DE10232507C1 - Verfahren zum sequenzkontrollierten Herstellen eines Nukleinsäureprodukts - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zum sequenzkontrollierten Herstellen eines Nukleinsäureprodukts (NP) vorgeschlagen, bei welchem besonders zuverlässig sequenzkontrolliert und mit hoher Ausbeute aus gegebener Nukleinsäuresequenzinformation (NSI) zu einer gewünschten Zielsequenz (ZS) ein Nukleinsäureprodukt (NP) hergestellt werden kann. Dazu werden Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) bereitgestellt, komplementär einander zugeordnet, in vorbestimmten Mengen zusammengebracht und im Rahmen einer Hybridisierungsreaktion abschnittsweise miteinander verbunden. Es schließt sich ein Auffüllen und/oder Schließen von vorliegenden Stranglücken (SL, KL) an. Dabei wird mindestens ein Nukleinsäurepolymerasesystem verwendet. Durch die spezifische Anordnung und Ausgestaltung der Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) und das Verwenden des Nukleinsäurepolymerasesystems kann die Erzeugung des Nukleinsäureprodukts (NP) mit einer hohen Ausbeute und Verifikationsrate durchgeführt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum sequenzkontrollier­ ten Herstellen eines Nukleinsäureprodukts und insbesondere ein Verfahren zum Herstellen synthetischer Gene.

Viele Produkte und Verfahren der modernen Molekularbiologie, Biochemie und Gentechnik beruhen auf der Möglichkeit, Nuk­ leinsäureprodukte auf der Grundlage vorliegender Sequenzin­ formationen auf einfache und verifizierbare und verlässliche Art und Weise herstellen zu können. Will man bei einer vor­ liegenden Sequenzinformation die betreffende Sequenz in di­ rekter Art und Weise z. B. ab initio synthetisieren, so ergibt sich beim schrittweisen Aufbau der Sequenz das Problem, dass der Aufbau der Sequenz von einem Schritt zu einem nachfolgen­ den immer mit einem, wenn auch kleinen, so doch von Null verschiedenen Fehler verbunden ist. Das bedeutet, dass z. B. beim Hinzufügen eines Nukleinsäurebausteins zu einer bereits bestehenden Teilsequenz die entsprechende Reaktion nur mit einer von 100% deutlich verschiedenen Ausbeute realisierbar ist. Das heißt, es entstehen auch immer abweichende und nicht gewünschte Syntheseprodukte. Durch entsprechende Nach­ kontroll- und Aufreinigungsverfahren können derzeit Nuklein­ säureprodukte realisiert und verifiziert werden, welche die Anzahl von etwa 35 bis 50 Nukleinsäureeinheiten, zum Beispiel entsprechenden Basenpaarungen, nicht überschreiten.

Insgesamt gesehen bedeutet diese vorliegende Problematik für bestehende Anforderungen bei längeren Sequenzen, dass die notwendige Qualität eines Nukleinsäureprodukts nicht in aus­ reichendem Maße sichergestellt werden kann. Des Weiteren nimmt die Verifikation und Überprüfung der Qualität entspre­ chender Nukleinsäureprodukte mit steigender Komplexität der Sequenz, also der Nukleinsäuresequenzinformation einen immer größeren Zeit- und somit auch Kostenanteil ein.

Aus der DE 100 46 069 A1 ist ein Verfahren zur Mikro- Polynukleotidsynthese bekannt, bei welchem Polynukleotide unter Verwendung mikrofluidischer Systeme herstellbar sind. Dabei wird ein Startermoleküloligonukleotid verwendet, wel­ ches eines der Enden eines Stranges der zu synthetisierenden Polynukleotidsequenz umfasst. Es werden ein oder mehrere Hybridisierungsschritte durchgeführt an Sequenzabschnitten eines zu synthetisierenden Strangs oder an deren komplemen­ tären Sequenzabschnitten, wobei die jeweiligen endständigen Sequenzen jeweils so überlappen, dass sie die Hybridisierung mit einem endständigen Teilabschnitt aus dem Startermolekül ermöglichen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum sequenzkontrollierten Herstellen eines Nukleinsäureprodukts anzugeben, bei welchem Nukleinsäureprodukte auf besonders einfache Art und Weise mit hoher Qualität und Verlässlich­ keit mit vergleichsweise hohen Ausbeuten erzeugbar sind.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsäureprodukts erfindungsgemäß mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der abhängigen Un­ teransprüche.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum sequenzkontrollierten Herstellen eines Nukleinsäureprodukts ist insbesondere zur Ausbildung von Nukleinsäureprodukten von mehr als 50 Basen oder Basenpaaren geeignet und ausgebildet.

Zunächst wird Nukleinsäuresequenzinformation zu einer ge­ wünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäurepro­ dukts bereitgestellt. Diese Sequenzinformation kann zum Bei­ spiel die direkte Information zu einer Desoxyribonukleinsäu­ resequenz oder einer Ribonukleinsäuresequenz oder derglei­ chen sein. Es kann sich auch um indirekte Information han­ deln, zum Beispiel um eine Aminosäuresequenz, für welche die gewünschte Zielsequenz codiert.

Es werden ferner erfindungsgemäß eine Mehrzahl Sequenzprimer und eine Mehrzahl Koordinationsprimer bereitgestellt.

Bei den Primern handelt es sich um Polymere, welche als Star­ terelemente für eine Synthese eines übergeordneten Polymers dienen. Es kann sich dabei zum Beispiel um Teile der Zielse­ quenz handeln, zum Beispiel um Oligonukleotide. Bei der nach­ folgenden Synthese oder Hybridisierungsreaktion sind die Sequenzprimer oder Koordinationsprimer zum Beispiel als Be­ standteile des herzustellenden Nukleinsäureprodukts einge­ baut. Nachfolgend werden die Begriffe Desoxyribonukleinsäure, DNS, DNA einerseits und die Begriffe Ribonukleinsäure, RNS, RNA synonym verwendet.

Die Sequenzprimer überdecken einen ersten Einzelstrang des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts gemäß der Nukleinsäurese­ quenzinformation zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugen­ den Nukleinsäureprodukts abschnittsweise und paarweise dis­ junkt.

Das heißt, dass ein Teil der Nukleinsäuresequenzinformation der Zielsequenz, nämlich eines Einzelstrangs davon durch die Sequenzprimer getragen wird, wobei die jeweiligen Sequenzpri­ mer, wenn sie gemäß der Nukleinsäuresequenzinformation ange­ ordnet würden, einander nicht überlappten. Das heißt, im Hinblick auf die Nukleinsäuresequenzinformation bestehen zwischen benachbarten Sequenzprimern höchstens Lücken, vor­ zugsweise besteht zwischen je zwei Sequenzprimern im Hinblick auf die Nukleinsäuresequenzinformation immer eine Sequenzlü­ cke.

Die Koordinationsprimer ihrerseits überdecken einen hinsicht­ lich der Nukleinsäuresequenzinformation zur gewünschten Ziel­ sequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts komplementä­ ren zweiten Einzelstrang oder Komplementärstrang zum zu er­ zeugenden Nukleinsäureprodukt gemäß der Nukleinsäuresequenz­ information zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts abschnittsweise und paarweise disjunkt.

Das heißt, zu dem erstgenannten ersten Einzelstrang besteht gemäß der Nukleinsäuresequenzinformation der gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts ein kom­ plementärer zweiter Einzelstrang, der auch als Komplementär­ strang bezeichnet wird. Die Koordinationsprimer ihrerseits überdecken im Hinblick auf die Nukleinsäuresequenzinformation der gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäure­ produkts diesen komplementären zweiten Einzelstrang oder Komplementärstrang ebenfalls abschnittsweise und disjunkt. Das heißt wiederum, dass die Koordinationsprimer, die zum ersten Einzelstrang komplementäre Nukleinsäuresequenzinforma­ tion des Komplementärstrangs abschnittsweise tragen, wobei wiederum höchstens Lücken, aber keine Überdeckungen der Koor­ dinationsprimer zueinander vorkommen. Gemäß der Nukleinsäure­ sequenzinformation angeordnete benachbarte Koordinationspri­ mer weisen also zwischen sich höchstens eine Lücke auf, über­ decken sich jedoch nicht. Vorzugsweise ist zwischen je zwei benachbarten Koordinationsprimern immer eine Lücke vorgese­ hen.

Die Mehrzahl Sequenzprimer und die Mehrzahl Koordinationspri­ mer werden einander komplementär zugeordnet. Dies bedeutet kurz gesagt, dass sämtliche Sequenzprimer und sämtliche Koor­ dinationsprimer die gesamte vorliegende Nukleinsäuresequenz­ information zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts in irgendeiner Form repräsentieren, wobei jeweils Lücken zwischen benachbarten Sequenzprimern oder Koordinationsprimern komplementär überdeckt werden durch einen Koordinationsprimer oder Sequenzprimer, welcher gerade die zwischen den benachbarten Primern bestehenden Lücken komplementär abdeckt oder überdeckt. Dies gilt auch für die Endbereiche, wobei, sollte in Bezug auf die Nukleinsäurese­ quenzinformation ein endständiger Primer nicht das Ende der Zielsequenz oder dessen Komplement bilden, sondern zwischen dem endständigen Primer und dem eigentlichen Ende der Zielse­ quenz oder dem Komplement eine Lücke bestehen, ein zugeordne­ ter komplementärer Primer vorliegt, der diese Lücke komple­ mentär überdeckt und ausfüllt.

Insgesamt bedeutet dies, dass das komplementäre Zuordnen der Mehrzahl Sequenzprimer und der Mehrzahl Koordinationsprimer zueinander dadurch erfolgt, dass erstens zu zueinander be­ nachbarten Bereichen der Erden der Sequenzen zu gemäß der Nukleinsäuresequenzinformation zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts unmittelbar aufeinan­ der folgende Sequenzprimern jeweils ein dazu komplementärer Koordinationsprimer derart vorgesehen wird, dass dessen Se­ quenz die Bereiche der Enden der Sequenzen im benachbarten Sequenzprimer gemäß der Nukleinsäuresequenzinformation zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäurepro­ dukts komplementär überdeckt, und dass zweitens zu zueinander benachbarten Bereichen der Enden der Sequenzen zu gemäß der Nukleinsäuresequenzinformation zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts unmittelbar aufeinan­ der folgende Koordinationsprimern jeweils ein dazu komplemen­ tärer Sequenzprimer derart vorgesehen wird, dass dessen Se­ quenz die Bereiche der Enden der Sequenzen der benachbarten Koordinationsprimer gemäß der Nukleinsäuresequenzinformation zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäure­ produkts komplementär überdeckt.

Die Sequenzprimer und die Koordinationsprimer werden in vor­ bestimmten Mengen zusammengebracht.

Es wird eine Hybridisierungsreaktion zwischen Sequenzprimern und Koordinationsprimern durchgeführt. Dabei wird mindestens ein zumindest abschnittsweise doppelsträngiger zusammenhän­ gender Nukleinsäurestrang gemäß mindestens eines zusammenhän­ genden Abschnitts der Nukleinsäuresequenzinformation zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäurepro­ dukts ausgebildet.

Ferner werden im ausgebildeten Nukleinsäurestrang ebenfalls vorliegende Stranglücken oder Sequenzlücken gemäß der Nuk­ leinsäuresequenzinformation zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts unmittelbar aufeinander folgender Sequenzprimer und/oder Koordinationsprimer aufge­ füllt und/oder geschlossen.

Weiterhin werden im ausgebildeten Nukleinsäurestrang gegebe­ nenfalls vorliegende Stranglücken oder Sequenzlücken zwischen einem gemäß der Nukleinsäuresequenzinformation zu gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts endstän­ digen Endes eines Sequenzprimers oder Koordinationsprimers und einem gemäß der Nukleinsäuresequenzinformation zur ge­ wünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts gegebenenfalls vorliegenden und komplementär gegenüberstehen­ den endständigen komplementären Ende eines komplementären Koordinationsprimers bzw. komplementären Sequenzprimers hin aufgefüllt und/oder geschlossen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dabei, dass bei den Schritten des Auffüllens und/oder des Schließens ausgebildeter Stranglücken oder Sequenzlücken mindestens ein Nukleinsäurepolymerasesystem, wobei Nukeinsäureeinheiten verwendet werden und wobei insbesondere im Falle von zu syn­ thetisierenden DNS-Sequenzen eine DNS-Polymerase mit proof­ reading-(3'-5'-Exonuklease)-Aktivität, insbesondere Pfu-DNA- Polymerase, verwendet wird.

Kernideen der vorliegenden Erfindung sind somit das disjunkte und komplementäre Bereitstellen, Anordnen und Zuordnen von Sequenzprimern und Koordinationsprimern gemäß vorliegender Nukleinsäuresequenzinformation zu einer gewünschten Zielse­ quenz eines zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts zu deren Hybridisierung und das Auffüllen dabei gegebenenfalls erzeug­ ter Stranglücken oder Sequenzlücken im Hybridisierungsprodukt unter Verwendung mindestens eines Nukleinsäurepolymerase­ systems.

Durch diese Maßnahmen wird aufgrund der hohen Spezifizität von Nukleinsäurepolymerasesystemen und aufgrund der erfin­ dungsgemäßen Anordnung und Hybridisierung der Sequenzprimer und Koordinationsprimer ein Nukleinsäureprodukt mit hoher Qualität, das heißt mit besonders geringer Fehlerrate er­ zeugt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist es vorgesehen, dass die Sequenzen jeweils einander zugeordneter Sequenzprimer und Koordinationsprimer so gewählt werden, dass sie sich hinsichtlich der Nukleinsäuresequenzinformation zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäurepro­ dukts und hinsichtlich der sich komplementär gegenüberstehen­ den Bereiche der Enden der Sequenz in einem zusammenhängenden Endübergangsbereich einander komplementär überdeckend ergän­ zen zu einem Enddoppelstrangabschnitt. Das bedeutet, dass dabei nicht nur die Lücken durch die jeweils zugeordneten Primer komplementär überdeckt werden, sondern dass sich dort die einander zugeordneten Primer auch noch bereichsweise mit ihren Enden gegenüberstehen. Dadurch wird die Hybridisie­ rungsreaktion auf geeignete Weise realisierbar und steuerbar.

Dabei ist es insbesondere vorgesehen, dass der Überlappungs­ bereich bzw. der Enddoppelstrangabschnitt jeweils mit einer Mehrzahl von Nukleinsäureeinheiten vorgesehen wird. Dabei ist einerseits zu berücksichtigen, dass eine steigende Mehrzahl komplementär überlappender Nukleinsäureeinheiten zu einer höheren Spezifizität führt, dass andererseits eine geringere Zahl von komplementär sich überlappender Nukleinsäureeinhei­ ten das Bereitstellen von kleineren Primern und damit eine kostengünstigere Vorgehensweise ermöglicht, zumal dann länge­ re Stranglücken ausgebildet und durch das Polymerasesystem besonders fehlerfrei aufgefüllt werden können.

Es wird dabei bevorzugt, dass die Mehrzahl Nukleinsäureein­ heiten, welche sich komplementär überdecken, 5 bis 10, 10 bis 20 und/oder 20 bis 40 Nukleinsäureeinheiten umfassen.

Bei einer anderen Alternative des erfindungsgemäßen Verfah­ rens ist es vorgesehen, dass durch das Auffüllen und/oder Schließen von Stranglücken und/oder Sequenzlücken mit Nuk­ leinsäureeinheiten hinsichtlich sich komplementär gegenüber­ stehender aufgefüllter Stranglücken und/oder aufgefüllter Sequenzlücken der Koordinationsprimer und/oder Sequenzprimer Innendoppelstrangabschnitte gebildet werden. Das bedeutet, dass dort, wo beim Hybridisierungsprodukt zunächst eine Stranglücke oder Sequenzlücke vorherrscht, nach dem Auffüllen ein innen liegender Doppelstrangabschnitt, also ein Innendop­ pelstrangabschnitt ausgebildet ist.

Dabei ist es vorgesehen, dass der Innendoppelstrangabschnitt jeweils mit einer Mehrzahl Nukleinsäureeinheiten ausgebildet wird, welche insbesondere in etwa ein ganzzahliges Vielfaches oder ein n-faches der Mehrzahl Nukleinsäureeinheiten der jeweils zugeordneten Endüberlappungsbereiche bzw. der Enddop­ pelstrangabschnitte ist, insbesondere mit n = 2, 4, 8, 16. Dadurch wird insbesondere erreicht, dass zuvor die Lücken und dann nachfolgend die Innendoppelstrangabschnitte besonders breite Bereiche einnehmen, während die Endbereiche und ent­ sprechend die Enddoppelstrangabschnitte in ihrem Umfang be­ schränkt werden. Auch dadurch werden die Qualität und Ausbeu­ te gesteigert.

Grundsätzlich ist es denkbar, dass die Hybridisierungsreakti­ on und die Reaktionen zum Auffüllen und/oder Schließen von Stranglücken oder Sequenzlücken im Sinne einer Ein-Topfreak­ tion durchgeführt werden, wobei bestimmte Mengen Sequenzpri­ mer und Koordinationsprimer in einem gemeinsamen Reaktionsbe­ reich zusammengebracht werden und dann gemäß den erfindungs­ gemäßen Reaktionsschritten zum Hybridisieren und Auffüllen zur Reaktion gebracht werden. Dies hat aber zur Folge, dass bei vergleichsweise langen Zielsequenzen die Reaktionsbedin­ gungen für die Vielzahl aufeinander folgender Einzelreaktio­ nen in komplexer Art und Weise eingestellt werden müssen. Weiterhin ist dabei problematisch, dass entweder eine sehr große Anzahl von Sequenzprimern und Koordinationsprimern gleichzeitig zur Reaktion gebracht werden muss, oder dass mit einer geringeren Anzahl langkettiger Sequenzprimer und/oder Koordinationsprimer gearbeitet werden muss. Beide Fälle sind im Hinblick auf die dann einzustellenden Reaktionsbedingungen und im Hinblick auf die Qualitätssicherung problematisch, zumal auch höhere Kosten dadurch anfallen, dass initial gege­ benenfalls langkettigere Sequenzprimer und/oder Koordinati­ onsprimer bereitgestellt werden müssen.

Daher ist es alternativ vorgesehen, das erfindungsgemäße Verfahren im Rahmen einer Mehr-Topfreaktion durchzuführen, wobei vorbestimmte Mengen Sequenzprimer und Koordinationspri­ mer in einer Mehrzahl N von Reaktionsbereichen Rj aufgeteilt zusammengebracht werden und dann nachfolgend zur Hybridisie­ rungsreaktion und zur Reaktion des Auffüllens und/oder Schließens von Stranglücken oder Sequenzlücken gebracht wer­ den.

Dabei ist es insbesondere gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, dass das Aufteilen der Nukleinsäuresequenzinformation der Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts und/oder das Aufteilen in verschiedene Reaktionsbereiche gemäß einer vorgegebenen Aufteilung A der Nukleinsäuresequenzinformation zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäure­ produkts und/oder einer vorgegebenen Verteilung zugeordneter Sequenzprimer und Koordinationsprimer erfolgt.

Die Aufteilung A der Zielsequenz des zu erzeugenden Nuklein­ säureprodukts in einander zugeordnete Sequenzprimer und Koor­ dinationsprimer oder in Sequenzabschnitte dafür kann hin­ sichtlich der Überlappungsbereiche oder Endüberlappungsberei­ che der einander zugeordneten Sequenzprimer und Koordinati­ onsprimer vor der Durchführung der entsprechenden Reaktion erfolgen, insbesondere mittels eines Algorithmus, welcher verschiedene Gesichtspunkte des erfindungsgemäßen Verfahrens optimiert.

Dabei kann zum Beispiel ein wesentlicher Aspekt eine gute Qualitätskontrolle von Anfang an sein. Das bedeutet zum Bei­ spiel, dass man gegebenenfalls mit sequenzkontrollierten Primern von nur bis zu 50 Basen Sequenzlänge arbeitet. Des­ halb kann es auch sinnvoll sein, zur Erzielung eines deutli­ chen Kostenvorteils die Sequenzprimer oder Koordinationspri­ mer so zu wählen, dass die entstehenden Sequenzlücken oder Stranglücken möglichst groß werden. Dabei kann es auch sinn­ voll sein, die Reaktions- oder Hybridisierungstemperatur für das Hybridisieren der einander zugeordneten Sequenzprimer und Koordinationsprimer derart zu wählen, dass die jeweiligen Endüberlappungsbereiche eine möglichst hohe Spezifizität und dabei ggf. eine möglichst geringe Länge aufweisen, so dass dort z. B. eine kürzere Überlappung ausreicht, um die Hybridi­ sierungsreaktion doch spezifisch, d. h. fehlerfrei ausführen zu können. Andererseits kann es von Bedeutung sein, eine größtmögliche Länge der Sequenzprimer und/oder der Koordina­ tionsprimer auszuwählen, wodurch sich die Anzahl erforderli­ cher Einzelreaktionen, d. h. erforderlicher Reaktionsbereiche für die Mehr-Topfreaktion ergibt. Die Lücken zwischen Über­ lappungsbereichen, das heißt die Sequenzlücken und die Stranglücken sollen auch deshalb möglichst groß sein, um Ausgangsmaterial und den Aufwand dafür einzusparen. Für die Spezifizität der Hybridisierungsreaktion sollten die Überlap­ pungsbereiche, d. h. die Endüberlappungsbereiche der Koordina­ tionsprimer und Sequenzprimer möglichst hohe Anteile an den Nukleotiden auf der Basis von Guanosin und Cytidin tragen. Des Weiteren kann der Algorithmus zur Erzielung einer beson­ ders günstigen Aufteilung der Nukleinsäuresequenzinformation auch berücksichtigen, dass mögliche ungünstige Sektoren der Strukturen beim Hybridisieren und Auffüllen und gegebenen­ falls bei einer späteren Amplifikation ausgeschlossen werden.

Die Reaktions- oder Hybridisierungstemperaturen für das Hybridisieren der einander zugeordneten Sequenzprimer und Koordinationsprimer und/oder von einander zugeordneten Reak­ tionszwischenprodukten können z. B. jeweils derart gewählt werden, dass sie gleiche oder sehr ähnliche Werte annehmen, insbesondere im Bereich eines Unterschieds von 1K oder 1°C, und/oder dass möglichst viele Einzelreaktionen oder Mehr- Topfreaktionen in jeweils einzelnen Reaktionsbereichen gleichzeitig und gemeinsam gesteuert durchgeführt werden können, z. B. in einem gemeinsamen PCR-Cycler-Gerät, insbeson­ dere bei einer Aufteilung (A) in mehr als vier Reaktionsbe­ reiche. Dies dient der Prozessökonomie im Hinblick auf Zeit- und Materialersparnis.

Alternativ oder zusätzlich können die Reaktions- oder Hybri­ disierungstemperaturen (Tm) für das Hybridisieren der einan­ der zugeordneten Sequenzprimer und Koordinationsprimer und/oder von einander zugeordneten Reaktionszwischenprodukten jeweils derart gewählt werden, dass sie sehr unterschiedliche Werte annehmen, insbesondere im Bereich eines Unterschieds von mehr als 1K oder 1°C, und/oder dass in einer zumindest teilweisen Ein-Topfreaktion möglichst viele Einzelreaktionen nacheinander in einem gemeinsamen Reaktionsbereich gesteuert durchgeführt werden.

Eine weitere Alternative des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, dass die Sequenzprimer und/oder die Koordinationsprimer so ausgewählt und bereitgestellt werden, dass die durch sie jeweils erfassten Mehrzahlen Nukleinsäure­ einheiten und die Mächtigkeit ihrer Sequenzen etwa gleich sind, so dass insbesondere die zugrunde liegende Nukleinsäu­ resequenzinformation auf die Mehrzahl Sequenzprimer und/oder die Mehrzahl Koordinationsprimer gleichmäßig verteilt wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass für die vorgegebene Auf­ teilung der Nukleinsäuresequenzinformation zur gewünschten Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts und/oder die vorgegebene Aufteilung der zugeordneten Sequenzprimer und/oder Koordinationsprimer gemäß einer Zweierpotenz er­ folgt, insbesondere gemäß 2^N+1 mit N = 0, 1, 2, . . .

Im Hinblick auf die Aufteilung der Nukleinsäuresequenzinfor­ mation zur gewünschten Zielsequenz ist es insbesondere vorge­ sehen, dass nach Abschluss der erfindungsgemäßen Schritte des Durchführens der Hybridisierungsreaktion des Auffüllens et­ waig vorhandener Sequenzlücken unter Verwendung mindestens eines Nukleinsäurepolymerasesystems die Inhalte der einzelnen Reaktionsbereiche in Bezug auf die Nukleinsäuresequenzinfor­ mation der Zielsequenz des zu erzeugenden Nukleinsäurepro­ dukts benachbarter Reaktionsbereiche paarweise zusammenge­ bracht werden, dass die erhaltenen und zusammengebrachten Reaktionsprodukte als Doppelstränge in Einzelstränge auf­ gespalten werden und dass nachfolgend die Schritte des Durch­ führens der Hybridisierungsreaktion und des Auffüllens und/oder Schließens gegebenenfalls vorliegender Stranglücken unter Verwendung eines Nukleinsäurepolymerasesystems erneut durchgeführt werden. Das bedeutet insgesamt, dass sukzessive über das Vereinigen benachbarter Reaktionsbereiche immer größere Abschnitte zur Nukleinsäuresequenzinformation der Zielsequenz synthetisiert werden.

Demzufolge ist es vorgesehen, dass die zuletzt beschriebene Vorgehensweise so oft wiederholt wird, bis sämtliche ur­ sprünglichen Reaktionsbereiche in einem gemeinsamen Reakti­ onsbereich zusammengefasst vorliegen. Auf diese Art und Weise können selbst bisher nicht erreichte Sequenzlängen sukzessive mit besonders hoher Ausbeute und besonders hoher Qualität synthetisiert werden.

Zur Steigerung der Ausbeute werden die Reaktionsschritte des Hybridisierens und des Auffüllens und/oder Auffüllens der Stranglücken oder Sequenzlücken jeweils mit einer Polymerase­ kettenreaktion oder PCR zur Vervielfältigung der jeweiligen Reaktionsprodukte verbunden. Dies geschieht in der gängigen Art und Weise, so dass die Reaktionsprodukte hinsichtlich ihrer Ausbeute stark steigerbar sind.

Dabei ist es insbesondere vorgesehen, dass zur Erhöhung der Reaktionsausbeute in Bezug auf ein Zwischenreaktionsprodukt aus einem Reaktionsbereich oder in Bezug auf das Reaktions­ produkt den jeweiligen Reaktionsbereich oder Reaktionsansatz Amplifikationsprimer zugesetzt werden.

Dabei werden bevorzugterweise Amplifikationsprimer gewählt, die zu den Endbereichen äußerer Sequenzprimer oder Koordina­ tionsprimer komplementär sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann dazu verwendet werden, einen Nukleinsäuredoppelstrang als Nukleinsäureprodukt zu erzeugen. Dabei kann es sich insbesondere um eine Desoxyribo­ nukleinsäure oder DNS oder um Fragmente oder Derivate davon handeln.

Des Weiteren kann es vorgesehen sein, dass als Nukleinsäure­ produkt ein Nukleinsäureeinzelstrang erzeugt wird, und zwar insbesondere indem zunächst ein Nukleinsäuredoppelstrang erzeugt wird und in zwei zueinander komplementäre Einzel­ stränge aufgespalten wird. Ferner ist es dann vorgesehen, dass einer der Einzelstränge ausgewählt und isoliert wird. Es kann sich bei einem erzeugten Nukleinsäureeinzelstrang um einen Einzelstrang einer DNS handeln. Andererseits kann auch ein Ribonukleinsäureeinzelstrang als Nukleinsäureprodukt ausgebildet werden.

Das Auswählen und/oder das Isolieren eines Einzelstrangs kann über ein entsprechendes Markieren mit mindestens einer Mar­ kierung mindestens eines der Einzelstränge erfolgen. Es kann dabei derjenige Einzelstrang markiert werden, welcher auszu­ wählen ist, oder es kann derjenige Einzelstrang ausgewählt werden, welcher nicht auszuwählen ist, oder es werden Einzel­ stränge mit unterschiedlichen Markierungen markiert.

Die mindestens eine Markierung wird vorteilhafterweise an mindestens einem der Sequenzprimer, einem Koordinationsprimer und/oder an einer endständigen und aufgefüllten Sequenzlücke und/oder Stranglücke ausgebildet.

Besonders vorteilhaft gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn genau eine Markierung verwendet wird.

Die Markierung selbst kann eine magnetische, elektrische, gravimetrische, fluorimetrische und/oder biochemische Markie­ rung sein.

Vorteilhafterweise werden ein Magnetic Bead oder eine magne­ tische Mikrokugel als magnetische Markierung verwendet.

Die Verwendung von Nukleinsäuresequenzinformationen, welche dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrundezulegen ist, kann auf vielfältige Art und Weisen geschehen. Es kann sich dabei handeln um die Information zu einer Sequenz eines Nukleinsäu­ reeinzelstrangs, eines dazu komplementären Nukleinsäureein­ zelstrangs und/oder um eine abschnittsweise Kombination eines Nukleinsäureeinzelstrangs und seines komplementären Nuklein­ säureeinzelstrangs, so dass insgesamt gesehen die Information direkt und komplementär vollständig ist in Bezug auf die zu erzeugende Zielsequenz.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass das erzeugte Nukleinsäure­ produkt nach dem eigentlichen Herstellen zum Kontrollieren der Qualität und/oder zum Kontrollieren der Sequenz einem Sequenzierverfahren unterworfen wird.

Des Weiteren ist es dabei vorgesehen, dass jedem Nukleinsäu­ reprodukt ein gemeinsamer 5'-Endbereich angefügt wird, wobei ein 5'-Endbereich gewählt wird, der für die Hybridisierung eines Standardsequenzierprimers geeignet ist. Dieser Bereich kann gleichzeitig der Markierung für die Aufreinigung ent­ sprechen.

Dabei ist es des Weiteren in vorteilhafter Weise vorgesehen, dass nach der Qualitätskontrolle und/oder der Sequenzkontrol­ le der angefügte 5'-Endbereich abgespalten wird, zum Beispiel enzymatisch, um das eigentliche Nukleinsäureprodukt zu erhal­ ten.

Bei der Kontrolle der Qualität und/oder der Sequenz ist es des Weiteren gegebenenfalls in vorteilhafter Weise vorgese­ hen, dass dem 5'-Endbereich des zu erzeugenden Nukleinsäure­ produkts eine Promotersequenz angefügt wird, insbesondere eine RNS-Polymerasepromotersequenz, ein SP6-Promoter, ein T7- Promoter, ein T3-Promoter oder dergleichen. Promotoren sind dabei z. B. Sequenzfolgen der DNS, die der RNS-Polymerase das Binden an die DNS ermöglichen, und zwar am Start einer abzu­ lesenden Sequenz, die dann mit Hilfe der RNS-Polymerasen in eine RNS-Sequenz transkribiert wird. Diese Sequenzfolgen sind daher für die spätere RNS-Synthese unabdingbar, falls dies als Anwendung des Produkts beabsichtigt ist.

Dabei ist es von besonderem Vorteil, dass die Promotersequenz zwischen der Sequenz des Standardsequenzierprimers und der Sequenz des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts eingefügt wird.

Bei sämtlichen auftretenden Nukleinsäuresequenzen, insbeson­ dere also bei den Nukleinsäuresequenzen der Sequenzprimer, der Koordinationsprimer, der Amplifikationsprimer, der Promo­ tersequenzen, bieten sich vielfältige Möglichkeiten an. So ist es zum Beispiel vorgesehen, dass als Nukleinsäuresequen­ zen verwendet werden und/oder erzeugt werden, Ribonukleinsäu­ ren oder RNS und/oder Desoxyribonukleinsäuren oder DNS. Diese liegen insbesondere in natürlicher oder in künstlich erzeug­ ter Form vor. Des Weiteren sind dabei denkbar Plasmid-DNS, Phagen-DNS, bakterielle DNS, vorzugsweise aus Escherichia coli. Des Weiteren sind diese Nukleinsäuresequenzen in ein­ zelsträngiger Form oder in doppelsträngiger Form denkbar.

Als Nukleinsäureeinheiten können im Rahmen der Erfindung natürliche oder künstliche Nukleotide und/oder deren Derivate auftreten. Dabei handelt es sich insbesondere um Nukleotide auf der Basis von Adenosin, Thymidin, Uracil, Guanosin und Cytidin und deren Derivaten.

Dabei werden in vorteilhafter Weise als insbesondere freie Nukleinsäureeinheiten zum Auffüllen und/oder Schließen der Stranglücken oder Sequenzlücken und/oder zur Amplifikation im Rahmen einer PCR-Reaktion Desoxyribonukleotide verwendet, insbesondere Desoxyadenosin-5'-triphosphat oder dATP, Desoxy­ cytidin-5'-triphosphat oder dCTP, Desoxyguanosin-5'- triphosphat oder dGTP, Desoxythymidin-5'-triphosphat oder dTTP. Nach dem Einbau durch Auffüllen und/oder Schließen der Stranglücken oder Sequenzlücken und/oder durch Amplifikation und/oder in den Sequenzprimern, den Koordinationsprimern und/oder ggf. in den Amplifikationsprimern liegen diese Deso­ xyribonukleotide nach Abspaltung der Pyrophosphate Ppi als Monophosphate vor, insbesondere als Desoxyadenosin-5'- monophosphat oder dAMP, Desoxycytidin-5'-monophosphat oder dCMP, Desoxyguanosin-5'-monophosphat oder dGMP, Desoxythymi­ din-5'-monophosphat oder dTMP.

Alternativ oder zusätzlich ist es vorgesehen, dass als freie Nukleinsäureeinheiten zum Auffüllen und/oder Schließen der Stranglücken oder Sequenzlücken und/oder zur Amplifikation im Rahmen einer PCR-Reaktion Ribonukleotide verwendet werden, insbesondere Adenosin-5'-triphosphat oder ATP, Cytidin-5'- triphosphat oder CTP, Guanosin-5'-triphosphat oder GTP, Uri­ din-5'-triphosphat oder UTP. Nach dem Einbau durch Auffüllen und/oder Schließen der Stranglücken oder Sequenzlücken und/oder durch Amplifikation und/oder in den Sequenzprimern, den Koordinationsprimern und/oder ggf. in den Amplifikati­ onsprimern liegen diese Ribonukleotide nach Abspaltung der Pyrophosphate Ppi als Monophosphate vor, insbesondere als Adenosin-5'-monophosphat oder AMP, Cytidin-5'-monophosphat oder CMP, Guanosin-5'-monophosphat oder GMP, Uridin-5'- monophosphat oder UMP.

Die Nukleinsäureeinheiten sind also als freie Bausteine Triphosphate. Beim Einbau wird Pyrophosphat oder PPi ab­ gespalten, so dass in der Kette oder Sequenz Monophosphate erscheinen. Monophosphate liegen somit auch bei den verwende­ ten Primern vor.

Verwendung finden kann das erfindungsgemäße Verfahren ebenso in vielfältiger Weise. Zum Beispiel ist es denkbar, cDNS- Sequenzen zu synthetisieren, insbesondere dann, wenn diese am 5'- bzw. am 3'-Ende mit Adaptersequenzen, insbesondere Erken­ nungssequenzen für Restriktionsendonukleasen, für geeignete Subklonierungen in einem Expressionsvektor versehen sind.

Dabei ist zum Beispiel denkbar die Synthetisierung der cDNA von Proteorhodopsin anhand einer Sequenz gemäß der GenBank- Zugangsnummer AF279106. Es handelt sich dabei um ein Bakteri­ orhodopsinhomolog aus bislang nur molekularbiologisch charak­ terisierten marinen Bakterien. Es besitzt eine Länge von 747 Nukleotiden.

Des Weiteren denkbar ist die Anwendung des Verfahrens zur Synthetisierung der cDNA von Neurospora opsin I oder Nop1, einem Bakteriorhodopsinhomolog aus dem eukaryotischen Orga­ nismus Neurospora crassa, und zwar gemäß Sequenz mit der GenBank-Zugangsnummer AF135863 mit einer Sequenzlänge von 912 Nukleotiden.

Des Weiteren ist eine Anwendung denkbar auf die Synthetisie­ rung der cDNA von KCNE2 oder MirP1 gemäß der Sequenz mit der GenBank-Zugangsnummer AF071002. Es handelt sich dabei um eine humane beta-Untereinheit spannungsgesteuerter Kaliumkanäle mit einer Sequenzlänge von 372 Nukleotiden.

Ferner ist es vorgesehen, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in vorteilhafter Weise eine Anpassung des speziesabhängigen Vorzugsgebrauchs von so genannten Aminosäurecodons durchzu­ führen.

Bei einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass vorteilhafte und/oder nachteilige Restriktionsendonukleaseschnittstellen durch so genannte stille Mutagenese oder silent mutagenesis eingebaut und/oder verworfen werden. Dabei werden in relativ kurzen Sequenzbereichen degenerierte Codons sogenannte "stil­ le" Mutationen ausgetauscht, so dass eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym eingefügt oder entfernt wird, und zwar ohne die resultierende Aminosäureabfolge, für welche codiert wird, zu ändern.

Bei einer besonders vorteilhaften Weiterbildung des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass eine Aus­ gangssequenz derart modifiziert wird, dass eine Zielsequenz entsteht, die sich durch eine Anzahl enthaltener stiller Mutationen von der Ausgangssequenz unterscheidet. Dadurch wird ein so genanntes Fingerabdruck- oder Fingerprintmuster möglich, durch das die Zuordnung einer bestimmten Sequenz zu einem Besitzer oder zu einer Quelle möglich ist, ohne dass dies in der resultierenden Aminosäuresequenz des daraus translatierten Proteins für den Benutzer der Sequenz nach­ prüfbar ist.

Bevorzugt werden die Verfahrensschritte der Hybridisierungs­ reaktion, des Auffüllens der Stranglücken oder Sequenzlücken und/oder des Amplifizierens oder Teile davon jeweils bei einer Reaktionstemperatur oder Hybridisierungstemperatur Tm durchgeführt, welche insbesondere bestimmt werden kann gemäß:

wobei nG und nC die Zahlen der zu vorgesehenen oder vorzuse­ henden Nukleinsäureeinheiten mit Guanosinresten G bzw. mit Cytidinresten C im jeweiligen Oligonukleotid, nNukleotide die Gesamtzahl der Nukleotide und log10([Na⁺]) der dekadische Logarithmus der Konzentration [Na⁺] an Natriumionen Na⁺ im jeweiligen Reaktionsbereich bedeuten.

Insbesondere ist es günstig, wenn die Aufteilung (A), die Sequenzprimer (SP), die Koordinationsprimer (KP), die End­ überlappungsbereiche (Ü3, Ü5) und/oder die auszubildenden Enddoppelstrangabschnitte (EDSA), insbesondere in ihrer Zu­ sammensetzung, so gewählt werden, dass sich eine Hybridisie­ rungstemperatur Tm ergibt, welche im Bereich von etwa 55°C bis etwa 68°C liegt.

Ferner ist es vorteilhaft, dass gemäß einer weiteren Ausfüh­ rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens als Nukleinsäure­ polymerasesystem verwendet wird mindestens eine thermostabile Nukleinsäurepolymerase mit niedriger Fehlerrate und intrinsi­ scher 3'-5'-Exonukleaseaktivität oder Proof-reading- Aktivität, insbesondere Pfu-DNS-Polymerasen.

Die Erfindung wird weiter erläutert anhand einer schemati­ schen Zeichnung auf der Grundlage bevorzugter Ausführungsfor­ men.

Fig. 1A-C zeigen in schematischer Art und Weise den erfindungsgemäßen Zusammenhang zwischen Nuk­ leinsäuresequenzinformation und der allgemei­ nen Struktur der Sequenzprimer und Koordina­ tionsprimer.

Fig. 2A-3B zeigen schematisch das erfindungsgemäße Auf­ füllen von Stranglücken in der Abfolge von Sequenzprimern bzw. Koordinationsprimern.

Fig. 4A-E zeigen in schematischer Form eine Ausfüh­ rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Bei den nachfolgend beschriebenen Figuren bezeichnen gleiche Bezugszeichen gleiche oder gleichwirkende Bauelemente oder Strukturen, ohne dass in jedem Fall eine detaillierte Be­ schreibung wiederholt wird.

Fig. 1A zeigt die Nukleinsäuresequenzinformation NSI im Sinne einer Zielsequenz ZS zu einem Nukleinsäuredoppelstrang als Nukleinsäureprodukt NP, welches aus einem ersten Einzelstrang ES und einem dazu zweiten komplementären Einzelstrang oder Komplementärstrang KP besteht. Jeder der Einzelstränge weist ein 5'-Ende und ein 3'-Ende auf.

Durch entsprechende Aufteilung und Auswahl werden der Nuk­ leinsäuresequenzinformation NSI entsprechend Sequenzprimer SP und Koordinationsprimer KP ausgewählt und bereit gestellt. Die diesen Primern SP und KP zugrunde liegende Sequenzinfor­ mationen sind der Sequenzinformation zum ersten Einzelstrang ES bzw. zum Komplementärstrang KS entnommen. Die Primer be­ sitzen ihrerseits jeweils ein 5'-Ende und ein 3'-Ende sowie entsprechende Endbereiche E5 bzw. E3.

Die Fig. 2A und 3A zeigen in schematischer Art und Weise die erfindungsgemäße Anordnung und Zuordnung von Sequenzpri­ mern SP und Koordinationsprimern zueinander.

In Fig. 2A sind zwei Sequenzprimer SP gezeigt, welche gemäß der Nukleinsäuresequenzinformation NSI benachbart zueinander angeordnet sind. Dabei besteht zwischen dem 3'-Ende bzw. dem entsprechenden Endbereich E3 des ersten, hier rechten Se­ quenzprimers SP und dem 5'-Ende bzw. dem entsprechenden End­ bereich E5 des zweiten, hier linken Sequenzprimer SP eine Sequenzlücke SL oder Stranglücke SL.

Die Sequenzlücke SL zwischen den Sequenzprimern SP wird durch den zugeordneten Koordinationsprimer KP komplementär über­ deckt oder ergänzt. Der Koordinationsprimer KP besitzt sei­ nerseits ebenfalls ein 5'-Ende mit einem entsprechen Endbe­ reich E5 und ein 3'-Ende mit einem entsprechenden Endbereich E3. Der Koordinationsprimer KP ist so angeordnet, dass sein 3'-Endbereich E3 oder ein Teil davon dem 3'-Endbereich E3 des ersten Sequenzprimers SP oder einem Teil davon gegenüber­ liegt, so dass ein gemeinsamer Endüberlappungsbereich Ü3 gebildet wird. Der Koordinationsprimer KP ist ferner so ange­ ordnet, dass sein 5'-Endbereich E5 oder ein Teil davon dem 5'-Endbereich E5 des zweiten Sequenzprimers SP oder einem Teil davon gegenüberliegt, so dass ein gemeinsamer Endüber­ lappungsbereich Ü5 gebildet wird.

Im Übergang zu dem in Fig. 2B gezeigten Zustand sind dann über einen erfindungsgemäßen Hybridisierungsvorgang und einen erfindungsgemäßen Auffüllvorgang die Sequenzprimer SP mit dem Koordinationsprimer hybridisiert zusammengefügt, wobei auch die Stranglücken SL zwischen den Sequenzprimern SP und zwi­ schen dem Koordinationsprimer KP und den endständigen Se­ quenzlücken KL des Komplementärstrangs KS aufgefüllt und geschlossen sind, dass zum Einen Enddoppelstrangabschnitte EDSA und zum Anderen Innendoppelstrangabschnitte IDSA ausge­ bildet sind.

Fig. 3A ist analog zu Fig. 2A zu betrachten, wobei jedoch ein Sequenzprimer SP vorgesehen ist, welcher eine Sequenzlücke KL zwischen zwei vorgesehenen Koordinationsprimern KP komplemen­ tär überdeckt.

Fig. 3B zeigt entsprechend einen Zustand nach dem Verbinden der Primer durch Hybridisieren und nach dem Schließen der Sequenzlücken durch Ausbilden von Innendoppelstrangabschnit­ ten IDSA und von Enddoppelstrangabschnitten EDSA.

Das in den Fig. 2A bis 3B gezeigt vorgehen lässt sich auf beliebige Anzahlen sich gegenüber stehender Sequenzprimer SP und Koordinationsprimer KP verallgemeinern und anwenden.

Die Fig. 4 bis 7 illustrieren auf schematische Art und Weise Zwischenzustände die bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erreicht werden.

In Fig. 4 werden vier Sequenzprimer SP1 bis SP4 und vier Koordinationsprimer KP1 bis KP4 bereitgestellt und zwar gemäß der vorliegenden Nukleinsäuresequenzinformation NSI zur Ziel­ sequenz ZS des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts NP. Diese Sequenzprimer SP1 bis SP4 und Koordinationsprimer KP1 bis KP4 besitzen die in Fig. 1 erläuterte Struktur und überdecken die Nukleinsäuresequenzinformation NSI zur Zielsequenz ZS des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts NP vollständig in disjunkter und komplementärer Art und Weise. Zur Durchführung einer PCR- Amplifikation zur Ausbeutesteigerung sind noch Amplifikati­ onsprimer AP1a bis AP4a und. AP1r bis AP4r vorgesehen, die jeweils zu den 5'-Endbereichen der Koordinationsprimer KP1 bis KP4 bzw. zu den 5'-Endbereichen der Sequenzprimer komple­ mentär sind.

In Fig. 5 ist der gesamte Reaktionsansatz in vier separate Reaktionsbereiche R 1,1 bis R 1,4 einer ersten Reaktionsstufe unterteilt. Dabei werden im Reaktionsbereich R 1,j für j = 1 bis 4 der Sequenzprimer SPj und der Koordinationsprimer KPj mit den Amplifikationsprimern APja und APjr in vorgegebenen Mengen in einer Lösung zusammen und zur Hybridisierung ge­ bracht, welche durch den Pfeil angedeutet ist und ein Doppel­ strangprodukt zu Ergebnis hat, welches jeweils aus den kom­ plementären Einzelsträngen NP 1,j und NP' 1,j besteht.

So werden z. B. im Reaktionsbereich R 1,1 der Sequenzprimer SP1 und der Koordinationsprimer KP1 in Anwesenheit der Ampli­ fikationsprimer AP1a und AP1r hybridisiert und vervielfäl­ tigt, wobei die komplementären Einzelstränge NP 1,1 und NP' 1,1 als Reaktionsprodukte entstehen, und zwar in Form eines Doppelstrangs.

Entsprechenden gilt für die weiteren Reaktionsbereiche R 1,2 bis R 1,4.

Gemäß Fig. 6 werden dann die resultierenden Reaktionsprodukte wiederum paarweise in Reaktionsbereichen R 2,1 und R 2,2 der zweiten Stufe zusammen und zur Hybridisierung gebracht, näm­ lich in R 2,1 die Zwischenprodukte NP 1,2 und NP' 1,1, die teilweise überlappende und komplementäre 3'-Endbereiche be­ sitzen, in Anwesenheit der Amplifikationsprimer AP1a und AP2r sowie im Reaktionsbereich R 2, 2 die Zwischenprodukte NP 1,4 und NP' 1,3, die ebenfalls teilweise überlappende und komple­ mentäre 3'-Endbereiche besitzen, in Anwesenheit der Amplifi­ kationsprimer AP3a und AP4r. Es entstehen Reaktionsprodukte oder Nukleinsäureprodukte NP 2,1 und NP' 2,1 bzw. NP 2,2 und NP' 2,2 der zweiten Zwischenstufe. Die Reaktion ist wieder durch einen Pfeil angedeutet.

Die so entstandenen Nukleinsäureprodukte NP 2,1 und NP' 2,1 bzw. NP 2,2 und NP' 2,2 der zweiten Zwischenstufe können dann in einem zusammengefassten Reaktionsbereich R3 der dritten Zwischenstufe in Anwesenheit bestimmter Amplifikationsprimer zum Endprodukt NP = NP 3 hybridisiert werden. In Fig. 7 wer­ den dazu die Nukleinsäurezwischenprodukte NP 2,2 und NP' 2,1 der zweiten Zwischenstufe in Anwesenheit der Amplifikati­ onsprimer AP1a und AP4r hybridisiert, was durch den ersten Pfeil angedeutet ist.

In einem zweiten Schritt werden dann die Einzelstränge NP 3 und NP' 3 im Doppelstrangverband voneinander gelöst, das gewünschte Nukleinsäureprodukt NP = NP 3 kann isoliert und bereit gestellt werden, es entspricht der gewünschten Zielse­ quenz ZS der vorgegebenen Nukleinsäuresequenzinformation NSI.

Claims (44)

1. Verfahren zum sequenzkontrollierten Herstellen eines Nuk­ leinsäureprodukts,
mit den Schritten:

• a) Bereitstellen von Nukleinsäuresequenzinformation (NSI) zu einer gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP),
• b) Bereitstellen einer Mehrzahl Sequenzprimer (SP), wobei die Sequenzprimer (SP) einen ersten Einzelstrang (Es) zum zu erzeugenden Nukleinsäureprodukt (NP) gemäß der Nuk­ leinsäuresequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielse­ quenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) abschnittsweise und paarweise disjunkt überdecken,
• c) Bereitstellen einer Mehrzahl Koordinationsprimer (KP), wobei die Koordinationsprimer (KP) einen hinsichtlich der Nukleinsäuresequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) komplementären zweiten Einzelstrang (KS) oder Kom­ plementärstrang (KS) zum zu erzeugenden Nukleinsäurepro­ dukt (NP) gemäß der Nukleinsäuresequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nuk­ leinsäureprodukts (NP) abschnittsweise und paarweise dis­ junkt überdecken,
• d) dabei komplementäres Zuordnen der Mehrzahl Sequenzprimer (SP) und der Mehrzahl Koordinationsprimer (KP) zueinander dadurch,
  dass zu zueinander benachbarten Bereichen (E3, E5) der Enden (3', 5') der Sequenzen zu gemäß der Nukleinsäure­ sequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) un­ mittelbar aufeinander folgenden Sequenzprimern (SP) jeweils ein dazu komplementärer Koordinationsprimer (KP) derart vorgesehen wird, dass dessen Sequenz die Bereiche (E3, E5) der Enden (3', 5') der Sequenzen der benachbarten Sequenzprimer (SP) gemäß der Nukleinsäu­ resequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) kom­ plementär überdeckt und
  dass zu zueinander benachbarten Bereichen (E3, E5) der Enden (3', 5') der Sequenzen zu gemäß der Nukleinsäure­ sequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) un­ mittelbar aufeinander folgenden Koordinationsprimern (KP) jeweils ein dazu komplementärer Sequenzprimer (SP) derart vorgesehen wird, dass dessen Sequenz die Bereiche (E3, E5) der Enden (3', 5') der Sequenzen der benachbarten Koordinationsprimer (KP) gemäß der Nuk­ leinsäuresequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäurepro­ dukts (NP) komplementär überdeckt,
• e) Zusammenbringen vorbestimmter Mengen Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP),
• f) Durchführen einer Hybridisierungsreaktion zwischen Se­ quenzprimern (SP) und Koordinationsprimern (KP) und dabei Ausbilden mindestens eines zumindest abschnittsweise dop­ pelsträngigen zusammenhängenden Nukleinsäurestrangs (NS) gemäß mindestens eines zusammenhängenden Abschnitts der Nukleinsäuresequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP),
• g) Auffüllen und/oder Schließen im ausgebildeten Nukleinsäu­ restrang (NS) vorliegender Stranglücken (SL, KL) oder Se­ quenzlücken (SL, KL) zwischen gemäß der Nukleinsäurese­ quenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) unmittelbar aufeinander folgenden Sequenzprimern (SP) und/oder Koor­ dinationsprimern (KP) und
• h) Auffüllen und/oder Schließen im ausgebildeten Nukleinsäu­ restrang (NS) vorliegender Stranglücken (SL, KL) oder Se­ quenzlücken (SL, KL) zwischen einem gemäß der Nukleinsäu­ resequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) end­ ständigen Ende (3', 5') eines Sequenzprimers (SP) oder Koordinationsprimers (KP) und einem gemäß der Nukleinsäu­ resequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) vorlie­ genden und komplementär gegenüber stehenden endständigen komplementären Ende (5', 3') eines komplementären Koordi­ nationsprimers (KP) bzw. komplementären Sequenzprimers (SP) hin,
• i) Verwenden mindestens eines Nukleinsäurepolymerasesystems bei den Schritten g) und h) des Auffüllens und/oder Schließens, wobei Nukleinsäureeinheiten (NSE) verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen jeweils einander zugeordneter und dann hybridisierter Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) so gewählt werden, dass sie sich hinsichtlich der Nuk­ leinsäuresequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielse­ quenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) und hinsichtlich sich komplementär gegenüberstehender Bereiche (E3, E5) der Enden (3', 5') der Sequenz in einem zusammen­ hängenden Endüberlappungsbereich (Ü3, Ü5) einander komple­ mentär überdeckend ergänzen zu einem Enddoppelstrangab­ schnitt (EDSA).

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Endüberlappungsbereich (Ü3, Ü5) bzw. der Enddoppel­ strangabschnitt (EDSA) jeweils mit einer Mehrzahl von Nuk­ leinsäureeinheiten (NSE) vorgesehen werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mehrzahl Nukleinsäureeinheiten (NSE) 5 bis 10, 10 bis 20 oder 20 bis 40 Nukleinsäureeinheiten (NSE) umfasst.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass durch das Auffüllen und/oder Schließen von Stranglücken (SL, KL) und/oder Sequenzlücken (SL, KL) mit Nukleinsäure­ einheiten (NSE) hinsichtlich sich komplementär gegenüberste­ hender aufgefüllter Stranglücken (SL, KL) und/oder aufge­ füllter Sequenzlücken (SL, KL) der Koordinationsprimer (KP) und/oder Sequenzprimer (SP) Innendoppelstrangabschnitte (ID- SA) gebildet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Innendoppelstrangabschnitt (IDSA) jeweils mit einer Mehrzahl Nukleinsäureeinheiten (NSE) ausgebildet wird, wel­ che insbesondere ein Vielfaches oder n-faches der Mehrzahl Nukleinsäureeinheiten (NSE) der jeweils zugeordneten End­ überlappungsbereiche (Ü3, Ü5) bzw. der Enddoppelstrangab­ schnitte (EDSA) ist, insbesondere mit n = 2, 4, 8, 16.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die vorbestimmten Mengen Sequenzprimer (SP) und Koordi­ nationsprimer (KP) gemäß Schritt e) in einem gemeinsamen Reaktionsbereich (R) zusammengebracht und gemäß den Schrit­ ten f) bis i) zur Reaktion gebracht werden, insbesondere im Sinne einer Ein-Topfreaktion.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen einander zugeordneten Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) und insbesondere die vor­ bestimmten Mengen davon gemäß Schritt e) in einer vorgegebe­ nen Mehrzahl N Reaktionsbereiche (Rj) aufgeteilt zusammenge­ bracht und gemäß den Schritten f) bis i) zur Reaktion ge­ bracht werden, insbesondere im Sinne einer Mehr- Topfreaktion.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufteilen der Nukleinsäuresequenzinformation (NSI) der Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) und somit die Definition der einander zugeordneten Se­ quenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) und/oder das Aufteilen der einander zugeordneten Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) in verschiedene Reaktionsbereiche (R, Rj) jeweils gemäß einer vorgegebenen Aufteilung (A) der Nukleinsäuresequenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielse­ quenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) und/oder einer vorgegebenen Aufteilung (A) zugeordneter Se­ quenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) erfolgt.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzprimer (SP) und/oder die Koordinationsprimer (KP) so ausgewählt und bereitgestellt werden, dass die durch sie jeweils erfassten Mehrzahlen Nukleinsäureeinheiten (NSE) oder die Mächtigkeit ihrer Sequenzen in etwa gleich sind, so dass insbesondere die zugrunde liegende Nukleinsäuresequenz­ information (NSI) auf die Mehrzahl Sequenzprimer (SP) und/oder die Mehrzahl Koordinationsprimer (KP) gleichmäßig verteilt wird.

11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die vorgegebene Aufteilung (A) der Nukleinsäurese­ quenzinformation (NSI) zur gewünschten Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) und/oder die vorge­ sehene Aufteilung (A) der zugeordneten Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) in etwa gemäß einer Zweierpo­ tenz erfolgt, insbesondere gemäß 2^N+1 mit N = 0, 1, 2, . . .

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9 bis 11, so­ fern diese auf Anspruch 8 rückbezogen sind, dadurch gekennzeichnet,

• a) dass nach Abschluss der Schritte f) bis i) des Verfahrens die Inhalte der Reaktionsbereiche (Rj) in Bezug auf die Nukleinsäuresequenzinformation (NSI) der Zielsequenz (ZS) des zu erzeugenden Nukleinsäureprodukts (NP) benachbarter Reaktionsbereiche (Rj) paarweise zusammengebracht werden,
• b) dass die erhaltenen und zusammengebrachten Reaktionspro­ dukte als Doppelstränge in Einzelstränge aufgespalten werden, und
• c) dass nachfolgend die Schritte f) bis i) erneut durchge­ führt werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte j), k) und l) so oft wiederholt werden, bis sämtliche ursprüngliche Reaktionsbereiche (Rj) in einem gemeinsamen Reaktionsbereich (R) zusammengefasst vorliegen.

14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsschritte f) bis i) jeweils mit einer Poly­ merasekettenreaktion zur Vervielfältigung der jeweiligen Reaktionsprodukte verbunden werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erhöhung der Reaktionsrate in Bezug auf ein Zwi­ schenreaktionsprodukt oder in Bezug auf das Reaktionsprodukt dem jeweiligen Reaktionsbereich (R, Rj) oder Reaktionsansatz Amplifikationsprimer (AP) zugesetzt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Amplifikationsprimer (AP) gewählt werden, welche zu den Endbereichen (E3, E5) äußerer Sequenzprimer (SP) oder Koor­ dinationsprimer (KP) komplementär sind.

17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Nukleinsäuredoppelstrang als Nukleinsäureprodukt (NP) erzeugt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein Nukleinsäureeinzelstrang als Nukleinsäureprodukt (NP) erzeugt wird, insbesondere indem zunächst ein Nuklein­ säuredoppelstrang erzeugt wird und in zwei zueinander kom­ plementäre Einzelstränge (ES, KS) aufgespalten wird und in­ dem ferner einer der Einzelstränge (ES, KS) ausgewählt und isoliert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Auswählen und/oder das Isolieren eines Einzel­ strangs über das Markieren mit mindestens einer Markierung (M) mindestens eines der Einzelstränge (ES, KS) erfolgt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Markierung (M) an mindestens einem Se­ quenzprimer (SP), einem Koordinationsprimer (KP) und/oder an einer endständigen und aufgefüllten Sequenzlücke (SL, KL) und/oder Stranglücke (SL, KL) ausgebildet wird, wobei die Markierung insbesondere jeweils an einem 5'-Ende oder am 3'- Ende einer Zielsequenz vorgesehen wird.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass genau eine Markierung (M) verwendet wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils eine magnetische, elektrische, gravimetrische, fluorimetrische und/oder biochemische Markierung (M) verwen­ det wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass ein Magnetic Bead als Markierung (M) verwendet wird.

24. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Nukleinsäuresequenzinformation (NSI) verwendet wer­ den die Information zu einer Sequenz eines Nukleinsäureein­ zelstrangs (ES), eines dazu komplementären Nukleinsäureein­ zelstrangs (KS) und/oder einer abschnittsweisen Kombination eines Nukleinsäureeinzelstrangs (ES) und seines komplementä­ ren Nukleinsäureeinzelstrangs (KS), welcher insgesamt gese­ hen direkt und komplementär vollständig ist.

25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erzeugte Nukleinsäureprodukt (NP) nach dem eigent­ lichen Herstellen zum Kontrollieren der Qualität und/oder zum Kontrollieren der Sequenz einem Sequenzierverfahren un­ terworfen wird.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass jedem Nukleinsäureprodukt (NP) ein gemeinsamer 5'- Endbereich angefügt wird, wobei ein 5'-Endbereich gewählt wird, der für die Hybridisierung eines Standardsequen­ zierprimers geeignet ist.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Qualitätskontrolle und/oder nach der Sequenz­ kontrolle der angefügte 5'-Endbereich abgespalten wird, insbesondere enzymatisch, um das eigentliche Nukleinsäureprodukt (NP) zu erhalten.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass dem 5'-Endbereich des zu erzeugenden Nukleinsäurepro­ dukts (NP) eine Promotersequenz angefügt wird insbesondere ein RNS-Polymerasepromoter, ein SP6-Promoter, ein T7-Promo­ ter, ein T3-Promoter.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotersequenz zwischen der Sequenz des Standard­ sequenzprimers und des sequenzerzeugenden Nukleinsäurepro­ dukts (NP) eingefügt wird.

30. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Nukleinsäuresequenzen verwendet und/oder erzeugt werden Ribonukleinsäuren oder RNS und/oder Desoxyribonuk­ leinsäuren oder DNS, insbesondere in natürlicher oder künst­ lich erzeugter Form, als Plasmid-DNS, Phagen-DNS, bakteriel­ le DNS, aus Escherichia coli, in einzelsträngiger Form oder in doppelsträngiger Form.

31. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Nukleinsäureeinheiten (NSE) verwendet werden natür­ liche oder künstliche Nukleotide und/oder deren Derivate, insbesondere auf der Basis von Adenosin, Thymidin, Uracil, Guanosin, Cytidin und/oder deren Derivate.

32. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als freie Nukleinsäureeinheiten (NSE) zum Auffüllen und/oder Schließen der Stranglücken oder Sequenzlücken und/oder zur Amplifikation im Rahmen einer PCR-Reaktion Desoxyribonukleotide verwendet werden, insbesondere Desoxya­ denosin-5'-triphosphat (dATP), Desoxycytidin-5'-triphosphat (dCTP), Desoxyguanosin-5'-triphosphat (dGTP), Desoxythymi­ din-5'-triphosphat (dTTP), wobei diese nach dem Einbau durch Auffüllen und/oder Schließen der Stranglücken (SL, KL) oder Sequenzlücken (SL, KL) und/oder durch Amplifikation und/oder in den Sequenzprimern (SP), in den Koordinationsprimern (KP) und/oder ggf. in den Amplifikationsprimern (AP), ggf. nach Abspaltung von Pyrophosphaten (PPi), als Monophosphate vor­ liegen, insbesondere als Desoxyadenosin-5'-monophosphat (dAMP), Desoxycytidin-5'-monophosphat (dCMP), Desoxyguano­ sin-5'-monophosphat (dGMP) oder Desoxythymidin-5'- monophosphat (dTMP).

33. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass freie Nukleinsäureeinheiten (NSE) zum Auffüllen und/oder Schließen der Stranglücken oder Sequenzlücken und/oder zur Amplifikation im Rahmen einer PCR-Reaktion Ri­ bonukleotide verwendet werden, insbesondere Nukleinsäureeinheiten (NSE) Ribonukleotide verwendet werden, insbesondere Adenosin-5'-triphosphat (ATP), Cytidin-5'- triphosphat (CTP), Guanosin-5'-triphosphat (GTP), Uridin-5'- triphosphat (UTP), wobei diese nach dem Einbau durch Auffül­ len und/oder Schließen der Stranglücken (SL, KL) oder Se­ quenzlücken (SL, KL) und/oder durch Amplifikation und/oder in den Sequenzprimern (SP), in den Koordinationsprimern (KP) und/oder ggf. in den Amplifikationsprimern (AP), ggf. nach Abspaltung von Pyrophosphaten (PPi) als Monophosphate vor­ liegen, insbesondere als Adenosin-5'-monophosphat (AMP), Cytidin-5'-monophosphat (CMP), Guanosin-5'-monophosphat (GMP) oder Uridin-5'-monophosphat (UMP).

34. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die cDNS von Proteorhodopsin gemäß der Sequenz der GenBank-Zugangsnummer AF279106 erzeugt wird.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, bei welchem eine cDNS von Neurospora opsin I oder Nop1 gemäß der Sequenz der GenBank-Zugangsnummer AF135863 erzeugt wird.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, bei welchem die cDNS von KCNE2 oder MirP1 gemäß der Sequenz der GenBank-Zugangsnummer AF071002 erzeugt werden.

37. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Anpassung des speziesabhängigen Vorzugs­ gebrauchs von Aminosäurecodons durchge­ führt wird.

38. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem vorteilhafte und/oder nachteilige Restriktion­ sendonukleaseschnittstellen eingebaut und/oder verworfen werden durch so genannte stille Mutagenese insbesondere durch Austauschen degenerierter Codons in relativ kurzen Sequenzbereichen, und zwar ohne eine re­ sultierende Aminosäureabfolge zu ändern, so dass eine Erken­ nungssequenz für ein Restriktionsenzym entsteht oder verwor­ fen wird.

39. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine gegebene Ausgangssequenz derart modifiziert wird, dass eine Zielsequenz entsteht, welche durch eine gan­ ze Anzahl stiller Mutationen von der Ausgangssequenz derart unterschieden ist, dass dadurch ein Fingerprintmuster zum wieder Erkennen erzeugbar ist.

40. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte f) bis i) oder Teile davon je­ weils bei einer Reaktionstemperatur oder Hybridisierungstem­ peratur Tm durchgeführt werden, welche insbesondere bestimmt werden kann gemäß:
wobei nG und nC die Zahlen der zu vorgesehenen oder vorzuse­ henden Nukleinsäureeinheiten (NSE) mit Guanosinresten G bzw. mit Cytidinresten C im jeweiligen Oligonukleotid, nNukleoti­ de die Gesamtzahl der Nukleotide und log₁₀([Na⁺]) der dekadi­ sche Logarithmus der Konzentration [Na⁺] an Natriumionen Na⁺ im jeweiligen Reaktionsbereich (R, Rj) bedeuten.

41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufteilung (A), die Sequenzprimer (SP), die Koordi­ nationsprimer (KP), die Endüberlappungsbereiche (Ü3, Ü5) und/oder die auszubildenden Enddoppelstrangabschnitte (EDSA) in ihrer Zusammensetzung so gewählt werden, dass sich eine Hybridisierungstemperatur Tm ergibt, welche im Bereich von etwa 55°C bis etwa 68°C liegt.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 oder 41, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurepolymerasesystem mindestens eine ther­ mostabile Nukleinsäurepolymerase aufweist mit niedriger Feh­ lerrate und intrinsischer 3'-5'-Exonukleaseaktivität oder Korrekturleseaktivität, insbesondere Pfu-DNS-Polymerasen.

43. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufteilen oder die Aufteilung (A) der Nukleinsäure­ sequenzinformation (NSI) der Zielsequenz (ZS) des zu erzeu­ genden Nukleinsäureprodukts (NP) zur Definition der einander zugeordneten Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) oder der Sequenzabschnitte dafür und/oder das Aufteilen oder die Aufteilung (A) der einander zugeordneten Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) in verschiedene Reaktions­ bereiche (R, Rj) gemäß einem Optimierungsalgorithmus er­ folgt, insbesondere hinsichtlich Qualität und Ausbeute des Nukleinsäureprodukts (NP) und/oder seiner Zwischenprodukte und/oder hinsichtlich des Aufwandes.

44. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) oder Sequenzabschnitte dafür hinsichtlich der Überlappungs­ bereiche oder Endüberlappungsbereiche (Ü3, Ü5) der einander zugeordneten Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) optimiert werden, wobei ein oder mehrere der folgenden As­ pekte berücksichtigt werden:
eine gute Qualitätskontrolle bereits am Anfang des ge­ samten Verfahrens, insbesondere in der ersten Reaktionsstufe (R1),
es werden am Anfang nur sequenzkontrollierten Sequenz­ primer (SP), Koordinationsprimer (KP) und/oder Amplifikati­ onsprimer (AP) eingesetzt, vorzugsweise mit einer Sequenz­ länge von bis zu 50 Basen oder Basenpaaren,
die Sequenzprimer (SP) und/oder Koordinationsprimer (KP) werden so gewählt, dass die entstehenden Sequenzlücken (SL) oder Stranglücken (SL) möglichst groß werden,
die Reaktions- oder Hybridisierungstemperaturen (Tm) für das Hybridisieren der einander zugeordneten Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) werden jeweils derart ge­ wählt, dass die jeweiligen Endüberlappungsbereiche (Ü3, Ü5) eine möglichst hohe Spezifizität aufweisen und dabei ggf. eine möglichst geringe Länge aufweisen, so dass dort insbesondere eine kürzere Überlappung ausreicht, um die Hybridisierungs­ reaktion doch spezifisch, d. h. fehlerfrei auszuführen,
die Reaktions- oder Hybridisierungstemperaturen (Tm) für das Hybridisieren der einander zugeordneten Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) und/oder von einander zu­ geordneten Reaktionszwischenprodukten werden jeweils derart gewählt, dass sie gleiche oder sehr ähnliche Werte annehmen, insbesondere im Bereich eines Unterschieds von 1K oder 1°C, und/oder dass möglichst viele Einzelreaktionen oder Mehr- Topfreaktionen in jeweils einzelnen Reaktionsbereichen (R, Rj) gleichzeitig und gemeinsam gesteuert durchgeführt werden können, insbesondere in einem gemeinsamen PCR-Cycler-Gerät, insbe­ sondere bei einer Aufteilung (A) in mehr als vier Reaktions­ bereiche (R, Rj),
die Reaktions- oder Hybridisierungstemperaturen (Tm) für das Hybridisieren der einander zugeordneten Sequenzprimer (SP) und Koordinationsprimer (KP) und/oder von einander zu­ geordneten Reaktionszwischenprodukten werden jeweils derart gewählt, dass sie sehr unterschiedliche Werte annehmen, ins­ besondere im Bereich eines Unterschieds von mehr als 1K oder 1°C, und/oder dass in einer zumindest teilweisen Ein- Topfreaktion möglichst viele Einzelreaktionen nacheinander in einem gemeinsamen Reaktionsbereich (R, Rj) gesteuert durchgeführt werden,
es wird eine größtmögliche Länge für die Sequenzprimer (SP) und/oder die Koordinationsprimer (KP) derart gewählt, dass sich eine besonders geringe Anzahl erforderlicher Ein­ zelreaktionen und/oder erforderlicher Reaktionsbereiche (R, Rj) für die Mehr-Topfreaktion ergibt,
die Sequenzlücken (SL) oder Stranglücken (SL) werden möglichst groß gewählt, um Ausgangsmaterial und den Aufwand einzusparen bei den Sequenzprimern (SP) und den Koordinati­ onsprimern (KP),
für eine hohe Spezifizität der Hybridisierungsreaktion werden die einander zugeordneten Sequenzprimer (SP) und Ko­ ordinationsprimer (KP) mit möglichst hohe Anteilen an den Nukleotiden auf der Basis von Guanosin und Cytidin in den Überlappungsbereichen oder Endüberlappungsbereichen (Ü3, Ü5) gewählt.