CN104480131A - 一种在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及构建基于甲醇营养型汉逊酵母和毕赤酵母的通用载体，其构建方法包括如下步骤：步骤（1），用限制性内切酶 Bgl Ⅱ和 Bam HⅠ双酶切质粒pHanMOX-GFP，得到pHan载体；步骤（2），用限制性内切酶 Bgl Ⅱ和 Bam HⅠ双酶切消化载体质粒pPinkAOX1-HPV16L1，回收片段PAOX1-HPV16L1-CYC1TT后与步骤（1）所得pHan载体以T4连接酶16℃连接过夜，转化并涂布含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板，提取质粒酶切鉴定，得到重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1。本发明使用上述通用载体指导了人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1在毕赤酵母和汉逊酵母中的表达。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及构建基于甲醇营养型汉逊酵母和毕赤酵母的通用载体，通过考察汉逊酵母核糖体DNA和自主复制序列以及毕赤酵母醇氧化酶1型启动子、翻译延伸因子1-α启动子，和汉逊酵母甲醇氧化酶启动子在穿梭载体中的作用，构建基于汉逊酵母核糖体DNA以及毕赤酵母启动子的能于汉逊酵母和毕赤酵母中穿梭表达的通用载体的方法。
背景技术
甲醇营养型酵母毕赤酵母和汉逊酵母是两个异源蛋白表达宿主系统。它们不仅具有分泌效率高和翻译后蛋白修饰的真核表达系统特点，并且还具备基因操作容易、在简单培养基中快速生长以及不产生内毒素和病毒DNAs的优势。这两个宿主系统均具有细胞生长高密和蛋白高产量的特点，因此适合于工业大规模生产重组蛋白。
近些年，由于汉逊酵母所具备的的优势特性，如生长温度高、生长速率快、蛋白表达高效，已成为国际上公认的理想的外源基因表达系统之一。在汉逊酵母中，外源DNA整合于酵母染色体基因组中，随染色体有丝分裂而复制，稳定存在于染色体上，因此异源蛋白获得在宿主内的稳定表达。这种整合可以是同源重组整合或随机整合。在同源重组中，引入的外源DNA序列必须与汉逊酵母基因组具有同源序列，而由于重组方式和重组位点的不同将会导致重组转化子性质相异。为了使重组蛋白稳定而高效地表达，重组质粒必须高拷贝地整合入酵母基因组中。在汉逊酵母中，高拷贝的基因组整合质粒可以通过高频率的同源或非同源重组的方式获得。
核糖体DNA序列已成功介导了重组质粒在广泛的异源宿主系统中的整合。而这样的整合主要得益于核糖体DNA保守的结构以及在基因组一个或多个位点上头尾相接的串联重复排列模式。核糖体DNA重复排列的数目和长度在不同的种属里变化很大。在汉逊酵母中一个8.1k碱基对长的单元可以在单一染色体基因组上具有50至60个拷贝。而汉逊酵母核糖体DNA的组成和顺序同酿酒酵母中的核糖体DNA单元非常相似。每一个核糖体DNA单元均由以下几个元件顺序构成，分别是非转录间隔区1，5SrRNA，非转录间隔区2，35S前体序列，外部转录间隔区，18S，5.8S和25S rRNA序列。这样的保守性给汉逊酵母提供了一个基于核糖体DNA的表达平台，扩大了汉逊质粒在不同酵母宿主间指导蛋白表达的能力，例如植酸酶酵母。在植酸酶酵母中，核糖体DNA靶向的载体能够共整合多达3个不同的表达质粒，而这仅仅只通过一次转化步骤。
除了汉逊酵母核糖体DNA外，先前的研究显示汉逊酵母自主复制序列也可用于外源基因的高拷贝整合。自主复制序列又称为复制起点序列，作为顺式作用元件，是真核生物中一类能启动DNA复制的序列，是染色体正常起始复制所必需的。自主复制序列DNA具有一段富含AT的200个碱基对的保守序列，真核生物染色体上有多个自主复制序列。在汉逊酵母中，携带有汉逊酵母自主复制序列的质粒可以高效地转化汉逊酵母，并且可以在体外以自我复制的形式游离稳定存在。
相比于汉逊酵母而言，毕赤酵母较难获得高拷贝的整合，而这样高拷贝的整合发生的几率仅仅为1％。
毕赤酵母和汉逊酵母均为甲醇营养型酵母。它们使用甲醇作为唯一的碳源用于异源蛋白的表达，并且分别受到严格的甲醇调控启动子醇氧化酶1型启动子和甲醇氧化酶启动子的调控。两个启动子均是较强的启动子并且在两个宿主表达系统中均应用广泛。两个启动子均具有相同的调控机制。当酵母细胞在抑制性碳源，如葡萄糖、甘油和乙醇中生长时，醇氧化酶1型启动子在毕赤酵母中同甲醇氧化酶启动子在汉逊酵母中一样均没有活性；当去除了抑制性碳源加入甲醇后，两个启动子均能被强烈地诱导，显示出较高的活性。
与诱导型启动子比起来，由于不需要诱导并且容易操作，组成型启动子在指导异源蛋白表达上得到了广泛的应用。毕赤酵母翻译延伸因子1-α启动子是近年发现的较强的组成型启动子。翻译延伸因子1-α启动子可以使用广泛的碳源对异源蛋白的表达进行调控，碳源如葡萄糖、甘油、甲醇和其它碳源，而指导异源蛋白表达显示出了生长相关的调控模式。使用植酸酶酵母的翻译延伸因子1-α启动子成功指导了绿色荧光蛋白在汉逊酵母中的表达，而毕赤酵母翻译延伸因子1-α启动子在汉逊酵母中的应用却还没有报道。但毕赤酵母醇氧化酶1型启动子也早已在汉逊酵母中应用，如使用毕赤酵母醇氧化酶1型启动子在汉逊酵母中表达转化酶可达1克每升的产量。
毕赤酵母及汉逊酵母都是目前应用广泛的表达系统，一个异源蛋白的高效表达往往与宿主细胞的遗传背景密切相关，很难保证一个宿主系统对所有的异源蛋白的表达都是必要的，因此，经常需要在多个系统中进行表达优化的尝试。本发明致力于构建一个通用型的质粒载体系统，以实现异源蛋白在毕赤酵母及汉逊酵母中的穿梭应用。而该通用质粒载体则主要是基于汉逊酵母的核糖体DNA元件以及毕赤酵母醇氧化酶1型启动子。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供了一个在毕赤酵母和汉逊酵母中穿梭表达异源蛋白的方法，通过基于汉逊酵母核糖体DNA和毕赤酵母醇氧化酶1型启动子的通用载体实现。
本发明采用的技术方案如下：
一种在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，包括如下步骤：
步骤(1)，用限制性内切酶BglⅡ和BamH Ⅰ双酶切质粒pHanMOX-GFP，得到pHan载体；
步骤(2)，用限制性内切酶BglⅡ和BamH Ⅰ双酶切消化载体质粒pPinkAOX1-HPV16L1，回收片段PAOX1-HPV16L1-CYC1TT后与步骤(1)所得pHan载体以T4连接酶16℃连接过夜，转化并涂布含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板，提取质粒酶切鉴定，得到重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1，该质粒即为通用载体。
上述技术方案中，所述的步骤(1)中的酶切反应体系为质粒pHanMOX-GFP 0.25μg/μl 20微升，BglⅡ1微升，BamH Ⅰ1微升，10×K buffer 5微升，双蒸水23微升。
上述技术方案中，所述的步骤(2)中的酶切反应体系为质粒pPinkAOX1-HPV16L10.35μg/μl 20微升，BglⅡ1微升，BamH Ⅰ1微升，10×K buffer 5微升，双蒸水23微升。
上述技术方案中，所述的连接反应体系为PAOX1-HPV16L1-CYC1TT片段2微升，pHan载体1.26微升，10×T4buffer 1微升，T4连接酶0.5微升，双蒸水5.24微升；其中，所述的PAOX1-HPV16L1-CYC1TT片段与pHan载体的连接摩尔浓度比为1:3。片段与载体的具体浓度没有要求，只要片段和载体摩尔浓度比为1:3即可，本发明其他地方亦同。
上述技术方案中，所述的含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板包括以下物质：每升含胰蛋白胨10克，酵素提取物5克，氯化钠10克和琼脂粉15克；还包括终浓度为0.1mg/mL的卡那霉素。
上述技术方案中，所述的提取质粒酶切鉴定的具体操作方法为，质粒pHanAOX1-HPV16L1用限制性内切酶Sac Ⅰ于37℃水浴锅中酶切1小时候，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，显示于2470个碱基长度的地方有一条带则表明质粒构建正确，其中酶切鉴定反应体系为：质粒pHanAOX1-HPV16L10.36μg/μl 2微升，Sac Ⅰ0.2微升，10×L buffer 1微升，双蒸水6.8微升。
上述构建的重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1在指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达中的应用。
重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1转化毕赤酵母和汉逊酵母来指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达，具体方法为：重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1经限制性内切酶AflⅡ消化后转化毕赤酵母，重组克隆子经过无博来霉素加压的连续培养后再经博来霉素加压筛选的过程，随机挑取6个单克隆重组子经甲醇诱导表达人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1蛋白。
指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达方法为：
汉逊酵母重组质粒pHanAOX1-HPV16L1经AflⅡ线性化后电转化毕赤酵母PinkTMStrain Ⅰ及汉逊酵母细胞，涂布含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板，分别于30℃和37℃培养；待菌落长出后，分别从四个平板上各挑取3个菌落进行非抗性压力下的连续传代，共重复转接培养5次，将第六次转接培养24小时后的菌液于含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板划线，培养后分别随机挑取各平板上的6个菌落进行诱导表达，诱导24小时后的酵母培养物进行蛋白免疫印迹检测人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达。
本发明的作用机理及研究过程：
首先本发明考察了汉逊酵母核糖体DNA和自主复制序列元件在介导重组质粒在汉逊酵母和毕赤酵母中的转化效率的研究。3个汉逊酵母重组质粒pHanMOX-GFP(包含有汉逊酵母核糖体DNA和自主复制序列元件)、pHanMOX-rDNA(仅包含有汉逊酵母核糖体序列)、pHanMOX-HARS(仅包含有汉逊酵母自主复制序列)经过限制性内切酶AflⅡ消化后分别转化汉逊酵母和毕赤酵母。转化效率使用每微克线性化DNA转化后所产生的克隆形成单位来表示，见图1。重组汉逊酵母质粒pHanMOX-GFP在汉逊酵母中的转化效率较其在毕赤酵母中高，重组汉逊酵母质粒pHanMOX-rDNA无论是在汉逊酵母中还是毕赤酵母中均同重组汉逊酵母质粒pHanMOX-GFP一样，并且均显著高于质粒pHanMOX-HARS在汉逊酵母中的转化效率(大约20至30倍)，然而质粒pHanMOX-HARS在毕赤酵母中的转化效率几乎为零。结果表明，汉逊酵母核糖体DNA在汉逊酵母本身中介导了比汉逊酵母自主复制序列高的转化效率；而在毕赤酵母中汉逊酵母核糖体DNA尽管也介导了转化，但转化效率却低很多。相比之下，汉逊酵母自主复制序列则不能够介导质粒在毕赤酵母中的转化，表明汉逊酵母自主复制序列在毕赤酵母中不具备以体外游离质粒自主复制形式存在的能力，并且汉逊酵母自主复制序列也不能够介导在毕赤酵母中有效的整合。.
线性化质粒在同源重组事件和质粒整合至染色体基因组中具有重要的意义。但实际上，线性化的质粒具备再环化的潜力，并且再环化的质粒对转化效率会产生影响。
碱性磷酸酶在人体内脏中广泛分布。碱性磷酸酶是一种重要的分子生物学酶工具。碱性磷酸酶可以去除脱氧核苷酸5’末端的磷酸基团，从而阻止了脱氧核苷酸5’末端和3’末端的连接，因此脱氧核苷酸处于抑制状态，能够保持线性化的形式。
为了考察质粒再环化对含有汉逊酵母核糖体DNA和/或者汉逊酵母自主复制序列元件的重组质粒转化汉逊酵母和毕赤酵母的转化效率的影响，线性化的质粒pHanMOX-GFP，pHanMOX-rDNA，和pHanMOX-HARS在转化前分别经牛小肠碱性磷酸酶处理和未处理。结果表明，在毕赤酵母中，相比于经过牛小肠碱性磷酸酶处理的质粒，牛小肠碱性磷酸酶未处理的重组质粒pHanMOX-GFP和pHanMOX-rDNA具有较高的转化效率。经过牛小肠碱性磷酸酶处理的质粒导致质粒在体内不能够再环化，降低了转化效率，见图2A。然而重组质粒pHanMOX-HARS在转化板上没有克隆产生。在汉逊酵母中，经牛小肠碱性磷酸酶处理的质粒HanMOX-GFP和pHanMOX-rDNA比未经牛小肠碱性磷酸酶处理的质粒具有较高的转化效率，而牛小肠碱性磷酸酶未处理的重组质粒pHanMOX-HARS的转化效率却略高于经牛小肠碱性磷酸酶处理的质粒，结果见图2B。结果表明，线性化对于重组质粒在汉逊酵母中的转化效率起到重要的作用，再环化可能会阻碍质粒整合至染色体基因组中；而在毕赤酵母中，转化质粒可能以游离形式存在于基因组外，因此再环化对于汉逊酵母核糖体DNA介导的重组质粒在毕赤酵母中的转化效率影响较显著。
以上转化实验的结果表明汉逊酵母核糖体DNA介导的质粒在毕赤酵母中的转化效率不高，但仍能指导异源蛋白的表达。因此我们以绿色荧光蛋白作为报告基因，使用汉逊酵母核糖体DNA介导的质粒，在毕赤酵母中指导绿色荧光蛋白的表达。
汉逊酵母重组质粒pHanMOX-GFP转化毕赤酵母PichiaPink TMStrain Ⅰ感受态细胞，随机挑取克隆进行表达。结果显示10％的克隆能指导绿色荧光蛋白表达，表明汉逊酵母甲醇氧化酶启动子能够在毕赤酵母中工作，而汉逊酵母核糖体DNA未能介导质粒在毕赤酵母基因组中有效的整合。
为了在毕赤酵母中获得整合的重组子，采用两种方法筛选高表达克隆。一种就是采用博来霉素不断加压筛选，另一种则是经过无博来霉素压力连续传代后再经过博来霉素加压筛选。结果表明经过一系列不同浓度博来霉素抗生素加压筛选后，在不同浓度抗生素平板上单克隆的数目并没有变化(见图3)，随机挑取不同抗生素浓度平板上的克隆进行表达，绿色荧光蛋白的表达强度在不同浓度加压筛选下没有区别，见图4A。相比之下，经过无博来霉素压力连续传代后，绿色荧光蛋白的表达强度显著提高，见图4B。
以上结论表明汉逊酵母核糖体DNA介导的质粒在毕赤酵母中的转化，可能以游离复制的形式存在于染色体基因组外。这些质粒不能在扩增的细胞中稳定存在，在没有抗生素加压的连续的细胞增殖和有丝分裂过程中维持几代后便渐渐丢失，而只有整合至染色体基因组中的质粒，由于可能发生的同源或非同源重组事件，因而再经过博来霉素加压筛选后能稳定存在并且有效地指导异源蛋白的表达。
至此我们已建立了以汉逊酵母核糖体DNA介导的重组质粒在毕赤酵母中有效的整合方法，并且通过此方法可以筛选到高表达的克隆。
然而作为基因的一部分，启动子控制着基因表达的起始和表达的程度。因此对于一个穿梭载体而言，一个通用的强的启动子是必不可少的。于是我们考察了毕赤酵母醇氧化酶1型启动子、翻译延伸因子1-α启动子和汉逊酵母甲醇氧化酶启动子分别在毕赤酵母和汉逊酵母中指导蛋白表达的能力。
毕赤酵母醇氧化酶1型启动子是一个广泛使用的强的甲醇调控启动子。醇氧化酶催化甲醇代谢的第一步反应，将甲醇转化为甲醛。低聚物黄素酶对甲醇和氧气的亲和性较低，需要大量的醇氧化酶维持细胞在甲醇中的生长，因此醇氧化酶的含量占到了细胞中总mRNA的5％和总可溶性蛋白的30％。醇氧化酶在抑制性碳源中没有活性，如葡萄糖、甘油和乙醇，这种严格的调控是在转录水平上进行的。
毕赤酵母翻译延伸因子1-α启动子是目前应用比较广泛的组成型启动子。翻译延伸因子1-α是真核翻译机械的主要组成部分，介导了氨酰tRNA转移至核糖体上维持肽链的延伸。毕赤酵母翻译延伸因子1-α启动子具有很强的生长相关特性，是一个适合于异源蛋白表达的强的组成型启动子。
汉逊酵母甲醇氧化酶启动子是汉逊酵母中应用最为广泛的甲醇诱导型启动子。当细胞生长在甲醇、甘油或是山梨醇培养基中，甲醇氧化酶基因能被强烈地激活，而当细胞生长在葡萄糖或是乙醇培养基中，甲醇氧化酶启动子不具备活性。
首先我们考察了上述三个启动子，即醇氧化酶1型、翻译延伸因子1-α和甲醇氧化酶启动子能否在毕赤酵母中工作。基于毕赤酵母质粒pPink-LC改造的重组毕赤酵母质粒pPinkAOX1-GFP，pPinkTEF1-GFP和pPinkMOX-GFP经限制性内切酶Spe Ⅰ消化后分别转化毕赤酵母PichiaPinkTMStrain Ⅰ，随机挑取重组克隆子表达绿色荧光蛋白，结果显示三个启动子均能够在毕赤酵母中工作，并能指导绿色荧光蛋白的表达，见图5A。
其次我们考察了上述三个启动子能否在汉逊酵母中工作。基于汉逊酵母质粒改造的重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-GFP，pHanTEF1-GFP和pHanMOX-GFP经限制性内切酶AflⅡ消化后转化汉逊酵母。结果显示，三个启动子均能在汉逊酵母中工作，其中毕赤酵母醇氧化酶1型启动子指导绿色荧光蛋白表达的强度同汉逊酵母甲醇氧化酶启动子一致，而毕赤酵母翻译延伸因子1-α启动子则弱于以上两个启动子，见图5B。
此外，之前的研究发现毕赤酵母醇氧化酶1型启动子在汉逊酵母中具有很强的渗漏表达，这同汉逊酵母甲醇氧化酶启动子一致。醇氧化酶1型启动子和甲醇氧化酶启动子二者在毕赤酵母和汉逊酵母中的表达能力显示两者均可用于构建穿梭质粒，结合先前的研究结果表明毕赤酵母和汉逊酵母启动子以及汉逊酵母的整合元件均可以用于从宿主的基因背景出发进行通用穿梭载体的优化表达。
根据上述研究成果，我们使用构建的穿梭质粒用于人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达应用。人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1是目前主要的对抗人乳头瘤病毒感染的预防性商业化疫苗的主要抗原。因此作为我们本研究的模式蛋白，人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1在毕赤酵母和汉逊酵母中的表达被用于基于汉逊酵母核糖体DNA和毕赤酵母醇氧化酶1型启动子的通用载体的功能研究。重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1经限制性内切酶AflⅡ消化后转化毕赤酵母，重组克隆子经过无博来霉素加压的连续培养后再经博来霉素加压筛选的过程，随机挑取6个单克隆重组子经甲醇诱导表达人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1。蛋白免疫印迹结果显示，重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1无论是转化毕赤酵母还是汉逊酵母均能成功地表达了人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1，见图6。
本发明的作用机理及研究过程的具体操作步骤在具体实施方式中有相应的说明。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
一.本发明主要提供一种用于异源蛋白表达的通用载体在甲醇营养型毕赤酵母和汉逊酵母中的应用方法。
二.其次本发明通过使用包含有汉逊酵母核糖体DNA和/或者自主复制序列的汉逊酵母重组质粒转化汉逊酵母和毕赤酵母，发现汉逊酵母核糖体DNA能够有效地介导重组质粒在汉逊酵母本身中的转化，同时也能介导其在毕赤酵母中的转化。
三.本发明通过使用绿色荧光蛋白作为报告基因，经过无博来霉素压力的连续传代后再经过博来霉素的加压筛选过程，使得含有汉逊酵母核糖体DNA的汉逊酵母重组质粒pHanMOX-GFP能够介导其在毕赤酵母基因组中稳定的整合并且能很好地指导绿色荧光蛋白的表达。
四.本发明表明毕赤酵母醇氧化酶1型启动子和翻译延伸因子1-α启动子以及汉逊酵母甲醇氧化酶启动子均能在毕赤酵母和汉逊酵母两个宿主表达系统中很好地工作。
五.本发明成功
使用基于汉逊酵母核糖体DNA和毕赤酵母醇氧化酶1型启动子的通用载体指导了人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1在毕赤酵母和汉逊酵母中的表达。
附图说明
图1为汉逊酵母重组质粒pHanMOX-GFP、pHanMOX-rDNA、pHanMOX-HARS转化毕赤酵母和汉逊酵母转化效率比较；其中，A.汉逊酵母重组质粒pHanMOX-GFP转化汉逊酵母和毕赤酵母，B.汉逊酵母重组质粒pHanMOX-rDNA和pHanMOX-HARS转化汉逊酵母C.汉逊酵母重组质粒pHanMOX-rDNA和pHanMOX-HARS转化毕赤酵母；数据以每微克线性化DNA转化后所产生的克隆形成单位表示，每次转化独立进行三次平行实验；
图2为汉逊酵母重组质粒pHanMOX-GFP、pHanMOX-rDNA、pHanMOX-HARS经牛小肠碱性磷酸酶处理和未处理转化毕赤酵母和汉逊酵母的转化效率比较；A.重组质粒转化毕赤酵母克隆数B.重组质粒转化汉逊酵母克隆数；数据以每微克线性化DNA转化后所产生的克隆形成单位表示，每次转化独立进行三次平行实验；
图3为汉逊酵母重组质粒pHanMOX-GFP重组菌在不同浓度博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板上的生长情况；其中，A为0.2mg/mL博来霉素；B为0.5mg/mL博来霉素；C为1mg/mL博来霉素；
图4为汉逊酵母重组质粒pHanMOX-GFP转化毕赤酵母后在博来霉素加压筛选和无博来霉素加压连续传代下绿色荧光蛋白的表达情况；A为转化重组子在一系列不同浓度博来霉素压力筛选下表达绿色荧光蛋白；1：0.2mg/mL博来霉素；2：0.5mg/mL博来霉素；3：1mg/mL博来霉素B为转化重组子经过无博来霉素压力连续传代后再经过博来霉素加压筛选表达绿色荧光蛋白；4：第一次传代；5：第二次传代；6：第三次传代；
图5为毕赤酵母醇氧化酶1型启动子和翻译延伸因子1-α启动子以及汉逊酵母甲醇氧化酶启动子指导绿色荧光蛋白在毕赤酵母和汉逊酵母中的表达；A为毕赤酵母重组质粒pPinkAOX1-GFP、pPinkTEF-GFP、pPinkMOX-GFP介导绿色荧光蛋白在毕赤酵母细胞中的表达；1：重组质粒pPinkAOX1-GFP；2：重组质粒pPinkTEF1-GFP；3：重组质粒pPinkMOX-GFP；B为汉逊酵母重组质粒pHanAOX1-GFP、pHanTEF1-GFP、pHanMOX-GFP介导绿色荧光蛋白在汉逊酵母细胞中的表达；4：重组质粒pHanAOX1-GFP；5：重组质粒pHanTEF1-GFP；6：重组质粒pHanMOX-GFP；
图6为重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1介导的人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1在毕赤酵母和汉逊酵母中表达情况的蛋白免疫印迹；上栏为重组质粒pHanAOX1-HPV16L1介导的人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1在毕赤酵母中的表达；下栏为重组质粒pHanAOX1-HPV16L1介导的人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1在汉逊酵母中的表达；数字1～6代表不同重组克隆子。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明中各种限制性内切酶、buffer缓冲液、T4连接酶还有PCR的各种试剂均是购自于TakaraTM，中文名：宝生物工程(大连)有限公司的。
离心机的型号为Sorvall ST 16R Centrifuge，厂家：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，文中离心没有以r/min来规定离心速度，而是采用离心力来表示的。
材料与方法
菌株与质粒
毕赤酵母细胞系PichiaPinkTMStrain Ⅰ(InvitrogenTM)用作蛋白表达宿主菌，汉逊酵母菌株购自美国菌种典藏中心(ATCC)，也用作蛋白表达宿主菌。
大肠杆菌DH5α(TakaraTM)用作表达载体构建中的克隆宿主。
毕赤酵母质粒pPink-LC(InvitrogenTM)和用于毕赤酵母重组质粒构建。
毕赤酵母重组质粒pPinkAOX1-HPV16L1用于汉逊酵母重组质粒构建。
汉逊酵母原始质粒pHanMOX-GFP和pRMHP2.1用于汉逊酵母重组质粒构建。
质粒pThioHisA(InvitrogenTM)用于汉逊酵母重组质粒pHanMOX-HARS构建。
质粒pCDNA3-GFP用于绿色荧光蛋白的核苷酸片段扩增。
毕赤酵母改造表达质粒为pPinkAOX1-GFP、pPinkTEF1-GFP、pPinkMOX-GFP，汉逊酵母改造表达质粒为pHanMOX-rDNA、pHanMOX-HARS、pHanAOX1-GFP、pHanTEF1-GFP、pHanAOX1-HPV16L1。
巴斯德毕赤酵母和汉逊酵母的转化：
巴斯德毕赤酵母的转化采用电转化的方法。电转化感受态细胞的制备依据毕赤酵母PichiaPinkTM表达系统表达手册制备。制备方法如下：取少部分毕赤酵母PichiaPinkTMStrain Ⅰ甘油菌划酵母浸出粉胨葡萄糖复合培养基琼脂平板，于30℃培养3-5天。挑取单菌落于装有10毫升酵母浸出粉胨葡萄糖的125毫升三角瓶中，30℃、280r/min培养24小时后，取部分过夜菌液加入到装有100毫升酵母浸出粉胨葡萄糖的1升三角瓶中，调节600纳米波长处吸光值至0.2，30℃、280r/min过夜培养。用分光光度计监测菌液600纳米波长处吸光值，至该吸光值到1.3-1.5(菌体处于对数生长期)后，将菌液转移至50毫升灭菌的离心筒中，1500g、4℃离心5分钟，弃上清，沉淀用40毫升冰预冷的无菌水重悬菌体；1500g、4℃离心5分钟，弃上清，沉淀再次用40毫升冰预冷的无菌水重悬菌体；1500g、4℃离心5分钟，弃上清，沉淀用20毫升1摩尔冰预冷的灭菌山梨醇重悬菌体；1500g、4℃离心5分钟，沉淀用600微升1摩尔冰预冷的灭菌山梨醇重悬菌体，于冰上分装，每支80-100微升，现用现做，不能冻存。
毕赤酵母电转化PichiaPinkTMStrain Ⅰ感受态细胞的方法和电转条件如下：将80-100微升电转化毕赤酵母PichiaPinkTMStrain Ⅰ细胞与5-10微克线性化质粒混合后转移至冰预冷的2毫米电转杯中，于冰上放置5分钟，使用Gene Pulser Xcell电转仪电转化DNA，电转条件为：1500伏，25微伏，200欧。电转后迅速加入1毫升冰预冷的酵母浸出粉胨葡萄糖山梨醇缓冲溶液轻轻混匀后于24-30℃静置至少2小时，取100-300微升涂布于毕赤酵母腺嘌呤缺陷平板或含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板，于30℃培养5-6天。
汉逊酵母的转化亦采用电转化方法。电转化感受态细胞制备如下：挑在酵母浸出粉胨葡萄糖培养平板上挑取汉逊酵母保存菌种单菌落于5毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，37℃过夜培养。之后将这5毫升过夜菌液接种于300毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，37℃培养至600纳米波长处吸光值为1.2～1.5之间(约6小时)，之后将该培养菌液3000g、4℃离心10分钟，加入灭菌水洗涤下沉淀(不悬)，之后加入50毫升pH＝7.5的清洗液重悬后，于37℃、转速为100～200r/min摇床培养15分钟。之后将菌液经3000g，4℃离心10分钟后，用200毫升冰预冷的STM溶液重悬，再经3000g，4℃离心10分钟后用100毫升冰预冷的STM溶液重悬，之后在3000g，4℃离心10分钟，最后加入1毫升冰预冷的STM溶液重悬，每管60微升分装后冻存于-80℃备用。
汉逊酵母电转化感受态细胞的方法和电转条件如下：将60微升电转化汉逊酵母感受态细胞与1-2微克线性化质粒混合后转移至冰预冷的2毫米电转杯中，于冰上放置5分钟，使用Gene Pulser Xcell电转仪电转化DNA，电转条件为：1500伏，50微伏，129欧。电转后迅速加入1毫升冰预冷的酵母浸出粉胨葡萄糖缓冲溶液上下混匀3次，后于37℃静置培养2小时，取100-300微升涂布于含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板，于37℃培养3-4天。
培养基：
含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板：每升含胰蛋白胨10克，酵素提取物5克，氯化钠10克，琼脂粉15克；终浓度为0.1mg/mL的卡那霉素，加双蒸水定容至1升。
含0.1mg/mL氨苄西林霉素的LB平板：每升含胰蛋白胨10克，酵素提取物5克，氯化钠10克，琼脂粉15克；终浓度为0.1mg/mL的氨苄西林霉素，加双蒸水定容至1升。
毕赤酵母腺嘌呤缺陷筛选平板：每升含有含有硫酸铵而不含氨基酸的酵母氮碱基13.4g，腺嘌呤氨基酸混合物1.25g，琼脂粉20克，生物素5毫克，10×葡萄糖100毫升，加双蒸水定容至1升。
含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板：每升含有酵母提取物10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克，琼脂粉20克，终浓度为0.2mg/mL博来霉素，加双蒸水定容至1升。
甘油复合物缓冲液培养基和甲醇复合物缓冲液培养基：每升包含酵母提取物10克，蛋白胨20克，100毫摩尔pH6.0磷酸钾缓冲液，含有硫酸铵而不含氨基酸的酵母氮碱基13.4g，生物素0.004克，其中甘油复合物缓冲液中加入10×甘油100毫升，而甲醇复合物缓冲液中加入10×甲醇100毫升，加双蒸水定容至1升。
酵母浸出粉胨葡萄糖培养基：每升包含酵母提取物10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克，加双蒸水定容至1升。
酵母浸出粉胨甘油培养基：每升包含酵母提取物10克，蛋白胨20克，10×甘油100毫升，加双蒸水定容至1升。
酵母浸出粉胨甲醇培养基：每升包含酵母提取物10克，蛋白胨20克，10×甲醇100毫升，加双蒸水定容至1升。
转化效率：
重组质粒转化实验每个转化均独立进行三次平行实验。转化效率使用每微克线性化DNA转化后所产生的克隆形成单位来表示。数据使用GraphPad Prism5.0软件统计分析。
绿色荧光蛋白检测：
取10微升酵母培养物涂片，用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达，使用油镜100×拍照保存。
蛋白免疫印迹检测方法如下：
酵母培养物样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶(分离胶质量浓度为12％)电泳分离后使用Bio-Rad半干转膜仪300毫安恒流条件下转聚偏二氟乙烯膜1小时。封闭液(每升含脱脂奶粉50克)封闭1小时，鼠抗人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1IgG2a单克隆抗体一抗孵育1.5小时，用Tris盐-吐温20缓冲液洗膜三次，每次5分钟；之后用辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG二抗孵育1小时，Tris盐-吐温20缓冲液洗膜三次，Tris盐缓冲液洗膜两次，每次5分钟，加入 显色底物孵育1～2分钟后，用X光片曝光显色。
实施例：用于异源蛋白表达的通用载体在甲醇营养型毕赤酵母和汉逊酵母中的应用方法
1)汉逊酵母核糖体DNA及自主复制序列元件对质粒在毕赤酵母和汉逊酵母细胞中转化效率的作用分析
①重组质粒pHanMOX-rDNA和pHanMOX-HARS构建
用限制性内切酶Sal Ⅰ单酶切质粒pHanMOX-GFP，酶切产物经胶回收后以T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板，提取质粒酶切鉴定，鉴定正确的质粒为pHanMOX-rDNA。酶切反应体系为：质粒pHanMOX-GFP 0.6μg/μl 15微升，Sal Ⅰ1微升，10×H buffer 4微升，双蒸水20微升。连接反应体系为：质粒pHanMOX-rDNA0.45μg/μl 4微升，10×T4buffer 1微升，T4连接酶0.5微升，双蒸水4.5微升。
用限制性内切酶Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切质粒pThioHisA所得Trx基因片段，与同样双酶切质粒pRMHP2.1所得载体以T4连接酶16℃连接过夜，转化、涂板，提取质粒酶切鉴定。
质粒pThioHisA的酶切反应体系为：质粒pThioHisA 0.47μg/μl 15微升，Nde Ⅰ1微升，EcoR Ⅰ1微升，10×H buffer 4微升，双蒸水19微升。
质粒pRMHP2.1的酶切反应体系为：质粒pRMHP2.10.36μg/μl 15微升，Nde Ⅰ1微升，EcoR Ⅰ1微升，10×H buffer 4微升，双蒸水19微升。
连接反应体系为：Trx基因片段3.2微升，质粒载体pRMHP2.10.8微升，10×T4buffer 1微升，T4连接酶0.5微升，双蒸水4.5微升。Trx基因片段与质粒载体pRMHP2.1的连接摩尔浓度比为1:3。
②重组汉逊酵母质粒pHanMOX-GFP、pHanMOX-rDNA和pHanMOX-HARS分别转化毕赤酵母和汉逊酵母转化效率比较
质粒pHanMOX-GFP和pHanMOX-rDNA用限制性内切酶AflⅡ线性化，质粒pHanMOX-HARS用限制性内切酶Nde Ⅰ线性化，于37℃水浴中酶切3小时，线性化产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收，测DNA浓度。分别取等量(其中含线性化质粒2～3微克)的线性化质粒pHanMOX-GFP、pHanMOX-rDNA和pHanMOX-HARS电转化毕赤酵母PichiaPinkTMStrain Ⅰ感受态细胞，涂含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板，30℃培养5-6天；再分别取等量的线性化质粒电转化汉逊酵母感受态细胞，涂板，37℃培养3-4天。待菌落长出后，统计平板上的菌落数，结果以每微克线性化DNA所转化出的菌落个数显示。分别进行三次独立转化实验，实验数据用GraphPad Prism5软件分析，以直方统计图显示。
③重组汉逊酵母质粒pHanMOX-GFP、pHanMOX-rDNA和pHanMOX-HARS经牛小肠碱性磷酸酶处理后和未经牛小肠碱性磷酸酶处理的质粒分别转化毕赤酵母和汉逊酵母的转化效率比较
质粒pHanMOX-GFP和pHanMOX-rDNA用限制性内切酶AflⅡ线性化，质粒pHanMOX-HARS用限制性内切酶Nde Ⅰ线性化，于37℃水浴中酶切3小时，线性化产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收，测DNA浓度。分别取一定量的线性化质粒(其中含线性化质粒5～6微克)，用牛小肠碱性磷酸酶37℃处理30分钟后回收，测DNA浓度。之后，分别取未经牛小肠碱性磷酸酶处理和经牛小肠碱性磷酸酶处理的等量(其中含线性化质粒2～3微克)线性化质粒电转化毕赤酵母PichiaPinkTMStrain Ⅰ感受态细胞，涂含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板，30℃培养5-6天；同样，线性化质粒电转化汉逊酵母感受态细胞，涂板，37℃培养3-4天。待菌落长出后，统计平板上的菌落数，结果以每微克线性化DNA所转化出的菌落个数显示。分别进行三次独立转化实验，实验数据用GraphPad Prism5软件分析，以直方统计图显示。
2)基于汉逊酵母核糖体DNA靶向的质粒pHanMOX-GFP在毕赤酵母中介导报告基因绿色荧光蛋白的表达
汉逊酵母质粒pHanMOX-GFP转化毕赤酵母诱导表达
质粒pHanMOX-GFP用限制性内切酶AflⅡ于37℃水浴中酶切3小时，线性化产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化回收，测DNA浓度。取20微升0.28μg/μl线性化质粒电转化毕赤酵母PichiaPinkTMStrain Ⅰ感受态细胞，涂板，30℃培养5-6天。
①博来霉素加压筛选整合质粒：
用牙签随机挑取平板上白色菌落(共75个)转移至含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板上30℃培养3-4天，之后相继对应转移至含0.5mg/mL博来霉素、含1mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板上，分别于30℃培养3-4天。挑取不同博来霉素浓度的酵母浸出粉胨葡萄糖平板各自10个单菌落进行表达。重组菌单菌落接种于5毫升甘油复合物缓冲液培养基中，30℃、280r/min过夜培养。24小时后，各取1毫升诱导前菌液保存，换为5毫升甲醇复合物缓冲液培养基进行诱导表达。诱导后24小时取样，检测绿色荧光蛋白表达。
②博来霉素不加压连续传代后再经博来霉素抗性筛选整合质粒：
随机从线性化质粒pHanMOX-GFP转化毕赤酵母PichiaPinkTMStrain Ⅰ平板上挑取5个单菌落于5毫升甘油复合物缓冲液培养基中，30℃、280r/min培养48小时后，各取50微升菌液涂布含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板(板1-5：第一次传代诱导)，同时，取菌液以1：10的比例转接至新鲜的5毫升甘油复合物缓冲液培养基中于30℃、280r/min培养48小时后，同样按之前的涂布、转接与培养操作，重复两个循环。获得板6-10(第二次传代)以及板11-15(第三次传代)。分别随机从各板中各挑取2个菌落进行诱导表达，诱导后24小时的样品进行绿色荧光蛋白检测。
3)考察毕赤酵母醇氧化酶1型启动子、翻译延伸因子1-α启动子以及汉逊酵母甲醇甲醇氧化酶启动子在毕赤酵母和汉逊酵母中表达绿色荧光蛋白的能力
①重组毕赤酵母质粒pPinkAOX1-GFP构建
用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ分别双酶切绿色荧光蛋白核苷酸片段扩增产物(编码绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，绿色荧光蛋白基核苷酸片段扩增引物见SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；核苷酸片段扩增绿色荧光蛋白基因以质粒pCDNA3-GFP为模板，扩增反应条件为：95℃，预变性5分钟，之后95℃，变性30秒；52℃，退火30秒；72℃，延伸1分钟；72℃，再延伸10分钟，共30个循环)和毕赤酵母质粒pPink-LC，酶切产物回收后，绿色荧光蛋白基因片段和载体pPink-LC按一定比例，以T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含0.1mg/mL氨苄西林美素的LB平板，筛选阳性克隆，酶切鉴定正确的质粒为pPinkAOX1-GFP。
用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ分别双酶切绿色荧光蛋白核苷酸片段扩增产物酶切反应体系为：绿色荧光蛋白核苷酸片段扩增产物0.08μg/μl 20微升，EcoR Ⅰ1微升，Kpn Ⅰ1.5微升，10×M buffer 5微升，双蒸水22.5微升。
用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ分别双酶切毕赤酵母质粒pPink-LC酶切反应体系为：pPink-LC 0.40μg/μl 20微升，EcoR Ⅰ1微升，Kpn Ⅰ1.5微升，10×M buffer 5微升，双蒸水22.5微升。
连接反应体系为：绿色荧光蛋白基因4微升，pPink-LC 1微升，10×T4buffer 1微升，T4连接酶0.5微升，双蒸水3.5微升；其中，绿色荧光蛋白基因片段和质粒载体pPink-LC的连接摩尔浓度比为1:3。
②重组毕赤酵母质粒pPinkTEF1-GFP构建
用限制性内切酶BglⅡ和EcoR Ⅰ双酶切消化载体所得片段PTEF1，与同样双酶切消化质粒pPinkAOX1-GFP所得载体以T4连接酶16℃连接过夜，转化、涂板，提取质粒酶切鉴定。
酶切质粒反应体系为：质粒0.433μg/μl15微升，BglⅡ1微升，EcoR Ⅰ0.7微升，10×H buffer 5微升，双蒸水28.3微升。
酶切质粒pPinkAOX1-GFP反应体系为：质粒pPinkAOX1-GFP 0.733μg/μl15微升，BglⅡ1微升，EcoR Ⅰ0.7微升，10×H buffer 5微升，双蒸水28.3微升。
连接反应体系为：PTEF1基因1微升，质粒pPink-GFP 1微升，10×T4buffer 1微升，T4连接酶1微升，双蒸水6微升；其中，PTEF1基因片段和质粒载体pPink-GFP的连接摩尔浓度比为1:3。
③重组毕赤酵母质粒pPinkMOX-GFP构建
用限制性内切酶BglⅡ和BamH Ⅰ双酶切质粒pHanMOX-GFP所得片段PMO X-GFP-MOXTT，与同样双酶切毕赤酵母质粒pPink-LC所得载体以T4连接酶16℃连接过夜，转化、涂含0.1mg/mL的氨苄西林霉素平板，提取质粒酶切鉴定。鉴定正确的质粒为pPinkMOX-GFP。
酶切质粒pHanMOX-GFP反应体系为：质粒pHanMOX-GFP 0.633μg/μl 15微升，BglⅡ1微升，BamH Ⅰ1微升，10×K buffer 4微升，双蒸水19微升。
酶切质粒pPink-LC反应体系为：质粒pPink-LC 0.733μg/μl 15微升，BglⅡ1微升，BamH Ⅰ1微升，10×K buffer 4微升，双蒸水19微升。
连接反应体系为：pMOX-GFP-MOXTT 4微升，质粒pPink-LC 1微升，10×T4buffer 1微升，T4连接酶0.5微升，双蒸水3.5微升；其中，pMOX-GFP-MOXTT片段和质粒载体pPink-LC的连接摩尔浓度比为1:3。
④重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-GFP构建
用限制性内切酶BglⅡ和BamH Ⅰ双酶切消化载体质粒pPinkAOX1-GFP，回收片段PAOX1-GFP-CYC1TT后与同样双酶切质粒pHanMOX-GFP所得载体以T4连接酶16℃连接过夜，转化、涂布含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板，提取质粒酶切鉴定。
酶切质粒pHanMOX-GFP反应体系为：质粒pHanMOX-GFP 0.25μg/μl 20微升，BglⅡ1微升，BamH Ⅰ1微升，10×K buffer 5微升，双蒸水23微升。
酶切质粒pPinkAOX1-GFP反应体系为：质粒pPinkAOX1-GFP 0.35μg/μl20微升，BglⅡ1微升，BamH Ⅰ1微升，10×K buffer 5微升，双蒸水23微升。
连接反应体系为：PAOX1-GFP-CYC1TT 2微升，质粒载体pHan 1.26微升，10×T4buffer 1微升，T4连接酶0.5微升，双蒸水5.24微升；其中，片段PAOX1-GFP-CYC1TT和质粒载体pHan的连接摩尔浓度比为1:3。
⑤重组汉逊酵母质粒pHanTEF1-GFP构建
用限制性内切酶BglⅡ和BamH Ⅰ双酶切质粒pPinkTEF1-GFP载体所得片段PTEF1-GFP-CYC1TT与同样双酶切质粒pHanMOX-GFP所得载体以T4连接酶16℃连接过夜，转化涂布含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板，提取质粒酶切鉴定。
酶切质粒pPinkTEF1-GFP反应体系为：质粒pPinkTEF1-GFP 0.467μg/μl15微升，BglⅡ1微升，BamH Ⅰ1微升，10×K buffer 4微升，双蒸水19微升。
酶切质粒pHanMOX-GFP反应体系为：质粒pHanMOX-GFP 0.333μg/μl 15微升，BglⅡ1微升，BamH Ⅰ1微升，10×K buffer 4微升，双蒸水19微升。
连接反应体系为：PTEF1-GFP-CYC1TT 2微升，质粒载体pHan 1.2微升，10×T4buffer 1微升，T4连接酶0.5微升，双蒸水5.3微升，其中，片段PT EF1-GFP-CYC1TT和质粒载体pHan的连接摩尔浓度比为1:3。
⑥利用毕赤酵母醇氧化酶1型启动子、翻译延伸因子1-α启动子以及汉逊酵母甲醇氧化酶启动子分别在毕赤酵母和汉逊酵母中表达绿色荧光蛋白。重组质粒pPinkAOX1-GFP、pPinkTEF1-GFP、和pPinkMOX-GFP经限制性内切酶Spe Ⅰ线性化，重组质粒pHanAOX1-GFP、pHanTEF1-GFP、和pHanMOX-GFP经限制性内切酶AflⅡ线性化，回收后，线性化质粒分别电转化毕赤酵母PichiaPinkTMStrain Ⅰ和汉逊酵母感受态细胞，涂含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板。随机从转化毕赤酵母质粒板子上各挑取10个单克隆于5毫升甘油复合物缓冲液培养基中培养，24小时后换为5毫升甲醇复合物缓冲液诱导表达。同样，随机从转化汉逊酵母质粒板子上各挑取10个单克隆于5毫升酵母浸出粉胨甘油培养基中培养，24小时后换为5毫升酵母浸出粉胨甲醇培养基诱导表达，取诱导后24小时菌液检测绿色荧光蛋白表达情况。
4)应用所构建的基于汉逊酵母核糖体DNA、自主复制序列和毕赤酵母醇氧化酶1型启动子的通用载体pHanAOX1-HPV16L1在毕赤酵母和汉逊酵母中穿梭表达人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1。
①重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1的构建，包括如下步骤：
步骤(1)，用限制性内切酶BglⅡ和BamH Ⅰ双酶切质粒pHanMOX-GFP，得到pHan载体；
步骤(2)，用限制性内切酶BglⅡ和BamH Ⅰ双酶切消化载体质粒pPinkAOX1-HPV16L1，回收片段PAOX1-HPV16L1-CYC1TT后与步骤(1)所得pHan载体以T4连接酶16℃连接过夜，转化并涂布含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板，提取质粒酶切鉴定，得到重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1，该质粒即为通用载体。
所述的步骤(1)中的酶切反应体系为质粒pHanMOX-GFP 0.25μg/μl 20微升，BglⅡ1微升，BamH Ⅰ1微升，10×K buffer 5微升，双蒸水23微升。
所述的步骤(2)中的酶切反应体系为质粒pPinkAOX1-HPV16L10.35μg/μl20微升，BglⅡ1微升，BamH Ⅰ1微升，10×K buffer 5微升，双蒸水23微升。
所述的连接反应体系为PAOX1-HPV16L1-CYC1TT片段2微升，pHan载体1.26微升，10×T4buffer 1微升，T4连接酶0.5微升，双蒸水5.24微升；其中，所述的PAOX1-HPV16L1-CYC1TT片段与pHan载体的连接摩尔浓度比为1:3。
所述的含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板包括以下物质：每升含胰蛋白胨10克，酵素提取物5克，氯化钠10克和琼脂粉15克；还包括终浓度为0.1mg/mL的卡那霉素。
所述的提取质粒酶切鉴定的具体操作方法为，质粒pHanAOX1-HPV16L1用限制性内切酶Sac Ⅰ于37℃水浴锅中酶切1小时候，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，显示于2470个碱基长度的地方有一条带则表明质粒构建正确，其中酶切鉴定反应体系为：质粒pHanAOX1-HPV16L10.36μg/μl 2微升，Sac Ⅰ0.2微升，10×L buffer 1微升，双蒸水6.8微升。
②重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1转化毕赤酵母和汉逊酵母指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达
重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1转化毕赤酵母和汉逊酵母来指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达，具体方法为：重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1经限制性内切酶AflⅡ消化后转化毕赤酵母，重组克隆子经过无博来霉素加压的连续培养后再经博来霉素加压筛选的过程，随机挑取6个单克隆重组子经甲醇诱导表达人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1蛋白。
指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达方法为：
汉逊酵母重组质粒pHanAOX1-HPV16L1经AflⅡ线性化后电转化毕赤酵母PinkTMStrain Ⅰ及汉逊酵母细胞，涂布含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板，分别于30℃和37℃培养；待菌落长出后，分别从四个平板上各挑取3个菌落进行非抗性压力下的连续传代，共重复转接培养5次，将第六次转接培养24小时后的菌液于含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板划线，培养后分别随机挑取各平板上的6个菌落进行诱导表达，诱导24小时后的酵母培养物进行蛋白免疫印迹检测人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达。
本发明所述编码绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列及上述的引物的序列如表1所示。
表1序列
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (9)
1.一种在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），用限制性内切酶BglⅡ和BamHⅠ双酶切质粒pHanMOX-GFP，得到pHan载体；
步骤（2），用限制性内切酶BglⅡ和BamHⅠ双酶切消化载体质粒pPinkAOX1-HPV16L1，回收片段PAOX1-HPV16L1-CYC1TT后与步骤（1）所得pHan载体以T4连接酶16℃连接过夜，转化并涂布含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板，提取质粒酶切鉴定，得到重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1，该质粒即为通用载体。
2.根据权利要求1所述的在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，所述的步骤（1）中的酶切反应体系为质粒pHanMOX-GFP 0.25μg/μl 20微升，BglⅡ 1微升，BamHⅠ1微升，10×K buffer 5微升，双蒸水23微升。
3.根据权利要求1所述的在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，所述的步骤（2）中的酶切反应体系为质粒pPinkAOX1-HPV16L1 0.35μg/μl 20微升，BglⅡ 1微升，BamHⅠ1微升，10×K buffer 5微升，双蒸水23微升。
4.根据权利要求1所述的在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，所述的连接反应体系为PAOX1-HPV16L1-CYC1TT片段 2微升，pHan载体1.26微升，10×T4 buffer 1微升，T4连接酶 0.5微升，双蒸水5.24微升；其中，所述的PAOX1-HPV16L1-CYC1TT片段与pHan载体的连接摩尔浓度比为1:3。
5.根据权利要求1所述的在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，所述的含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板包括以下物质：每升含胰蛋白胨10克，酵素提取物5克，氯化钠10克和琼脂粉15克；还包括终浓度为0.1mg/mL的卡那霉素，其溶剂为双蒸水。
6.根据权利要求1所述的在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，所述的提取质粒酶切鉴定的具体操作方法为，质粒pHanAOX1-HPV16L1用限制性内切酶SacⅠ于37°C水浴锅中酶切1小时候，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，显示于2470个碱基长度的地方有一条带则表明质粒构建正确，其中酶切鉴定反应体系为：质粒pHanAOX1-HPV16L1 0.36μg/μl 2微升，SacⅠ0.2微升，10×L buffer 1微升，双蒸水6.8微升。
7.权利要求1-6任意一项构建的重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1在指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达中的应用。
8.根据权利要求7所述的重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1在指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达中的应用，其特征在于，重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1转化毕赤酵母和汉逊酵母来指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达，具体方法为：重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1经限制性内切酶AflⅡ消化后转化毕赤酵母，重组克隆子经过无博来霉素加压的连续培养后再经博来霉素加压筛选的过程，随机挑取6个单克隆重组子经甲醇诱导表达人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1蛋白。
9.根据权利要求8所述的重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1在指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达中的应用，其特征在于，指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达方法为：
汉逊酵母重组质粒pHanAOX1-HPV16L1经AflⅡ线性化后电转化毕赤酵母PinkTM StrainⅠ及汉逊酵母细胞，涂布含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板，分别于30℃和37℃培养；待菌落长出后，分别从四个平板上各挑取3个菌落进行非抗性压力下的连续传代，共重复转接培养5次，将第六次转接培养24小时后的菌液于含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板划线，培养后分别随机挑取各平板上的6个菌落进行诱导表达，诱导24小时后的酵母培养物进行蛋白免疫印迹检测人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达。
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| CN103215302A (zh) * | 2012-01-21 | 2013-07-24 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv18 l1蛋白的方法 |
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