias macromoléculas de ADN e de ARN, e/ou interferindo com várias enzimas envolvidas na síntese de ácidos nucleicos, e/ou modificando o metabolismo de nucleósidos fisiológicos.

Os análogos de nucleósidos encontravam-se também entre os primeiros compostos que se mostrou serem eficazes contra infecções virais. Por exemplo, os quatro primeiros fármacos 1 anti-VIH a serem aprovadas, AZT, ddl, ddC e D4T eram análogos de nucleósidos. Pensa-se que estes fármacos e outros análogos de nucleósidos têm um mecanismo semelhante de inibição do HIV, em que os nucleósidos são progressivamente fosforilados a um 5'-trifosfato, que então actua como um terminador de cadeia numa reacção da transcriptase inversa (RT).

Os análogos de nucleobases são também usados no tratamento do cancro. Por exemplo o fluorouracilo (5-FU) é uma pirimidina fluorada que é metabolizado intracelularmente à sua forma activa, monofosfato de fluorodesoxiuridina (FdUMP). A forma activa inibe a síntese de ADN por inibição da produção normal de timidina. 0 fluorouracilo é administrado intravenosamente para tratar cancros do cólon, recto, mama, estômago, e pâncreas. 0 fluorouracilo encontra-se também disponível em cremes e soluções para tratamento tópico de alguns cancros da pele e verrugas genitais. 0 desenvolvimento da terapia génica abriu novas possibilidades para o uso de fármacos compreendendo uma região de nucleobases. Este domínio particular da terapia génica que é designada por “terapia génica suicida" usa genes cujos produtos de expressão são capazes de transformar uma substância inactiva (um pró-fármaco) numa substância citotóxica, dando assim origem a morte celular. 0 gene que codifica a timidina cinase do vírus Herpes simplex tipo 1 (HSV- 1 TK) constitui o protótipo dos genes suicida (Caruso et al. , 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 , 7024- 7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550 -1552; Ram et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361) . Ao passo que o polipéptido TK nao é tóxico como tal, catalisa a transformação de análogos de nucleósidos tais como aciclovir 2 ou ganciclovir (GCV). Os nucleósidos modificados são incorporados nas cadeias de ADN que se encontram no processo de elongação, inibindo, como consequência, a divisão celular. Encontra-se actualmente disponível um grande número de pares de genes suicida/pró-fármaco. Os que podem ser mais especificamente mencionados são a purina nucleósido fosforilase e a 6-metilpurina desoxiribonucleósido de

Escherichia coli (E. Coli) (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 223-238), guanina fosforibosil transferase e 6- tioxantin de E. coli (Mzoz e Moolten, 1993, Human Gene

Therapy 4, 589-595) e citosina desaminase (CDase) e 5- fluorocitosina (5FC).

Em humanos, o transporte de fármacos compreendendo uma região de nucleobases através da membrana da célula é passivo ou feito por transportador membranar dedicado. Por exemplo, a maioria dos análogos de nucleósidos são moléculas hidrofílicas e o seu transporte pela membrana celular é regulado por transportador membranar. Em células de mamífero, existem duas famílias de genes principais transportadoras de nucleósidos: os transportadores equilibrados de nucleósidos (ENTs) e os transportadores concentrativos de nucleósidos (CNTs) . Os ENTs são proteínas de transporte facilitado e os CNTs são transportadores activos secundários Na(+)-dependentes (Kong et al., 2004, Curr Drug Metab, 5,:63-84).

Os transportadores de nucleósidos estão implicados na resistência a análogos de nucleósidos anti-cancro. Um polimorfismo de nucleótido único (SNPs) em transportadores de fármacos pode contribuir para variação inter-individual em resposta a análogos de nucleósidos (Damaraju et al., Oncogene. 2003, 22: 7524-36). Assim, existe uma necessidade para uma nova estratégia terapêutica que pode evitar uma expressão baixa ou não existente dos transportadores de nucleósidos. Além disso, existe também uma necessidade em 3 aumentar a concentração intracelular de fármacos compreendendo uma região de nucleobases pois a concentração intracelular está correlacionada com a eficiência terapêutica.

Koike et al. (Câncer Res. 1997 Dez 15;57(24):5475-9) divulgam um vector contendo uma sequência de ADNc anti-sentido parcial de cMOAT (um transportador membranar). Tal vector não codifica a proteína cMOAT mas é capaz de inibir a expressão da proteína cMOAT em células transfectadas. Testaram-se células transfectadas com este vector para a sua sensibilidade a vários fármacos, alguns deles compreendendo nucleobases. Dl não descreve a combinação de um precursor de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases e de uma sequência compreendendo um gene que codifica uma permease. Além disso, Dl nunca descreve nem sugere o uso adicional de um gene suicida.

Patel et al (Blood. 2000 Abr 1; 95 ( 7): 2356-63) descrevem um vector retroviral que codifica o transportador de nucleósidos hENT2, e o seu uso para transfectar células. Testaram-se então estas células para a sua sensibilidade a vários fármacos compreendendo nucleobases. D2 nunca descreve ou sugere o uso adicional de um gene suicida.

Anand et al (Expert Opin Biol Ther. 2002 Ago; 2 (6) : 607-20) é um artigo de revisão que focaliza em pró-fármacos orientados para transportadores/receptores da membrana. O parágrafo 3.3 é particularmente relacionado com nucleósidos e sistema de transporte de nucleobases e descreve vários transportadores de nucleósidos membranares, bem como novos compostos orientados para estes transportadores. D3 não descreve nem sugere o uso combinado de um precursor de um fármaco 4 compreendendo uma região de nucleobases e de uma sequência compreendendo um gene que codifica uma permease. Além disso, D3 nunca descreve nem sugere o uso adicional de um gene suicida.

Um dos objectivos do presente invento consiste em melhorar a concentração intracelular de fármacos compreendendo uma região de nucleobases em células (e.g. células tumorais ou células infectadas por vírus). Este objectivo é alcançado por transfecção das células alvo por uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um gene que codifica uma permease. 0 presente invento também tem como objectivo melhorar a eficácia de terapia génica suicida, usando em combinação uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um gene que codifica uma permease e uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um gene suicida. Este uso particular melhora a concentração intracelular do pró-fármaco (i.e. o precursor de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases) que pode ser convertido pela proteína codificada pelo gene suicida. Este uso também pode melhorar o efeito do espectador aumentando a transferência do fármaco das células transfectadas pelo gene suicida para as células que expressam a permease. A este respeito, o presente invento também permite usar menores quantidades de fármacos ou pró-fármacos e reduzir os efeitos colaterais induzidos por tais tratamentos.

Para esta finalidade, o presente invento faculta um estojo de elementos compreendendo: 5 - um precursor de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases, e uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um gene que codifica uma permease, e uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um gene suicida.

Num modo de execução preferido, pretende-se que o estojo de elementos de acordo com o invento seja usado para o tratamento de cancro e/ou de doenças virais em vertebrados e mais particularmente em humanos.

Tal como é aqui usado um fármaco compreendendo uma região de nucleobases é uma molécula que compreende na sua estrutura apenas uma região de nucleobases. De acordo com um modo de execução preferido do invento, o fármaco compreendendo uma região de nucleobases é capaz de matar células e mais preferivelmente de matar células tumorais. De acordo com outro modo de execução preferido, o fármaco compreendendo uma região de nucleobases é capaz de reduzir ou prevenir a replicação de um virus numa célula.

De acordo com o invento uma região de nucleobases é escolhida do grupo que consiste em Adenina, Timina, Guanina, Uracilo, Citosina e seus análogos.

De acordo com um modo de execução preferido do invento, um fármaco compreendendo uma região de nucleobases é escolhido do grupo compreendendo: análogos de gemcitabina, troxacitabina, nucleósidos capecitabina, clofarabina, tais como citarabina, fludarcibina, cladribina, azidotimidine (AZT), 6 didanosina (ddl), zalcitabina (ddC), stavudina (d4T), fluorometileno desoxicitidina (FMdC) e lamivudina, floxuridina (FUdR) e

Análogos de pirimidina tal como 5-fluorouracilo (5-FU), e

Análogos de purina tais como tioguanina, mercaptopurina, aciclovir, valaciclovir, famciclovir, ganciclovir.

Tal como é aqui usado, um precursor de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases refere-se a uma molécula que pode ser convertida por uma ou mais reacções enzimáticas num fármaco compreendendo uma região de nucleobases.

De acordo com um modo de execução preferido do invento, um precursor de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases é escolhido do grupo compreendendo azidotimidina (AZT), Ganciclovir (GCV), 5-Fluorocitosina (5-FC), 5-Fluorouracilo (5-FU), 6-Metilpurina desoxiribonucleósidos, Ganciclovir éster do ácido elaidico, penciclovir, Aciclovir, Valaciclovir, (E)-5-(2-bromovinil)-2'-desoxiuridina, zidovu-dina, 2'-Exo-metanocarbatimidina.

Tal como é aqui usado, permease refere-se a proteínas transmembranares envolvidas na transferência de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases, ou um seu precursor pela membrana celular. A permease de acordo com o invento refere-se notavelmente à purina permease, citosina permease e transportadores de nucleósidos. 7

De acordo com um modo de execução preferido do invento, a permease é uma purina ou citosina permease de S. Cerevisiae. Os transportadores de nucleobases de S. cerevisiae consistem na purina-citosina permease, conhecido como FCY2, e a uracil permease, conhecida como FUR4. De acordo com um modo de execução mais preferido do invento, a permease tem uma sequência de aminoácido escolhida do grupo compreendendo SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2. A purina-citosina permease, FCY2, medeia o simporte de protões e adenina, guanina, hipoxantina e citosina através da membrana plasmática de levedura (Grenson 1969, Jund e Lacroute 1970, Polak e Grenson 1973, Chevallier et al. 1975, Hopkins et al. 1988). A proteína FCY2 também medeia o transporte de 5-fluorocitosina, um análogo de citosina (Grenson 1969, Jund e Lacroute 1970). O gene FCY2 codifica uma proteína de 533 aminoácidos (58 kDa) inicialmente prevista ter 10-12 domínios geradores-transmembranares (Weber et al. 1990), agora com nove agora favorecidos (Ferreira et al. 1999). FCY2 exibe afinidades similares pelas nucleobases de purina e citosina (Brethes et al. 1992). A captação de uracilo em S. cerevisiae é mediada pela uracil permease, FUR4 (Jund e Lacroute 1970, Jund et al. 1977). O FUR4 é um simportador uracilo/protão (Hopkins et al. 1988) previsto ser uma proteína de 633 aminoácidos (71,7 kDa) com 10 domínios transmembranares e caudas N- e C-terminais hidrofílicas citoplasmáticas longas (Jund et al. 1988, Garnier et al. 1996). A proteína FUR4 também pode mediar o transporte de 5-fluorouracilo, um análogo do uracilo (Jund e Lacroute 1970). A este respeito, de acordo com um modo de execução preferido, a permease é escolhida do grupo compreendendo FCY2 e Fur4 e seus análogos. Sequências de aminoácidos de FCY2 e Fur4 encontram-se notavelmente disponíveis na base de dados swissprot (número de acesso P17064 e P05316 respectivamente). Análogos de Fur4 e FCY2 referem-se a polipéptidos tendo uma sequência de aminoácidos que têm pelo menos um grau de identidade superior a 70%, vantajosamente superior a 80%, de preferência superior a 90%, e mais preferencialmente superior a 95% com a sequência de aminoácidos da proteína parental e que retém a capacidade para transportar um fármaco compreendendo uma região de nucleobases pela membrana celular

De acordo com outro modo de execução preferido, a permease é escolhida do grupo compreendendo hENTl, hENT2, hCNTl, hCNT2 e hCNT3 e seus análogos. As sequências de aminoácidos destas permeases encontram-se disponíveis para o perito da técnica, notavelmente na base de dados swissprot. Análogos deste polipéptidos referem-se a um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos um grau de identidade superior a 70%, vantajosamente superior a 80%, de preferência superior a 90%, e mais preferencialmente superior a 95% com a sequência de aminoácidos do polipéptido parental e que retém a capacidade para transportar um fármaco compreendendo uma região de nucleobases pela membrana celular. O perito na técnica é capaz de escolher a permease que se associará com o fármaco ou o precursor do fármaco compreendendo uma região de nucleobases. Por exemplo, FCY2 e Fur 4 associam-se de preferência com 5-FC.

Gene suicida refere-se a um gene que codifica uma proteína capaz de converter um precursor de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases num fármaco compreendendo uma região de nucleobases. 9

Genes suicida compreendem mas não se encontram limitados a genes que codificam proteínas que têm uma actividade citosina desaminase, uma actividade timidina cinase, uma actividade uracil fosforibosil transferase, uma actividade purina nucleósido fosforilase e/ou, uma actividade timidilato cinase.

De preferência, o gene suicida incluído no estojo de elementos de acordo com o invento codifica uma proteína capaz de transformar o precursor do fármaco compreendendo uma região de nucleobases incluído no mesmo estojo de elementos. Exemplos de genes suicida e precursores correspondentes de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases são divulgados na tabela seguinte:

Gene Suicida Precurso de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases Timidina Cinase Ganciclovir; Éster do ácido elaídico do ganciclovir; Penciclovir; Aciclovir; Valaciclovir; (E)-5-(2-bromovinil)-2'-desoxiuridina; azidotimidina; 2'-Exo-metanocarbatimidina Citosina 5-Fluorocitosina desaminase purina 6-Metilpurina desoxirribósido; nucleósido Fludarabina fosforilase uracil 5-Fluorocitosina; fosforibosil 5-Fluorouracilo 10 transferase timidilato cinase Azidotimidina

De acordo com um modo de execução preferido do invento, o gene suicida de acordo com o invento codifica uma proteína tendo pelo menos uma actividade CDase. A CDase está envolvida na via metabólica da pirimidina através da qual citosina exógena é transformada em uracilo por meio de uma desaminação hidrolítica. Ao passo que as actividades em CDase foram demonstradas em procariotas e eucariotas inferiores (Jund e Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102, 607-615; Beck et al., 1972, J. Bacteriol. 110, 219-228; De Haan et al., 1972,

Antonie van Leeuwenhoek 38, 257-263; Hoeprich et al., 1974, J. Inf. Dis. 130, 112-118; Esders e Lynn, 1985, J. Biol.

Chem. 260, 3915-3922), ela não está presente em mamíferos (Koechlin et al., 1966, Biochem Pharmacol. 15, 435-446; Polak et al., 1976, Chemotherapy 22, 137-153). Os genes FCY1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) e codA de E. coli, que codificam respectivamente a CDase destes dois organismos, são conhecidos e as suas sequências foram publicadas (EP 402 108; Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1-6; WO93/01281). A CDase também desamina um análogo da citosina, i.e. 5-fluorocitosina (5-FC), formando assim 5-fluorouracilo (5-FU), que é um composto que é altamente citotóxico quando é convertido em 5-fluoro-UMP (5-FUMP). As células a que falte actividade de CDase, ou devido a uma mutação que inactive o gene que codifica a enzima ou porque são naturalmente deficientes nesta enzima, tal como o são as células de mamífero, são resistente a 5-FC (Jund e Lacroute, 1970, J. Bacteriol, 102, 607-615; Kilstrup et al., 1989, J. Bacteriol. 1989 171, 2124-2127). Em contraste, as células de mamífero 11 para as quais foram transferidas as sequências que codificam actividade em CDase tornam-se sensíveis a 5-FC (Huber et al., 1993, Câncer Res. 53, 4619-4626; Mullen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 33-37; WO 93/01281). Além disso, as células vizinhas não transformadas também ficam sensíveis a 5-FC (Huber et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 8302-8306) . Este fenómeno, que é designado um efeito de espectador, é devido às células que expressam a actividade CDase que segregam 5-FU, que então intoxica as células vizinhas por difusão directa pela membrana plasmática. Esta propriedade de 5-FU em difundir passivamente representa uma vantagem quando comparado ao sistema de referência tk/GCV onde o efeito de espectador exige haver contacto com as células que expressam tk (Mesnil et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 1831-1835). Todas as vantagens que a CDase confere no âmbito da terapia génica, em particular, terapia génica anti-cancro, podem então ser prontamente entendidas. A este respeito, de acordo com um modo de execução mais preferida do invento, o gene que codifica uma proteína tendo uma actividade de CDase é FCY1 ou CodA ou um seu análogo. Análogos destes genes referem-se a um gene tendo uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos um grau de identidade superior a 70%, vantajosamente superior a 80%, de preferência superior a 90%, e mais preferencialmente superior a 95% com a sequência de ácidos nucleicos do gene parental. 0 pedido de Patente FR2004/001657 descreve um gene que codifica uma proteína que tem uma actividade de CDase melhorada. Este polipéptido é derivado de um CDase nativa por adição de uma sequência de aminoácidos. De acordo com outro modo de execução preferido do invento, a proteína que tem uma actividade de CDase é um polipéptido descrito em FR2004/001657 e mais preferencialmente o polipéptido 12 representado no identificador de sequência SEQ ID N0:1 de FR2 004/001657.

Em procariotas e eucariotas inferiores, o uracilo é transformado em UMP pela acção da uracil fosforibosil transferase (UPRTase). Esta enzima converte 5-FU em 5-FUMP. De acordo com outro modo de execução preferido o gene suicida de acordo com o invento codifica uma proteína tendo uma actividade UPRTase. A UPRTase em questão no presente invento pode ser de qualquer origem, em particular de origem procariótica, fúngica ou de levedura. A título de ilustração, as sequências de ácido nucleico que codificam as UPRTases de E. coli (Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem 204, 51-56), de Lactococcus lactis (Martinussen e Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457-6463), de Mycobacterium bovis (Kim et al., 1997, Biochem Mol. Biol. Int 41, 1117-1124) e de Bacillus subtilis (Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 177, 271-274) podem ser usadas no contexto do invento. Contudo, é mais particularmente preferido usar uma UPRTase de levedura e em particular a codificada pelo gene FUR1 de S. cerevisiae cuja sequência divulgada em Kem et al. (1990, Gene 88, 149-157) é aqui introduzida a titulo de referência. Como guia, as sequências dos genes e as das UPRTases correspondentes podem ser encontradas na literatura e em bases de dados da especialidade (SWISSPROT, EMBL, Genbank, Medline e semelhantes).

Além disso, o pedido PCT/FR99/00904 descreve um gene FUR1 a que faltam 105 nucleótidos em 5' da parte de codificação que permite a síntese de uma UPRTase da qual os 35 primeiro resíduos foram eliminados na posição N-terminal e começando 13 com a metionina na posição 36 na proteína nativa. 0 produto de expressão do gene mutante, designado FUR1A105, é capaz de complementar um mutante furl de S. cerevisiae. Além disso, o mutante truncado exibe uma maior actividade de UPRTase do que a da enzima nativa. Assim, de acordo com um modo de execução particularmente vantajoso, o polipéptido codificado pelo gene suicida de acordo com o invento é um mutante de deleção de uma UPRTase nativa. A deleção encontra-se de preferência situada na região N-terminal da UPRTase original. Pode ser completa (afectando todos os resíduos da dita região N-terminal) ou parcial (afectando um ou mais resíduos contínuos ou descontínuos na estrutura primária). Em geral, um polipéptido consiste nas partes N-terminal, central e C-terminal, cada representando cerca de um terço da molécula. Por exemplo, uma vez que a UPRTase de S. cerevisiae tem 251 aminoácidos, a sua parte N-terminal, consiste nos primeiros 83 resíduos a começar com o designado iniciador de metionina situado na primeira posição da forma nativa. Tal como para a UPRTase de E. coli, a sua parte N-terminal cobre as posições 1 a 69.

Uma proteína preferida que tem uma actividade de UPRTase compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente como representado no identificador de sequência SEQ ID NO: 1 de PCT/FR99/00904, começando com o resíduo Met na posição 1 e terminando com o resíduo Vai na posição 216. 0 termo "substancialmente" refere-se a um grau de identidade com a dita sequência SEQ ID NO: 1 de PCT/FR99/00904 superior a 70%, vantajosamente superior a 80%, de preferência superior a 90%, e mais preferencialmente superior a 95%. Ainda mais preferivelmente, compreende a sequência de aminoácidos representada na sequência identificadora SEQ ID NO: 1 de PCT/FR99/00904. Como acima mencionado, pode compreender 14 mutações adicionais. Pode mencionar-se em particular a substituição do resíduo serina na posição 2 (posição 37 na UPRTase nativa) por um resíduo alanina.

De acordo com outro modo de execução preferido, o gene suicida do invento codifica uma proteína que tem pelo menos uma actividade Cdase e uma UPRTase. Os pedidos de patente W096/1618 e PCT/FR99/00904 descrevem o uso de uma proteína de fusão que codifica uma enzima com dois domínios que têm actividades CDase e UPRTase e demonstram que a transferência de um gene híbrido codA::upp ou FCY1::FUR1 ou FCY1::FUR1A105 transportado por um plasmídeo de expressão aumenta a sensibilidade das células B16 transfectadas a 5-FC. A proteína e as sequências nucleicas encontram-se descritas nestes dois pedidos.

Embora a fusão possa ocorrer em qualquer local do primeiro polipéptido, as extremidades N- ou C-terminais são preferidas e em particular a extremidade N-terminal. Vantajosamente, a fusão em fase usa um segundo polipéptido tendo uma actividade de citosina desaminase (CDase) e que é derivada de uma citosina desaminase nativa, de tal modo que o polipéptido de fusão de acordo com o invento exibe as actividades em CDase e UPRTase. É preferida uma fusão FCY1::FUR1. Um tal polipéptido bifuncional torna possível melhorar a sensibilidade das células alvo a 5-FC e a 5-FU. É usada uma CDase de origem procariótica ou eucariótica inferior. Ainda mais preferível é um CDase de levedura, e em particular a codificada pelo gene FCY1 Saccharomyces cerevisiae. A clonagem e a sequenciação dos genes que codificam CDases de várias fontes encontram-se disponíveis na

Deve literatura e bancos de dados da especialidade. 15 mencionar-se que a sequência do gene FCY1 é divulgada em Erbs et al. (1997, Curr. Genet. 31, 1-6). É evidentemente possível usar um mutante de CDase tendo uma capacidade de conversão que é comparável ou superior à da enzima nativa.

Os peritos na técnica são capazes de clonar as sequências de CDase ou UPRTase a partir dos dados publicados e de levar a cabo possíveis mutações, de testar a actividade enzimática das formas mutantes num sistema acelular ou celular de acordo com a tecnologia da arte prévia ou com base no protocolo indicado no pedido PCT/FR99/00904, e de fundir, em particular em fase, os polipéptidos com actividade de CDase e UPRTase, e consequentemente a totalidade ou parte dos genes correspondentes.

De acordo com um modo de execução mais preferido do invento, o gene suicida codifica um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente como representado no identificador de sequência SEQ ID NO: 2 de PCT/FR99/00904, começando com o resíduo Met na posição 1 e terminando com o resíduo Vai na posição 373. 0 termo "substancialmente" tem a definição acima facultada. Um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos como representado no identificador de sequência SEQ ID NO: 2 de PCT/FR99/00904 é mais particularmente adequado para levar a cabo o invento.

Outro polipéptido codificado preferido encontra-se divulgado em W096/16183 e mais preferivelmente o polipéptido codificado por coda::upp ou FCY1::FUR1.

As sequências de ácido nucleicos podem ser facilmente obtidas por clonagem, por PCR ou por síntese química de acordo com as técnicas convencionais em uso. Podem ser genes nativos ou 16 genes derivados destes por mutação, deleção, substituição e/ou adição de um ou mais nucleótidos. Além disso, as suas sequências encontram-se amplamente descritas na literatura que pode ser consultada por peritos na técnica. 0 presente invento refere-se também a um estojo de elementos como acima apresentado, caracterizado por as ditas sequências de ácido nucleico serem inseridas num ou mais vectores recombinantes de plasmídeos ou de origem virai, e por tais vectores recombinantes transportarem tais sequências nucleotidicas colocadas sob controlo dos elementos necessários para a sua expressão numa célula hospedeira.

Mais particularmente, o estojo de elementos do invento pode compreender a dita sequência de ácidos nucleicos compreendendo um gene que codifica uma permease e a dita sequência de ácidos nucleicos compreendendo um gene suicida inserido no mesmo vector recombinante ou em vectores recombinantes distintos. De acordo com um modo de execução preferido, as sequências de ácido nucleico são incluídas no mesmo vector recombinante.

Também é descrito um vector recombinante que transporta pelo menos uma das sequências nucleotidicas de acordo com o invento que é colocada sob controlo dos elementos que são necessários para a expressar numa célula hospedeira. Mais particularmente, é descrito um vector recombinante compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma permease. 0 vector recombinante pode ser de origem plasmídica ou virai e pode, onde apropriado, ser combinado com uma ou mais substâncias que melhoram a eficiência de transfecção e/ou 17 estabilidade do vector. Estas substâncias encontram-se amplamente documentadas na literatura que está disponível para o perito na técnica (ver, por exemplo, Feigner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson e Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 647-654). A titulo de ilustração não limitativo, as substâncias podem ser polímeros, lipidos, em particular lipidos catiónicos, lipossomas, proteínas nucleares ou lipidos neutros. Estas substâncias podem ser usadas sozinhas ou em combinação. Uma combinação que pode ser considerada é a de um vector plasmídico recombinante que é combinado com lipidos catiónicos (DOGS, DC-CHOL, "spermine-chol", "spermidine-chol", etc.), lisofosfolípidos (por exemplo Hexadecilfosfocolina) e lipidos neutros (DOPE).

De acordo com um modo de execução preferido, os lipidos catiónicos que podem ser usados no presente invento são lipidos catiónicos descritos em EP901463B1 e mais preferivelmente pcTG90. A escolha do plasmídeos que podem ser usados no âmbito do presente invento é imensa. Podem ser vectores de clonagem e/ou vectores de expressão. De um modo geral, são conhecidos do perito, e como existem vários comercialmente disponíveis, também é possível construi-los ou modificá-los usando as técnicas de manipulação genética. Exemplos que podem ser mencionados são os plasmídeos derivados de pBR322 (Gibco BRL) , pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) ou p Poli (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201). De preferência, um plasmídeos que é usado no contexto do presente invento contém uma origem de replicação que assegura que a replicação é iniciada numa célula produtora 18 e/ou numa célula hospedeira (por exemplo, a origem de CoIEl será escolhida para um plasmideo pretendido para produzido em E. coli e o sistema oriP/EBNAl será escolhido se desejado que o plasmideo seja auto-replicativo numa célula hospedeira de mamífero, Lupton e Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815). 0 plasmideo pode compreender adicionalmente um gene de selecção que permite que as células transfectadas sejam seleccionadas ou identificadas (complementação de uma mutação auxotrófica, gene que codifica resistência a um antibiótico, etc.). Naturalmente, o plasmideo pode conter elementos adicionais que melhoram a sua manutenção e/ou estabilidade numa determinada célula (sequência cer, que promove a manutenção de um plasmideo em forma monomérica (Summers e Sherrat, 1984, Cell, 36, 1097-1103, sequências para integração no genoma da célula)) .

Relativamente a um vector virai, é possível considerar um vector que é derivado de um poxvírus (vírus vaccinia, em particular MVA, "canarypoxvirus", etc.), de um adenovírus, de um retrovírus, de um herpesvírus, de um alfavírus, de um vírus espumoso ou de um vírus associado ao adenovírus. É possível usar vectores virais de replicação competente ou de replicação deficiente. Será dada preferência ao uso de um vector que não integra. A este respeito, os vectores adenovirais e o MVA são muito particularmente adequados para implementar o presente invento.

De acordo com um modo de execução preferido, o vector virai de acordo com o invento deriva de um Vírus Vaccinia Ancara Modificado (MVA). Os vectores MVA e métodos para produzir tais vectores encontram-se completamente descritos nas patentes Europeias EP83286 e EP206920, bem como em Mayr et 19 al. (1975, Infection 3, 6-14) e Sutter e Moss (1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 10847-10851). De acordo com um modo de execução mais preferida, a sequência de nucleótidos de acordo com o invento pode ser inserida na deleção I, II, III, IV, V e VI do vector MVA e ainda mais preferencialmente na deleção III (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040).

Os retrovírus têm a propriedade de infectar, e na maioria dos casos integrarem-se em células em divisão e a este respeito são particularmente apropriados para uso em relação ao cancro. Um retrovírus recombinante de acordo com o invento contém geralmente as sequências LTR, uma região de encapsidação e a sequência de nucleótidos de acordo com o invento, que é colocada sob controlo do LTR retroviral ou de um promotor interno tais como os abaixo descritos. O retrovírus recombinante pode ser derivado de um retrovírus de qualquer origem (murino, primata, felino, humano, etc.) e em particular do MOMuLV (vírus Moloney da leucemia de murino), MVS (vírus do sarcoma Murino) ou retrovírus Amigo murino (Fb29). É propagado numa linhagem celular de encapsidação que é capaz de facultar em trans os polipéptidos virais gag, pol e/ou env que são necessários para constituir uma partícula virai. Tais linhas celulares encontram-se descritas na literatura (PA317, Psi CRIP GP + Am-12 etc.) . O vector retroviral de acordo com o invento pode conter modificações, em particular nos LTRs (substituição da região do promotor com um promotor de eucariótica) ou a região de encapsidação (substituição com uma região de encapsidação heteróloga, por exemplo o tipo VL30) (ver pedidos Franceses 94 08300 e 97 05203) . 20

Será também dada preferência ao uso de um vector adenoviral a que falta a totalidade ou parte de pelo menos uma região que é essencial para replicação e que é seleccionado das regiões El, E2, E4 e L1-L5 para evitar que o vector seja propagado no organismo hospedeiro ou no ambiente. É preferida uma deleção da região El. Contudo, pode ser combinada com outra (s) modificação(ões)-/deleção(ões) que afectam, em particular, a totalidade ou parte das regiões E2, E4 e/ou L1-L5, ao ponto que as funções essenciais defeituosas são complementadas em trans por meio de uma linha celular complementaar e/ou um vírus auxiliar. A este respeito, é possível usar vectores de segunda geração do estado da arte (ver, por exemplo, pedidos internacionais WO-A-94/28152 e WO-A-97/04119). A título de ilustração, a deleção da parte principal da região El e da unidade de transcrição de E4 é muito particularmente vantajosa. Com a finalidade de aumentar as capacidades de clonagem, o vector adenoviral pode carecer adicionalmente da totalidade ou parte da região E3 não essencial. De acordo com outra alternativa, é possível fazer uso de um vector adenoviral mínimo que retém as sequências que são essenciais para encapsidação, designadamente as ITRs (Repetição Terminal Invertida) 5' e 3', e a região de encapsidação. Os vários vectores adenovirais, e as técnicas para os preparar, sao conhecidos (ver, por exemplo, Graham e Prevect, 1991, em Methods in Molecular Biology, Vol 7, P 109-128; Ed: E.J. Murey, The Human Press mc) .

Além disso, a origem do vector adenoviral de acordo com o invento pode variar tanto do ponto de vista das espécies como do ponto de vista do serótipo. 0 vector pode ser derivado do genoma de um adenovírus de origem humana ou animal (canino, aviário, bovino, murino, ovino, suíno, símio, etc.) ou de um híbrido compreendendo fragmentos de genoma adenoviral de pelo 21 menos duas origens diferentes. Pode ser feita menção mais particular aos adenovirus CAV-1 ou CAV-2 de origem canina, ao adenovirus DAV de origem aviária ou ao adenovirus do tipo 3 Mau de origem bovina (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128: 171-176; Spibey e Cavanagh, J. Gen. Virol. 1989, 70: 165-172; Jouvenne et al., Gene, 1987, 60: 21-28; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76: 93-102). Contudo, será dada preferência a um vector adenoviral de origem humana gue é de preferência derivado de um adenovirus de serótipo C-, em particular um adenovirus de serótipo C do tipo 2 ou 5.

Tal como é aqui utilizado o termo "de replicação competente" refere-se a um vector virai capaz de replicar numa célula hospedeira na ausência de qualquer trans-complementação. No âmbito do presente invento, este termo também abrange vectores adenovirais de replicação selectiva ou de replicação condicional que são projectados para replicar melhor ou selectivamente em células hospedeiras do cancro ou hiperproliferativas.

De acordo com um modo de execução preferido do invento, o vector de replicação competente é um vector adenoviral de replicação competente. Estes vectores adenovirais de replicação competente são bem conhecidos do perito na técnica. Entre estes, os vectores adenovirais deletados na região Elb que codifica o inibidor P53 de 55kD, como no virus ONYX-015 (Bischoff et al, 1996; Heise et al., 2000; WO 94/18992), são particularmente preferidos. Em conformidade, este virus pode ser usado para infectar e matar selectivamente células neoplásicas p53-deficientes. Uma pessoa de perícia ordinária na técnica também pode mutar e romper o gene inibidor de p53 no adenovirus 5 ou outros vírus de acordo com técnicas estabelecidas. Também podem ser usados 22 no presente invento vectores adenovirais deletados na região de ligação EIA Rb. Por exemplo, o virus Delta24 que é um adenovirus mutante que transporta uma deleção de 24 pares de bases na região EIA (Fueyo et al., 2000). O Delta24 tem uma deleção na região de ligação Rb e não se liga a Rb. Assim, a replicação dos vírus mutantes é inibida por Rb numa célula normal. Contudo, se o Rb for inactivado e a célula se tornar neoplásica, o Delta24 já não é inibido. Ao invés, o vírus mutante replica eficazmente e lisa a célula Rb-deficiente.

Um vector adenoviral de acordo com o presente invento pode ser gerado in vitro em Escherichia coli (E. coli) por ligação ou recombinação homóloga (ver, por exemplo, pedido internacional WO-A-96/17070) ou então através de recombinação numa linha celular complementar.

Os elementos necessários para a expressão consistem em todos os elementos que permitem que a sequência de nucleótidos seja transcrita em ARN e que o ARNm seja traduzido em polipéptido. Estes elementos compreendem, em particular, um promotor que pode ser regulável ou constitutivo. Naturalmente, o promotor é adequado ao vector escolhido e à célula hospedeira. Exemplos que podem ser mencionados são os promotores de eucariotas dos genes PGK (fosfoglicerato cinase), MT (metalotioneína; Mclvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), oí-1 antitripsina, CFTR, surfactante, imunoglobulina, β-action (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 426-436) e SRa (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8, 466-472), o promotor precoce do vírus SV40 (vírus de Símio) , o LTR de RSV (vírus do sarcoma de Rous), o promotor TK de HSV-I, o promotor precoce do Vírus CMV (Citomegalovírus). os promotores do vírus vaccinia p7.5K pH5R, pKlL, p28 e pll, e os promotores adenovirais EIA e MLP. O promotor também pode ser um promotor 23 que estimula a expressão num tumor ou célula de cancro. Pode ser feita menção particular aos promotores do gene MUC-I que é sobre-expresso nos cancros da mama e próstata (Chen et al., 1995, J. Clin. Inviest. 96, 2775-2782), do gene CEA (que significa antigeno carcino-embriónico) que é sobre-expresso em cancros do cólon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748) do gene tirosinase, que é sobre-expresso em melanomas (Vile et al., 1993, Câncer Res. 53, 3860-3864), do gene ERBB-2 que é sobre-expresso nos cancros da mama e pancreático (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175) e do gene α-fetoproteína que é sobre-expresso nos cancros do fígado (Kanai et al., 1997, Câncer Res. 57, 461-465). O promotor precoce do citomegalovírus (CMV) é muito particularmente preferido.

Contudo, quando é usado um vector que deriva de um Vírus Vaccinia (como por exemplo um vector MVA), o promotor do gene 7.5K da timidina cinase é particularmente preferido.

Os elementos necessários podem além disso incluir elementos adicionais que melhoram a expressão da sequência de nucleótidos de acordo com o invento ou a sua manutenção na célula hospedeira. Podem ser particularmente mencionadas sequências de intrão, sequências sinal de secreção, sequências de localização nuclear, locais internos para a re-iniciação da tradução do tipo IRES, sequências poliA de terminação da transcrição, líderes tripartidos e origens de replicação. Estes elementos são conhecidos do perito na técnica. O vector recombinante de acordo com o invento também pode compreender um ou mais genes adicionais de interesse, sendo possível que estes genes sejam colocados sob controlo dos mesmos elementos reguladores (cassete policistrónica) ou de elementos independentes. Genes que podem ser mencionados em particular são os genes que codificam interleucinas IL-2, IL-4, IL-7, IL-10 e IL-12, interferões, factor de necrose tumoral (TNF), factores estimulantes de colónia (CSF), em particular GM-CSF, e factores que actuam na angiogénese (por exemplo PAI-1, que significa inibidor do activador do plasminogéneo). Num modo de execução particular, o vector recombinante de acordo com o invento compreende o gene de interesse que codifica IL-2 ou que codifica interferão γ (INFy). Também é possível considerar combinar a sequência de nucleótidos de acordo com o invento com outros genes suicida tais como o gene TK de HSV-1, o gene ricin, o gene toxina da cólera, etc. 0 presente pedido também descreve uma partícula virai que compreende um vector recombinante de acordo com o invento.

Uma tal partícula virai pode ser gerada de um vector virai usando qualquer técnica que seja convencional no âmbito da técnica. A partícula virai é propagada numa célula complementar que é adequada às deficiências do vector. Com respeito a um vector adenoviral, será feito uso, por exemplo, da linha celular 293, que foi estabelecido usando células embrionárias humanas do rim e que complementam eficazmente a função EI (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72), da linha celular A549-E1 (Imler et al., 1996, Gene Therapy 3, 75-84) ou de uma linha celular que permite dupla complementação (Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565;

Krougliak e Graham, 1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586;

Wang et al., 1995 Gene Therapy 2, 775-783; pedido internacional WO 97/04119). Também é possível empregar vírus auxiliares par pelo menos complementar parcialmente as funções defectivas. Entende-se por uma célula complementar 25 como sendo uma célula que é capaz de facultar em trans os factores precoces e/ou tardios que são necessários para encapsidar o genoma virai num capsideo virai para gerar uma partícula virai que contém o vector recombinante. A dita célula pode não ser capaz de complementar todas as funções defectivas do vector só por si e, neste caso, pode ser transfectado/transduzido com um vector/vírus auxiliar que fornece as funções adicionais. 0 pedido também descreve um processo para preparar uma partícula virai, em cujo processo: (i) um vector recombinante de acordo com o invento é introduzido numa célula complementar que é capaz de complementar o dito vector em trans, de modo a obter uma célula complementar transfectada, (ii) a dita célula complementar transfectada é cultivada sob condições que são adequadas para permitir que a dita partícula virai seja produzida, e (iii) a dita partícula virai é recuperada da cultura celular.

Embora a partícula virai possa ser evidentemente recuperada do sobrenadante da cultura, também pode ser recuperada das células. Um dos métodos geralmente empregues consiste em lisar as células por meio de ciclos consecutivos de congelamento/descongelamento para recolher os vírus no sobrenadante da lise. Os vírus podem ser então amplificados e purificados usando as técnicas da arte (método cromatográfico, método de ultra-centrifugação, em particular através de um gradiente cloreto de césio, etc.). 26 0 presente invento refere-se também a uma composição que compreende um estojo de elementos, um vector recombinante ou um partícula virai de acordo com o invento em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável

Um estojo de elementos de acordo com o invento é mais especificamente pretendido para o tratamento preventivo ou curativo de doenças por meio de terapia génica e mais especificamente para doenças proliferativas (cancros, tumores, restenose, etc.) e doenças de origem infecciosa, em particular de origem virai (induziu pelos vírus da hepatite B ou C, HIV, herpes, retrovírus, etc.).

Um estojo de elementos de acordo com o invento pode ser preparado de modo convencional tendo em vista administrá-lo localmente, por via parental ou pela via digestiva. Em particular, uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente terapêutico ou profiláctico é combinada com um excipiente farmaceuticamente aceitável. É possível considerar um grande número de vias de administração. Exemplos que podem ser mencionados são intragástrica, subcutânea, intracardíaca, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumor, intranasal, intrapulmonar e vias intratraqueais. No caso destes três últimos modos de execução, é vantajoso a administração ocorrer por meio de um aerossol ou por meio de instilação. A administração pode ocorrer como uma dose única ou como uma dose que é repetida numa ou mais ocasiões após um intervalo de tempo particular. A via de administração e dosagem apropriadas varia, dependendo de uma variedade de parâmetros, por exemplo o indivíduo, a doença a ser tratada ou o(s) gene(s) de interesse a ser(em) transferido(s). As preparações baseadas em partículas virais de acordo com o invento podem ser formuladas na forma de doses de entre 104 e 27 IO14 pfu (unidades formadoras de placas), vantajosamente 105 e 1013 pfu, de preferência 106 e 1012 pfu, mais preferencialmente 109 e IO10 quando são usadas partículas adenovirais e 106 e 107 quando são usadas partículas de MVA. Relativamente ao vector recombinante de acordo com o invento, é possível considerar doses compreendendo de 0,01 a 100 mg de ADN, de preferência de 0,05 a 10 mg, muito particularmente preferível de 0,5 a 5 mg. A formulação também pode incluir um diluente, um adjuvante ou um excipiente que são aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, bem como agentes solubilizantes, estabilizantes e conservantes. No caso de uma administração injectável, é dada preferência a uma formulação numa solução aquosa, não aquosa ou isotónica. Pode ser apresentada como dose única ou como multidoses, em forma líquida ou seca (pó, liofilizado, etc.) que pode ser reconstituída na altura de uso usando um diluente apropriado. A formulação também pode compreender quantidades apropriadas de pró-fármacos. O presente invento refere-se também ao uso terapêutico ou profiláctico de um estojo de elementos, ou de um vector recombinante de acordo com o invento para preparar um medicamento pretendido para tratar o corpo humano ou animal através de terapia génica. De acordo com uma primeira possibilidade, o medicamento pode ser administrado directamente in vivo (por exemplo por injecção intravenosa, num tumor acessível, nos pulmões por meio de um aerossol, no sistema vascular usando um cateter apropriado, etc.). Também é possível adoptar a vivo abordagem ex vivo, que consiste em remover células do paciente (células estaminais da medula óssea, linfócitos do sangue periférico, células do músculo, etc.), transfectando-as ou infectando-as in vitro em 28 conformidade com as técnicas da arte e então readministrá-las ao paciente. Um uso preferido consiste em tratar ou prevenir cancros, tumores e doenças que resultam de proliferação celular não desejada. Aplicações concebíveis que podem ser mencionadas são cancros da mama, do útero (em particular os induzidos por vírus do papiloma), da próstata, do pulmão, da bexiga, do fígado, do cólon, do pâncreas, do estômago, do esófago, da laringe, do sistema nervoso central (e.g. glioblastoma) e do sangue (linfomas, leucemia, etc.). Também pode ser usado no contexto das doenças cardiovasculares, por exemplo com vista a inibir ou retardar a proliferação das células do músculo liso da parede do vaso sanguíneo (restenose). Finalmente, no caso de doenças infecciosas, é possível conceber que o medicamento seja aplicado a SIDA. 0 pedido também descreve um método para tratar doenças através de terapia génica, caracterizado por um estojo de elementos, um vector recombinante, uma partícula virai ou uma célula hospedeira de acordo com o invento é administrado a um organismo ou célula hospedeiro que necessita de tal tratamento. 0 fármaco compreendendo uma região de nucleobases ou um seu precursor pode ser administrado em conformidade com prática padrão {e.g. oral, via sistémica). A título de ilustração, relativamente ao 5-FU, é possível usar uma dose de 50 a 500 mg/kg/dia, sendo preferida uma dose de 200 mg/kg/dia. No âmbito do presente invento, o pró-fármaco é administrado em conformidade com prática padrão (e.g. pelos, sistematicamente), ocorrendo a administração antes, concomitantemente ou então subsequente à administração de uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com o invento. A via oral é preferida. É possível administrar uma dose única de 29 pró-fármaco ou doses que são repetidos durante um período que é suficientemente lonqo para permitir que o metabolito tóxico seja produzido no organismo ou célula hospedeiro.

Além disso, o estojo de elementos ou método de acordo com o invento pode ser combinado com uma ou mais substâncias que potenciam o efeito citotóxico do fármaco compreendendo uma região de nucleobases. Pode ser feita menção em particular a fármacos que inibem as enzimas da via da biosíntese de novo das pirimidinas (por exemplo os abaixo mencionados), fármacos tais como Leucovorin (Waxman et al., 1982, Eur. J. Câncer Clin. Oncol. 18, 685-692), o qual, na presença do produto do metabolismo de 5-FU (5-FdUMP), aumenta a inibição de timidilato sintetase, resultando numa diminuição no "pool" de dTMP, que é necessário para replicação, e finalmente fármacos tais como metotrexato (Cadman et al., 1979, Science 250, 1135-1137) o qual, ao inibir dihidrofolato reductase e aumentar o pool de PRPP (fosforibosilpirofosfato) , provoca um aumento na incorporação de 5-FU no ARN celular. O estojo de elementos ou método de acordo com o invento pode ser combinado com uma ou mais substâncias eficazes em terapia anti-cancro. O estojo de elementos ou métodos de acordo com o invento também pode ser usado em combinação com radioterapia.

Figura 1 Actividade antitumoral da combinação de adenovírus e 5-FC a 125 e 50 mg/kg/dia no crescimento de xenoenxerto de cancro do cólon LoVo em ratinhos Swiss nude. Os tumores foram estabelecidos por implantação s.c. de 5xl06 células em ratinhos nude. Quando os tumores eram palpáveis, inocularam-se os animais por via intratumoral 3 vezes com Ad-vazio (A) Ad-FCUl (B) e Ad-FCY2FCU1 (C) , e tratados durante 3 semanas administrações orais de 5-FC. Usando Ad-vazio (A), sem 30 diferenças nas curvas de crescimento entre ausência e presença de 5-FC (P>0,05). Usando Ad-FCUl (B) , existe uma diferença significativa nas curvas de crescimento entre presença e ausência de 5-FC apenas a 125 mg/kg/dia (P<0,05). Usando Ad-FCY2FCU1 (C) , existe uma diferença significativa nas curvas de crescimento entre sem 5-FC e 5-FC sistémico a 125 e 50 mg/kg/dia (P<0,05).

Exemplos:

Construção de um adenovírus que expressa FCY2 da região El:

Amplificou-se o gene completo purina-citosina permease de levedura (FCY2, 1599 bp) do plasmídeo pAJ14 (Bloch et al. 1992) como modelo usando reacção de polimerização em cadeia (PCR). Usaram-se como iniciadores os oligonucleótidos SEQ ID N°3 : 5'-TAACGATCTCGAGCCATGGTGGAAGAGGGAAATAATGTTTACG-3 (OTG14626, correspondendo à extremidade 5' da sequência de codificção do FCY2 mas introduzindo uma sequência consenso Kozak substituindo Leu na posição 2 por uma Vai e incorporando um local de restrição Xhol a montante do codão de iniciação) e SEQ ID N° 4: 5'- CCCTAATCACGCGTTCCTAACGACCGAAGTATTTTAAT-3' (OTG14627, correspondendo à extremidade 3' e inserindo um local de restrição Mlul a jusante do codão de terminação). Digeriu-se o produto de PCR com Xhol e Mlul e subclonou-se nos locais correspondentes do vector de expressão de mamífero pCIneo (Promega) gerando o plasmídeo pTG15829. As sequências do pTG15829 revelaram uma mutação silenciosa no nucleótido +1272 (G para A) na grelha de leitura aberta do gene FCY2. Inseriu-se, do plasmídeo pTG15829, o fragmento Xhol-Mlul contendo o gene FCY2 no vector de transferência pTG13387 clivado pelas mesmas enzimas, gerando o vector de transferência pTG15857. 31

Gerou-se o vector adenoviral Ad-FCY2 (pTG15895) por recombinação homóloga na estirpe de E. coli BJ5183 entre o fragmento Pacl-BstEII do pTG15857 e o vector pTG6624 linearizado por Clal. 0 elemento final Ad-FCY2 (pTG15895) contém uma deleção em E3 (nucleótidos 28592 a 30470) , ao passo que a região El (nucleótidos 459 a 3510) foi substituída pela cassete de expressão contendo, de 5' para 3', o aumentador/promotor imediato-precoce do CMV, um intrão β-globina/lgG humano quimérico, o gene FCY2, e o sinal de poliadenilação bGH. Geraram-se as partículas adenovirais que expressam FCY2 (AdTG15895) por transfecção numa linha celular que complementa a função EI (por exemplo linha PERC6).

Construção de vim adenovirus que expressa uma unidade bicistrónica FCY2 IRES FCUl da região El:

Isolou-se o fragmento Nhel-Notl do plasmídeo pTG15829 contendo o gene FCY2 e introduziu-se no vector pTG14347 (plasmídeo pTG4369p53FCUl descrito em patente p53FCUl) linearizado com Nhel-Notl. 0 plasmídeo pTG16055 assim obtido contém, de 5' para 3', o gene FCY2, a sequência IRES (Locais internos de entrada do ribossoma) do ECMV (vírus da encefalomiocardite), e o gene FCUl. Do plasmídeos pTG16055, inseriu-se o fragmento Nhel-BamHI no vector de transferência pTG14799 (plasmídeo descrito em patente FCU1-8) clivado pelas mesmas enzimas, gerando o vector de transferência pTG16066. Gerou-se o vector adenoviral Ad-FCY2FCU1 (pTG16079) por recombinação homóloga na estirpe de E. coli BJ5183 entre o fragmento Pacl-BstEII do pTG 16066 e o vector pTG6624 linearizado por Ciai. O elemento final Ad-FCY2FCU1 (pTG16079) contém uma deleção em E3 (nucleótidos 28592 a 30470) , ao passo que a região El (nucleótidos 459 a 3510) foi substituída pela cassete de expressão < contendo, de 5' para 32 3', o aumentador/promotor imediato-precoce do CMV, um intrão β-globina/IgG humano quimérico, a unidade bicistrónica FCY2 IRES FCU1, e o sinal de poliadenilação bGH. Geraram-se as partículas adenovirais que expressam FCY2 IRES FCU1 (AdTG16079) por transfecção numa linha celular que complementa a função EI (por exemplo linha PERC6).

Ensaios de captação de 5-fluorocitosina:

Infectou-se a linha celular tumoral humana A549 (ATCC CCL-185) com Mock, um adenovírus vazio (AdTG15149), um adenovírus que expressa FCUl (AdTG14800 descrito em patente FCU1-8) ou FCY2 (AdTG15895) ou FCY2 e FCUl (AdTG16079). Infectaram-se as células (5.106) a MOI 20 e plaquearam-se em placas de 60-mm. Após 24 horas, mediu-se a captação de 5-FC em células transfectadas por técnicas traçadoras convencionais. Mediu-se a taxa inicial de 5-FC (10 μΜ, temperatura ambiente) usando um período de incubação de 1 min e traçou-se com [3H] 5-FC a uma concentração de 0,15 yCi/ml.

Resumidamente, 24 horas após a infecção, lavaram-se as células uma vez com o tampão de transporte (NaCl 100 mM, KCI2 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 lmM e HEPES 10 mM, pH 7,5). Iniciaram-se os ensaios de captação por adição de 2 ml de tampão de transporte contendo 5-FC a 10 μΜ ( [3H] 5-FC a 0,15 pCi/ml). No fim da incubação, removeu-se marcação extracelular por três lavagens rápidas com tampão de transporte arrefecido em gelo. Solubilizaram-se as células em 1 ml de SDS a 5% para quantificação de radioactividade por contagem de cintilação em meio líquido. 33

Tabela 1: Captação de 5-FC em células A549 transfectadas A captação de 5-FC foi medida usando tampão de transporte contendo 5-FC 10 μΜ. Cada valor representa a média de três experiências independentes ± SD. Vector Captação de 5-FC (pmol/min/5.106 células) Mock 7,97 ± 3, 76 Ad-vazio (AdTG15149) 9,74 ± 3,31 Ad-FCUl (AdTG14800) 13,28 ± 5,74 Ad-FCY2 (AdTG 15895) 38,94 ± 7, 61 Ad-FCY2FCU1 (AdTG16 0 79) 77 ± 28,7

Os resultados apresentados na Tabela 1 demonstram um aumento no transporte de 5-FC em células infectadas por Adenovírus que expressam FCY2 (AdFCY2 e AdFCY2FCUl). Tais resultados indicam que a levedura FCY2, expressa em células humanas, codifica um transportador 5-FC funcional.

Sensibilidade celular in vitro a 5-FC:

Compararam-se células tumorais infectadas com os diferentes adenovirus para a sua sensibilidade a 5-FC. A linha celular tumoral humana A549 (ATCC CCL-185) foi infectada com Mock, um adenovirus vazio (AdTG15149), um adenovirus expressando FCUl (AdTGl4800 descrito em patente FCU1-8) ou FCY2 (AdTG15895) ou FCY2 e FCUl (AdTG16079). Infectaram-se as células a um MOI de 1 e então cultivaram-se na presença de diferentes concentrações de 5-FC. Após 6 dias de cultura, determinou-se 34 a viabilidade das células usando "trypan blue". Os valores de LD50 para 5-FC listados na Tabela 2 são a média de quatro contagens.

Experiências In vivo: 0 objectivo deste estudo consiste em comparar a actividade antitumoral do Ad-FCUl e Ad-FCY2FCU1 recombinantes em combinação com administração oral de 5-fluorocitosina (5-FC) a 125 ou 50 mg/kg/dia em ratinhos nude que transportam cancro do cólon humano LoVo.

Injectaram-se células LoVo por via subcutânea (s.c.) nos flancos de ratinhos nude Swiss. Inseriu-se em cada animal 5xl06 células LoVo suspensas em 100 ml de PBS. Quando os tumores alcançaram 30-50 mm3, trataram-se os ratinhos com os vectores indicados a uma dose de 1108IU de modo aleatório. Injectaram-se os vectores (suspensos em 100 ml de Tris-HCl lOmM, pH7,5, MgCl2 1 mM) directamente no tumor nos dias 12, 15 e 18 após a implantação do tumor. A partir do dia 12, administrou-se 5-FC por via oral com sonda gástrica a 62,5 mg/kg/dia (0,6 ml 5-FC 0,25% em água) ou a 25 mg/kg/dia (0,6 ml 5-FC 0,1% em água) duas vezes ao dia durante 3 semanas. Mediu-se o tamanho do tumor em duas dimensões usando calibradores. O volume do tumor foi calculado em mm3 usando a fórmula (p 6)(comprimento x largura2).

Levaram-se a cabo análises estatísticas usando o teste não-paramétrico Mann-Whitney U e o software Statistica 6.1 (StatSoft, Inc.,). Um P < 0,05 foi considerado ser estatisticamente significativo. 35

Usando a administração de 5 FC a 125 mg/kg/dia, a injecção de Ad-FCUl e Ad-FCY2FCU1 resultou numa supressão estatisticamente significativa do crescimento do tumor (Fig. 1B,C). Este efeito antitumoral foi especifico de FCU1/5-FC porque a infecção com Ad-vazio, que não induz actividade de FCU1, não reduziu significativamente o tamanho do tumor na presença de 5-FC (Fig. IA) . A uma dose inferior de 5-FC (50 mg/kg/dia), observou-se uma inibição significativa de crescimento do tumor após entrega de Ad-FCY2FCU1 (Fig. 1C) , ao passo que não foi observada modificação no crescimento do tumor usando Ad-FCUl. Este resultado indica que a combinação de FCY2 e FCU1 é significativamente mais eficaz que FCU1 sozinho e sugere que o sistema FCY2FCU1/5-FC é mais eficiente que o sistema FCU1/5-FC numa abordagem de terapia genica no cancro.

Tabela2:Valores LD50 para 5-FC de células adenovirus- transduzidas A549:

Vector LDso (μΜ) Mock > 1000 Ad-vazio > 1000 (AdTG15149) Ad-FCUl 50 (AdTG14800) Ad-FCY2 > 1000 (AdTG15895) Ad-FCY2FCU1 20 (AdTGl6 0 7 9)

Estes resultados mostram que a co-expressão dos genes FCY2 e FCUl do vector adenoviral (AdTG16079) sensibiliza as células a 5-FC mais fortemente que a expressão do gene FCUl (AdTG14800). Esta maior sensibilidade a 5-FC resulta da 36 captação de 5-FC codificado pelo gene FCY2. Usando células infectadas com Ad-FCY2 (AdTG15895), não foi observado efeito antiproliferativo, indicando que a administração exclusiva de FCY2, na ausência de actividade de citosina desaminase, é insuficiente para um protocolo de terapia antitumoral eficaz.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> TRANSGENE S.A. <120> Estojo de elementos projectado para implementar um tratamento antitumoral ou antiviral num mamífero. <13 0> 348 657 / D 22887 <160> 4 <17 0> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 533 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 37

Met Vai Glu Glu Gly Asn Asn Vai 1 5

Arg Ser Pro Vai Ile Gly Ser Ser 20 Ala Ser Glu Thr Phe Thr Ala Thr 35 40 Vai Glu Ser Ser Glu Ala Thr Lys 50 55 Ala Ser Leu Asn Ala Glu Thr Lys 65 70 Glu Lys Thr Asp Asp Ser Ile Leu 85 Ala Asn Met Vai Ile Ala Ser Tyr 100 Vai Phe Gly Leu Asn Phe Gly Gin 115 120 Asn xie Met Gly Leu Ile Phe Vai 130 135 Glu Leu Gly Leu Arg Gin Met Ile 145 150 Vai Thr Ala Arg Ile Phe Ser Leu 165 Trp Gly lie Vai Asn Thr Ser Vai 180 Asn Glu Gly Ser Gly His Vai Cys 195 200

Tyr Glu 10 Ile Gin Asp Leu Glu 15 Lys Leu 25 Glu Asn Glu Lys Lys 30 Vai Ala Ser Glu Asp Asp Gin 45 Gin Tyr Ile Leu Ser Trp Phe 60 His Lys Phe Phe Gly Vai Glu 75 Pro Vai Thr Glu Asp 80 Asn Ala 90 Ala Ser Met Trp Phe 95 Ser Ala 105 Leu Gly Ala Leu Gly 110 Pro Met Ser Vai Leu Vai Ile 125 Ile Phe Phe Ala Phe Phe Ser 140 Vai Phe Gly Ala Leu Ser Arg Tyr 155 Leu Vai Gly Asn 160 Ile Asn 170 Vai Ile Ala Cys Vai 175 Gly Ser 185 Ala Gin Leu Leu Asn 190 Met Met Pro Ile Trp Ala Gly Cys Leu Ile 205 38

Ile Ile Gly Gly Thr Val Leu Val Thr Phe Phe Gly Tyr Ser Val Ile 210 215 220 His Ala Tyr Glu Lys Trp Ser Trp Val Pro Asn Phe Ala Val Phe Leu 225 230 235 240 val Ile Ile Ala Gin Leu Ser Arg Ser Gly Lys Phe Lys Gly Gly Glu 245 250 255 Trp Val Gly Gly Ala Thr Thr Ala Gly Ser Val Leu Ser Phe Gly Ser 260 265 270 Ser Ile Phe Gly Phe Ala Ala Gly Trp Thr Thr Tyr Ala Ala Asp Tyr 275 280 285 Thr Val Tyr Met Pro Lys Ser Thr Asn Lys Tyr Lys Ile Phe Phe Ser 290 295 300 Leu Val Ala Gly Leu Ala Phe Pro Leu Phe Phe Thr Met Ile Leu Gly 305 310 315 320 Ala Ala Ser Ala Met Ala Ala Leu Asn Asp Pro Thr Trp Lys Ala Tyr 325 330 335 Tyr Asp Lys Asn Ala Met Gly Gly Val Ile Tyr Ala Ile Leu Val Pro 340 345 350 Asn Ser Leu Asn Gly Phe Gly Gin Phe Cys Cys Val Leu Leu Ala Leu 355 360 365 Ser Thr Ile Ala Asn Asn Ile Pro Asn Met Tyr Thr Val Ala Leu Ser 370 375 380 39

Ala 385 Gin Ala Leu Trp Ala 390 Pro Leu Ala Lys Ile 395 Pro Arg Vai Vai Trp 400 Thr Met Ala Gly Asn 405 Ala Ala Thr Leu Gly 410 Ile Ser Ile Pro Ala 415 Thr Tyr Tyr Phe Asp Gly 420 Phe Met Glu Asn 425 Phe Met Asp Ser Ile 430 Gly Tyr Tyr Leu Ala 435 Ile Tyr Ile Ala Ile 440 Ser Cys Ser Glu His 445 Phe Phe Tyr Arg Arg 450 Ser Phe Ser Ala Tyr 455 Asn Ile Asp Asp Trp Asp 460 Asn Trp Glu His 465 Leu Pro Ile Gly Ile 470 Ala Gly Thr Ala Ala 475 Leu Ile Vai Gly Ala 480 Phe Gly Vai Ala Leu 485 Gly Met Cys Gin Thr 490 Tyr Trp Vai Gly Glu 4 95 Ile Gly Arg Leu Ile Gly Lys 500 Tyr Gly Gly Asp 505 Ile Gly Phe Glu 510 Leu Gly Ala Ser Trp Ala 515 Phe Ile ile Tyr 520 Asn Ile Leu Arg Pro 525 Leu Glu Leu

Lys Tyr Phe Gly Arg 530

<210> 2 <211> 633 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 40

Met Ala Asp Asn Leu Ser Leu His Leu Ser Gly Ser Ser Lys Arg Leu 1 5 10 15

Asn Ser Arg Gin Leu Met Glu Ser Ser Asn Glu Thr Phe Ala Pro Asn 20 25 30

Asn Vai Asp Leu Glu Lys Glu Tyr Lys Ser Ser Gin Ser Asn Ile Thr 35 40 45

Thr Glu Vai Tyr Glu Ala Ser Ser Phe Glu Glu Lys Vai Ser Ser Glu 50 55 60

Lys Pro Gin Tyr Ser Ser Phe Trp Lys Lys Ile Tyr Tyr Glu Tyr Vai 65 70 75 80

Vai Vai Asp Lys Ser Ile Leu Gly Vai Ser Ile Leu Asp Ser Phe Met 85 90 95

Tyr Asn Gin Asp Leu Lys Pro Vai Glu Lys Glu Arg Arg Vai Trp Ser 100 105 110

Trp Tyr Asn Tyr Cys Tyr Phe Trp Leu Ala Glu Cys Phe Asn Ile Asn 115 120 125

Thr Trp Gin Ile Ala Ala Thr Gly Leu Gin Leu Gly Leu Asn Trp Trp 130 135 140

Gin Cys Trp Ile Thr Ile Trp Ile Gly Tyr Gly Phe Vai Gly Ala Phe 145 150 155 160

Vai Vai Leu Ala Ser Arg Vai Gly Ser Ala Tyr His Leu Ser Phe Pro 165 170 175

Ile Ser Ser Arg Ala Ser Phe Gly Ile Phe Phe Ser Leu Trp Pro Vai 180 185 190

Ile Asn Arg Vai Vai Met Ala Ile Vai Trp Tyr Ser Vai Gin Ala Tyr 195 200 205

Ile Ala Ala Thr Pro Vai Ser Leu Met Leu Lys Ser Ile Phe Gly Lys 210 215 220

Asp Leu Gin Asp Arg Ile Pro Asp His Phe Gly Ser Pro Asn Ala Thr 225 230 235 240

Thr Tyr Glu Phe Met Cys Phe Phe Ile Phe Trp Ala Ala Ser Leu Pro 245 250 255

Phe Leu Leu Vai Pro Pro His Lys Ile Arg His Leu Phe Thr Vai Lys 260 265 270 41

Ala Vai Leu Vai Pro Phe Ala Ser 275 280

Arg Axg Ala His Gly Arg Ile Ala 290 295

Pro His Gly Ser Ala Phe Ser Trp 305 310

Cys Met Ala Asn Phe Ser Thr Met 325

Arg Phe Ser Lys Asn Pro Asn Ser 340

Ile Pro Phe Leu Phe Ser Ile Thr 355 360

Ala Ala Gly Tyr Glu Ile Tyr Gly 370 375

Vai Leu Glu Lys Phe Leu Gin Thr 385 390

Gly Vai Phe Leu Ile Ser Phe Vai 405

Asn Ile Ser Ala Asn Ser Leu Ser 420

Phe Pro Lys Phe Ile Asn Ile Lys 435 440

Met Ala Leu Cys Ile Cys Pro Trp 450 455

Phe Thr Met Ala Leu Ser Ala Tyr 465 470

Gly Vai Vai Cys Ser Asp Tyr Phe 485

Leu Thr His Ile Tyr Ser His Gin 500

Asn Arg Phe Gly Ile Asn Trp Arg 515 520

Vai Ala Pro Cys Leu Pro Gly Phe 530 535

Ile Lys Vai Ser Asp Gly Ala Met 545 550

Vai Gly Tyr Gly Leu Ser Phe Ser 565 .

Phe Pro Vai Pro Gly Çys Pro Vai 580

Phe Gly Phe Leu Ile Trp Ala Ile 285

Leu Gly Ser Leu Thr Asp Vai Gin 300

Ala Phe Leu Arg Ser Leu Met Gly 315 320

Vai Ile Asn Ala Pro Asp Phe Ser 330 335

Ala Leu Trp Ser Gin Leu Vai Cys 345 350

Cys Leu Ile Gly Ile Leu Vai Thr 365

Ile Asn Tyr Trp Ser Pro Leu Asp 380

Thr Tyr Asn Lys Gly Thr Arg Ala 395 400

Phe Ala Vai Ala Gin Leu Gly Thr 410 415

Cys Gly Thr Asp Met Ser Ala I-le 425 430

Arg Gly Ser Leu Phe Cys Ala Ala 445

Asn Leu Met Ala Thr Sei Ser Lys 4 60

Ala Ile Phe Leu Ser Ser Ile Ala 475 480

Vai Vai Arg Arg Gly Tyr Ile Lys 490 495

Lys Gly Ser Phe Tyr Met Tyr Gly 505 510

Ala Leu Ala Ala Tyr Leu Cys Gly 525

Ile Ala Glu Vai Gly Ala Pro Ala 540

Lys Leu Tyr Tyr Leu Ser Tyr Trp 555 560

Ser Tyr Thr Ala Leu Cys Tyr Phe 570 575

Asn Asn Ile Ile Lys Asp Lys Gly 585 590

Glu Glu Trp Lys 605 Ile Ser Vai Tyr

Trp Phe Gin Arg Trp Ala Asn Vai Asp Asp Phe Glu 595 600

Asp Thr Ile Glu Arg Asp Asp Leu Vai Asp Asp Asn 610 615 620

Glu His Glu His Glu Lys Thr Phe Ile 625 630

<210> 3 <211> 42 <212> AND <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 taacgatctc gagccatggt ggaagaggga aataatgttt ac 42 <210> 4 <211> 38

<212> AND <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 ccctaatcac gcgttcctaa cgaccgaagt attttaat 38 19-03-2009 43

Claims (25)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Estojo de elementos para o tratamento de cancro e/ou doenças virais em vertebrados e mais particularmente em humanos compreendendo: - um precursor de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases, e - uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um gene que codifica uma permease envolvida na transferência do seu dito precursor pela membrana celular, e - uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um gene suicida que codifica uma proteína capaz de converter o dito precursor num fármaco compreendendo uma região de nucleobases.
2. 2. Estojo de elementos de acordo com a reivindicação 1, em que o dito fármaco compreendendo uma região de nucleobases é seleccionado do grupo compreendendo citarabina, gemcitabina, capecitabina, fludarcibina, cladribina, troxacitabina, clofarabina, azidotimidina, (AZT), didanosina (ddl), zalcitabina (ddC), stavudina (d4T), fluorometileno desoxicitidina (FMdC) e lamivudina, floxuridina (FUdR), 5-fluorouracilo (5-FU), tioguanina, mercaptopurina, aciclovir, valaciclovir, famciclovir e ganciclovir.
3. 3. Estojo de elementos de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, em que a dita permease é uma purina ou uma citosina permease de S. Cerevisiae.
4. 4. Estojo de elementos de acordo com a reivindicação 3, em que a dita permease é escolhida do grupo compreendendo FCY2 e Fur4 e seus análogos. 1
5. 5. Estojo de elementos de acordo com uma das reivindicações 1 a 4 em que o dito gene suicida é seleccionado do grupo compreendendo genes que codificam proteína que tem uma actividade de citosina desaminase, uma actividade de timidina cinase, uma actividade de uracil fosforibosil transferase, uma actividade purina nucleósidos fosforilase e/ou uma actividade de timidilato cinase.
6. 6. Estojo de elementos de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, em que o dito gene suicida codifica uma proteína tendo uma actividade de citosina desaminase.
7. 7. Estojo de elementos de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, em que o dito gene suicida codifica uma proteína que tem pelo menos uma actividade de citosina desaminase e uma actividade de uracil fosforibosil transferase.
8. 8. Estojo de elementos de acordo com a reivindicação 6, em que o gene suicida é seleccionado do grupo que consiste em CodA, Upp, FUR1, FCY1 e FUR1A105.
9. 9. Estojo de elementos de acordo com a reivindicação 7, em que a dita proteína é uma proteína de fusão na qual um primeiro polipéptido exibindo uma actividade de UPRTase ou CDase é fundido em fase com pelo menos um segundo polipéptido, exibindo o dito segundo polipéptido uma actividade de CDase ou UPRTase, respectivamente.
10. 10. Estojo de elementos de acordo com a reivindicação 7, em que o dito gene suicida incluiu uma primeira sequência de ácidos nucleicos seleccionada do grupo que consiste em upp, FURl e FUR1A105, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos seleccionada do grupo consistindo em CodA e FCY1. 2
11. 11. Estojo de elementos de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, em que o dito precursor de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases é escolhido do grupo compreendendo azidotimidina (AZT), Ganciclovir (GCV), 5-Fluorocitosina (5-FC), 5-Fluorouracilo (5-FU), 6-Metilpurina desoxiribonu-cleósido, Ganciclovir éster do ácido elaidico, penciclovir, Aciclovir, Valaciclovir, (E)-5-(2-bromovinil)-2'-desoxiuri-dina, azidotimidina, 2'-Exo-metanocarbatimidina.
12. 12. Estojo de elementos de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, em que a dita sequência de ácidos nucleicos é inserida num vector recombinante de origem plasmídica ou virai.
13. 13. Estojo de elementos de acordo com a reivindicação 1, em que as ditas sequências de ácido nucleico são inseridas no mesmo vector recombinante.
14. 14. Estojo de elementos de acordo com a reivindicação 1, em que as ditas sequências de ácido nucleico são inseridas em vectores recombinantes distintos.
15. 15. Vector recombinante compreendendo um gene que codifica uma permease envolvida na transferência do dito seu precursor através da membrana celular e um gene suicida que codifica uma proteína capaz de converter um precursor de um fármaco compreendendo uma região de nucleobases num fármaco compreendendo uma região de nucleobases num fármaco compreendendo uma região de nucleobases.
16. 16. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 15, caracterlzado por o dito vector ser seleccionado do grupo que consiste de plasmídeos e vectores virais, onde apropriado 3 combinado com uma ou mais substâncias que melhora(m) a eficácia de transfecção e/ou a estabilidade do vector.
17. 17. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 16, em que a dita substância que melhora a eficácia de transfecção e/ou a estabilidade do vector é seleccionada do grupo compreendendo lípidos catiónicos, polímeros catiónicos, lisofosfolípidos, e polipéptidos.
18. 18. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 16, em que o dito vector é um vector virai que é derivado de um vírus de varíola, de um adenovírus, de um retrovírus, de um vírus herpes, de um alfavírus, de um vírus espumoso ou de um vírus associado ao adenovírus.
19. 19. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 18, em que o dito vector derivado de um Vírus Vaccinia Ancara Modificado (MVA).
20. 20. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 19, em que o dito gene que codifica uma permease e o dito gene suicida são inseridos num local de uma deleção natural no genoma do MVA seleccionado do grupo que consiste em deleção I, II, III, iv, V e VI.
21. 21. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 20 em que os ditos genes são inseridos no local da deleção III natural.
22. 22. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 18, em que o dito vector é um vector adenoviral a que falta adicionalmente a totalidade ou parte da região E3 não essencial. 4
23. 23. Composição farmacêutica compreendendo um estojo de elementos de acordo com uma das reivindicações 1 a 14 ou um vector recombinante de acordo com uma das reivindicações 15 a 22 .
24. 24. Uso de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 23 para a preparação de um medicamento.
25. 25. Uso de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 23 para a preparação de um medicamento para o tratamento de cancro. 19-03-2009 5