JP2021073261A - 組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量ｂ型肝炎ワクチン - Google Patents

Abstract

【課題】組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンを提供する。【解決手段】Ｂ型肝炎ワクチンを生産するための組換えハンセヌラ・ポリモルファ発酵液のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）純品（原液）の収率が３００ｍｇ／Ｌ−４００ｍｇ／Ｌであり、ＨＢｓＡｇの用量の目安が４０μｇ／剤又は２０μｇ／剤であることを特徴とする。【選択図】図４

Description

本発明は、遺伝子工学分野に属し、ハンセヌラ・ポリモルファで組換え発現するＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の成人用量が４０μｇ／１ｍＬ、小児用量が２０μｇ／０．５ｍＬであるＢ型肝炎ワクチン製品に関する。

Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）感染は重大な公衆衛生上の問題である。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、ＷＨＯ）の報道によると、世界６０億人の中、約２０億人がＨＢＶに感染したことがあり、そのうち、３．５億人は慢性ＨＢＶに感染しており、ＨＢＶ感染による肝不全、肝硬変、原発性肝細胞癌（肝癌）から毎年約１００万人が死亡している。全世界の肝臓癌患者の中、７５％以上がＨＢＶにより引き起こされる。中国はＨＢＶ感染症流行地域である。１９９２年に、中国衛生部はＢ型肝炎ワクチンを計画免疫管理に組み入れた。２００１年１２月、国務院は、Ｂ型肝炎ワクチンを子供計画免疫に組み入れることを正式に承認して、各省、市、自治区が、２００２年から、少額の手数料以外、すべての新生児にＢ型肝炎ワクチンを無料で接種することが要求される。２００５年３月に策定された計画免疫条例によれば、２００５年６月１日から、すべての新生児にＢ型肝炎ワクチンによる免疫を無料で行うようになる。約１５年間に亘り努力を重ねた結果、中国の一般人口、特に１５歳以下の児童は、Ｂ型肝炎ウイルス感染率が著しく低下している。２００６年の全国Ｂ型肝炎血清疫学調査から明らかなように、全人口のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）キャリア率が１９９２年の９．７５％から７．１８％に低下し、５歳以下の児童のＢ型肝炎表面抗原キャリア率が従来の９．６７％から０．９６％に低下している。それに基づいて、中国では、現在、慢性ＨＢＶ感染者は約９３００万人であり、そのうち、慢性Ｂ型肝炎患者は約２０００万例であり、毎年、ＨＢＶによる肝硬変や肝癌に起因する死亡例は３０万例以上であり、Ｂ型肝炎の新たな発症例は５０万〜１００万ある。従って、この疾患は、現在、さらに将来の長期間に、中国の人々の健康を損ない、社会の発展を妨げ、社会の安定性に悪影響を与える重要な要因となっているため、重大な公衆衛生上の問題であるとともに、人間本位社会を構築するプロセスにおいて、優先的に解決すべき重大な健康上の課題でもある。中国人口の高ＨＢＶ感染により、国に大きな経済的負担をもたらす。調査によると、中国では、慢性Ｂ型肝炎（肝硬変や肝がんを含む）による直接または間接的な医療費は１年間あたり約６,８００億元と高い。Ｂ型肝炎ワクチンによる免疫予防及び治療は疾患による負担を軽減させるのに最も有効な方法である。

遺伝子組換え技術は、現代のバイオテクノロジーの中核技術であり、Ｂ型肝炎ワクチンの主成分であるウイルス様粒子Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ）を量産するための唯一な技術でもある。１９７０年代に、開発された最初の微生物遺伝子組換え技術は、原核細胞の大腸菌発現系である。真核細胞の翻訳後の処理及び修飾機能がないため、ＨＢｓＡｇ線状抗原のみを発現させ、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原として組み立てることができない。線状抗原の免疫原性が弱いことが原因で、１０年近くの研究を経た後、失敗を宣告した。１９８０年代に、酵母は単細胞の真核微生物として、原核生物のように大規模な発酵生産が実施されやすく、遺伝的操作が簡単であるという特徴を有するとともに、哺乳類細胞の翻訳後の処理及び修飾機能を有し、真核生物の生物学的活性なタンパク質の生産に用いると、多数の利点がある。出芽酵母は外来遺伝子を発現する最初の真核系であり、米国のメルク社は最初にＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原の発現に成功して、最初の遺伝子組換えＢ型肝炎ワクチン及び最初の抗癌ワクチンを開発した。しかしながら、出芽酵母発現系の工業的生産には、たとえば、エンジニアリング菌株の外来遺伝子プラスミドが細胞質に遊離しており、遺伝的安定性が悪いこと、発酵密度が不十分で、生産効率が低いこと、合成したポリペプチド鎖が過度にグリコシル化されるなどの複数の欠点がある。１９８６年にメルク社が開発した出芽酵母組換えＨＢｓＡｇ純品（原液）の収率が１０ｍｇ／リットルであり、当時のＨＢｓＡｇ粒子抗原の産量により制限されるため、該組換えＢ型肝炎ワクチンの用量を５μｇ／剤として決定した。１９９５年に、中国の北京天壇社及び深セン康泰社が米国Ｍｅｒｃｋ社から輸入した出芽酵母組換えＢ型肝炎ワクチンは８００リットルの発酵規模の正式な生産を開始させた。Ｍｅｒｃｋ社の標準によれば、１リットルあたりの発酵液からＨＢｓＡｇウイルス様粒子抗原の純品を３ミリグラム生産し、年間生産量は５μｇ／剤の２０００万剤である。約十年間に亘ってプロセスを改良した結果、１リットルあたりの発酵液で生産できるＨＢｓＡｇウイルス様粒子抗原の純品（原液）が１０ミリグラムまで向上されている。１９８９年にグラクソ・スミスクライン社が開発して生産した出芽酵母組換えＢ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原純品（原液）の収率が２０ｍｇ／リットルにも達し、産量が倍増するため、成人用量が２０μｇ／剤、小児用量が１０μｇ／剤として決定した。中国の科学者は、１９９０年代初めに、組換えＨＢｓＡｇ ＶＬＰ粒子抗原が細胞外に直接分泌できるという利点を有する組換えＣＨＯ細胞型Ｂ型肝炎ワクチンを独自に開発した。しかしながら、動物細胞を振盪フラスコ培養する必要があり、産量が低く、１リットルあたりＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原純品（原液）１ミリグラムしか生産できない。１９９５年にドイツのＲｈｅｉｎｌａｎｄ社が開発したハンセヌラ・ポリモルファ組換えＢ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原純品（原液）の収率が６０ｍｇ／リットルに向上され、産量がさらに数倍に増加し、２００４年に、韓国で別の会社と協力して生産を開始させ、用量は、以上と同じ、成人用量が２０μｇ／剤、小児用量が１０μｇ／剤と決定した。本特許権者が１９９５年からハンセヌラ・ポリモルファ組換えＢ型肝炎ワクチンの研究開発に取り組んでいる。１９９８〜２００２年に大連高新生物製薬有限公司でリーダとして開発したハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇ ａｄｗＢ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原純品（原液）の収率が４０ｍｇ／リットルであり、２００２年に国家の承認を受けて市販されてきた。出願者は２００３−２００６年に北京天壇生物製品株式会社と契約を締結して組換えハンセヌラ・ポリモルファＨＢｓＡｇ−ａｄｒ２Ｂ型肝炎ワクチンを開発した。当該Ｂ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原純品（原液）の収率が８５ｍｇ／リットル以上に達し、２０１５年に国家新薬評価を申告しており、該ワクチンに基づいて出願した中国特許出願の公開番号がＣＮ１０４２３２６６１Ａである。従来のＢ型肝炎ワクチンが従来のエンジニアリング菌株で発現するＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の産量により制限されること及びＢ型肝炎ワクチンを広範に接種するというニーズがあるという現状に鑑み、従来のＢ型肝炎ワクチンは一般的に上記小用量で接種する形態を取る。

現在、中国のＢ型肝炎ワクチンの免疫応答のパイロット状況については、下記２群の臨床研究によれば、サンプル量が大きく、厳格に管理され、ゴールドスタンダードとなる化学発光微粒子免疫アッセイによりＡｎｔｉ−ＨＢｓを検出し、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ免疫応答の新しい標準に基づいて結果を分析した。（１）上海市では、２０１１年に、１５３１名の新生児に０、１、６月に出芽酵母組換えＢ型肝炎ワクチンを５μｇ／剤で接種したところ、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ免疫応答の結果として、低／無応答率は２１．６８％と高い。幾何平均力価ＧＭＴは２８２．３４ｍＩＵ／ｍｌだけである。同時に、５１６名の新生児に０、１、６月にハンセヌラ・ポリモルファ組換えＢ型肝炎ワクチンを１０μｇ／剤で接種した結果、低／無応答率は３．１０％である。ＧＭＴは１４０８．０８ｍＩＵ／ｍｌである。（２）山東省では、２０１３年に、成人易感染集団に対して、０、１、６月に、それぞれ２群の組換えＢ型肝炎ワクチンを接種し、具体的には、２,０１１名に、ＧＳＫ社から輸入した出芽酵母組換えＢ型肝炎ワクチンを２０μｇ／剤で接種し、その結果、Ａｎｔｉ−ＨＢｓの低／無応答率は２９．７９％と高く、Ａｎｔｉ−ＨＢｓの幾何平均力価ＧＭＴは２７０．３９ｍＩＵ／ｍｌだけである。また、２,２９０名に、華北製薬金坦社によるＣＨＯ組換えＢ型肝炎ワクチンを２０μｇ／剤で接種し、その結果、Ａｎｔｉ−ＨＢｓの低／無応答率は２８．４３％と高く、Ａｎｔｉ−ＨＢｓの幾何平均力価ＧＭＴは３１２．６７ｍＩＵ／ｍｌだけである。

上記結果を分析して分かるように、中国では、従来の４種類のＢ型肝炎ワクチンにおいて、新生児向けのハンセヌラ・ポリモルファ組換えＢ型肝炎ワクチンだけが理想的であり、残りの３種類である新生児向けの５μｇ／剤の出芽酵母組換えＢ型肝炎ワクチン、成人向けの出芽酵母組換えＢ型肝炎ワクチン２０μｇ／剤及び成人向けのＣＨＯ組換えＢ型肝炎ワクチン２０μｇ／剤はいずれも、低／無応答率が３０％程度と高く、幾何平均力価ＧＭＴが３００ ｍＩＵ／ｍｌ程度と低い。特に、現在、中国国内では、成人に適用できるＢ型肝炎ワクチンはなかった。復旦大学の董生福博士と山東大学の李平理博士によれば、現在のＢ型肝炎ワクチンには免疫原性の弱いという問題がある。市場の需要が高免疫原性Ｂ型肝炎ワクチンを開発するための原動力となり、下記高用量Ｂ型肝炎ワクチンを開発することが期待される。Ｂ型肝炎ワクチンの小児用量は２０μｇ／剤であり、０、１、６月のプログラムに従い３剤接種すると、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ免疫応答の幾何平均力価ＧＭＴが≧２０００ ｍＩＵ／ｍｌ、低／無応答率（＜１００ ｍＩＵ／ｍｌ）が＜５％、高応答率（≧ １０００ｍＩＵ／ｍｌ）が＞６０％であると予期されている。Ｂ型肝炎ワクチンの成人用量は４０μｇ／剤であり、０、１、６月のプログラムに従い３剤接種すると、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ免疫応答の幾何平均力価ＧＭＣが＞１０００ｍＩＵ／ｍｌ、低／無応答率（＜１００ ｍＩＵ／ｍｌ）が＜５％、高応答率（≧ １０００ｍＩＵ／ｍｌ）が＞５０％であると予期されている。

１９９２年と２００６年に実行した全国人口におけるＢ型肝炎ウイルスの疫学調査報告の結果によれば、５歳おきの集団のＨＢｓＡｇキャリア率の変化の過程全体について詳細に分析し、分析結果に基づいて、中国のＢ型肝炎ワクチンへの総需要量を予測した。それに基づいて、全国人口のＢ型肝炎ワクチンの品種に対する問題を把握して、上記高用量Ｂ型肝炎ワクチンニーズの総産量を決定する。（１）中国ではすべての新生児へＢ型肝炎ワクチンを無料で接種する計画免疫を施したところ、５歳以下の児童のＢ型肝炎表面抗原キャリア率が従来の９．６７％から０．９６％に低下し、中国ではＨＢｓＡｇをキャリアした人数を２２００万減少させることに大きな貢献をした。一方、２００６年からの１５年後、すなわち２０２１年までに、新生児にＢ型肝炎ワクチンを接種する計画免疫を続けても、５歳以下の児童のＢ型肝炎表面抗原のキャリア率が元々低いため、全国人口のＨＢｓＡｇキャリア率を更に低下させることに貢献がなくなる。（２）２００６年に、５歳以下、１０歳以下、及び１５歳以下の児童が一般的にＢ型肝炎ワクチンを接種されている場合、人口のＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のキャリア率が０．９６％からそれぞれ１．９６％と３．３７％に迅速に上昇し、特にＢ型肝炎ウイルスの高流行地域（表面抗原（ＨＢｓＡｇ）キャリア率％＞８．０％）である１２個の省や市（安徽、福建、江西、広東、広西、海南、重慶、チベット、江蘇、浙江、湖北、四川）では、上記年齢の児童の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）キャリア率が大幅に上がっている。それは、児童のＢ型肝炎ワクチンのＡｎｔｉ−ＨＢｓ低／無応答率が高いためであると考えられる。高流行地域では新生児を免疫するときに２０μｇ／剤で３剤接種することが推薦され、それによって、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ保護応答のレベルをより向上させ、低／無応答率を低下させることができる。ワクチンの需要量は年間約６００万人分（３剤）である。（３）全国では、１５歳以下〜２０歳以下の人口のＨＢｓＡｇキャリア率は３．３７％から７．２１％に急速に上昇した。中国国内外の報告によると、児童にＢ型肝炎ワクチンにより一次免疫応答をした後、免疫学的記憶の作用により、有効な保護期間が１０〜１４年持続している。上記免疫学的記憶による保護期間が切れた１０〜１４歳の児童の場合、免疫保護作用を高めるために、通常、０、１、６月のプログラムに従い、３剤のハンセヌラ・ポリモルファ組換えＢ型肝炎ワクチン２０μｇ／剤を用いて二次免疫をした。このように、中国の１０〜２０歳以下の人口のＨＢｓＡｇキャリア率が３．００％以下に制御され、持続的に１５年間実施すると、中国ではＨＢｓＡｇをキャリアした人口数を９００万減少させることができる。ワクチンの需要量は年間約１８００万人分（３剤）である。（４）１５〜５９歳の成人のＨＢｓＡｇキャリア率が８．５７％と高いが、、成人のＢ型肝炎ワクチン接種率が１３．７８％だけである。まず、成人では、高リスク集団と易感染集団についてすべて０、１、６月のプログラムに従いハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇＢ型肝炎ワクチン４０μｇ／剤を３剤接種し、最終的に、すべての成人に該Ｂ型肝炎ワクチンを接種することを実現する。全国では、１５〜５９歳の成人は合計１０億であり、１年間に１．２億−１．５億人分接種するとすれば、すべての人口にＢ型肝炎ワクチンを接種するのに７〜８年間がかかる。次に、免疫学的記憶周期を１０年とすれば、２０、３０、４０及び５０歳に、０、１、６月のプログラムに従い、３剤のハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇＢ型肝炎ワクチン４０μｇ／剤を用いて二次免疫をする。このように、ワクチンの需要量は年間１億人分（３剤）以上である。１０年間持続して実施すると、１５〜５９歳の人口のＨＢｓＡｇキャリア率が６．００％程度に制御でき、このような対策は、中国のＨＢｓＡｇをキャリアした人数を２０００万減少させることに貢献できる。前記のとおり、高免疫原性、高用量の組換えＢ型肝炎ワクチンを提供する問題を解決し、中国のＢ型肝炎の予防効果を向上させ、「肝炎患者が多い国」の難問を解決するために重大な意義がある。

上記技術的問題を解決するために、本発明は、組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンであって、前記Ｂ型肝炎ワクチンを生産する組換えハンセヌラ・ポリモルファ発酵液のＨＢｓＡｇ純品（原液）の収率が３００ｍｇ／Ｌ−４００ｍｇ／Ｌであり、前記Ｂ型肝炎ワクチンにおいて、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の用量の目安が４０μｇ／剤又は２０μｇ／剤であることを特徴とする組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンを提供する。前記４０μｇ／剤の用量の目安が成人向けの用量の目安、前記２０μｇ／剤の用量の目安が児童向けの目安である。
前記組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されることを特徴とする。前記Ｂ型肝炎表面抗原はａｄｗサブタイプである。
前記組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＢ型肝炎表面抗原のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されることを特徴とする。
前記組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＢ型肝炎表面抗原は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）構造であり、ＨＢｓＡｇをハンセヌラ・ポリモルファ脂質に挿入してなり、前記ＨＢｓＡｇの１４個のシステインのうち９〜１２個がジスルフィド結合を形成することを特徴とする。
前記組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファの宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞株は、ＨＵ−１１（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８）であり、前記宿主であるハンセヌラ・ポリモルファのオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＨＵＲＡ３）が破壊されたＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されることを特徴とする。
前記組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンにおいて、インサイチュ共沈殿法又は直接吸着法によって製造されるアルミアジュバント、好ましくはインサイチュ共沈殿法によって製造されるアルミアジュバントをさらに含むことを特徴とする。
前記組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンにおいて、前記Ｂ型肝炎ワクチンの免疫手順は、０、１、２〜１２月にそれぞれ１剤、合計３剤注射し、好ましくは、０、１、６月にそれぞれ１剤、合計３剤注射することを特徴とする。
前記組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンにおいて、剤型が、プレフィルド注射液剤、注射液剤又は凍結乾燥粉末注射剤から選ばれ、好ましくは、プレフィルド注射液剤であることを特徴とする。
本発明は、組換えハンセヌラ・ポリモルファをさらに提供し、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列が含まれ、好ましくは、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファのゲノムにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列が組み込まれていることを特徴おとする。
前記組換えハンセヌラ・ポリモルファにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファの宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞株は、ＨＵ−１１（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８）であり、前記宿主であるハンセヌラ・ポリモルファのオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＨＵＲＡ３）が破壊されたＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されることを特徴とする。

本発明に係る組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンは、高ＶＬＰ抗原・高産量の組換えハンセヌラ・ポリモルファ株をスクリーニングし、それをエンジニアリング菌として、従来技術よりもＢ型肝炎表面抗原の産量及び品質を大幅に向上させ、それによって、本発明は、ハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇの成人用量が４０μｇ／剤、小児用量が２０μｇ／剤である高用量Ｂ型肝炎ワクチンを提供する。同等の生産規模（２台の８００リットル発酵缶）では、ハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇ ＶＬＰ純品（原液）の年間生産量が１９,８００グラムである場合、成人用量が４０μｇ／剤のＢ型肝炎ワクチン３．３億剤（１．１億人分）及びハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇの小児用量が２０μｇ／剤の３．３億剤（１．１億人分）を生産でき、産量は中国のすべての人口を免疫接種するための需要量を満足できる。同時に、本発明では、従来のＢ型肝炎表面抗原のヌクレオチド配列を改良して、新しいヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそれがコードするポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を提供し、従来のＢ型肝炎表面抗原のヌクレオチド配列に比べて、該改良した配列を用いることによって、高産量の組換えハンセヌラ・ポリモルファエンジニアリング菌株をスクリーニングしやすい以外、高純度ＨＢｓＡｇ ＶＬＰを生成することができ、電子顕微鏡（図４参照）の写真から明らかなように、配列を改良した組換えハンセヌラ・ポリモルファエンジニアリング菌株を用いて生産するＢ型肝炎表面抗原は高品質のウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、優れた免疫効果を奏する。且つ、生産するＨＢｓＡｇは純度が高く、パイロット規模の条件では９７．２％に達し、量産の条件では、９９％の純度標準に達する。そして、本発明に係るＢ型肝炎ワクチン製品は、好ましくはプレフィルド注射液剤として製造され、プレフィルドシリンジは、１ケースごとに１剤あり、使用しやすく、使用方法やコツが容易に把握でき、使い捨て型注射器であるため、繰り返し使用が不能である。ワクチンを接種するときに、別途で注射器を準備する必要がないため、ガラス注射器を使用する場合、完全に消毒しないことによる伝染病の感染又は蔓延や不適な針先端部による接種効果への影響を避け、使い捨て型注射器の繰り返し使用のリスクを避ける。実験から分かるように、一般的に分注した組換えＢ型肝炎ワクチンのプレフィルド注射液剤は、３７℃で４５日間放置した後の熱安定性実験から分かるように、ワクチンのインビトロ相対効力（ＲＰ）がいずれも要求を満たし、一般的に分注したＢ型肝炎ワクチンは、同一保存条件では、ＲＰがいずれも要求を満たせない。プレフィルドシリンジに分注した組換えＢ型肝炎ワクチンは、短時間内でコールドチェーン輸送に依存せずに、保存したり使用したりすることが可能であり、高齢者の数が多い区域、人口が少ない区域、国境地帯や貧困地域で毎年生まれた４８０万の新生児に２４ｈ内でＢ型肝炎ワクチンを接種する接種率の実現が期待できる。プレフィルドシリンジに分注したＢ型肝炎ワクチンの完全な接種は良好な総合的費用便益比を有する。

プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２の構築過程の模式図である。 ｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２プラスミドの物理マップである。 スクリーニングして得られたエンジニアリング菌株ＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。 組換えハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇの純品（原液）の電子顕微鏡写真である。 実施例２における組換えハンセヌラ・ポリモルファの形質転換とスクリーニング工程のフローチャートである。

ハンセヌラ・ポリモルファ細胞内プラスミドｐＭＰＴ−０２の構築は、出願者の非独占的な独自技術である。
遺伝子合成技術を用いて、ハンセヌラ・ポリモルファＭＯＸ（メタノールオキシダーゼ）プロモーター１．５ｋｂ、ハンセヌラ・ポリモルファＭＯＸ（メタノールオキシダーゼ）ターミネーター３５０ｂｐ、ハンセヌラ・ポリモルファの自律複製配列ＨＡＲＳ １．０ｋｂ、及び出芽酵母のウラシル遺伝子ＳｃＵＲＡ３ １．１ｋｂの５つの遺伝子素子を緊密に連結した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐIIプラスミドに挿入して、シャトルプラスミドｐＭＰＴ−０２を構築する。

ウラシル栄養要求性ＵＲＡ３−宿主細胞株ＨＵ−１１を用いた宿主細胞の開発
相同配列によって媒介される相同組み込みによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＨＵＲＡ３）が破壊された組換えハンセヌラ・ポリモルファ株ＨＵ−１１（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８）を構築する。該菌株は、中国国内及び国外で使用されて突然変異誘発により生じた従来の栄養要求性宿主菌株に比べて、遺伝的安定性が高く、復帰突然変異率が低いという特徴を有し、遺伝的形質転換及び組換え菌株のスクリーニングを容易に実施できるとともに、野生型菌株の生理学的および生化学的特徴を保持し、組換え菌株の培養や外因性タンパク質の効率的な発現に寄与し、高い工業応用価値がある。ハンセヌラ・ポリモルファ遺伝子が破壊された宿主菌ＨＵ１１株のＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡシーケンシング結果から明らかなように、遺伝子が破壊された結果、３１位の塩基後に、ＧＡＡＧＴの５個の塩基が挿入されている。ＧＡＡＧＴの５個の塩基の挿入によりフレームシフト突然変異が発生する。フレームシフト突然変異により１１位後の２５４個のアミノ酸コードはすべて突然変異し、突然変異により合計１５個の終了コードが発生し、このことから、ＵＲＡ３構造遺伝子がさらに発現できないことを示している。ＧＡＡＧＴの５個の塩基は同時に復帰突然変異を発生する確率が極めて小さく、実験によっても宿主菌ＨＵ１１株の復帰突然変異率がゼロであることを確認した。このような「０」復帰突然変異率を有する宿主菌は、形質転換やスクリーニングに特に有利である。上記遺伝子ノックアウト技術によって構築されたＵＲＡ３⁻栄養要求性宿主細胞株ＨＵ−１１（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８）については出願者が出願した発明特許ＣＮ１６５１５７０Ａに開示された。宿主ハンセヌラ・ポリモルファ菌ＨＵ−１１のオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＨＵＲＡ３）が破壊されたＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：３に示される。

本発明に係る組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のＤＮＡ配列はＨＢｓＡｇ ａｄｗ２サブタイプに基づいて設計されるものであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。前記ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：２である。

ハンセヌラ・ポリモルファ細胞内プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２（図１参照）の構築
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列に基づいてヌクレオチド配列（以下、ＨＢｓＡｇ ａｄｗ２遺伝子と略称）を合成し、ＨＢｓＡｇ ａｄｗ２遺伝子プラスミドを含むグリセロール菌として構築し、シーケンシングして正確なプラスミドをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、酵素消化産物からゲル抽出して、７０１ｂｐの目的断片ＤＮＡを回収する。

酵素消化して同定して正確なプラスミドｐＭＰＴ−０２をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、ゲル抽出して回収したベクターＤＮＡを連結して、ハンセヌラ・ポリモルファの細胞内プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ−ａｄｗ２を得て、プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ−ａｄｗ２をＥ．ｃｏｌｉ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＪＭ１０９（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ｄ９０５２）に熱形質転換して、平板にコーティングして菌体を一晩培養する。形質転換平板から単一コロニーを選択して、プラスミドＤＮＡを抽出した後、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、酵素消化結果から、すべて陽性クローンであることが分かる。シーケンシングした結果、プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ−ａｄｗ２の結果は正確である。

ＨＢｓＡｇ ａｄｗ２遺伝子をハンセヌラ・ポリモルファ発現系の細胞内プラスミドｐＭＰＴ−０２のポリクローナル部位であるＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの間に挿入する。プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２は全長７６６５ｂｐである。プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ−ａｄｗ２の構築過程の模式図は図１に示される。ｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２プラスミドの物理マップは図２に示される。

組換えハンセヌラ・ポリモルファＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）ａｄｗ２サブタイプエンジニアリング菌株の構築
組換えハンセヌラ・ポリモルファＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）ａｄｗ２サブタイプエンジニアリング菌株を構築するには、出願者が開発した細胞エレクトロポレーション技術を用いて、振幅１５００Ｖ、容量２２００Ｖ、時間定数３〜５ｍｓのＲＣパルスで１回電気穿孔し、ｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２プラスミドを用いて、ＵＲＡ３−遺伝子をノックアウトしたＨＵ−１１株（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８）のハンセヌラ・ポリモルファ細胞を形質転換する。ＭＤ選択培養用平皿から成長した単一コロニー形質転換体を選択して、ＭＤ液体培地に移した後、連続継代培養し、ａｄｗ２サブタイプＨＢｓＡｇ遺伝子及び対応する調節要素をマルチコピーにして、宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞染色体に異種組み込む。千株余りの形質転換体の単一コロニーについて下記３つのステップのスクリーニングを行う。
（１）形質転換体の単一コロニーが大きく、細胞の成長速度が高いクローン株はマルチコピーである確率が高い。
（２）ＰＣＲ技術によってＨＢｓＡｇ遺伝子と単一コピー数ＭＯＸ（メタノールオキシダーゼ）遺伝子の電気泳動バンドの明るさを比較することによって、ＨＢｓＡｇ遺伝子のコピー数を半定量的に決定する。
（３）メタノールで誘導して振盪フラスコ培養を７２時間行った形質転換体の細胞が破砕した後に放出したＨＢｓＡｇの発現レベルを検出する。

ＰＣＲ技術を形質転換体スクリーニングに適用することは本願の新たな創造である。外来遺伝子ＨＢｓＡｇのマルチコピーの決定、ハンセヌラ・ポリモルファ染色体に対して異種組み込みを行っても、ハンセヌラ・ポリモルファ染色体におけるＭＯＸ遺伝子が破壊せずに完全に存在することに対して、重要な役割を果たし、ハンセヌラ・ポリモルファ発現系の特有の長所を示している。このために、ハンセヌラ・ポリモルファ染色体におけるＭＯＸ遺伝子（単一コピー）の増幅とＨＢｓＡｇ外来遺伝子（マルチコピー）の異種組み込みを同時に実施できる一対のプライマーを設計する。増幅産物のアガロースゲル電気泳動でのバンドの明るさを比較することによって、ＨＢｓＡｇ遺伝子がマルチコピーであるか否かを大体判断できる。この方法は、エンジニアリング菌のＨＢｓＡｇ遺伝子のマルチコピー菌株の予備スクリーニングに用いられる。増幅したＨＢｓＡｇ断片の長さは８００ｂｐ、増幅したＭＯＸ断片の長さは２０００ｂｐである。

プライマー配列：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒｗａｒｄ：５ ｉｍｅｒ ｆｏｒｗａｒｄを設計使用して増幅した産物のアガロースゲル電気泳動でのバンドの明るさ。
ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒｗａｒｄ：５ ‘−ＴＣＡＡＡＡＧＣＧＧＴＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣＧＴ−’３
ｐｒｉｍｅｒ ｒｅｖｅｒｓｅ：５ ‘−ＴＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＧＴＧ−’３

ＰＣＲ産物についてのアガロースゲル電気泳動
エンジニアリング菌のＨＢｓＡｇ遺伝子の増幅産物の大きさは約８００ｂｐ、ハンセヌラ・ポリモルファの単一コピー遺伝子のＭＯＸ遺伝子の増幅産物の大きさは約２０００ｂｐである。スクリーニングして得られたエンジニアリング菌株のＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真は図３に示され、図３中、１はＭａｒｋｅｒである。

得られたエンジニアリング菌株について３０リットルのパイロット規模発酵を行い、３ロットの発酵原液における組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＨＢｓＡｇ含有量を検出する。
国家標準に準じて、Ｌｏｗｒｙ法タンパク質定量キットを用いて、タンパク質の濃度を測定し、標準品はキットの提供したウシ血清アルブミン、回帰曲線はｙ＝１．０３６８ｘ−０．０１０９、Ｒ^２＝０．９９９である。発酵原液を生理食塩水で５倍希釈した後、吸光度検出を、ロットごとに２回検出して、それぞれ対応する純品原液におけるＨＢｓＡｇの濃度を計算し、さらにＨＢｓＡｇ収率を計算し、下表に示す。

本組換えハンセヌラ・ポリモルファＨＢｓＡｇの純度を高圧液体クロマトグラフィーで分析したところ、組換えＨＢｓＡｇ純品（原液）の純度は９７％以上であった。組換えハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇの純品（原液）の電子顕微鏡写真は図４に示される。結果から示されるように、組換えＨＢｓＡｇは、高純度、高濃度で、且つウイルス様粒子（ＶＬＰ）構造が安定的である。

組換えハンセヌラ・ポリモルファＨＢｓＡｇの成人用量が４０μｇ／剤、小児用量が２０μｇ／剤のＢ型肝炎ワクチンの新製品
２０１０年の欧州Ｂ型肝炎免疫学コンセンサスグループの報道によれば、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の免疫接種がＢ型肝炎を予防・治療するための免疫基礎であり、従来、接種後に抗−ＨＢｓを検出することにより免疫反応の強さを評価した。通常、１０ｍＩＵ／ｍｌを保護応答とするが、低レベルの抗−ＨＢｓは顕著なＨＢｓＡｇ感染をカバーしてしまう。その結果、一部の国家（たとえばイギリス、１９９６年）では、より高い保護応答である１００ ｍＩＵ／ｍｌを採用し、すなわち、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ＜１００ｍＩＵ／ｍｌを低／無応答として判断する。このため、近年開発されている予防性Ｂ型肝炎ワクチンで免疫した後、血清学的に検出した保護性Ａｎｔｉ−ＨＢｓ応答レベルの国際格付基準は以下のとおりである。Ａｎｔｉ−ＨＢｓ＜１０ｍＩＵ／ｍｌを無応答、１０ｍＩＵ／ｍｌ≦Ａｎｔｉ−ＨＢｓ＜１００ ｍＩＵ／ｍｌを低応答、１００ｍＩＵ／ｍｌ≦Ａｎｔｉ−ＨＢｓ＜１０００ ｍＩＵ／ｍｌを正常応答、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ≧１０００ｍＩＵ／ｍｌを高応答として判定する。上記報道のとおり、上記標準によれば、中国では、既存の４種類のＢ型肝炎ワクチンのうち、新生児向けのハンセヌラ・ポリモルファ組換えＢ型肝炎ワクチン１０μｇ／剤のＡｎｔｉ−ＨＢｓ応答レベルは上記格付標準に合致し、残りの３種類、すなわち、新生児向けの５μｇ／剤出芽酵母組換えＢ型肝炎ワクチン、成人向けの出芽酵母組換えＢ型肝炎ワクチン２０μｇ／剤及び成人向けのＣＨＯ組換えＢ型肝炎ワクチン２０μｇ／剤はいずれも、低／無応答率が３０％程度と高く、幾何平均力価ＧＭＴが３００ｍＩＵ／ｍｌ程度と低い。特に、中国では、現在、成人に適用できるＢ型肝炎ワクチンはなかった。このため、市場では、高Ａｎｔｉ−ＨＢｓ免疫応答を有する組換えＢ型肝炎ワクチンの開発が期待され、ハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇの成人用量が４０μｇ／剤、小児用量が２０μｇ／剤のＢ型肝炎ワクチンの新製品の発展の原動力となっている。

実践したところ、Ｂ型肝炎ワクチンのＡｎｔｉ−ＨＢｓ応答レベルはＨＢｓＡｇ抗原用量に依存的であり、一般的に、「曲線関係」を有する。すなわち、ワクチンＨＢｓＡｇ抗原用量の増加に伴い、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ応答レベルがまずゆっくりと増大する。ＨＢｓＡｇ抗原用量が所定量まで増大した後、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ応答レベルが急速に増加する線形区間に入り、線形区間では、抗原が倍増して、誘導可能なＡｎｔｉ−ＨＢｓ応答が倍増し、線形区間では、ＨＢｓＡｇ抗原用量が少なくとも４個の倍増点を有する。ＨＢｓＡｇ抗原用量が再び増加すると、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ応答レベルがゆっくりと増大するようになる。従って、児童と成人用のワクチンのＨＢｓＡｇ抗原用量を対応する「曲線の急速な増加線形区間」にすべきである。児童ＨＢｓＡｇ抗原用量５μｇ／剤が線形区間の二番目の倍増点にある場合、ＨＢｓＡｇ抗原用量１０μｇ／剤は三番目の倍増点にあり、児童ＨＢｓＡｇ抗原用量がさらに２０μｇ／剤になるまで倍増すると、四番目の倍増点にあり、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ応答レベルはまだ数倍向上する潜在力がある。また、成人ＨＢｓＡｇ抗原用量２０μｇ／剤が線形区間における三番目の倍増点にあると、ＨＢｓＡｇ抗原用量４０μｇ／剤は四番目の倍増点にあり、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ応答レベルはまた数倍向上する潜在力がある。上記Ｂ型肝炎ワクチンのＡｎｔｉ−ＨＢｓ応答レベルはＨＢｓＡｇ抗原用量依存的関係を有し、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ応答レベルを向上させるようにハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇの成人用量が４０μｇ／剤、小児用量が２０μｇ／剤のＢ型肝炎ワクチンの新製品を決定するための重要な理論的根拠となる。上記ハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇＢ型肝炎ワクチンの新製品のＡｎｔｉ−ＨＢｓ応答の予期目標については、１５−５９歳のすべての成人に適用する幾何平均力価はＧＭＣ＞Ａｎｔｉ−ＨＢｓ１０００ｍＩＵ／ｍｌで、低／無応答率（＜Ａｎｔｉ−ＨＢｓ１００ ｍＩＵ／ｍｌ）＜５％で、高応答率（≧Ａｎｔｉ−ＨＢｓ１０００ｍＩＵ／ｍｌ）＞５０％で、ＨＢｓＡｇ高流行地域の新生児と１０−１３歳の児童に適用する幾何平均力価はＧＭＣ＞Ａｎｔｉ−ＨＢｓ２０００ｍＩＵ／ｍｌで、低／無応答率＜５％で、高応答率＞６０％である。

本発明に係る組換えハンセヌラ・ポリモルファのＨＢｓＡｇ純品（原液）の収率が３００ｍｇ／リットル以上に達し、従来のハンセヌラ・ポリモルファ又は出芽酵母組換えのＨＢｓＡｇ純品（原液）の収率よりも５倍余り〜３０倍と高く、現在の世界最高水準であり、遺伝子組換え技術の革新である。２台の８００リットル酵缶の規模で換算すると、組換えＨＢｓＡｇ純品（原液）の年間産量は以下のとおりである。
２台（原液リットル（作動体積）×（作動体積）リットル×（作動タンク／年＝１９,８００グラム／年

ハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇの成人用量が４０μｇ／剤、小児用量が２０μｇ／剤のＢ型肝炎ワクチンの新製品を量産するための前提条件となる。ハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇ ＶＬＰ純品（原液）の年間産量が１９,８００グラムになったとき、ハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇの成人用量が４０μｇ／剤のＢ型肝炎ワクチンの年間産量は３．３億剤（１．１億人分）及びハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇの小児用量が２０μｇ／剤のＢ型肝炎ワクチンの新製品の年間産量は３．３億剤（１．１億人分）であり、世界最大の組換え型Ｂ型肝炎ワクチンメーカーになり、産量が全国のすべての人口の免疫接種に必要な量を満足できる。
以下、実施例にて本発明についてさらに説明するが、下記実施例は説明するためのものであり、限定するものではなく、本発明の保護範囲は下記実施例により制限されない

実施例１
前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列に基づいて、ｐＭＰＴ−ＨＢｓＡｇ ａｄｗ２プラスミドを構築した。プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２の構築プロセスは以下の工程を含む。
設計したハンセヌラ・ポリモルファの好ましいコードＨＢｓＡｇ ａｄｗ２のＤＮＡ配列に基づいてＨＢｓＡｇ ａｄｗ２遺伝子を合成し、ＨＢｓＡｇ ａｄｗ２遺伝子プラスミドを含むグリセロール菌を構築し、ＭＣ４０７Ｂ−１６と命名した。
シーケンシングして正確なＭＣ４０７Ｂ−１６プラスミドをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、酵素消化産物についてＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ｄ３０１）でゲル抽出して、７０１ｂｐの目的断片ＤＮＡを回収して、Ｉｎｓｅｔ ＤＮＡ６とした。
酵素消化し、同定して正確なプラスミドｐＨＭＰＴ−０２をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、ゲル抽出して回収して、ベクターＤＮＡを得て、Ｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡ６とした。

ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ． Ｄ６０２２）におけるＳｏｌｕｔｉｏｎを用いて、Ｉｎｓｅｔ ＤＮＡ６とＶｅｃｔｏｒ ＤＮＡ６を連結した後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＪＭ１０９（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ｄ９０５２）に熱形質転換し、平板にコーティングして菌体を一晩培養した。形質転換平板から単一コロニーを選択して、プラスミドＤＮＡを抽出した後、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、酵素消化結果から、ＭＣ４０７Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ−７７〜８０はすべて陽性クローンであることが分かった。
ＭＣ４０７Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ−７７プラスミドをそれぞれプライマーＲＶ−Ｍ、Ｍ１３−４７、ＭＣ４０７Ｐ１、ＭＣ４０７Ｐ２、ＭＣ４０７Ｐ３、ＭＣ４０７Ｐ４、ＭＣ４０７Ｐ５、ＭＣ４０７Ｐ６、ＭＣ４０７Ｐ７、ＭＣ４０７Ｐ８、ＭＣ４０７Ｐ９、ＭＣ４０７ＢＦ１１、ＭＣ４０７ＢＲ１１でシーケンシングした結果、プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２の結果は正確であることが分かった。

実施例２
ハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇエンジニアリング菌株（すなわち、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列を含むハンセヌラ・ポリモルファ宿主細胞の形質転換スクリーニング株）の構築
組換えハンセヌラ・ポリモルファＢ型肝炎ワクチンの形質転換とスクリーニングの過程は図５に示される。
具体的に以下を含む。
１）細胞エレクトロポレーション法を用いて、ｐＭＰＴ−ＨＢｓＡｇプラスミドで宿主細胞であるＵＲＡ３−栄養要求性ハンセヌラ・ポリモルファ細胞株ＨＵ−１１（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８）を形質転換した。選択培地（ＭＤ液体培地）で平皿により培養した。ＭＤ選択培養用平皿から成長した単一コロニー形質転換体を選択して、ＭＤ液体培地に移した後、連続継代培養し、ａｄｗ２サブタイプＨＢｓＡｇ遺伝子及び対応する調節要素をマルチコピーにして、宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞の染色体に異種組み込んだ。
２）菌株スクリーニングは以下のステップを含む。
（１）ウラシル原栄養形質転換体の単一コロニーを選択する。
菌体の成長速度が高いコロニーを用いて、ＰＣＲ技術によってＨＢｓＡｇ遺伝子のバンドの明るさを検出した後、コピー数の多いコロニーを選択して、選択培地を用いて単一コロニーを振盪フラスコ培養し、２０〜４００世代連続継代培養した。
（２）マルチコピーの異種組み込み形質転換クローン株をスクリーニングする。
ステップ（１）で継代培養した後、メタノールで７２時間誘導培養して、ラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｒ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）で形質転換体の細胞が破砕された後に放出するＨＢｓＡｇの発現レベルを測定する。
（３）遊離プラスミドを除去した高コピー・高発現クローン株をスクリーニングする。
ステップ（２）でスクリーニングしたクローン株を、ＹＰＤ完全培地で４８時間培養した後、選択培地平皿に移してクローン化培養を行い、定量的ＰＣＲによってＨＢｓＡｇ遺伝子のコピー数を検出し、ＲＩＡによってＨＢｓＡｇ発現レベルを検出する。
（４）ステップ（３）の検出結果に基づいて、遺伝的安定性に優れた組換えハンセヌラ・ポリモルファＨＢｓＡｇエンジニアリング菌の初代菌株を選択する。

実施例３
３０リットルのパイロット規模発酵の主なプロセス過程は以下のとおりである。
１）シード培地２００ｍｌで、液体窒素を用いて貯蔵した菌種を解凍して、培地に接種し、２つの０．５Ｌ振盪フラスコに等分して、３１℃で２２時間培養して一次シードとした。
２）シード培地１６００ｍｌを用いて一次シードを二次シード培地に移して、６個の１Ｌ振盪フラスコに等分して、３１℃で２０時間培養して二次シードとした。
３）１２Ｌ発酵培地をｐＨ５．５に調整して３０Ｌ発酵缶に投入し、二次シードを接種した後、３０〜３１℃で、グリセリン、メタノールの２種の炭素源で、成長、抑制解除及び誘導の３つの時期を経て、合計８５〜９６時間培養して、誘導を停止してから２〜３時間後、細胞を収穫した。凍結細胞をホモジネートした。

操作ポイントは以下の通りである
（１）成長時期における流加操作は、溶存酸素が有意に低下して、基礎培地が消費されたときに実施し始め、且つ、基礎培地の消費量の増加に伴い徐々に流加速度を向上させ、溶存酸素が戻る前の２〜３時間に流加を終了した。
（２）成長時期の後期に、溶存酸素の上昇をモニタリングして、溶存酸素の最低値を記録し、溶存酸素が７０−８０％まで戻ったときに、流加を開始させて、抑制解除時期に入った。
（３）抑制解除時期の後期に、流加終了後、溶存酸素が戻り始める。溶存酸素が７０〜８０％まで戻ったときに、メタノールを流加して溶液を誘導し、メタノール濃度を３〜５‰に制御し、メタノール検出流加コントローラで流加速度を制御した。
（４）細胞収獲時のメタノール残留を減少させるように、発酵終了前の２〜３時間に、メタノール流加を停止した。

培地
１．塩化カルシウム溶液の調製
ＣａＣｌ_２ １１．３３ｇを正確に秤量して、洗浄した三角フラスコに投入し、適量の脱イオン水を加えて溶解した後、２００ｍｌに定容した。

２．微量元素溶液の調製
下記試薬を正確に秤量した。

秤量した試薬を洗浄した三角フラスコに投入して、適量の脱イオン水を加えて溶解した後、２００ｍｌに定容した。

３．ビタミン溶液の調製
下記試薬を正確に秤量した。

まず、ビオチンを５０％イソプロパノール１０ｍｌに溶解して、溶解後、Ｔｈｉａｍｉｎ ＨＣｌを加えて、次に適量の脱イオン水を加えて溶解した後、水で１００ｍｌに定容した。

４．痕跡元素溶液の調製
下記試薬を正確に秤量した。

秤量した試薬を洗浄した三角フラスコに投入して、適量の脱イオン水を加えて溶解した後、水で５０ｍｌに定容した。
以上の４種類の溶液をそれぞれ除菌して濾過して、使用時まで保存した。

５．シード塩溶液の調製
下記試薬を正確に秤量した。

秤量した試薬を洗浄した三角フラスコに投入して、適量の脱イオン水を加えて溶解した後、１６００ｍｌに定容した。

６．２０００ｍｌ三角フラスコにグリセリン２７ｇ、混合塩溶液３６０ｍＬを秤取して、脱イオン水を加えて１８００ｍｌに定容し、等量で２つの２０００ｍｌ三角フラスコに分注して、１１０℃で３０分間高圧蒸気滅菌を行った。
１１０℃で３０分間高圧蒸気滅菌を行うことで、５００ｍｌ三角フラスコを２個、１０００ｍｌ三角フラスコを６個、１００ｍｌと５００ｍｌのメスシリンダーをそれぞれ１つ充填前に滅菌した。

７．一次シード培地
クリーンベンチにおいて、無菌操作により滅菌したグリセリン水溶液をそれぞれ１００ｍｌ秤取して、それぞれ滅菌後の２個の５００ｍｌ三角フラスコに投入して、塩化カルシウム溶液１ｍｌ、微量元素溶液１ｍｌ、ビタミン溶液０．５ｍｌ、痕跡元素溶液０．２５ｍｌをそれぞれ加えて、加えた溶液を均一に振とうさせた。

８．二次シード培地
クリーンベンチにおいて、無菌操作技術により滅菌後のグリセリン水溶液１６００ｍｌを秤取して、滅菌後の２０００ｍｌ三角フラスコに投入して、塩化カルシウム溶液１６ｍｌ、微量元素溶液１６ｍｌ、ビタミン溶液８ｍｌ、痕跡元素溶液４ｍｌをそれぞれ加えた。

９． 発酵培地
試薬として、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４ １７５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＫＣｌ ４４ｇ、ＮａＣｌ ４．４ｇを正確に秤量して、２０００ｍｌの脱イオン水に溶解した。
５００ｍｌ小ビーカーにグリセリン５２０ｇを秤量して、消泡剤１０ｍｌを加えて、オンラインで滅菌し、次に、塩化カルシウム溶液１７５ｍｌ、微量元素溶液１７５ｍｌ、ビタミン溶液８８ｍｌ、痕跡元素溶液４４ｍｌを加えた。

１０．流加培地
１０００ｍｌ三角フラスコに、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４８７ｇ、グリセリン２６０ｇを秤取して、脱イオン水を５００ｍｌ加え、包まれた流加管路に加えて、１１０℃で３０分間滅菌した。

１１．抑制解除溶液
５０００ｍｌ三角フラスコに、グリセリン１８００ｇを秤取して、脱イオン水６６０ｍｌを加え、包まれた流加管路に加えて、１１０℃で３０分間滅菌し、冷却後、無菌操作により濾過除菌した塩溶液５４０ｍｌを加えた。

１２．誘導溶液
１０００ｍｌ三角フラスコに、グリセリン４００ｍｌを秤取して、包まれた流加管路に加え、１１０℃で３０分間滅菌し、冷却後、無菌操作によりメタノール１６００ｍｌを加えた。

実施例４
精製
実施例３で得られた発酵液について、細胞を収穫して細胞を洗浄し、詳細な精製ステップについては、以下の文献を参照すればよい。李津、孔艷．組換えＢ型肝炎ワクチンの生産プロセス。李津、兪詠霆、董徳詳編集：生物製薬装置及び分離精製技術．第１版．北京：化学工業出版社、２００３：３４８−３４９。さらに、上記収獲した細胞をホモジナイザーで破砕して、ＨＢｓＡｇを放出させ、０．２２μｍの微多孔ろ過器で濾過して、細胞破片を除去し、次に、３００Ｋの限外ろ過器で限外ろ過して小分子不純物を除去し、シリカゲル吸着処理法によりＨＢｓＡｇを抽出し、最後に、ブチルアガロース疎水性クロマトグラフィー方法で精製した。

参照文献
１、斉小秋ら、全国人口のウイルス性Ｂ型肝炎の血清学的疫学調査の報告、２０１１年４月第１版、人民衛生出版社。
２、庄輝、中国のＢ型肝炎予防治療現状及び目標、２００８年、会議。
３、黎健ら、上海市で新生児に組換えＢ型肝炎ワクチン（酵母）を接種した後の低／無応答についての研究、中国のワクチン及び免疫、２０１１年、第１７巻第５期：３９９−４０３。
４、劉甲野ら、成人に２０ミリグラムの組換えＢ型肝炎ワクチンを接種した後の免疫応答及びその影響要素の比較研究、中国のワクチン及び免疫、２０１３年、第１９巻第２期：１４２−１４６。
５、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ａｒｅ ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎｓ ｎｅｅｄｅｄ ｆｏｒ ｌｉｆｅｌｏｎｇ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｉｍｍｕｎｉｔｙ？ Ｌａｎｃｅｔ ２０００； ３５５： ５６１−５６５。

Claims (9)

1. 組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチンであって、
   前記Ｂ型肝炎ワクチンを生産する組換えハンセヌラ・ポリモルファ発酵液のＨＢｓＡｇ純品の収率が３００ｍｇ／Ｌ〜４００ｍｇ／Ｌであり、
   前記Ｂ型肝炎ワクチンにおいて、Ｂ型肝炎表面抗原の成人用量の目安が４０μｇ／剤で、小児用量の目安が２０μｇ／剤であり、
   前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＢ型肝炎表面抗原のＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されることを特徴とする組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチン。
2. 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＢ型肝炎表面抗原のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されることを特徴とする請求項１に記載の組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチン。
3. 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＢ型肝炎表面抗原は、ウイルス様粒子構造であり、ＨＢｓＡｇをハンセヌラ・ポリモルファ脂質に挿入してなり、前記ＨＢｓＡｇの１４個のシステインのうち９〜１２個がジスルフィド結合を形成することを特徴とする請求項１又は２に記載の組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチン。
4. 前記Ｂ型肝炎ワクチンは、インサイチュ共沈殿法又は直接吸着法によって製造されるアルミアジュバント、好ましくは、インサイチュ共沈殿法によって製造されるアルミアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチン。
5. インサイチュ共沈殿法又は直接吸着法によって製造されるアルミアジュバント、好ましくはインサイチュ共沈殿法によって製造されるアルミアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチン。
6. 前記Ｂ型肝炎ワクチンの免疫手順は、０、１、２〜１２月にそれぞれ１剤、合計３剤注射し、好ましくは、０、１、６月にそれぞれ１剤、合計３剤注射することを特徴とする請求項１に記載の組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチン。
7. 剤型が、プレフィルド注射液剤、注射液剤又は凍結乾燥粉末注射剤から選ばれ、好ましくは、プレフィルド注射液剤であることを特徴とする請求項１に記載の組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチン。
8. 前記Ｂ型肝炎表面抗原はａｄｗサブタイプであることを特徴とする請求項１に記載の組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチン。
9. 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファの宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞株はＨＵ−１１であり、保蔵番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８であり、前記宿主であるハンセヌラ・ポリモルファのオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼの遺伝子が破壊されたＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されることを特徴とする請求項１に記載の組換えハンセヌラ・ポリモルファによる高用量Ｂ型肝炎ワクチン。

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