CN102933596B - 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。还提供包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

Description

具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

涉及序列表

本申请含有计算机可读形式的序列表，该计算机可读形式通过提述并入本文。

涉及生物材料的保藏

本申请包含对于生物材料保藏的引用，所述保藏通过提述并入本文。对于其完整信息，参见说明书“生物材料保藏”部分。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法，和本发明的葡糖淀粉酶的用途，以及使用本发明的葡糖淀粉酶产生液化、糖化和发酵产物的工艺。本发明还涉及包含本发明的葡糖淀粉酶的组合物。

相关领域描述

葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶由几种丝状真菌和酵母产生，其中来自曲霉属(Aspergillus)的那些在商业上最为重要。

葡糖淀粉酶(等同于淀粉葡糖苷酶，AMG)主要作为糖化酶出售予多种工业，包括酿造、淀粉和燃料工业。在淀粉和燃料工业中，商业上使用葡糖淀粉酶将已经由α-淀粉酶部分水解的淀粉材料转化为葡萄糖。然后可使用发酵生物将葡萄糖直接或间接地转化为发酵产物。商业性发酵产物的实例包括醇(例如乙醇，甲醇，丁醇，1,3-丙二醇)，有机酸(例如柠檬酸，乙酸，衣康酸，乳酸，葡糖酸，葡糖酸盐，乳酸，琥珀酸，2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H₂和CO₂)，和更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B₁₂，β-胡萝卜素)；激素，和其他难以合成产生的化合物。发酵工艺亦常用于可饮用醇类(例如啤酒和葡萄酒)，乳制品(例如在酸奶和乳酪的生产中)，皮革，饮料和烟草工业。

终产物亦可为糖浆。例如，终产物可为葡萄糖，但亦可例如由葡萄糖异构酶转化为果糖或由几乎等量的葡萄糖和果糖构成的混合物。该混合物，或进一步富集果糖的混合物，是在整个世界都商业化的最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。

公开了两种形式的来自草酸青霉(Penicillium oxalicum)的葡糖淀粉酶的纯化和特性(Yoshiki YAMASAKI,Agric.Biol.Chem.,41(5),755~762,1977)。这两种葡糖淀粉酶均在高至55℃稳定，但在60℃左右的温度，葡糖淀粉酶活性显著下降。这两种形式的葡糖淀粉酶的序列并未公开于该文献，甚至较迟的文献中。

发明概述

本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟序列具有优选至少61.5%，更优选至少63%，更优选至少65%，更优选至少68%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，并且甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，97%，98%，99%或100%同一性；

(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少低严格条件，更优选至少中等严格条件，甚至更优选至少中等-高严格条件，最优选至少高严格条件，并且甚至最优选至少非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少61.5%，更优选至少63%，更优选至少65%，更优选至少68%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，并且甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，97%，98%，99%或100%同一性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽包含一个或多个(例如几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有葡糖淀粉酶活性的片段。

本发明亦涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明的多肽的核苷酸序列。

本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，并涉及产生具有葡糖淀粉酶活性的多肽的方法。

本发明亦涉及用本发明的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。

本发明亦涉及包含本发明的多肽的组合物。

本发明亦涉及本发明的多肽用于液化、糖化和/或发酵工艺，优选在淀粉转化中的用途，涉及本发明的多肽用于生产糖浆、饮料和/或发酵产物的用途，并且涉及本发明的多肽用于酿造的用途。

本发明亦涉及用于从含淀粉材料产生液化、糖化和/或发酵产物的工艺，其包括下述步骤：

用本发明的多肽处理含淀粉材料。

附图说明

图1显示纯化的本发明的草酸青霉葡糖淀粉酶样品的SDS-PAGE电泳。泳道1：标志物(97、66、45、30、20.1和14.4kDa)；泳道2：本发明的草酸青霉葡糖淀粉酶在纯化前的上清；泳道3：本发明的草酸青霉葡糖淀粉酶。

本发明的草酸青霉葡糖淀粉酶的多核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和2。

发明详述

本发明的一个目标是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸，优选地，提供具有高度热稳定性的具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。

定义

葡糖淀粉酶活性：术语“葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，3.2.1.3)活性”在本文中定义为催化从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶活性。葡糖淀粉酶活性可以以AGU单位测量。参见下文“材料和方法”部分中的“葡糖淀粉酶活性”部分。

本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的葡糖淀粉酶活性的至少20%，优选至少40%，更优选至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，和甚至最优选至少100%。

分离的多肽：术语“分离的”和“纯化的”意指从与其天然地相结合的至少一种组分移去的多肽或多核苷酸。举例而言，多肽如通过SDS-PAGE确定，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，和至少90%纯，而多核苷酸如通过琼脂糖电泳确定，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文意指为以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至21是信号肽的SignalP(Nielsen等,1997,Protein Engineering 10:1-6)程序，所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸22至616。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有葡糖淀粉酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个方面，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP(Nielsen等,1997,见上)程序，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸64至1848。

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOS S:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,TrendsinGenetics 16:276-277)(优选3.0.0版或更高版本)的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开启罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等,2000,见上文)(优选3.0.0版或更高版本)的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开启罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL (NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

一种来自黑曲霉(Aspergillus niger)的具有葡糖淀粉酶活性的多肽(uniprot:P69328)(Svensson,B.Larsen,K.Gunnarsson,A.;"Characterization of aglucoamylase G2 from Aspergillus nige r.";Eur.J.Biochem.154:497-502(1986))与本发明的SEQ ID NO:2的草酸青霉葡糖淀粉酶48.1%相同。

一种来自Hormoconis resinae的具有葡糖淀粉酶活性的多肽(UNIPROT:Q03045)(Joutsjoki,V.V.Torkkeli,T.K.;"Glucoamylase P gene ofHormoconis resinae:molecular cloning,sequencing  and  introduction  intoTrichoderma reesei.";FEMS Microbiol.Lett.78:237-243(1992))与本发明的SEQ ID NO:2的草酸青霉葡糖淀粉酶51.68%相同(无缺口)。

同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为用SEQ ID NO:2的草酸曲霉[大肠杆菌(E.coli)DSM 23123]葡糖淀粉酶或其成熟多肽，在tfasty检索(Pearson,W.R.,1999,于Bioinformatics Methods and Protocols.,S.Misener和S.A.Krawetz编,185-219页)中给出小于0.001的E值(或预期分数)的预测蛋白质。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文中定义为从SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有葡糖淀粉酶活性。在一个方面，片段含有至少473个氨基酸残基，例如SEQ ID NO:2的氨基酸28至500(本发明的GH151域)，更优选至少575个氨基酸残基，例如，SEQ ID NO:2的氨基酸28至500(本发明的GH151域)和氨基酸514至615(本发明的CBM20x域，或其同源序列。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其同源序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽片段。在一个方面，亚序列含有SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少1419个核苷酸，例如编码本发明的GH151域(核苷酸82-1500)的核苷酸，更优选至少其1725个核苷酸，例如编码本发明的GH151域和CBM20x (核苷酸1540-1845)的核苷酸。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种(例如几个)可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8％，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92%纯，更优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，甚至更优选至少98%纯，最优选至少99%纯，并且甚至最优选至少99.5%纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式，即，所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为可通过逆转录从自真核细胞获得的成熟的、剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺乏可存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。该起始的、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其经历一系列步骤，最后作为成熟的、剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称作剪接的过程去除内含子序列。因此，来源于mRNA的cDNA不含任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，其以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段。所述核酸构建体亦可为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的多肽的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(例如几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(例如几个)氨基酸侧链的置换。

人工变体：当用于本文，术语“人工变体”意指由表达SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的修饰的核苷酸序列，或其同源序列的生物所产生的，具有葡糖淀粉酶活性的多肽。所述修饰的核苷酸序列是通过人为介入修饰SEQ IDNO:1中公开的多核苷酸序列或其同源序列获得的核苷酸序列。

具有葡糖淀粉酶活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽(在下文中称为“同源多肽”)，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有优选至少61.5%，更优选至少63%，更优选至少65%，更优选至少68%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的序列同一性程度。在一个优选的方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差九个氨基酸，优选相差八个氨基酸，优选相差七个氨基酸，优选相差六个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其等位变体。在一个优选的方面，本发明的多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽。在另一个优选的方面，本发明的多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸22至616或其等位变体，或它们具有葡糖淀粉酶活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽的组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有葡糖淀粉酶活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽的组成为SEQID NO:2的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽的组成为SEQ IDNO:2的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽的组成为SEQ ID NO:2的氨基酸22至616或其等位变体，或它们具有葡糖淀粉酶活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽的组成为SEQ ID NO:2的氨基酸22至616。在另一个方面，所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸22至616。

在第二个方面，本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选非常低严格条件，更优选低严格条件，更优选中等严格条件，更优选中等-高严格条件，甚至更优选高严格条件，和最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,MolecularCloning，ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。

SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针是至少100个核苷酸长度。例如，所述核酸探针的长度可为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。可使用甚至更长的探针，例如长度为优选至少600个核苷酸，更优选至少800个核苷酸，甚至更优选至少1000个核苷酸，甚至更优选至少1500个核苷酸，或最优选至少1800个氨基酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。

因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至并且固定于硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料。为了鉴定与SEQ ID NO:1，或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用于Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列；其全长互补链；或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸64至1848。在另一个优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。在另一个优选的方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM 23123中的质粒AMG 1中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。在另一个优选的方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM 23123中的质粒AMG 1中包含的成熟多肽编码区。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸82至1500，核苷酸1504至1845。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，以及对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺，对于中等和中-高严格性为35%的甲酰胺，或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2%SDS优选在45℃(非常低严格性)，更优选在50℃(低严格性)，更优选在55℃(中等严格性)，更优选在60℃(中等-高严格性)，甚至更优选在65℃(高严格性)，并且最优选在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy的计算法(1962,Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 48:1390)计算的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5%NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodiummonobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及由多核苷酸编码的具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多核苷酸包含或组成为如下核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少61.5%，更优选至少63%，更优选至少65%，更优选至少68%,更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性程度，并编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。参见下文“多核苷酸”部分。

在第四个方面，本发明涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(例如几个)氨基酸的人工变体。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(polyhistidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了用20个标准氨基酸，也可用非标准氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代野生型多肽中的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3,3-二甲基脯氨酸。

或者，氨基酸变化可为这样的性质，其使得所述多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸变化可改善多肽的热稳定性，改善其底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即葡糖淀粉酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,1992,Science 255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochem.30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；Ner等,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速确定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入可为最多10个，优选最多9个，更优选最多8个，更优选最多7个，更优选最多6个，更优选最多5个，更优选最多4个，甚至更优选最多3个，最优选最多2个，并且甚至最优选最多1个。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合蛋白，就切割所述位点，从融合蛋白质释放具有葡糖淀粉酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology 13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology 9:378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过因子Xa蛋白酶切割(Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等,1995,Biotechnology 13:982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过Genenase I切割(Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens,2003,Drug Discovery World 4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln后通过TEV蛋白酶切割(Stevens,2003，见上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens,2003,见上文)。

在一个优选的方面，本发明的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其编码具有葡糖淀粉酶活性的片段的亚序列。

在一个优选的方面，本发明的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。

在一个优选的方面，本发明的多肽由质粒AMG 1中包含的多核苷酸编码，所述质粒包含于大肠杆菌DSM 23123。

在一个优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸64至1848。

具有葡糖淀粉酶活性的多肽的来源

本发明的具有葡糖淀粉酶活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明的具有葡糖淀粉酶活性的多肽可为真菌多肽。举例而言，所述多肽可为酵母多肽，如具有葡糖淀粉酶活性的酵母多肽如假丝酵母属(Candida)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，毕赤酵母属(Pichia)，酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或更优选具有葡糖淀粉酶活性的丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳属(Cyphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有葡糖淀粉酶活性的Acremoniumcellulolyticus、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Cgrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chryssosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰色腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、托姆青霉(Penicillium thomii)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、Thielaviaachromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、Thielavia microspora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在更优选的方面，所述多肽是具有葡糖淀粉酶活性的草酸青霉多肽。在最优选的方面，所述多肽是具有葡糖淀粉酶活性的草酸青霉多肽，例如，包含SEQID NO:2的成熟多肽的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的身份(identity)。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸，就能够通过使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有葡糖淀粉酶活性的多肽的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成。

在一个优选的方面，本发明的核苷酸序列包含或组成为SEQ ID NO:1。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含或组成为大肠杆菌DSM 23123中包含的质粒AMG 1中所含的多核苷酸序列。在另一个优选的方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，成熟多肽编码序列为SEQ ID NO:1的核苷酸64至1848。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含大肠杆菌DSM 23123中包含的质粒AMG 1中包含的成熟多肽编码序列或由所述成熟多肽编码序列组成。本发明还涵盖编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，所述核苷酸序列由于遗传密码的简并性与SEQ ID NO:1或其成熟多肽编码序列有差异。本发明还涉及SEQ ID NO:1的亚序列，其编码SEQ ID NO:2的具有葡糖淀粉酶活性的片段。

本发明亦涉及突变体多核苷酸，其包含或组成为有至少一个突变的SEQID NO:1的成熟多肽编码序列，其中所述突变体核苷酸序列编码SEQ ID NO:2的成熟多肽。

所述至少一个突变可为一个或多个(例如一个或几个)突变。优选地，所述至少一个突变是最多10个，优选最多9个，更优选最多8个，更优选最多7个，更优选最多6个，更优选最多5个，更优选最多4个，甚至更优选最多3个，最优选最多2个，并且甚至最优选最多1个突变。优选所述突变为核苷酸取代、缺失和/或插入。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从青霉属菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此例如可为所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含或组成为如下核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有优选至少61.5%，更优选至少63%，更优选至少65%，更优选至少68%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性程度，并编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等,1991,Protein Expression and Purification 2:95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。可以根据本领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells,1989,见上文)来鉴定对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的葡糖淀粉酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，deVos等,1992,见上文；Smith等,1992,见上文；Wlodaver等,1992,见上文)。

在一个优选的方面，本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，其在优选非常低严格条件，更优选低严格条件，更优选中等严格条件，更优选中等-高严格条件，甚至更优选高严格条件，和最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或其等位变体和亚序列(Sambrook等,1989,见上文)，如本文中所定义。

在一个优选的方面，本发明还涉及通过下述方法获得的分离的多核苷酸：(a)将DNA群体在优选非常低严格条件，更优选低严格条件，更优选中等严格条件，更优选中-高严格条件，甚至更优选高严格条件，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(例如几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Asperillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其包含在曲霉属(Aspergilli)中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其包含在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，即由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C (CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，当其转录时，是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Molecular Cellular Biology 15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相连的信号肽，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。

在一个优选的方面，所述信号肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至21。在另一个优选的方面，所述信号肽编码序列包含或组成为SEQ ID NO:1的1至63。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基端的前肽。所得多肽称作酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均存在于在多肽的氨基端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽氨基端端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸，优选进一步包含启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(例如几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(例如几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

用于酵母宿主细胞的合适标记为ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1，和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS 1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Research 15:9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有所述多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的核酸构建体。将包含本发明多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属(Nacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和脲原体属(Ureaplasma)。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Molecular General Genetics 168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,Journal of Bacteriology 81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology 56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,Journal of Bacteriology 169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionaryof The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上文)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

在一个甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属细胞(Yarrowia)。

在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)细胞。在另一个优选的方面，酵母宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞。在另一个优选的方面，酵母宿主细胞是糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)细胞。在另一个优选的方面，酵母宿主细胞是道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)细胞。在另一个优选的方面，酵母宿主细胞是克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)细胞。在另一个优选的方面，酵母宿主细胞是诺地酵母(Saccharomyces norbensis)细胞。在另一个优选的方面，酵母宿主细胞是卵形酵母细胞(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusariumvenenatum)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑曲霉(Aspergillus niger)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是Chrysosporium lucknowense细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是镶片镰孢(Fusariumvenenatum)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是里氏木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182-187,AcademicPress,Inc.,New York；Ito等,1983,Journal of Bacteriology 153:163；和Hinnen等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是青霉属(Penicillium)的细胞。在一个更优选的方面，所述细胞是草酸青霉(Penicillium oxalicum)。在一个最优选的方面，所述细胞是草酸青霉，其包含大肠杆菌DSM 23123中含有的质粒AMG 1中的葡糖淀粉酶基因。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码本发明的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，该多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测所述多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989)。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有助于多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其经多核苷酸转化，所述多核苷酸编码本发明具有葡糖淀粉酶活性的多肽，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模式生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个(例如几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定整合了该表达构建体的宿主细胞有用的选择性标记，和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,Plant Physiology 86:506所述。

对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18:675-689；Zhang等,1991,Plant Cell 3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant and CellPhysiology 39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,Journal of Plant Physiology152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plantand Cell Physiology 39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,Plant Physiology 102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Molecular Biology 26:85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Molecular and general genetics 248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Molecular Biology 22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science 244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535；Shimamoto等,1989,Nature 338:274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Molecular Biology 19:15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其他的转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant Journal 2:275-281；Shimamoto,1994,Current OpinionBiotechnology 5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology 10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,PlantMolecular Biology 21:415-428所描述的。其它依照本公开使用的转化方法包括描述于美国专利号6,395,966和7,151,204中的那些(两者均通过全文提述并入本文)。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有葡糖淀粉酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

除了用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有本发明的构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。举例而言，可将编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽或其部分的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后裔(offspring)。此种后代可包含依据本发明制备的DNA构建体，或依据本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交导致本发明的转基因通过将起始种系与包含本发明的转基因的供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。此类步骤的非限制性实例进一步阐述于美国专利7,151,204号。

考虑包含本发明的具有葡糖淀粉酶活性的多肽的植物包括通过回交转化的过程生成的植物。举例而言，本发明的植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。

可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后代中提供有关良种种质相对程度的数据。举例而言，当具有期望性状但除此之外(otherwise)具有非农艺学期望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有该目标性状，还具有相对较大比例期望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽，并优选包含载体和/或赋形剂的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的葡糖淀粉酶活性，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。优选地，所述组合物配制为提供期望的特征如低色泽，低气味，和可接受的储藏稳定性。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶水解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。其他的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包括于所述组合物中的多肽稳定化。

下文给出了本发明的多肽或多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。

葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的组合

根据本发明的该方面，本发明的葡糖淀粉酶可与α-淀粉酶组合。优选地，酸性α-淀粉酶对葡糖淀粉酶的比例是0.05至5.0AFAU/AGU。更优选地，酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性之间的比例为至少0.10，至少0.15，至少0.20，至少0.25，至少0.30，至少0.35，至少0.40，至少0.45，至少0.50，至少0.55，至少0.60，至少0.65，至少0.70，至少0.75，至少0.80，至少0.85，至少0.90，至少0.95，至少1.00，至少1.05，至少1.10，至少1.20，至少1.30，至少1.40，至少1.50，至少1.60，至少1.70，至少1.80，至少1.85，或甚至至少1.90AFAU/AGU。然而酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性之间的比例应优选小于4.50，小于4.00，小于3.50，小于3.00，小于2.50，或甚至小于2.25AFAU/AGU。

上述组合物适用于液化、糖化和/或发酵工艺，优选用于淀粉转化，特别是用于产生糖浆和发酵产物，如乙醇。

下文给出了本发明的多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。

用途

本发明亦涉及本发明的多肽在液化、糖化和/或发酵工艺中的用途。所述多肽可用于单个工艺，例如，用于液化工艺、糖化工艺或发酵工艺。所述多肽亦可用于工艺的组合，例如用于液化和糖化工艺，用于液化和发酵工艺，或用于糖化和发酵工艺，优选涉及淀粉转化。

在本发明的一个优选的方面，所述液化、糖化和/或发酵工艺包括顺序或同时进行的液化和糖化工艺。

在常规酶液化工艺中，添加热稳定性α-淀粉酶，而长链淀粉降解为支化和线性的较短单元(麦芽糊精)，但不添加葡糖淀粉酶。本发明的葡糖淀粉酶高度热稳定，因此将该葡糖淀粉酶添加于液化工艺是有利的。本发明的葡糖淀粉酶当与α-淀粉酶在液化工艺中组合时具有协同作用。在常规糖化过程中，在液化工艺过程中生成的糊精进一步受水解以产生低分子糖DP1-3，其可由发酵生物代谢。所述水解通常使用葡糖淀粉酶进行，或者除了葡糖淀粉酶之外，可使用α-葡糖苷酶和酸性α-淀粉酶。

当应用本发明的葡糖淀粉酶，潜在地，与α-淀粉酶组合用于液化和/或糖化工艺中，特别是用于同时液化和糖化工艺中时，所述工艺可以以较高温度进行。通过将所述液化和/或糖化工艺在较高温度进行，所述工艺可在较短期限内进行，或者所述工艺可使用较低的酶剂量进行。此外，当将液化和/或糖化工艺以较高温度进行时，微生物污染的风险减少。

含淀粉材料的转化

本发明提供了本发明的葡糖淀粉酶用于从淀粉产生葡萄糖等的用途。一般而言，所述方法包括单独使用本发明的葡糖淀粉酶或在α-淀粉酶存在下使用本发明的葡糖淀粉酶来部分水解前体淀粉的步骤。

本发明的葡糖淀粉酶亦可与仅水解包含至少四个糖基残基的分子中的α-(1,6)-葡糖苷键的酶组合使用。优选地，本发明的葡糖淀粉酶与普鲁兰酶或异淀粉酶组合使用。异淀粉酶和普鲁兰酶在淀粉脱支中的用途，这些酶的分子性质，和这些酶与葡糖淀粉酶一起的潜在用途描述于G.M.A.van Beynum等,Starch Conversion Technology,Marcel Dekker,New York,1985,101-142。

在一个进一步的方法，本发明涉及本发明的葡糖淀粉酶在淀粉转化中的用途。此外，本发明的葡糖淀粉酶可用于包括连续糖化工艺的连续淀粉转化工艺。

糖浆、饮料和/或发酵产物的生产

本发明的葡糖淀粉酶的用途包括将淀粉转化为例如糖浆饮料，和/或发酵产物，包括乙醇。

本发明亦提供了使用本发明的葡糖淀粉酶从含淀粉材料产生糖浆，如葡萄糖等的工艺。合适的起始材料例示于“含淀粉材料”部分。一般而言，所述工艺包括下述步骤：在单独的本发明葡糖淀粉酶或其与α-淀粉酶的组合的存在下部分或完全地水解含淀粉材料(液化和/或糖化)以从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原端释放葡萄糖。

本发明的葡糖淀粉酶亦可以以固定化的形式使用。这适用于并常常用于产生特种糖浆如麦芽糖糖浆，以及与果糖糖浆例如高果糖糖浆(HFS)相关的寡糖的萃余液流中。

本发明的葡糖淀粉酶亦可用于产生多种饮料，如但不限于，番茄、马铃薯、甜薯(Chinese potato)、甘薯和/或南瓜的饮料。

发酵产物

术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物的发酵工艺的工艺产生的产物。根据本发明涵盖的发酵产物包括醇(例如，阿拉伯糖醇(arabinitol)、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；烷烃(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)；烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO))；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素，B₁₂，β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选的方面，所述发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即，可饮用的中性酒；或工业乙醇或用于可饮用醇类工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的产物。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porters)、陈贮啤酒(lagers)、苦味酒(bitters)、麦芽酒(maltliquors)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。使用的优选发酵工艺包括醇发酵工艺，其是本领域公知的。优选的发酵工艺为厌氧发酵工艺，其是本领域公知的。

酿造

本发明的葡糖淀粉酶高度热稳定，并因此其可用于需要高温下淀粉水解的工业。举例而言，本发明的葡糖淀粉酶可用于酿造工业。本发明的葡糖淀粉酶以有效量添加，其可方便地由本领域技术人员确定。

液化、糖化和/或发酵产物的产生

在此方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生液化、糖化和/或发酵产物的工艺，包括下述步骤：用本发明的多肽处理含淀粉材料。

合适的含淀粉起始材料列于下文“含淀粉材料”部分。涵盖的酶列于下文“酶”部分。优选地，本发明的工艺包括用单独的本发明多肽或其与α-淀粉酶一同处理含淀粉材料。优选地，用本发明的多肽(单独或在α-淀粉酶存在下)处理含淀粉材料的步骤是在40℃至100℃，优选65℃至90℃，更优选80℃至85℃进行，和/或在2.0至7.0的pH，优选pH 4.0至pH 6.0，更优选pH 4.5至pH 5.5进行。

本发明的液化和/或糖化产物是糊精，或低分子糖例如DP1-3。在液化工艺中，淀粉至葡萄糖、糊精和/或低分子量糖的转化通过添加本发明的葡糖淀粉酶而增强。发酵产物如乙醇可任选地在发酵之后例如通过蒸馏来回收。发酵优选在酵母，优选在酵母属的菌株的存在下进行。合适的发酵生物列于下文的“发酵生物”部分。

在发酵产物特别是乙醇的产生中，最广泛使用的工艺是同时糖化和发酵(SSF)工艺，其中可将发酵生物如酵母，和糖化酶一同添加。SSF通常在25℃至40℃，如29℃至35℃，如30℃至34℃，如大约32℃的温度进行。根据本发明在发酵过程中可将温度调高或调低。本发明的葡糖淀粉酶当用于液化工艺时可良好地增强乙醇产生。本发明的葡糖淀粉酶当与α-淀粉酶一同添加时，可加速发酵速率，且亦可增加最终乙醇效价。

常规糖化可使用本领域公知的条件进行。举例而言，完整的糖化工艺可持续高至约24至72小时，然而，通常仅在30至65℃，通常约60℃的温度进行通常40至90分钟的预糖化，接着在同时糖化和发酵(SSF)的发酵过程中进行完全糖化。糖化通常在30至65℃，通常大约60℃的温度进行。本发明的葡糖淀粉酶高度热稳定，因此本发明的预糖化和/或糖化可在与常规预糖化和/或糖化相比更高的温度进行。在一个实施方案中，本发明的工艺包括在同时糖化和发酵(SSF)工艺之前预糖化含淀粉材料。预糖化可在高温进行(例如50至85℃，优选60至75℃)，然后移至SSF。含淀粉材料可通过减少粒径，优选通过湿法磨制，减少至0.05至3.0mm，优选0.1至0.5mm来制备。在对其进行本发明的工艺之后，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，优选至少99%，并且甚至更优选100%的含淀粉材料的干固形物转化为可溶性淀粉水解物。

在一个实施方案中，本发明的工艺包括在本发明的葡糖淀粉酶的存在下糖化含淀粉材料，例如DE11(右旋糖当量11)麦芽糊精，以产生糖，其可由合适的发酵生物发酵为期望的发酵产物。

所述发酵工艺可进行1至250小时，优选25至190小时，更优选30至180小时，更优选40至170小时，甚至更优选50至160小时，仍更优选50至130小时的期间。

可制备含淀粉材料如粒状淀粉的浆料，其具有10至55wt%含淀粉材料的干固形物(DS)，优选25至40wt%干固形物，更优选30至35wt%干固形物。所述浆料可含有水和/或工艺水(process water)，如釜馏物(逆流(backset))、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或其他发酵产物设备(plant)的工艺水。

在对其进行本发明的工艺之后，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，优选至少99%，并且甚至更优选100%的含淀粉材料的干固形物转化为可溶性淀粉水解物。

含淀粉材料

根据本发明，可使用任何合适的含淀粉的起始材料，包括粒状淀粉。所述起始材料通常基于期望的发酵产物而选择。适用于本发明工艺的含淀粉的起始材料的实例包括块茎、根、茎、全谷粒、玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、树薯、高粱、稻、豌豆(pea)、豆(bean)或甘薯，或它们的组合，或谷类，含糖的原材料如糖蜜，果物材料，甘蔗或糖甜菜，马铃薯，以及含纤维素材料，如木质或植物残余物，或其组合。涵盖蜡质和非蜡质两者类型的玉米和大麦。

发酵生物

“发酵生物”指任何适用于发酵工艺并能够产生期望的发酵产物的生物，包括细菌和真菌生物。特别合适的发酵生物能够将糖如葡萄糖或麦芽糖直接或间接发酵(即转化)为期望的发酵产物。发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种，特别是酿酒酵母的菌株。商业上可获得的酵母包括例如Red Star^TM/Lesaffre Ethanol Red (可从Red Star/Lesaffre,USA获得)，FALI (可从Burns Philp Food Inc.,USA的分支机构Fleischmann’s Yeast获得)，SUPERSTART(可从Alltech获得)，GERT STRAND(可从Gert Strand AB,Sweden获得)和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。

酶

葡糖淀粉酶

葡糖淀粉酶优选为本发明的葡糖淀粉酶。然而如上所述，本发明的葡糖淀粉酶亦可与其他葡糖淀粉酶组合。

葡糖淀粉酶可以以0.001至10AGU/g DS，优选0.01至5AGU/g DS，如大约0.05，0.1，0.3，0.5，1或2AGU/g DS，特别是0.05至0.5AGU/g DS或0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/g DS的量添加。

α-淀粉酶

根据本发明α-淀粉酶可为任何来源的。优选真菌或细菌来源的α-淀粉酶。

在一个优选的方面，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加、在pH范围3至7，优选3.5至6，或更优选4至5具有最优活性的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。

细菌α-淀粉酶

根据本发明，细菌α-淀粉酶优选来源于芽孢杆菌属。

在一个优选的方面，所述芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，但亦可来源于其他芽孢杆菌菌种。涵盖的α-淀粉酶的具体实例包括示于WO 99/19467中SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(BLA)，示于WO 99/19467中SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(BAN)，和示于WO 99/19467中SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG)。在一个本发明的实施方案中，所述α-淀粉酶为分别与WO 99/19467中示为SEQ ID NO:1、2、3、4或5的任何序列具有至少60%，优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性的同一性程度的酶。

所述芽孢杆菌属α-淀粉酶亦可为变体和/或杂合体，特别是WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355(所有文献通过提述并入本文)任一篇中所描述的。具体而言，涵盖的α-淀粉酶变体公开于美国专利号6,093,562、6,297,038或美国专利号6,187,576(通过提述并入本文)，并包括在位置179至182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG α-淀粉酶)变体，所述缺失优选为WO 1996/23873中公开的双缺失(参见，例如第20页第1-10行，通过提述并入本文)，优选与WO 99/19467中公开的SEQ ID NO:3中所列的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO 99/19467(通过提述并入本文)中SEQ ID NO:3的编号方式的氨基酸179和180的缺失。甚至更优选的是与WO 99/19467中公开的SEQ IDNO:3中所列的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于Δ(181-182)的双缺失，并进一步包含N193F取代(亦表示为I181*+G182*+N193F)的芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。

所述α-淀粉酶亦可为产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽水解酶，EC 3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉(amylopectin)水解为α-构型的麦芽糖。一种来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖α-淀粉酶商业上可从Novozymes A/S,Denmark获得。产麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628，其通过提述并入本文。

细菌杂合α-淀粉酶

具体涵盖的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示为WO 99/19467中的SEQ ID NO:4)的445个C端氨基酸残基和来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(示为WO 99/194676中的SEQ ID NO:3)的37个N端氨基酸残基，并具有一个或多个，特别是所有的下述取代：

G48A+T49I+G 107A+H 156Y+A 181T+N 190F+I201F+A209V+Q264S (使用地衣芽孢杆菌编号)。亦优选具有一个或多个下述突变(或其他芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中对应的突变)的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S，和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选缺失E178和G179(使用WO 99/19467的SEQ IDNO:5的编号方式)。

真菌α-淀粉酶

真菌酸性α-淀粉酶包括来源于曲霉属菌株的酸性α-淀粉酶，如米曲霉、黑曲霉或川地曲霉α-淀粉酶。

优选的酸性真菌α-淀粉酶是Fungamyl样α-淀粉酶，其优选来源于米曲霉的菌株。在本公开中，术语“Fungamyl样α-淀粉酶”指与示于WO 96/23874的SEQID NO:10的氨基酸序列的成熟部分呈现高同一性，即高于70%，高于75%，高于80%，高于85%，高于90%，高于95%，高于96%，高于97%，高于98%，高于99%或甚至100%同一性的α-淀粉酶。

另一种优选的酸性α-淀粉酶来源于黑曲霉菌株。在一个优选的方面，所述酸性真菌α-淀粉酶是来自黑曲霉、作为“AMYA ASPNG”以初级登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库并更具体描述于WO 89/01969(实施例3)的α-淀粉酶。所述酸性黑曲霉酸性α-淀粉酶在WO 2004/080923(Novozymes)(通过提述并入本文)亦显示于SEQ ID NO:1。还涵盖了所述酸性真菌淀粉酶与WO 2004/080923中的SEQ ID NO:1具有至少70%同一性，如至少80%或甚至至少90%同一性，如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的变体。

在一个优选的方面，所述α-淀粉酶来源于川地曲霉，并公开于Kaneko等,J.Ferment.Bioeng.81:292-298(1996)“Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase fromAspergillus kawachii"；并进一步作为EMBL:#AB008370公开。

所述真菌酸性α-淀粉酶亦可为包含糖结合模块(CBM)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变体。在一个实施方案中，所述野生型酸性α-淀粉酶来源于川地曲霉的菌株。

酸性α-淀粉酶可根据本发明以0.01至10AFAU/g DS，优选0.01至5AFAU/gDS，特别是0.02至2AFAU/g DS的量添加。

真菌杂合α-淀粉酶

在一个优选的方面，所述真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括WO 2005/003311或美国专利公开号2005/0054071(Novozymes)或美国专利申请号2006/0148054(Novozymes)中公开的那些，其通过提述并入本文。杂合α-淀粉酶可包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)和任选的接头。

涵盖的杂合的α-淀粉酶的具体实例包括但不限于美国专利申请号2006/0148054中公开的那些，其包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)SBD的Fungamyl变体(美国申请号2006/0148054中的SEQ ID NO:100)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(美国申请号2006/0148054中的SEQ ID NO:101)，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(美国申请号2006/0148054中的SEQ ID NO:102)；以及具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和CBM的细小根毛霉α-淀粉酶(国际公开号WO2007/144424中的SEQ ID NO:2)。

涵盖的杂合的α-淀粉酶的其他具体实例包括但不限于公开于美国专利公开号2005/0054071中的那些，包括公开于第15页表3中的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。

商业性α-淀粉酶产品

优选的包含α-淀粉酶的商业性组合物包括来自DSM(Gist Brocades)的MYCOLASE；BAN^TM，TERMAMYL^TM SC，FUNGAMYL^TM，LIQUOZYME^TMX和SAN^TM SUPER，SAN^TM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASE^TML-40,000，DEX-LO^TM，SPEZYME^TM FRED，SPEZYME^TM AA，SPEZYME^TMEthyl，以及SPEZYME^TM DELTA AA(Genencor Int.)。

材料和方法

葡糖淀粉酶活性

葡糖淀粉酶活性可以AGU单位测定。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

Glucoamylase Unit(葡糖淀粉酶单位；AGU)定义为在标准条件(37℃，pH4.3，底物：麦芽糖100mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间6分钟)下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。

葡糖淀粉酶温育：
		底物：	麦芽糖100mM
缓冲液：	乙酸(盐)0.1M
		pH：	4.30±0.05
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	6分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

分析原理通过3个反应步骤描述：

步骤1是酶反应：

葡糖淀粉酶(AMG)，EC 3.2.1.3(外-α-1,4-葡聚糖-葡聚糖水解酶)水解麦芽糖以形成α-D-葡萄糖。在温育之后，反应用NaOH停止。

步骤2和3导致终点反应：

葡萄糖在由己糖激酶催化的反应中由ATP磷酸化。将形成的葡萄糖-6-磷酸通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化为6-磷酸葡糖酸。在同一反应中，等摩尔量的NAD+还原为NADH，导致在340nm的吸光度增加。可使用自动分析系统如Konelab 30 Analyzer(Thermo Fisher Scientific)。

酸性α-淀粉酶活性

当根据本发明使用时，任何酸性α-淀粉酶的活性可以AFAU (酸性真菌α-淀粉酶单位)测量。或者，酸性α-淀粉酶的活性可以KNU (Kilo Novozymes Units(Termamyl SC))测量。

酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

酸性α-淀粉酶活性可以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)进行测量。1AFAU定义为在下面提及的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

酸性α-淀粉酶，其为内-α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-葡糖苷键以形成具有不同链长的寡糖和糊精。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法(reverse colorimetry)在规定的分析条件下按照淀粉浓度的降低测定淀粉酶活性。

λ=590nm

蓝色/紫色    t=23秒    无色

标准条件/反应条件

底物：                可溶性淀粉，大约0.17g/L

缓冲液：              柠檬酸(盐)，大约0.03M

碘(I₂)：              0.03gL

CaCl₂：               1.85mM

pH：                  2.50±0.05

温育温度：            40℃

反应时间：            23秒

波长：                590nm

酶浓度：              0.025AFAU/mL

酶工作范围：          0.01-0.04AFAU/mL

更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可根据要求由Novozymes A/S,Denmark得到，其通过提述并入本文。

本发明进一步通过下述实施例描述，其不应视作对本发明的范围的限制。

培养基

PDA平板每升包含39克的马铃薯右旋糖琼脂(Difco,BD213400)。

NNCYP-PCS培养基每升包含5.0g的NaNO₃，3.0g的NH₄Cl，2.0g的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸，分子式：C₆H₁₃O₄NS H₂O)，2.5g的柠檬酸，0.2g的CaCl₂2H₂O，1.0g的Bacto Peptone，5.0g的酵母提取物，0.2g的MgSO₄7H₂O，4.0g的K₂HPO₄，1.0ml的Cove Trace Elements，2.5g的葡萄糖和25.0g的PCS(从National Renewable Energy Laboratory(NREL)获得的经预处理的玉米秸秆)。CoveTrace Elements每升包含0.04g的Na₂B₄O₇.10H₂O，0.4g的CuSO4.5H₂O，1.2g的FeSO4.7H₂O，0.7g的MnSO4.H₂O，0.8g的Na₂MoO₂.2H₂O，10g的ZnSO₄.7H₂O。

MLC培养基包含40g/L葡萄糖，50g/L大豆粉，4g/L柠檬酸，pH 5.0。M410培养基包含50gL麦芽糖-1H₂O，8g/L酵母提取物，2g/L MgSO₄.7H₂O，4g/L柠檬酸-1H₂O，50g/L葡萄糖，2g/L K₂HPO₄，0.5ml/LAMG痕量金属溶液，和2g/L尿素，pH4.5。AMG痕量金属溶液包含13.9gL FeSO₄.7H₂O，13.5g/LMnSO₄.1H₂O，6.8g/L ZnCl₂，2.5gL CuSO₄.5H₂O，0.24gL NiCl₂.6H₂O，和3g/L柠檬酸。

除非另行声明，培养基根据Sambrook等(1989)Molecular cloning：Alaboratory manual,Cold Spring Harbor lab.,Cold Spring Harbor,NY制备。用作缓冲液和底物的化学品为至少试剂级的商品。

酶

葡糖淀粉酶：

如公开于本发明的SEQ ID NO:2的草酸青霉。

埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)葡糖淀粉酶(其作为SEQ ID NO:7公开于国际公开WO 99/28448)。

黑曲霉葡糖淀粉酶(uniprot:P69328)(其公开于Svensson,B.Larsen,K.Gunnarsson,A.;"Characterization of a glucoamylase G2from Aspergillus niger.″;Eur.J.Biochem.154:497-502(1986))

α-淀粉酶：

作为变体JA001公开于国际公开WO 2005/003311的酸性α-淀粉酶

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)产生的α-淀粉酶，例如Termamyl^TMSC(商业上可从Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark获得的α-淀粉酶)

实施例

实施例1：制备草酸青霉菌株菌丝体以供总RNA提取

将草酸青霉菌株(其于2008年8月从中国云南省的土壤收集)接种于PDA平板上，并在25℃在暗处温育4日。将数个菌丝体-PDA栓接种于含有100ml的NNCYP-PCS培养基的500ml摇瓶。将所述瓶在25℃以160rpm振荡温育7日。分别在第4日和第7日收集菌丝体。然后将来自各日的菌丝体冻结于液氮，并储藏于-80℃直至使用。

实施例2：草酸青霉菌株RNA制备

将冻结的菌丝体转移入液氮预冰冻的研钵和杵，并研磨至细微粉末。总RNA从粉末化的菌丝体通过用Fenozol试剂(Active motif，Cat.No.22100)提取来制备。多聚A富集的RNA通过mTRAP总试剂盒(mTRAP total kit)(Active Motif，Cat.No.23012)分离。

实施例3：草酸青霉菌株cDNA文库的构建

将各日的双链cDNA用SMART cDNA文库构建试剂盒(TAKARA,Cat.No.634901)合成。将cDNA用Sfi I(New England Biolabs,Cat.No.R0123S)根据生产商的指示切割，并将cDNA通过使用44mM Tis碱，44mM硼酸，0.5mM EDTA(TBE)缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳来大小分级。将500bp及更大的cDNA级分从凝胶切出并使用PCR DNA and Gel Band Purification Kit根据生产商的指示(GE，Cat.No.28-9031-71)纯化。然后汇集等量的来自第4日和第7日的cDNA以供文库构建。

然后对制备的cDNA进行定向克隆，即使用T4连接酶(New England Biolabs,Cat.No.M0202T)根据生产商的指示连接入Sfi I切割的pMHas7(描述于国际公开WO 2009/037253)。将连接混合物使用GENE和Pulse Controller(Bio-Rad)以25uF，25mAmp，1.8kV用1mm间隙的小杯根据生产商的指示电穿孔入大肠杆菌ElectroMax DH10B细胞(Invitrogen,Cat.No.18290-015)。

将经电穿孔的细胞铺板于补充50mg/L卡那霉素的LB平板。从初始pMHas7载体连接的总共50000个转化体制备cDNA质粒汇集物。质粒DNA直接从菌落汇集物使用QIAGEN质粒试剂盒(QIAGEN,Cat.No.12143)制备。

实施例4：含有β-内酰胺酶报道基因的SigA4转座子的构建

为了构建具有减少的选择背景的pSigA2的信号捕捉转座子的改善型式，从描述于国际公开WO 01/77315的含转座子的质粒pSigA2构建的命名为pSigA4的含转座子质粒。所述pSigA2转座子含有编码在转座子自身上的无信号的β-内酰胺酶构建体。使用PCR构建见于质粒骨架上的完整β-内酰胺酶基因的缺失，其中使用校正读码的Pfu Turbo聚合酶ProofStart(QIAGEN GmbH Corporation,Hilden,Germany)和下述5’磷酸化的引物(TAG Copenhagen,Denmark)：

SigA2NotU-P：5’-TCGCGATCCGTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCT-3’(SEQ IDNO:3)

SigA2NotD-P：5’-CCGCAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAA-3’(SEQ IDNO:4)

扩增反应包含1μl的pSigA2(10ng/μl)，5μl的10X ProofStart Buffer(QIAGEN GmbH Corporation，Hilden，Germany)，2.5μl的dNTP混合物(20mM)，0.5μl的SigA2NotU-P(10mM)，0.5μl的SigA2NotD-P(10mM)，10μl的Q溶液(QIAGEN GmbH Corporation,Hilden,Germany)，和31.25μl的去离子水。使用DNA ENGINE^TM Thermal Cycler(MJ Research Inc.，Waltham，MA，USA)进行扩增，其程序如下：一个循环在95℃进行5分钟；和20个循环，每循环在94℃进行30秒，62℃进行30秒，和72℃进行4分钟。

3.9kb PCR翻译产物在使用40mM Tis碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠盐(TAE)缓冲液和0.1μg每ml的溴乙锭的0.8%琼脂糖凝胶上分离。将DNA条带在Eagle Eye Imaging System(Stratagene,La Jolla,CA,USA)协助下在360nm显影。将3.9kb DNA条带从凝胶切出，并使用PCR DNA and Gel BandPurification Kit(GE Healthcare,United Kingdom)根据生产商的指示纯化。

将3.9kb片段在16℃用10单位的T4DNA连接酶(New England Biolabs,Inc.,Beverly，MA,USA)，9μl的3.9kb PCR片段，和1μl的10X连接缓冲液(NewEngland Biolabs,Inc.,Beverly，MA,USA)自连接过夜。将连接物在65℃热失活10分钟，然后用Dpn I在37℃消化2小时。在温育之后，消化物使用PCR DNAand Gel Band Purification Kit纯化。

然后将纯化的材料根据生产商的指示转化入大肠杆菌Top10感受态细胞(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)。将转化混合物铺板于补充25μg每ml的氯霉素的LB平板上。对于数个转化体制备质粒微制备物，并用Bgl II消化。选择一个具有正确构建的质粒。该质粒命名为pSigA4。质粒pSigA4含有侧翼为Bgl II的转座子SigA2(其与WO 01/77315中公开的相同)。

将质粒pSigA4DNA的60μl样品(0.3μg/μl)用Bgl II消化，并在使用TBE缓冲液(90mM Tis-硼酸；2mM EDTA；pH 8.0)的0.8%琼脂糖凝胶上分离。将2kb的SigA2转座子DNA条带用200μl的EB缓冲液(QIAGEN GmbH Corporation,Hilden,Germany)洗脱，并使用PCR DNA and Gel Band Purification Kit根据生产商的指示纯化，并在200μl的EB缓冲液中洗脱。使用SigA2进行转座子辅助的信号捕捉。

实施例5：草酸青霉菌株的转座子辅助的信号捕捉

对于转座子辅助的信号捕捉的完整描述可见于WO 01/77315。将质粒汇集物用转座子SigA2和HyperMu转座酶(Epicenter,Cat.No.THM03210)根据生产商的指示进行处理。

对于草酸青霉cDNA文库的体外转座子标记，将2μl的含有大约100ng的DNA的SigA2转座子与1μl的含有1μg的DNA的草酸青霉cDNA文库的质粒DNA汇集物，1μl的HyperMu转座酶，和2μl的10X缓冲液以20μl的总体积混合，并在30℃温育3小时，接着添加2μl的终止缓冲液，并在75℃热失活10分钟。DNA通过添加2μl的3M乙酸钠pH 5和55μl的96%乙醇来沉淀，并在10,000x g，4℃离心30分钟。将沉淀在70%乙醇中洗涤，在室温风干，并重悬于10μl的去离子水。

将2μl体积的转座子标记的质粒汇集物使用GENE和PulseController(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)以25uF，25mAmp，1.8kV用1mm间隙的小杯根据生产商的步骤电穿孔入50μl的大肠杆菌ElectroMax DH10B细胞(Invitrogen)。

将经电穿孔的细胞在37℃以225rpm振荡在SOC培养基中温育1小时，然后铺板于下述选择培养基上：补充50μg每ml的卡那霉素的LB培养基；补充50μg每ml的卡那霉素和15μg每ml的氯霉素的LB培养基；和补充50μg每ml的卡那霉素，15μg每ml的氯霉素，和30μg每ml的氨苄青霉素的LB培养基。

通过将电穿孔物铺板于补充卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素的LB培养基，在30℃，3日之后观察到大约700个菌落。将所有菌落复制铺板于含有100mg/l的LB卡那霉素，氯霉素上。将菌落送至SinoGenoMax公司测序，其中使用下文所示的转座子正向和反向引物(引物A和B)，依照WO 01/77315(第28页)公开的方法。

引物A：5’-AGCGTTTGCGGCCGCGATCC-3’(SEQ ID NO:5)

引物B：5’-TTATTCGGTCGAAAAGGATCC-3’(SEQ ID NO:6)

实施例6：草酸青霉菌株葡糖淀粉酶的克隆

序列汇编和调绘(annotation)。从SinoGenoMax公司获得DNA序列，对其修剪以去除来源于载体和转座子序列的序列部分。将经修剪的序列通过使用程序PhredPhrap(Ewing等,1998,Genome Research 8：175-185；Ewing和Green,1998,Genome Research 8：186-194)归组为重叠群(contig)。接着将所有的重叠群与标准公开DNA和蛋白质序列数据库(TrEMBL，SWALL，PDB，EnsemblPep，GeneSeqP)中可获得的序列通过使用程序BLASTX 2.0a19MP-WashU[14-Jul-1998][Buildlinux-x8618:51:4430-Jul-1998](Gish等,1993,Nat.Genet.3：266-72)进行比较。通过分析BlastX结果直接鉴定出家族GH15葡糖淀粉酶基因。

草酸青霉cDNA的制备。cDNA通过遵循3’RapidAmplifiction of cDNA EndSystem(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)的指示合成。

草酸青霉菌株葡糖淀粉酶基因的克隆。基于通过TAST获得的草酸青霉葡糖淀粉酶基因信息，设计了下示的寡核苷酸引物以从5’端扩增葡糖淀粉酶基因。

有义引物：5’-ATGCGTCTCACTCTATTATCAGGTG-3’(SEQ ID NO:7)

全长基因通过PCR用有义引物和AUSP (由3’Rapid Amplifiction of cDNAEnd System供应)通过使用Platinum HIFI Taq DNA聚合酶(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)扩增。扩增反应物包含5μl的10x PCR缓冲液，2μl的25mMMgCl₂，1μl的10mM dNTP，1μl的10uM有义引物，1μl的10uM AUAP，2μl的第一链cDNA，0.5μl的HIFI Taq，和37.5μl的去离子水。PCR程序为：94℃，3分钟；10个循环，每循环94℃进行40秒，60℃40秒，其中每循环降低1℃，68℃进行2分钟；25个循环，每循环94℃进行40秒，50℃进行40秒，68℃进行2分钟；在68℃进行10分钟最终延伸。

将获得的PCR片段使用pGEM-T Vector System(Promega Corporation,Madison,WI,USA)克隆入pGEM-T载体(Promega Corporation,Madison,WI,USA)以生成质粒AMG 1。插入质粒AMG 1的葡糖淀粉酶基因经测序验证。将含有质粒AMG 1的大肠杆菌菌株TOP10(命名为NN059173)在2009年11月23日保藏于德意志微生物和细胞培养保藏中心(DSMZ)，并分配保藏号DSM 23123。

实施例7：克隆的草酸青霉葡糖淀粉酶的表达

将草酸青霉葡糖淀粉酶基因从质粒AMG 1通过PCR使用两个下示的克隆引物F和引物R重新克隆入曲霉属表达载体，所述引物基于已知的序列并添加供IN-FUSION^TM策略直接克隆用的标记而设计。

引物F：5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC(SEQ ID NO:8)

引物R：5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG(SEQID NO:9)

用质粒AMG 1进行了PCR反应以扩增全长基因。PCR反应物包含40μg的质粒AMG 1DNA，各1μl的引物(100μM)；12.5μl的2X Extensor Hi-Fidelity主混合物(Extensor Hi-Fidelity Master Mix,ABgene,United Kingdom)，和9.5μl的PCR-级水。PCR反应使用DYAD PCR仪(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行，其程序为在94℃进行2分钟，接着进行25个循环，每循环94℃进行15秒，50℃进行30秒，和72℃进行1分钟；然后在72℃进行10分钟。

将反应产物通过使用1x TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶分离，其中将大约1.9kb PCR产物条带从凝胶切出并使用PCR DNA and Gel BandPurification Kit(GE Healthcare,United Kingdom)根据生产商的指示进行纯化。将对应于草酸青霉葡糖淀粉酶基因的DNA使用IN-FUSION^TM Dry-Down PCRCloning Kit(BD Biosciences,Palo Alto,CA,USA)根据生产商的指示克隆入用BamHI和HindIII线性化的曲霉属表达载体。线性化的载体构建体描述于WO2005042735A 1。

使用2μl体积的连接混合物转化25μl的Fusion Blue大肠杆菌(包含于IN-FUSION^TM Dry-Down PCR Cloning Kit)。在42℃进行45秒热激并在冰上冷冻之后，添加250μl的SOC培养基，并将细胞在37℃以225rpm温育90分钟，然后铺板于含有50μg每ml的氨苄青霉素的LB琼脂平板上，并在37℃培养过夜。将选择的菌落在3ml的补充50μg每ml的氨苄青霉素的LB培养基上接种，并在37℃以225rpm温育过夜。将来自选择的菌落的质粒DNA使用MiniJETSTAR(Genomed,Germany)根据生产商的指示纯化。草酸青霉葡糖淀粉酶基因序列在异源表达之前通过Sanger测序验证。选择一个质粒进行进一步表达，并命名为XYZ。

黑曲霉MBin118的原生质体如WO 95/02043中所述制备。将一百μl的原生质体悬液与2.5μg的XYZ质粒混合，并添加250微升的60%PEG 4000(Applichem)(聚乙二醇，分子量4000)，10mM CaCl₂，和10mM Tris-HCl pH 7.5，并轻柔地混合。将混合物在37℃温育30分钟，并将原生质体与补充10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(Cove,1996,Biochim.Biophys.Acta 133:51-56)(1M)平板中的6%低熔点琼脂糖(Biowhittaker Molecular Applications)混合，并作为顶层添加在供转化选择的补充10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(1M)平板上(4ml每平板的顶层琼脂)。在37℃温育5日之后，挑取十六个转化体的孢子，并接种于96深孔MT平板中的750μlYP-2%麦芽糖培养基。在30℃静止培养5日之后，将来自每个孔的10μl的培养液在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶，Griton XT Precast凝胶(BioRad,CA,USA)上进行分析，以基于产生大量葡糖淀粉酶的能力鉴定出最佳的转化体。在初始转化平板上鉴定出选择的转化体，并将其作为孢子保存于20%甘油储备中，并冷冻储藏(-80℃)。

培养。将选择的转化体接种于100ml的MLC培养基并在30℃在旋转振荡器上在500ml摇瓶中温育2日。将3ml的培养液接种于100ml的M410培养基并在30℃培养3日。将培养液离心，并使用0.2μm膜过滤器过滤上清。

α-环糊精亲和凝胶。将十克的环氧活化的Sepharose 6B(GE Healthcare,Chalfont St。Giles,U.K)粉悬于蒸馏水并用蒸馏水在烧结玻璃过滤器上洗涤。将凝胶悬于偶联溶液(100ml的12.5mg/ml α-环糊精，0.5M NaOH)，并在室温温育以轻柔振荡温育一日。将凝胶用蒸馏水在烧结玻璃过滤器上洗涤，悬于100ml的1M乙醇胺pH，并在50℃温育4小时以供封闭。然后将凝胶用50mMTis-HCl，pH 8和50mM NaOAc，pH 4.0交替洗涤数次。将凝胶最终使用平衡缓冲液(50mM NaOAc，150mM NaCl，pH 4.5)填充于35-40ml柱。

从培养液纯化葡糖淀粉酶。将来自携带葡糖淀粉酶基因的黑曲霉MBin118的发酵的培养液通过0.22μm PES过滤器过滤，并施于之前在50mM NaOAc，150mM NaCl，pH 4.5缓冲液中预平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。将未结合的材料用平衡缓冲液从柱洗去，而葡糖淀粉酶使用含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液在3个柱体积内洗脱。

检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以观察葡糖淀粉酶是否结合于α-环糊精亲和凝胶。然后将纯化的葡糖淀粉酶样品针对20mM NaOAc,pH 5.0透析。纯度最终通过SDS-PAGE检查，仅发现单个条带(参见图1)。

实施例8：草酸青霉葡糖淀粉酶的表征

底物。底物：1%去离子水中的可溶性淀粉(Sigma S-9765)

反应缓冲液：pH 5.3的0.1M乙酸盐缓冲液

葡萄糖浓度确定试剂盒：Wako葡萄糖测定试剂盒(LabAssay Glucose,WAKO,Cat#298-65701)。

反应条件。将20μl可溶性淀粉和50μl乙酸盐缓冲液pH 5.3混合。将30μl酶溶液(50μg酶蛋白/ml)添加至100μl的终体积，接着在37℃温育15分钟。

葡萄糖浓度通过Wako试剂盒确定。

所有工作平行进行。

最佳温度。为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的最佳温度，在20，30，40，50，60，70，80，85，90和95℃进行了如上所述的反应条件测定。结果示于表1。

表1最佳温度

温度(℃)	20	30	40	50	60	70	80	85	90	95
											相对活性(%)	63.6	71.7	86.4	99.4	94.6	100.0	92.9	92.5	82.7	82.8

根据结果可见，在给定条件下草酸青霉葡糖淀粉酶的最佳温度为50℃至70℃之间，且该葡糖淀粉酶在95℃保持超过80%的活性。

热稳定性。为了评估草酸青霉的热稳定性，修改了反应条件测定，其中将酶溶液和乙酸盐缓冲液在20，30，40，50，60，70，75，80，85，90和95℃预温育15分钟。在温育之后，将20μl的淀粉添加至溶液，并如上所述进行测定。

结果示于表2。

表2：热稳定性

温度(℃)	20	30	40	50	60	70	80	85	90	95
											相对活性(%)	91.0	92.9	88.1	100.0	96.9	86.0	34.8	36.0	34.2	34.8

根据结果可见草酸青霉葡糖淀粉酶在高至70℃预温育15分钟之后仍稳定，因为其保持超过80%活性。

最佳pH。为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的最佳pH，在pH 2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.07.0，8.0，9.0，10.0和11.0进行了如上所述的反应条件测定。使用下述缓冲液替代使用反应条件测定中所述的乙酸盐缓冲液：100mM琥珀酸，HEPES，CHES，CAPSO，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01%Titon X-100，pH用HCl或NaOH调整至2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.07.0，8.0，9.0，10.0或11.0。

结果示于表3。

表3：最佳pH

根据结果可见草酸青霉葡糖淀粉酶在给定条件在pH 5.0具有最高活性。草酸青霉葡糖淀粉酶在广泛pH范围具有活性，因为其从pH 2至7保持超过50%活性。

pH稳定性。为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的热稳定性，修改了反应条件测定，其中将酶溶液(50μg/ml)在具有pH 2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.07.0，8.0，9.0，10.0和11.0的缓冲液(使用在进行最佳pH时所述的缓冲液)中预温育20小时。在预温育之后，将20μl可溶性淀粉以100μl的最终体积添加至溶液，并如上所述进行该测定。

结果示于表4。

表4：pH稳定性

根据结果可见草酸青霉葡糖淀粉酶在pH 3至pH 7预温育20小时之后仍稳定，且其在pH 8降低活性。

实施例9：草酸青霉葡糖淀粉酶的糖化性能

在70℃添加或不添加在WO 2005/003311作为变体JA001公开的酸性α-淀粉酶条件下来测试草酸青霉葡糖淀粉酶的糖化性能。在下述条件下运行糖化：底物：DE 11麦芽糊精，大约30%DS(w/w)，温度：70℃，起始pH：4.3，酶剂量：草酸青霉葡糖淀粉酶：0.075AGU/g DS，含或不含酸性α-淀粉酶：0.05AFAU/g DS。

作为对照，在60℃使用具有0.225AGU/g DS的黑曲霉葡糖淀粉酶(uniprot：P69328)。

糖化

用于糖化的底物通过将DE11麦芽糊精(从普通玉米制备)溶解于沸腾的Milli-Q水并将干物质调整至大约30%(w/w)来制备。将pH调整至4.3。将五毫升的底物转移至15ml塑料管，并置于70℃的水浴，然后将酶以表5中所示的浓度添加。定期取样，并使用HPLC分析以确定糖组成。

在糖化过程中产生的葡萄糖在表5中给出。数值为%DP1(葡萄糖)对DS(干固形物)。在72小时之后使用0.075AGU/g DS酶剂量(对应于0.016mg酶蛋白/gDS)获得了超过95%的葡萄糖收率。因为黑曲霉葡糖淀粉酶的剂量为0.225AGU/g DS(对应于0.12mg酶蛋白/g DS)，因此在糖化工艺中对草酸青霉葡糖淀粉酶每mg酶蛋白的酶剂量的需求显著降低。

表5

实施例10：草酸青霉葡糖淀粉酶在pH 4.50和5.80的80℃液化中的评估

该实施例说明液化和糖化可同时进行，得到可发酵为乙醇的醪。

起始样品。磨碎的玉米和逆流从Corn LP(Iowa,USA)获得并用于本实验。将目标%干固形物为32.5%的三份浆料样品以160g规模制备，使用58g的磨碎的玉米，53g的自来水，和48g的逆流。将两份浆料调整至pH 5.80，并将一份调整至pH 4.50。

液化处理。所有三份浆料接受0.1232KNU/g DS(KNU/g干固形物)剂量的Termamyl^TM SC(来自Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark的商业上可获得的α-淀粉酶)。一份pH 5.80浆料接受0.24AGU/g DS(AGU/g干固形物)的草酸青霉葡糖淀粉酶剂量，而另一份不接受任何处理(对照醪)。pH 4.50醪亦接受0.24AGU/gDS的草酸青霉葡糖淀粉酶剂量。所有浆料在80℃在预热的水浴中温育总共2小时，定期混合。在温育之后，将醪立即在冰上冷却至室温。将醪调整至pH 5.0，并添加尿素和青霉素以分别达到1000ppm和3ppm的终浓度。

发酵。在将大约5g的如上所述制备的醪添加至每个试管之前，对每个空试管进行称重。在将醪添加至合适的试管之后，将所有试管再次称重以测量起始醪重量。将草酸青霉葡糖淀粉酶添加至对照醪至0.24AGU/g DS的剂量。未将葡糖淀粉酶添加至含有其它2份醪的试管。将来自LeSaffre Corp(Wisconsin,USA)的RED STAR ETHANOL RED^TM酵母在32℃在自来水中重新水合30分钟(将5.50g置于100mL自来水中)，接着将100μl的该悬液使用重复移液管添加至每个试管。亦将去离子水添加至每个试管以维持恒定的起始%DS。在将葡糖淀粉酶(视需要)，水和酵母添加至每个试管之后，将其重新称重，然后置于设为32℃的恒温室总共58小时。每日两次将试管从该室移出，涡旋混合，重新称重，然后置回该室继续发酵。

在58小时的发酵之后，将所有试管涡旋、重新称重，然后发酵通过将50μl的40%H₂SO₄添加至每个试管，接着进行充分涡旋来终止。将试管在1500xg离心10分钟，然后将上清通过0.45μm尼龙过滤器注射器过滤至标记的HPLC小瓶。然后通过HPLC分析样品的乙醇含量。

结果示于表6。可见草酸青霉葡糖淀粉酶增强了乙醇的量，特别是在pH 4.50用于液化时。

表6

样品	乙醇，g/L
		0.24AGU/g DS草酸青霉葡糖淀粉酶用于液化，pH 4.50	120.36
0.24AGU/g DS草酸青霉葡糖淀粉酶用于液化，pH 5.80	119.21
		对照，草酸青霉葡糖淀粉酶未用于液化但用于发酵，pH5.80	118.88

实施例11：评估草酸青霉葡糖淀粉酶在pH 4.50在85℃液化中的剂量应答

起始样品。磨碎的玉米和逆流从Corn LP获得并用于本实验。十份目标%干固形物为32.5%的浆料样品以125g规模制备，使用45g的磨碎的玉米，42g的自来水，和38g的逆流。将五份浆料调整至pH 4.50。一份浆料充当对照。

液化处理。所有5份浆料接受0.1232KNU/g DS的Termamyl^TM SC剂量。在pH 4.50的五份浆料接受下述草酸青霉葡糖淀粉酶的剂量：0–0.0048–0.024–0.048–0.24AGU/g DS。将所有浆料在预热的水浴中在85℃温育总共2小时，定期混合。在温育之后，将醪立即在冰上冷却至室温。将醪调整至pH 5.0，并添加尿素和青霉素至达到分别1000ppm和3ppm的终浓度。

发酵。在将大约5g的醪添加至每个试管之前，对每个空试管进行称重。在将醪添加至合适试管之后，将所有试管再次称重以测量起始醪重量。将埃默森踝节菌葡糖淀粉酶添加至每个试管至0.50AGU/g DS的浓度。将来自LeSaffreCorp.的RED STAR ETHANOL RED^TM酵母在32℃在自来水中重新水合30分钟(5.50g置于100mL自来水中)，然后将100μl的该悬液使用重复移液管添加至每个试管。亦将去离子水添加至每个试管以保持恒定的起始%DS。在将埃默森踝节菌葡糖淀粉酶、水和酵母添加至每个试管之后，对其进行重新称重，然后置于设为32℃的恒温室总共54小时。每日两次将试管从该室移出，涡旋混合，重新称重，然后置回该室继续发酵。

在54小时的发酵之后，将所有试管涡旋、重新称重，然后发酵通过将50μl的40%H₂SO₄添加至每个试管，接着进行充分涡旋来终止。将试管在1500xg离心10分钟，然后将上清通过0.45μm尼龙过滤器注射器过滤至标记的HPLC小瓶。然后通过HPLC分析样品的乙醇含量。

结果示于表7。可见从磨碎的玉米和逆流产生的乙醇受液化中的草酸青霉葡糖淀粉酶以剂量响应方式改善。

表7

样品	乙醇g/L
		对照，草酸青霉葡糖淀粉酶未用于液化	128.33
0.0048AGU/g DS草酸青霉葡糖淀粉酶用于液化	128.57
		0.024AGU/g DS草酸青霉葡糖淀粉酶用于液化	128.75
0.048AGU/g DS草酸青霉葡糖淀粉酶用于液化	130.51
		0.24AGU/g DS草酸青霉葡糖淀粉酶用于液化	132.27

实施例12：草酸青霉葡糖淀粉酶在pH 4.5和85℃用于液化的进一步评估

浆料样品。使用在2008年5月间在National Corn to Ethanol Research Center(NCERC)的中试工厂制备的浆料样品作为本研究的起始材料。样品完全使用磨碎的玉米(无逆流)以目标%干固形物为32.0%制备。将其在pH 5.80，85℃使用0.0492KNU/g DS的Termamyl^TMSC液化30分钟。

液化处理。使用如上所述的NCERC浆料样品作为起始材料制备了六份不同的完全液化的玉米醪。简言之，称取约110g的浆料醪置于5个不同的250mlNalgene瓶中。将浆料醪样品使用40%H₂SO₄调整至pH 4.50。然后将草酸青霉葡糖淀粉酶的等分试样添加至每份醪至0-0.0048-0.024-0.048-0.096-0.24AGU/g DS的最终酶浓度。亦将0.0740KNU/g DS的Termamyl^TMSC添加至每份醪。将醪在预热的水浴中在85℃再温育1.5小时，定期混合。在温育之后，将醪立即在冰上冷却至室温。使用10%NaOH将醪调整至pH 5.0，并添加尿素和青霉素至达到分别1000ppm和3ppm的终浓度。对每份醪取少许样品进行HPLC分析以测量在液化过程中可转化为葡萄糖的淀粉的量。对于这些计算，将淀粉占起始磨碎的玉米的百分比假定为30.0%。

结果示于表8。可见在液化中转化为葡萄糖的淀粉的百分比通过在液化处理中添加草酸青霉葡糖淀粉酶而得到提高。

表8

发酵。在将大约5g的在上述液化处理中生成的醪添加至每个试管之前，对每个空试管进行称重。在将醪添加至合适试管之后，将所有试管再次称重以测量起始醪重量。然后将埃默森踝节菌葡糖淀粉酶储液添加至每个试管至0.50AGU/g DS的初始剂量。将来自LeSaffre Corp.的RED STAR ETHANOL RED^TM酵母在32℃在自来水中重新水合30分钟(5.50g置于100mL自来水中)，然后将100μl的该悬液使用重复移液管添加至每个试管。亦将去离子水添加至每个试管以保持恒定的起始%DS。在将埃默森踝节菌葡糖淀粉酶、水和酵母添加至每个试管之后，对其进行重新称重，然后置于设为32℃的恒温室总共54小时。每日两次将试管从该室移出，涡旋混合，重新称重，然后置回该室继续发酵。

在54小时的发酵之后，将所有试管涡旋、重新称重，然后发酵通过将50μl的40%H₂SO₄添加至每个试管，接着进行充分涡旋来终止。将试管在1500xg离心10分钟，然后将上清通过0.45μm尼龙过滤器注射器过滤至标记的HPLC小瓶。然后通过HPLC分析样品的乙醇含量。

结果示于表9。可见草酸青霉葡糖淀粉酶当在pH 4.5用于液化时增强了乙醇产生。

表9

实施例13：草酸青霉葡糖淀粉酶在pH5.0和70℃在预糖化中的评估

该实施例描述了乙醇产生工艺，其中在预糖化工艺中使用草酸青霉葡糖淀粉酶，接着不使用其它葡糖淀粉酶进行发酵工艺。将该工艺与传统的、其中液化工艺之后进行使用非热稳定的葡糖淀粉酶进行的SSF工艺的乙醇发酵工艺相比较。

浆料样品。使用在2008年5月间在National Corn to Ethanol Research Center(NCERC)的中试工厂制备的浆料样品作为本研究的起始材料。样品全部使用磨碎的玉米(无逆流)以目标%干固形物为32.0%制备。将其在pH 5.80，85℃使用0.0246KNU/g DS的Termamyl^TMSC液化30分钟。

液化处理。使用如上所述的NCERC浆料样品作为起始材料制备了一份完全液化的玉米醪。简言之，称取大约400g的浆料醪置于1LNalgene瓶中；将浆料醪样品使用40%H₂SO₄调整至pH 5.80。然后将0.0740KNU/g DS的Termamyl^TM SC添加至醪，然后在预热的水浴中在85℃再温育1.5小时，定期混合。

预糖化。在温育之后，将醪等分入两个100mL Nalgene瓶，在水浴中冷却至70℃，然后将草酸青霉葡糖淀粉酶的等分试样添加至每份醪以使最终的酶达到0和0.24AGU/gDS。将醪在水浴中在70℃再温育2小时，定期混合。在温育之后，将醪立即冷却至室温。使用10%NaOH将醪调整至pH 5.0，并添加尿素和青霉素至达到分别1000ppm和3ppm的终浓度。对每份醪取少许样品进行HPLC分析。

结果示于表10。可见在预糖化中转化为葡萄糖的淀粉的百分比通过添加草酸青霉葡糖淀粉酶而得到提高。

表10

发酵。在将大约5g的醪添加至每个试管之前，对每个空试管进行称重。在将醪添加至合适试管之后，将所有试管再次称重以测量起始醪重量。然后将埃默森踝节菌葡糖淀粉酶储液添加至对照试管至0.50AGU/g DS的初始剂量，但不向在预糖化中接受草酸青霉葡糖淀粉酶的样品添加额外的葡糖淀粉酶。

将来自LeSaffre Corp.的RED STAR ETHANOL RED^TM酵母在32℃在自来水中重新水合30分钟(5.50g置于100mL自来水中)，然后将100μl的该悬液使用重复移液管添加至每个试管。亦将去离子水添加至每个试管以保持恒定的起始%DS。在将埃默森踝节菌葡糖淀粉酶、水和酵母添加至每个试管之后，对其进行重新称重，然后置于设为32℃的恒温室总共54小时。每日两次将试管从该室移出，涡旋混合，重新称重，然后置回该室继续发酵。

在54小时的发酵之后，将所有试管涡旋、重新称重，然后发酵通过将50μl的40%H₂SO₄添加至每个试管，接着进行充分涡旋来终止。将试管在1500xg离心10分钟，然后将上清通过0.45μm尼龙过滤器注射器过滤至标记的HPLC小瓶。然后通过HPLC分析样品的乙醇含量。

结果示于表11。可见草酸青霉葡糖淀粉酶当在pH 5.80在70℃用于预糖化步骤时产生与由常规工艺(对照)产生的乙醇相当量的乙醇。考虑到与埃默森踝节菌葡糖淀粉酶活性(0.5AGU/g DS)相比，仅使用了一半量的草酸青霉葡糖淀粉酶活性，这是非常良好的结果。

表11

生物材料的保藏

下述的生物材料已经依据布达佩斯条约的条款保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，DSZ),Mascheroder Weg 1B,D-38124Braunschweig,Germany，并给予下述的登录号：

保藏物：具有包含草酸青霉葡糖淀粉酶序列的质粒的大肠杆菌菌株NN059173

登录号：DSM 23123        保藏日期：2009年11月23日

所述菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，依据该外国专利法律的授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。

此处记载并要求保护的发明不限于本文公开的具体方面的方面，因为这些方面意图作为本发明几个方面的示例。任何等同的方面都意图包括在本发明的范围内。事实上，在本文显示和记载的那些内容之外，对本发明的各种修改基于前述记载的内容对于本领域技术人员会是显而易见的。这些修改也意图落入所附权利要求的范围之内。在发生冲突的情况下，以包括定义在内的本公开内容为准。

Claims (35)

1.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其由下述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有99％或100％同一性，所述多肽在70℃预温育15分钟之后保持超过80％活性，所述多肽是具有葡糖淀粉酶活性的草酸青霉多肽；

(b)多肽，其由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成；

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列组成；和

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽包含一个或几个氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体，所述多肽变体在70℃预温育15分钟之后保持超过80％活性，所述多肽是具有葡糖淀粉酶活性的草酸青霉多肽。

2.权利要求1的多肽，其组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

3.权利要求1的多肽，其组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽。

4.权利要求1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸组成为SEQ IDNO:1的核苷酸序列。

5.权利要求1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸组成为SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列。

6.权利要求1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含于大肠杆菌DSM 23123中包含的质粒AMG1。

7.权利要求1-6任一项的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸22至616。

8.权利要求1-7任一项的多肽，其中所述成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:1的核苷酸64至1848。

9.一种分离的多核苷酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码权利要求1-8任一项的多肽。

10.权利要求9的分离的多核苷酸，其组成为SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列。

11.一种核酸构建体或表达载体，其包含权利要求9-10任一项的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，其指导所述多肽在表达宿主中的产生。

12.一种重组表达载体，其包含权利要求11的核酸构建体。

13.一种重组宿主细胞，其包含权利要求11的核酸构建体。

14.一种产生权利要求1-8任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有助于多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。

15.一种产生权利要求1-8任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有助于多肽产生的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

16.一种产生权利要求1-8任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有助于多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

17.一种组合物，其包含权利要求1-8任一项的多肽。

18.权利要求17的组合物，进一步包含α-淀粉酶。

19.权利要求1-8任一项的多肽用于液化、糖化和/或发酵工艺中的用途。

20.权利要求1-8任一项的多肽在淀粉转化中的用途。

21.权利要求19或20的用途，其中所述工艺包括液化工艺。

22.权利要求19或20的用途，其中所述工艺包括顺序或同时进行的液化工艺和糖化工艺。

23.权利要求19或20的用途，其中所述工艺包括糖化工艺。

24.权利要求19或20的用途，其中所述工艺包括液化工艺和顺序或同时进行的糖化和发酵工艺。

25.权利要求19或20的用途，其中所述工艺包括在同时糖化和发酵工艺之前的预糖化工艺。

26.权利要求1-8任一项的多肽用于生产糖浆、饮料和/或发酵产物中的用途。

27.权利要求26的用途，其中所述起始材料是含淀粉材料。

28.权利要求26或27的用途，其中所述发酵产物是：阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、山梨醇、木糖醇；有机酸、酮、烷烃、环烷烃、烯烃青霉素、四环素、酶、维生素、或激素。

29.权利要求26或27的用途，其中所述发酵产物是：1,3-丙二醇、丙三醇、或氨基酸。

30.权利要求1-8任一项的多肽用于酿造的用途。

31.一种用于从含淀粉材料产生液化、糖化和/或发酵产物的方法，其包括用权利要求1-8任一项的多肽处理含淀粉材料。

32.权利要求31的方法，其中添加α-淀粉酶。

33.权利要求31或32的方法，其中所述处理在40℃至100℃的温度，和/或在2.0至7.0的pH进行。

34.权利要求31或32的方法，其中所述处理在65℃至90℃的温度，和/或pH 4.0至pH 6.0的pH进行。

35.权利要求31或32的方法，其中所述处理在80℃至85℃的温度，和/或在pH 4.5至pH 5.5的pH进行。