DE4423183A1 - Verfahren zur Herstellung vorbestimmter Nucleotid-Sequenzen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung vorbe­ stimmter Nucleotid-Sequenzen, vorzugsweise von Genen aus kurzen Oligonucleotiden, die durch sequentielle Ligationen verbunden mit Annealing-Reaktionen zu einem doppelsträngigen Nucleinsäure-Molekül verbunden werden. Die Erfindung be­ trifft ferner Vektoren, die die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Nucleotid-Sequenzen enthalten sowie Wirtszellen, die diese Vektoren enthalten.

Segmente von nicht unmittelbar verfügbaren, das heißt nicht geeignet clonierten oder nicht für den Benutzer als Clon zur Verfügung stehenden Genen oder veränderte Genabschnitte wer­ den üblicherweise durch Ligation (Verknüpfung) und Annealing von relativ langen Oligonucleotiden (Länge 40 bis 80 Basen) hergestellt. Für jedes gewünschte Segment ist deshalb eine zweckgebundene Oligonucleotidsynthese notwendig, wobei die hergestellten Oligonucleotide sich in der Regel nicht für weitere Zwecke verwenden lassen. Diese konventionelle Art der Herstellung gewünschter Nucleotid-Sequenzen ist somit relativ zeit- und kostenaufwendig.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfah­ ren bereitzustellen, das die Herstellung gewünschter Nucleo­ tid-Sequenzen mit relativ geringem Zeit- und Kostenaufwand erlaubt. Diese Aufgabe wird durch das Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 1 gelöst.

Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung vorbestimmter Nucleotid-Sequenzen, das die folgenden Schritte umfaßt:

• (a) Ligation von mindestens zwei Oligonucleotiden bekann­ ter Sequenz;
• (b) Annealing von mindestens einem Oligonucleotid mit min­ destens zwei in Schritt (a) eingesetzten Oligonucleo­ tiden komplementärer Sequenz, wobei das Oligonucleotid und die komplementären Oligonucleotide einen Nuclein­ säure-Doppelstrang bilden, und der Nucleinsäure-Dop­ pelstrang mindestens ein überhängendes Ende aufweist;
• (c_a) Ligation des in Schritt (b) erhaltenen Nucleinsäure-Dop­ pelstranges mit mindestens einem weiteren Nuclein­ säure-Doppelstrang, der ein kompatibles überhängendes Ende aufweist und nach den Schritten (a) und (b) her­ gestellt wurde; und/oder
• (c_b) Ligation des in Schritt (b) erhaltenen Nucleinsäure-Dop­ pelstranges mit mindestens einem weiteren Oligo­ nucleotid bekannter Sequenz, das sich an ein überhän­ gendes Ende des Nucleinsäure-Doppelstranges an lagern und damit ligiert werden kann; ferner gegebenenfalls
• (d_a) Ligation des in Schritt (c_a) oder (c_b) erhaltenen Nucleinsäure-Doppelstranges mit mindestens einem wei­ teren Nucleinsäure-Doppelstrang, der ein kompatibles überhängendes Ende aufweist und nach den Schritten (a) und (b) und gegebenenfalls (c_a) oder (c_b) hergestellt wurde; und/oder
• (d_b) Ligation des in Schritt (c_a) oder (c_b) erhaltenen Nucleinsäure-Doppelstranges mit mindestens einem wei­ teren Oligonucleotid bekannter Sequenz, das sich an ein überhängendes Ende des Nucleinsäure-Doppelstranges anlagern und damit ligiert werden kann; und gegebenen­ falls
• (e) weitere Ligationen von Produkten, die mit den Schrit­ ten (a) und (b); (a), (b) und (c_a) oder (c_b); und/oder (a) bis (d) erhalten wurden.

Vorzugsweise weist der in Schritt (b) erhaltene Doppelstrang zwei überhängende Enden auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens läuft Schritt (a) zeitlich vor Schritt (b) ab.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens läuft Schritt (b) zeitlich vor Schritt (a) ab.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung be­ trifft ein Verfahren, in dem die Schritte (a) und (b) im we­ sentlichen gleichzeitig und vorzugsweise gleichzeitig ablau­ fen.

Die Schritte (a) und (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens können nacheinander oder gleichzeitig durchgeführt werden. Vom erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt sind daher auch sol­ che Ausführungsformen, in denen zunächst das Annealing ein­ zelner, teilweise komplementärer, überlappender Oligonucleo­ tide stattfindet und die so miteinander zu Nucleinsäure-Dop­ pelsträngen mit überhängenden Enden hybridisierten Nucleo­ tid-Sequenzen (die keine internen einzelsträngigen Bereiche aufweisen) zunächst miteinander und dann mit weiteren Nucleotid-Sequenzen mit kompatiblen Enden ligiert werden.

Ebenfalls vom erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt sind auch solche Ausführungsformen, in denen zuerst zwei oder mehrere Oligonucleotide miteinander ligiert werden und danach zu doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens ist die vorbestimmte Nucleotid-Se­ quenz eine DNA-Sequenz.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jegliche Art an DNA-Sequenzen synthetisiert werden, z. B. cDNA-Sequenzen und genomischen DNA-Sequenzen entsprechende Sequenzen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens ist die vorbestimmte Nucleotid-Se­ quenz eine RNA-Sequenz oder ein RNA/DNA-Hybrid.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es notwendig, daß die gesamte Nucleotid-Sequenz des gewünschten Segmentes bekannt oder vorbestimmt (de novo Synthese nach theoretischen Vorgaben) ist. Dies ist insbesondere deshalb notwendig, um den Ablauf und die Kombination verschiedener Oligonucleotide so auswählen zu können, daß nur doppelsträn­ gige Nucleinsäure-Moleküle mit einer einzigen, nämlich der gewünschten Sequenz hergestellt werden.

Da die Herstellung von Oligonucleotiden jedweder Sequenz mit üblichen Verfahren möglich ist und die Schritte (a) bis (e) fast beliebig miteinander kombiniert werden können, unter­ liegt somit die herzustellende gewünschte Nucleotid-Sequenz weder hinsichtlich der Basensequenz noch der Länge irgend­ welchen Einschränkungen.

Die Vermeidung unerwünschter oder mehrdeutiger Produkte ist eine entscheidende Bedingung für die korrekte Funktionsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens. Wenn beispielsweise Hexa­ nucleotide als Bausteine für die zu synthetisierende Nucleo­ tid-Sequenz verwendet werden, entstehen bei der Bildung von RNA- oder DNA-Doppelsträngen, die mit Ausnahme der überhän­ genden Enden keine Einzelstrangbereiche aufweisen, in jedem Ligationsansatz jeweils beispielsweise Überhänge von drei Nucleotiden. Somit sind sowohl 64 verschiedene 3′-Überhänge als auch 64 verschiedene 5′-Überhänge möglich, wobei es ge­ nau eine passende Paarung eines bestimmten 3′-Überhangs (z. B. 5′-GTA-3′) mit einem anderen der 64 3′-Überhänge gibt (hier: 5′-TAC-3′). Das gleiche gilt für die 5′-Überhänge. Es existieren mithin genau 32 eindeutige Kombinationsmöglich­ keiten für 3′-Überhänge und genausoviele eindeutige Kombina­ tionsmöglichkeiten für 5′-Überhänge, wobei durch die unge­ rade Anzahl überhängender Nucleotide vermieden wird, daß durch Rotationssymmetrie eine Ligation mehrdeutig wird. Mit anderen Worten, es wird vermieden, verschiedene Kombinatio­ nen von Oligonucleotiden zu erlauben, wodurch dann im Ergeb­ nis mehr als eine definierte, vorbestimmte Nucleotid-Sequenz entstehen würde. Somit kommt es bei der Wahl der jeweiligen Ligationspartner darauf an, daß in einem Ligationsansatz nicht mehrere verschiedene Ligationsprodukte entstehen kön­ nen. Das bedeutet, daß in einer Ligationsreaktion genau zwei definierte Überhänge entstehen dürfen, entweder ein 5′-Über­ hang und ein 3′-Überhang oder genau zwei 5′-Überhänge oder genau zwei 3′-Überhänge. Es dürfen also niemals mehr als zwei verschiedene Überhangssequenzen am Ende eines Reak­ tionszyklus entstehen. Weiterhin dürfen die während der Re­ aktion entstehenden Überhangssequenzen nicht komplementär zueinander sein. Allerdings dürfen durchaus gleiche Über­ hangssequenzen in verschiedenen Ligationsansätzen, auch in­ nerhalb eines Ligationszyklus, entstehen.

Umfaßt von der vorliegenden Erfindung sind auch solche Aus­ führungsformen, in denen bei der Anlagerung der Hexanucleo­ tide Überhänge mit 4 bzw. 2 Nucleotiden entstehen, d. h. daß ein Hexanucleotid mit vier Nucleotiden eines komplementären Oligonucleotids und zwei Nucleotiden des zweiten komplemen­ tären Oligonucleotids hybridisiert. Entsprechendes gilt bei der Wahl von Oligonucleotiden anderer Länge. Falls derartige Kombinationen von Oligonucleotiden erwünscht sind, müssen selbstverständlich die vorstehend dargelegten theoretischen Überlegungen entsprechend berücksichtigt werden.

Ein kritischer Parameter für die Effizienz des erfindungsge­ mäßen Verfahrens ist die Stringenz der Hybridisierungsreak­ tion, die wesentlich durch die Reaktionstemperatur und die Konzentration der Reaktanten bestimmt wird. Dem Fachmann ist bekannt, wie er die Stringenzbedingungen einer gewünschten Hybridisierungsreaktion einstellt. In einer bevorzugten Aus­ führungsform beträgt das Reaktionsvolumen jeder der Reaktio­ nen im ersten Zyklus 10 µl. Der Reaktionsansatz besteht bei­ spielsweise aus Standard-Ligase Puffer (entsprechend Sambrock et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, USA), 1 mM ATP, 1 Weiss-Einheit/ml T4-Ligase, 1 Ein­ heit/Reaktionsansatz T4-Polynucleotid-Kinase und den ent­ sprechenden Oligonucleotiden in einer Konzentration von 0,5 pMol/ml bis 7,0 pMol/ml. Vor der ersten Ligations- bzw. Annealingreaktion wird vorzugsweise für 30 Minuten bei 37°C oder bei Raumtemperatur kinasiert. Die anschließende Liga­ tion läuft bei 0°C bis 20°C ab und dauert vorzugsweise etwa 2 Stunden.

Für die nächsten Schritte werden die Reaktionsansätze der vorherigen Zyklen entsprechend der Sequenzvorgabe zusammen­ gegeben, eventuell zusätzliche, schon kinasierte Oligo­ nucleotide zugesetzt und wieder für vorzugsweise etwa 2 Stunden bei 0°C bis 20°C inkubiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet gegenüber den kommer­ ziell eingesetzten Verfahren zur Synthese von Nucleotid-Se­ quenzen eine Reihe von Vorteilen. Aufgrund der minimalen er­ forderlichen Menge an Oligonucleotiden (einige Nanogramm je­ des Oligonucleotids pro gewünschter Nucleotid-Sequenz) er­ laubt dieses Verfahren, Segmente undefinierter Länge zu sehr geringen Kosten herzustellen. Die Kosten einer Ligationsre­ aktion selbst sind ebenfalls sehr moderat. Darüber hinaus sind Standard-Ligationsprotokolle (Sambrook et al., a.a.O.) relativ einfach zu handhaben und gehören zur Routine heuti­ ger molekularbiologischer Tätigkeiten. Probleme bei der An­ wendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können sich allen­ falls dann ergeben, wenn die zu synthetisierenden Nuclein­ säure-Segmente lange Sequenzwiederholungen oder palindromi­ sche Regionen enthalten. Falls derartige Nucleinssäure-Frag­ mente in den gewünschten Nucleotid-Sequenzen enthalten sind, werden diese Fragmente getrennt nach konventionellen Metho­ den synthetisiert und anschließend mit den nach dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren hergestellten Nucleinsäure-Fragmenten verknüpft.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann automatisiert werden. Der kritische Faktor der Automatisierung liegt in der opti­ malen Programmierung der sequentiellen Reaktionen. Die best­ geeignete Verknüpfungsstrategie und die Zusammensetzung der Reaktionsansätze in den verschiedenen Schritten wird dabei mit einer geeigneten, für den Fachmann leicht herstellbaren Software kalkuliert, die uneindeutige und unerwünschte Kom­ binationen ausschließt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann für eine Vielzahl von Zwecken im Bereich der rekombinanten RNA/DNA-Technologie eingesetzt werden. Beispielhaft werden hier genannt:

• a) Herstellung von langen Adaptor-Sequenzen (z. B. für die nahtlose Verknüpfung von Fusionsgenen; Modularsysteme; Sequenz-Tagging, etc.)
• b) Herstellung von "Designergenen" in welchen mehrere gleichzeitige, zielgerichtete Veränderungen durchgeführt werden;
• c) de-novo-Synthese von Genen, viralen Vektoren oder Plas­ mid-Vektoren für gentherapeutische und biotechnologische Anwendungen und Forschungszwecke;
• d) Erzeugung von mutierten DNA-Sequenzen.

Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch mit konventionellen weiteren DNA-Synthese- und Clonierungs­ verfahren kombiniert werden. Auch derartige Ausführungsfor­ men sind von der vorliegenden Erfindung umfaßt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem in Schritt (a) mindestens zwei Ligationen in verschiedenen Ansätzen durchgeführt wer­ den, mit denen unterschiedliche Fragmente der vorbestimmten Nucleotid-Sequenz hergestellt werden, die anschließend durch mindestens eine Ligationsreaktion gemäß Schritt (c_a) und/oder Schritt (c_b) miteinander verknüpft werden.

Das Verfahren gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform ist schematisch in Fig. 1 dargestellt. Auf der ersten Stufe, die den Schritten (a) und (b) des erfindungsgemäßen Verfah­ rens entspricht, werden in getrennten Reaktionsansätzen je­ weils 3 bis 8 Oligonucleotide vorzugsweise kinasiert und in äquimolaren Mengen durch Ligation und Annealing zu jeweils einem Nucleinsäure-Doppelstrangmolekül mit überhängenden Enden kombiniert. Nach Vollendung der ersten Synthesestufe (Dauer 1 bis 2 Stunden) werden in einem weiteren Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens die auf der ersten Stufe hergestellten Nucleinsäure-Fragmente aus den verschiedenen Reaktionsansätzen hier zu zwei längeren Nucleinsäure-Frag­ menten miteinander so durch Ligation verknüpft, daß wieder nur definierte Produkte entstehen können. In einem weiteren Schritt (d) werden die beiden längeren Nucleinsäure-Frag­ mente zum Endprodukt verknüpft. In der Figur weist die ge­ strichelte Linie auf weitere Reaktionspartner, die weitere Teile der gewünschten Nucleotid-Sequenz codieren, und dem Reaktionsansatz zugemischt werden können. Dies können bei­ spielsweise Produkte aus den Schritten (a) (b), (c_a) und/oder (c_b) sein.

Selbstverständlich können bei längeren gewünschten Nucleo­ tid-Sequenzen weitere Ligationsschritte durchgeführt werden, die beispielsweise zwei in Schritt (d) erhaltene Nuclein­ säure-Fragmente miteinander verknüpfen.

Ein wesentlicher Vorteil insbesondere auch dieser Ausfüh­ rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung syn­ thetischer Nucleotid-Sequenzen ist der wesentlich geringere Zeitaufwand, mit dem man das gewünschte Produkt erhält. Die Geschwindigkeit der Synthese ist im wesentlichen lediglich von der Anzahl der Startreaktionen abhängig. Die Möglichkeit der vollständigen Automatisierung des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens führt zu einer zusätzlichen Einsparung an Arbeits­ kräften und damit an Kosten. Wenn man beispielsweise an­ nimmt, daß in einer Ligasereaktion durchschnittlich 4 Oligo­ nucleotide zu einem doppelsträngigen DNA-Segment verknüpft bzw. hybridisiert werden, dann kann man in zwei Zyklen, die beispielsweise den Schritten (a) verbunden mit (b) oder Schritt (c_a), (c_b), (d_a) oder (d_b) entsprechen, ein Segment von 192 Basenpaaren Länge (ausgehend von 16 Startreaktionen) herzustellen. So umfaßt beispielsweise der erste Zyklus das Kinasieren, Hybridisieren und Ligieren der in einem Reak­ tionsansatz zusammengegebenen Reaktanten, wobei beliebig viele Reaktionsansätze parallel ablaufen können (Fig. 1, Schritte (a) (b) stellen den ersten Zyklus einer Synthese ge­ mäß dem hier beschriebenen Verfahren dar). Ein Anschluß­ zyklus benutzt die Ligationsprodukte aus dem vorhergehenden Zyklus als Teil des neuen Reaktionsansatzes (Fig. 1, Schritt (c) stellt den zweiten Zyklus einer Synthese dar). Falls man etwa 60 Startreaktionen ansetzt, dann kann man unter den gleichen Bedingungen ein Segment von etwa 800 Basenpaaren in drei Zyklen herstellen (Dauer 6 bis 8 Stunden). Die Staffe­ lung verschiedener Ansätze erlaubt die spezifische Synthese und Clonierung von Gensegmenten mit einer Länge von mehreren Kilobasen pro Mitarbeiter pro Tag. Dieser Wert liegt minde­ stens eine Zehnerpotenz über den Leistungen der konventio­ nellen maschinellen Synthese.

Falls die gewünschte Nucleotid-Sequenz eine Länge von mehr als 500 Basenpaaren aufweist, werden vorzugsweise mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Subfragmente nach im Stand der Technik bekannten Verfahren (vgl. z. B. Sambrook et al., a.a.O.) cloniert und, sofern erforderlich, vorab charakterisiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens ist mindestens ein Teil der Oligo­ nucleotide kinasiert.

Die Kinasierung der Oligonucleotide vor dem Einsatz im er­ findungsgemäßen Verfahren erlaubt durch den Ausschluß der Ligation bestimmter Enden der Oligonucleotide eine weitere Einschränkung der Produktion von unerwünschten DNA-Sequen­ zen. Für handelsübliche Ligasen ist die Phosphorylierung der Oligonucleotide in der Regel Voraussetzung für die Verknüp­ fungsreaktion. Vorzugsweise sind sämtliche im erfindungsge­ mäßen Verfahren eingesetzten Oligonucleotide kinasiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens besteht mindestens ein Teil der Oli­ gonucleotide aus Hexanucleotiden.

Vorzugsweise sind sämtliche der in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Oligonucleotide Hexanucleotide. Durch entsprechende Auswahl der Hexanucleotide entstehen Nuclein­ säure-Doppelstränge, bei denen bevorzugt jeweils drei Nucleotide des Hexanucleotids mit drei Nucleotiden des kom­ plementären Hexanucleotids überlappen. Die Verwendung von Hexanucleotiden bietet sowohl aus Kosten- wie auch aus tech­ nischen Gründen entscheidende Vorteile: Hexanucleotide las­ sen sich in großen Syntheseansätzen nach konventionellen Nucleinsäure-Syntheseverfahren (wie alle anderen im erfin­ dungsgemäßen Verfahren verwendbaren Oligonucleotide auch) kostengünstig herstellen. Die technischen Vorteile bestehen vor allem darin, daß es eine relativ überschaubare Anzahl von Hexanucleotiden gibt (4096), daß man durch eine ungerade Anzahl von Nucleotiden in den entstehenden Überhängen keine Rotationssymmetrie erreichen kann, daß man durch die Anzahl der verschiedenen Überhangssequenzen (64) eine ausreichende Kombinationsmöglichkeit der entstehenden Segmente hat. Es ist durchaus möglich, Oligonucleotide anderer Längen, z. B. von vier, fünf oder auch zehn Nucleotiden, zu benutzen, wo­ bei die Anzahl der Überhangbasen vorzugsweise mindestens drei betragen und eine ungerade Zahl sein sollte. Der Nach­ teil, der in der Verwendung längerer Nucleotide liegt, ist die große Anzahl der zu synthetisierenden Oligonucleotide (es gibt 16 384 verschiedene Heptamere, 65 536 verschiedene Oktamere, 262 144 verschiedene Nonamere und 10 48 576 verschie­ dene Dekamere). Es ist allerdings möglich, nur eine Teil­ menge aller verschiedener Oligonucleotide zu synthetisieren und trotzdem alle möglichen langen Nucleinsäuresegmente mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens herzustellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit einer Mischung von Oligonucleotiden unterschiedlicher Länge durchgeführt werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens stammen die Oligonucleotide aus einer fortlaufend durchnumerierten Synthesebibliothek.

Die Herstellung einer derartigen durchnumerierten Synthese­ bibliothek erlaubt die einfache Entnahme und Kombination von Oligonucleotiden für den Einsatz im erfindungsgemäßen Ver­ fahren. Die Synthesebibliothek umfaßt günstigerweise Oligo­ nucleotide sämtlicher möglichen Sequenzen. Werden beispiels­ weise Hexanucleotide als Oligonucleotide verwendet, so soll­ ten für das erfindungsgemäße Verfahren alle möglichen 4096 Hexanucleotide vorab synthetisiert werden. Sofern sie in großen Ansätzen (0,1 bis 1,0 mMol) hergestellt werden, ist genug Material für einen nachfolgenden sehr preisgünstigen Einsatz beim erfindungsgemäßen Verfahren vorhanden. Vorzugs­ weise werden die hergestellten Hexanucleotide fortlaufend durchnumeriert und liegen damit als Synthesebibliothek vor.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens werden pro Ligations- und Annealing- Reaktion der Schritte (a) und (b) 3 bis 8 Oligonucleotide eingesetzt.

Mit dieser Anzahl eingesetzter Oligonucleotide wird die Kom­ bination der Oligonucleotide durch Ligation und Annealing zu gewünschten Nucleotid-Sequenzen optimiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens werden äquimolare Mengen an Oligo­ nucleotiden eingesetzt, da überschüssige Oligonucleotide in weiteren Zyklen störend sein können.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens wird am Ende ein Zyklus, d. h. nach Durchführung der Schritte (a) (b), (c_a), (c_b), (d_a) und/oder (d_b) ein Erhitzungspuls gesetzt.

Durch das Setzen eines oder mehrerer Erhitzungspulse kann die Erzeugung von unerwünschten und Fehlpaarungen enthal­ tenden Hybridisierungen zwischen Oligonucleotiden während der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unterbun­ den werden. Geeigneterweise werden in dieser Ausführungsform thermostabile Ligasen eingesetzt. Ein Erhitzungspuls kann beispielsweise 5 min bei 50°C bis 60°C gesetzt werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens ist die vorbestimmte Nucleotid-Se­ quenz ein Gen bzw. wird die vorbestimmte Nucleotid-Sequenz von einem Gen codiert.

Die vorbestimmte Nucleotid-Sequenz wird in dem Falle von einem Gen codiert, daß sie eine RNA-Sequenz ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird nach Schritten (a) (b), Schritt (c_a), Schritt (c_b), Schritt (d_a), Schritt (d_b) und/oder Schritt (e) ein Reinigungsschritt zur Entfernung nicht-ligierter Oligonucleotide eingeführt. Eine solche Reinigung kann beispielsweise über Gelelektrophorese, HPLC oder andere, geeignete Verfahren erfolgen. Dabei können die gereinigten Zwischenprodukte für weitere Schritte auf dem Weg zum vorbestimmten, gewünschten Nucleotid-Sequenzend­ produkt eingesetzt werden. Besonders bevorzugt werden die Reinigungsschritte nach dem Setzen von Erhitzungspulsen so­ wie bei der Verwendung nicht-äquimolarer Mengen an einge­ setzten Oligonucleotiden durchgeführt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens wird die vorbestimmte Nucleotid-Se­ quenz als Matritze in einer Polymerase-Kettenreaktion einge­ setzt.

Der Fachmann weiß, wie er ein derartiges gewünschtes Endpro­ dukt als Matrize in einer Polymerase-Kettenreaktion einzu­ setzen und die Bedingungen dafür auszuwählen hat.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens wird die vorbestimmte Nucleotid-Se­ quenz als Matrize in einer Ligase-Kettenreaktion eingesetzt. Auch hier weiß der Fachmann, wie er die entsprechenden Be­ dingungen zur Durchführung einer derartigen Reaktion aus zu­ wählen hat.

Die beiden vorstehend genannten bevorzugten Ausführungsfor­ men des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglichen die Ampli­ fizierung der vorbestimmten Nucleotid-Sequenzen, ohne diese clonieren zu müssen.

Die Erfindung betrifft ferner einen Vektor, der eine Nucleo­ tid-Sequenz enthält, die nach dem erfindungsgemäßen Verfah­ ren hergestellt worden ist.

Die vorbestimmte Nucleotid-Sequenz, die das Endprodukt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, kann leicht in Vektoren cloniert werden, die in ihrem sogenannten Polylinker Re­ striktionsstellen enthalten, die geeignete Überhänge für die Clonierung nach Restriktion mit dem entsprechenden Enzym aufweisen. Sofern Hexanucleotide für die Herstellung der ge­ wünschten, vorbestimmten Nucleotid-Sequenz eingesetzt wur­ den, weist die Clonierungsstelle im Polylinker nach Spaltung mit dem Restriktionsenzym passende Überhänge von vorzugs­ weise drei Nucleotiden (entweder 5′ oder 3′) auf.

Die Herstellung geeigneter Vektoren, die für derartige Clo­ nierungen verwendet werden können, ist im Stand der Technik bekannt (vgl. Sambrook et al., a.a.O. und darin zitierte Re­ ferenzen). Darüber hinaus sind derartige Vektoren im Handel erhältlich.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der er­ findungsgemäße Vektor ein Expressionsvektor.

Mit einem derartigen Expressionsvektor lassen sich die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Nucleotid-Se­ quenzen in einem geeigneten Wirt exprimieren. Die Expression derartiger Nucleotid-Sequenzen ist vor allem dann wünschens­ wert, wenn sie ein z. B. kommerziell interessantes Gen dar­ stellen.

Die Erfindung betrifft schließlich Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert worden sind. Geeignete Wirtszellen können, je nach der Art des Vektors, Bakterien, Hefen, Pilze, Pflanzen oder Teile davon, z. B. Pflanzenzellen, ferner Säugerzellen wie z. B. CHO-Zellen sein. Geeignete derartig transformierte Wirtszellen können beispielsweise auch zur Erzeugung transgener Tiere verwendet werden. Verfahren zur Herstellung derartiger transgener Tiere sind im Stand der Technik gut bekannt.

Die Figur zeigt

Fig. 1 Schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstel­ lung von vorbestimmten Nucleotid-Sequenzen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung einer vorbestimmten DNA-Sequenz unter Verwendung von Hexanucleotiden als Ausgangsmaterial

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die nachfolgend dargestellte Sequenz hergestellt:

In dieser Sequenz tritt das Triplett 5′-GTA-3′ mehrfach auf. Daher ist es notwendig, die Ligations- und Annealing-Reak­ tionen so auszuwählen, daß eindeutige Produkte entstehen. Dazu wird die Sequenz in Hexamere zerlegt:

Allein durch die Zerlegung in Hexamere wurde eines der 5′-GTA-3′-Tripletts aufgelöst. Zwei Tripletts stellen 3′-Über­ hänge dar, die im oberen Strang lokalisiert sind, eines stellt einen 5′-Überhang dar. Aufgrund dieser Verteilung muß nur noch gewährleistet werden, daß die beiden Hexanucleo­ tide, die die 3′-Überhänge bilden und das Triplett 5′-GTA-3′ aufweisen, nicht in einem Ligationsansatz zusammen einge­ setzt werden.

Dies wird durch den Einsatz der entsprechenden Hexanucleo­ tide in zwei getrennten Reaktionsansätzen erreicht, wobei das Endprodukt, d. h. ein DNA-Doppelstrang mit der vorstehend dargestellten Sequenz, in einer weiteren Ligationsreaktion gemäß Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens herge­ stellt wird.

Nach erstem Zyklus erzeugte Segmente:

Die in diesem Beispiel dargestellte Strategie zur Herstel­ lung einer vorbestimmten DNA-Sequenz ist vor der Herstellung weiterer DNA-Sequenzen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend anzuwenden. Da die Zahl der möglichen Gesamt­ kombinationen beispielsweise beim Einsatz von Hexanucleoti­ den als Ausgangsmaterialien durch verschiedene Parameter be­ stimmt wird (64 Überhangkombinationen, verschiedene Anzahl von Hexanucleotiden je Ligationsansatz, verschieden große Teilsequenzen je Ligationsansatz) ergibt sich eine derartig große Anzahl an Kombinationen, daß jede denkbare Sequenz mit dem erfindungsgemäßen Verfahren tatsächlich hergestellt wer­ den kann, mit der Ausnahme von Sequenzen, die umfangreiche Sequenzwiederholungen enthalten.

Claims (20)

1. Verfahren zur Herstellung vorbestimmter Nucleotid-Se­ quenzen, das die folgenden Schritte umfaßt:

• (a) Ligation von mindestens zwei Oligonucleotiden be­ kannter Sequenz;
• (b) Annealing von mindestens einem Oligonucleotid mit mindestens zwei in Schritt (a) eingesetzten Oligo­ nucleotiden komplementärer Sequenz, wobei das Oli­ gonucleotid und die komplementären Oligonucleotide einen Nucleinsäure-Doppelstrang bilden, und der Nucleinsäure-Doppelstrang mindestens ein überhän­ gendes Ende aufweist;
• (c_a) Ligation des in Schritt (b) erhaltenen Nuclein­ säure-Doppelstranges mit mindestens einem weiteren Nucleinsäure-Doppelstrang, der ein kompatibles überhängendes Ende aufweist und nach den Schritten (a) und (b) hergestellt wurde; und/oder
• (c_b) Ligation des in Schritt (b) erhaltenen Nuclein­ säure-Doppelstranges mit mindestens einem weiteren Oligonucleotid bekannter Sequenz, das sich an ein überhängendes Ende des Nucleinsäure-Doppelstranges anlagern und damit ligiert werden kann; ferner ge­ gebenenfalls
• (d_a) Ligation des in Schritt (c_a) oder (c_b) erhaltenen Nucleinsäure-Doppelstranges mit mindestens einem weiteren Nucleinsäure-Doppelstrang, der ein kompa­ tibles überhängendes Ende aufweist und nach den Schritten (a) und (b) und gegebenenfalls (c_a) oder (c_b) hergestellt wurde; und/oder
• (d_b) Ligation des in Schritt (c_a) oder (c_b) erhaltenen Nucleinsäure-Doppelstranges mit mindestens einem weiteren Oligonucleotid bekannter Sequenz, das sich an ein überhängendes Ende des Nucleinsäure-Dop­ pelstranges anlagern und damit ligiert werden kann; und gegebenenfalls
• (e) weitere Ligationen von Produkten, die mit den Schritten (a) und (b); (a), (b) und (c_a) oder (c_b); und/oder (a) bis (d) erhalten wurden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (a) zeitlich vor Schritt (b) abläuft.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (b) zeitlich vor Schritt (a) abläuft.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schritte (a) und (b) im wesentlichen gleichzeitig und vorzugsweise gleichzeitig ablaufen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die vorbestimmte Nucleotid-Sequenz eine DNA-Sequenz ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die vorbestimmte Nucleotid-Sequenz eine RNA-Sequenz oder ein RNA/DNA-Hybrid ist.

7. Verfahren nach einen der Ansprüche 1 bis 6, wobei in Schritt (a) mindestens zwei Ligationen in verschiedenen Ansätzen durchgeführt werden, mit denen unterschiedliche Fragmente der vorbestimmten Nucleotid-Sequenz herge­ stellt werden, die anschließend durch mindestens eine Ligationsreaktion gemäß Schritt (c_a) und/oder Schritt (c_b) miteinander verknüpft werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei minde­ stens ein Teil der Oligonucleotide kinasiert ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei minde­ stens ein Teil der Oligonucleotide aus Hexanucleotiden besteht.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Oligonucleotide aus einer fortlaufend durchnumerierten Synthesebibliothek stammen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei pro Ligations- und Annealing-Reaktion der Schritte (a) und (b) 3 bis 8 Oligonucleotide eingesetzt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei äqui­ molare Mengen an Oligonucleotiden eingesetzt werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei nach Durchführung der Schritte (a) (b), (c_a), (c_b), (d_a) und/oder (d_b) ein Erhitzungspuls gesetzt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die vorbestimmte Nucleotid-Sequenz ein Gen ist bzw. von einem Gen codiert wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei nach den Schritten (a) (b), (c_a), (c_b), (d_a), (d_b) und/oder (e) ein Reinigungsschritt zur Entfernung nicht-ligierter Oligonucleotide eingefügt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die vorbestimmte Nucleotid-Sequenz als Matrize in einer Po­ lymerase-Kettenreaktion eingesetzt wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die vorbestimmte Nucleotid-Sequenz als Matrize in einer Li­ gase-Kettenreaktion eingesetzt wird.

18. Vektor, enthaltend eine Nucleotid-Sequenz, die nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 hergestellt wurde.

19. Vektor nach Anspruch 18, der ein Expressionsvektor ist.

20. Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 18 oder 19 transformiert ist.