CN117529235A - 用于生产人造肉产品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于生产人造肉产品的方法，该方法包括将非动物蛋白组织化以及在组织化工艺之前或期间添加热稳定性内肽酶。
Description
序列表的引用
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技术领域
本发明涉及一种用于生产人造肉产品的方法，该方法包括将非动物蛋白组织化(texturizing)。
背景技术
不断增长的世界人口需要可持续生产的富含蛋白质的食品。例如，豆科作物(例如大豆和豆类)是用于生产富含蛋白质的食品的有吸引力的作物。但是其他非动物蛋白来源也正在被用于食品生产，例如来自各种植物、藻类、或昆虫。
组织化的产品(例如挤出的产品)在食品工业中广泛使用。挤出主要用于赋予食品特定的质地和独特的口感。
Osen等人(2014)，Journal of Food Engineering[食品工程杂志]127：67-74，已经研究了豌豆蛋白分离物的高水分挤出蒸煮。他们发现，由于升高的蒸煮温度(超过了蛋白质的变性温度)，豌豆蛋白的功能特性在纤维形成期间起着次要作用。
Xu等人(2020)，Trends in Food Science&Technology[食品科学与技术趋势]99，167-180，提供了使用反应挤出(REX)和酶来加工食品相关生物聚合物的发展概况。他们将REX-酶工艺分为两大技术类别：(1)REX-EH工艺，该工艺是包括挤出预处理然后是酶水解的系列系统；以及(2)eREX工艺，该工艺在REX之前或期间引入外源酶。他们得出的结论是，除了淀粉糖化之外，eREX仍然是未成熟的领域。
Chen等人(2011),Food Hydrocolloids[食品水胶体]25:887-897，已经研究了挤出预处理与随后的受控的酶水解的组合对大豆蛋白分离物的乳化特性的作用。
Czarnecki等人(1993),Journal of Food Science[食品科学杂志]58:395-398，将斑豆高蛋白级分与木瓜蛋白酶和纤维素酶一起孵育24或72小时，然后冷冻干燥，研磨，筛分和挤出，以从豆类中获得新的零食型产品。
Zhou等人(2017),J Food Process Preserv.[食品加工与保鲜杂志]41:e13301，已经研究了挤出和木瓜蛋白酶共挤出对豌豆蛋白以及对由挤出物的进一步木瓜蛋白酶水解产生的抗氧化肽的作用。
WO 2017/117398(雅培公司(Abbott))披露了制备蛋白质水解产物的方法，该方法包括将完整的蛋白质来源和蛋白酶组分添加到挤出机中。
WO 2018/125920(雅培公司)披露了制备营养粉剂的方法，该方法包括将完整的蛋白质来源、蛋白酶组分、脂肪组分和水添加到挤出机中。
植物蛋白的挤出可以赋予蛋白质纤维状的肉样结构。
人造肉产品是由例如植物蛋白制成的肉类替代品，该肉类替代品旨在模拟肉类产品的视觉外观、质地和味道。人造肉产品可以通过挤出(例如，大豆、小麦或豌豆蛋白)制成。挤出是导致蛋白质解折叠的热机械组织化工艺。在高水分(HM)挤出工艺中，冷却模具允许蛋白质重新排列并形成新的分子间共价键和非共价键。挤出机末端的冷却模具产生致密、分层和纤维状的肉样结构。在低水分(LM)挤出工艺中，产品在离开模具时会膨胀并形成具有纤维状、不溶性、多孔网络的膨化固体，该膨化固体可以吸收多达其重量三倍的液体。
组织化的植物蛋白(例如挤出的植物蛋白，特别是LM挤出的植物蛋白(也称为TVP))可以塑造成各种形状(厚块状、薄片状、小块、颗粒和条)和尺寸。
多年来，挤出一直被用于生产人造肉，以从植物蛋白获得肉样结构。然而，很难获得具有可接受的质地和功能特性的植物蛋白(例如豆科作物蛋白)的挤出物，这样的质地和功能特性使其在不必添加非天然成分(例如甲基纤维素)的情况下用于人造肉中来改善例如类似肉类的黏聚性和粘附性。
甲基纤维素在最终产品配制品中使用并且充当粘合剂，确保产品维持其质地和形状。甲基纤维素具有在加热时表现出热胶凝的能力，这使得产品保持在一起，并且减少蒸煮期间的失水量。
WO 2020/038541(拉伊西奥营养公司(Raisio Nutrition))披露了用于制造基于植物的肉类替代品的方法，该方法通过以下进行：使含有植物蛋白材料和燕麦材料以及任选地交联酶和/或蛋白质脱酰胺酶的混合物在25℃-55℃的温度下通过挤出机。使用低温和高温挤出生产包括转谷氨酰胺酶的肉类替代品，并且对于测试的每种感官特性以及整体质量评级，低温样品比相应的高温样品获得了更好的评级。
CN 109619208A(黑龙江八一农垦大学(UNIV HEILONGJIANG BAYIAGRICULTURAL))披露了用于制备增味的仿肉食品的方法，该方法通过以下进行：将包含豆类种子粉和大豆蛋白的原材料挤出膨化。使用Alcalase和Flavorzyme的超声酶解可以应用10-20分钟的持续时间，优选地随后进行美拉德(Maillard)反应，然后进行挤出膨化以提供浓郁的风味和持久的香气。
Bohrer(2019),Food Science and Human Wellness[食品科学与人类健康]8(4):320-329，已经研究了现代人造肉产品的配制品和营养组合物，并且发现甲基纤维素包含在许多这样的产品中。甲基纤维素等成分的健康受到质疑，尽管没有发现真正的健康风险或问题。然而，消费者对食品产品上更清洁标签的追求影响了食品加工商，使得他们尝试限制或淘汰加工的人造肉产品中使用的这样的成分。
本发明的目的是提供具有更好功能特性的组织化的非动物蛋白材料，使它们适用于在人造肉产品(例如汉堡肉饼、肉末、香肠或人造鸡块)中使用。
发明内容
本发明的诸位发明人惊讶地发现通过在组织化工艺(例如挤出工艺)之前或期间，将热稳定性内肽酶添加到非动物蛋白中，提供了组织化的非动物蛋白材料，当用于人造肉产品(例如汉堡肉饼)中时，该非动物蛋白材料赋予改善的特性，例如更高的粘附性和/或更高的持水能力。例如生汉堡肉饼的更高的粘附性允许减少或淘汰甲基纤维素等成分的使用，这些成分被消费者认为是非天然的。更高的持水能力赋予人造肉产品更好的多汁性。
因此，本发明提供了生产人造肉产品的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过以下将非动物蛋白组织化：(i)使其通过挤出机，该挤出机包括机筒、至少一个螺杆和喷嘴或冷却模具，或(ii)剪切池技术(shear cell technology)，从而形成至少一条或一块组织化的蛋白材料，将该蛋白材料任选地切成颗粒，
b)在步骤a)之前或期间，将热稳定性内肽酶添加到该非动物蛋白的至少一部分中，
c)任选地将该组织化的蛋白材料切碎或切条，以及
d)将该非动物蛋白与其他成分混合以获得该人造肉产品，
其中该与其他成分的混合可以在步骤a)之前、在步骤a)之后但在任选的步骤c)之前和/或在任选的步骤c)之后进行。
尽管挤出期间条件苛刻，但在此工艺期间直接添加蛋白酶令人惊讶地产生了显著的蛋白质水解，其通过挤出物的水解度(％DH)测量。即使％DH的适度增加也产生更好的溶解度，并且因此在最终应用中产生更好的功能性。
定义
术语“分离的”意指多肽、核酸、细胞或其他指定材料或组分与在自然界中发现的与其天然相关联的至少一种其他材料或组分(包括但不限于，例如，其他蛋白质、核酸、细胞等)分离。分离的多肽包括但不限于含有分泌的多肽的培养液。
术语“成熟多肽”意指在N末端加工(例如，信号肽的去除)后处于其成熟形式的多肽。在一个方面，SEQ ID NO:1的成熟多肽是氨基酸1-413，并且SEQ ID NO:2的成熟多肽是氨基酸1-188。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞以不同的方式对多肽进行加工，并且因此表达多核苷酸的一个宿主细胞与表达相同多核苷酸的另一个宿主细胞相比可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)。
术语“纯化的”意指基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术(例如，在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经受密度梯度离心的培养基中，纯化的多肽或核酸可形成离散的条带)所确定。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，以摩尔计的重量百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后分子的浓度大幅度增加时，组合物富集了该分子。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)
具体实施方式
本发明涉及生产人造肉产品的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过以下将非动物蛋白组织化：(i)使其通过挤出机，该挤出机包括机筒、至少一个螺杆和喷嘴或冷却模具，或(ii)剪切池技术，从而形成至少一条或一块组织化的蛋白材料，将该蛋白材料任选地切成颗粒，
b)在步骤a)之前或期间，将热稳定性内肽酶添加到该非动物蛋白的至少一部分中，
c)任选地将该组织化的蛋白材料切碎或切条，以及
d)将该非动物蛋白与其他成分混合以获得该人造肉产品，
其中该与其他成分的混合可以在步骤a)之前、在步骤a)之后但在任选的步骤c)之前和/或在任选的步骤c)之后进行。
非动物蛋白
非动物蛋白可以是，例如植物蛋白、水生蛋白质(例如来自海藻或微藻)、或发酵蛋白质(例如真菌蛋白(mycoprotein)，如阔恩素肉(Quorn))、或其任何组合。
非动物蛋白优选地是植物蛋白。
植物蛋白可以例如从以下中获得：豆科作物，例如豆类，如豌豆、小扁豆、鹰嘴豆，或油料作物，例如大豆、花生；种子，例如向日葵、亚麻、芝麻、奇亚；谷类作物，例如小麦、燕麦、玉米；假谷物，例如藜麦；草或牧场豆科作物，例如苜蓿、三叶草；油菜籽、卡诺拉(canola)、坚果、蔬菜、水果、蘑菇、棉籽中的任一种；或任何这些的任何组合。
在一个优选的实施例中，非动物蛋白是豆科作物蛋白，优选地大豆蛋白或豌豆蛋白。
非动物蛋白可以是豆科作物蛋白，其中在步骤a)之前或之后，将豆科作物蛋白与来自其他来源(例如其他植物)的非动物蛋白混合。
非动物蛋白可以是大豆蛋白，其中在步骤a)之前或之后，将大豆蛋白与来自其他来源(如其他植物，例如，小麦和/或其他豆科作物)的非动物蛋白(例如豌豆蛋白)混合。
非动物蛋白可以是豌豆蛋白，其中在步骤a)之前或之后，将豌豆蛋白与来自其他来源(如其他植物，例如，其他豆科作物)的非动物蛋白(例如大豆蛋白)混合。
非动物蛋白可以是非动物蛋白浓缩物，例如植物蛋白浓缩物或豆科作物蛋白浓缩物，优选地具有40％-70％(w/w)的蛋白质与干物质比率的豆科作物蛋白浓缩物。优选地，豆科作物蛋白浓缩物是大豆蛋白浓缩物、豌豆蛋白浓缩物、鹰嘴豆蛋白浓缩物、绿豆蛋白浓缩物、小扁豆蛋白浓缩物或蚕豆蛋白浓缩物，更优选地大豆蛋白浓缩物或豌豆蛋白浓缩物。
非动物蛋白可以是非动物蛋白分离物，例如植物蛋白分离物或豆科作物蛋白分离物，优选地具有70％-95％(w/w)的蛋白质与干物质比率的豆科作物蛋白分离物。优选地，豆科作物蛋白分离物是大豆蛋白分离物、豌豆蛋白分离物、鹰嘴豆蛋白分离物、绿豆蛋白分离物、小扁豆蛋白分离物或蚕豆蛋白分离物，更优选地大豆蛋白分离物或豌豆蛋白分离物。
非动物蛋白可以是脱壳豆科作物粉，优选地具有10％-30％、优选地15％-30％(w/w)的蛋白质与干物质比率的脱壳豆科作物粉。优选地，脱壳豆科作物粉是脱壳豌豆粉、脱壳鹰嘴豆粉、脱壳绿豆粉、脱壳小扁豆粉或脱壳蚕豆粉，最优选地脱壳豌豆粉。
非动物蛋白可以是脱脂豆科作物粉，优选地具有10％-30％、优选地15％-30％(w/w)的蛋白质与干物质比率的脱脂豆科作物粉。优选地，脱脂豆科作物粉是脱脂大豆粉。
非动物蛋白可以是脱脂豆科作物薄片，优选地具有40％-65％(w/w)的蛋白质与干物质比率的脱脂豆科作物薄片。优选地，脱脂豆科作物薄片是脱脂大豆薄片。
非动物蛋白可以是大豆粕。
挤出
自20世纪60年代以来，挤出蒸煮一直被用于生产人造肉，这些人造肉使用特别是大豆蛋白作为原材料，并且直到几年前还一直主要用作肉类补充品，来降低传统肉类行业中肉碎的成本。然而，尤其是在过去的10年中，更多的注意力集中在寻找适用的挤出物，以完全替代基于肉类的肉饼和香肠(参见，例如，在“Sustainable Meat Products andProcessing[可持续肉类产品和加工]”(2018 Charis Galanakis编辑,电子版ISBN9780128156889)中的K.Kyriakopoulou等人的第6章“Plant-Based Meat Analogues[基于植物的人造肉]”)。
挤出是一种热机械工艺，通过该工艺使湿润、可膨胀、淀粉性和蛋白质类的食品材料塑化并通过压力、热量和机械剪切的组合将其推动通过模具。典型的挤出机装置由进料系统、螺杆、机筒、模具和切割机组成。此外，在挤出之前可以任选地引入预处理系统。挤出机机筒可以分为7-9个部分(通常称为温度区)，这些部分可以单独进行加热。使用体积或重量受控的进料器将材料添加到挤出机的第一部分。使用泵将水(可能包括酶)或具有调节的水分含量的预处理材料进料到挤出机的第二部分。所使用的螺杆配置可以由正向和反向输送元件组成。在进料区，将材料混合、均质化，然后输送到压缩区。在该区，存在螺槽深度和螺距减小，导致剪切速率、温度和压力增加。通过螺杆旋转散失的机械能提高了挤出机内的加工温度。在130℃到180℃之间，蛋白质变性，产生黏弹性物质，这种物质可以在冷却模具中进行对齐。总而言之，工艺条件的这种改变将固体材料转化为流体熔体。在离开挤出机之前，达到最高温度和压力，这导致挤出的材料的粘度立即降低。在通过高水分挤出生产人造肉的情况下，冷却模具很长，以产生对齐并防止严重的材料膨胀，这可能会破坏新形成的结构。
人造肉产品的成功制备需要对挤出参数，例如螺杆速度、进料的水分含量、机筒温度、挤出机特性以及进料的化学和物理组成进行控制。技术人员将知晓如何调节挤出参数以优化工艺。
对于人造肉生产，根据挤出期间添加的水量：高水分挤出和低水分挤出，已经开发了两种产品类别。
在低水分挤出中，具有低水分含量的粉或浓缩物被转化为组织化的植物蛋白(TVP)(也称为干挤出物)，这些成分在挤出期间被水合例如15％的水分，产生具有较低的最终水分含量的挤出物。对于最终的人造肉配方，它们在蒸煮(例如油炸)之前被再水合并与其他成分混合。低水分挤出的产品呈现海绵状结构，并且快速膨胀和吸收水分。它们典型地被用作肉类补充品，但如今也部分或全部用作人造肉，如香肠和牛肉饼。
在高水分挤出中，这些成分在挤出期间被水合例如70％的水分，产生较高的最终水分含量的挤出物。大多数情况下，同向旋转的双螺杆挤出机用于此应用，并且产品直接用于进一步加工或者在挤出后冷冻以延长保质期并可能增强结构。高水分产品可以按原样使用，或切条以模拟鸡肉或古拉食(gullasch)样肉片，或切碎成不同大小以制成肉饼或香肠。
根据Egbert和Borders,2006,Achieving success with meat analogs[人造肉取得成功],Food Technol-Chicago[食品科技-芝加哥],60(1):28-34，人造肉产品可以含有水(50％-80％)，组织化的植物蛋白(10％-25％)，非组织化的蛋白(4％-20％)，调味剂(3％-10％)，脂肪(0-15％)，黏结剂(1％-5％)和着色剂(0-0.5％)。这些成分的组合产生了在感官属性方面被接受的人造肉。高水含量不仅降低了产品的成本，而且提供了所需的多汁性，在加工期间充当增塑剂并有助于乳化。
在本发明的方法的优选的实施例中，使非动物蛋白通过挤出机，优选地双螺杆挤出机，例如同向旋转的或反向旋转的双螺杆挤出机，更优选地同向旋转的双螺杆挤出机。
使非动物蛋白优选地在20℃-180℃、优选地50℃-170℃的温度下通过挤出机。
在优选的实施例中，挤出机具有多于一个温度区，例如2-10个、优选地5-9个温度区。
在本发明的实施例中，其中在步骤a)中使用高水分挤出工艺，挤出机优选地包括冷却模具。在这样的实施例中，非动物蛋白通过挤出机时的水分含量优选地为40％-90％，更优选为50％-75％(w/w)。
在本发明的实施例中，其中在步骤a)中使用低水分挤出工艺，挤出机优选地包括喷嘴。在这样的实施例中，非动物蛋白通过挤出机时的水分含量优选地为1％-35％，更优选为5％-30％(w/w)。
剪切池技术
基于挤出是有效的但没有明确定义的工艺的认识，十年前引入了基于明确定义的剪切流变形的技术来生产纤维状产品。受流变仪设计的启发开发了剪切装置，即所谓的剪切池，其中可以以叠锥或库埃特(couette)几何学施加强剪切。用这种技术获得的最终结构取决于成分和加工条件。纤维状产品用几种植物蛋白共混物(例如大豆蛋白浓缩物或大豆蛋白分离物(SPI)与例如小麦面筋蛋白(WG)、果胶和/或淀粉共混)获得。纤维状产品也可以通过使用酪蛋白钙来获得。该技术已被证明是成功的，至少达到了中试规模(BL Deckers等人,在Trends in Food Science&Technology[食品科学与技术趋势]81(2018)25-36中)。当使用剪切池技术时，通常也会应用高温(高于100℃)。
与在挤出工艺中一样，热稳定性蛋白酶可以应用于其他可能更温和的用于制造人造肉的工艺(例如剪切池技术)中，以此方式产生挤出物和最终配制的产品的相同的改善的性能。
内肽酶
在本发明的方法中，在组织化工艺(例如挤出工艺或剪切池技术工艺)之前或期间，将热稳定性内肽酶添加到非动物蛋白中。
在本发明的上下文中，热稳定性内肽酶可以被定义为如下内肽酶，在80℃和在内肽酶展现出其最大活性的至少40％的pH下孵育15分钟后，相对于其在37℃下孵育后的活性，该内肽酶具有至少80％的残余活性。
在本发明的上下文中，热稳定性内肽酶可以被定义为如下内肽酶，在80℃和pH 9下孵育15分钟后，相对于其在37℃下孵育后的活性，该内肽酶具有至少80％的残余活性。
技术人员将知晓如何确定残余活性。可以使用残余活性测量测定进行确定，如WO2016/087427的实例中所述。
优选地，热稳定性内肽酶是非特异性内肽酶。如果内肽酶是特异性内肽酶(例如在Arg或Lys之后切割)，或内肽酶是非特异性内肽酶，技术人员都将知晓。非特异性内肽酶也可以表征为具有广泛特异性的内肽酶。
非特异性内肽酶的特征可以在于在内肽酶展现出其最大活性的至少40％的温度和pH下，将0.5％(w/w)BSA与内肽酶一起孵育4小时产生至少10％、优选地至少15％的水解度。
在一些实施例中，已经分离了热稳定性内肽酶。
在一些实施例中，已经纯化了热稳定性内肽酶。
在一些实施例中，热稳定性内肽酶与SEQ ID NO:1或2中的任一个的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。内肽酶可以与SEQ ID NO:1或2中的任一个的成熟多肽相差多达10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸。
在一些实施例中，热稳定性内肽酶与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。内肽酶可以与SEQ ID NO:1的多肽相差多达10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸。
在一些实施例中，热稳定性内肽酶与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。内肽酶可以与SEQ ID NO:2的多肽相差多达10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸。
在一些实施例中，热稳定性内肽酶包含SEQ ID NO:1或2中的任一个的氨基酸序列或这些中的任一个的等位基因变体，或由其组成。
在一些实施例中，热稳定性内肽酶是SEQ ID NO:1或2中的任一个的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，几个)位置处包含取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在本发明的上下文中，术语“变体”意指在一个或多个(例如，几个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有内肽酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据某一位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，几个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。
氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,在The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有使多肽的物理化学特性改变的这样一种性质。例如，这些氨基酸改变可以影响多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得的突变型分子的内肽酶活性以鉴定对分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如由如以下技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如,de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)，以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
在本发明的方法中使用的热稳定性内肽酶可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“获得自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
在一些优选的实施例中，热稳定性内肽酶可以获得自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)，优选地拟诺卡氏菌属物种或葱绿拟诺卡氏菌(Nocardiopsis prasina)。
内肽酶可以获得自表征为超嗜热菌的生物。内肽酶可以获得自超嗜热细菌，例如热孢菌属(Thermotoga)、栖热腔菌属(Thermosipho)、闪烁杆菌属(Fervidobacterium)、产水菌属(Aquifex)、热杆菌属(Calderobacterium)、发状菌属(Thermocrinis)，或可以获得自古核生物，例如硫化叶菌属(Sulfolobus)、金属球菌属(Metallosphaera)、酸菌属(Acidianus)、憎叶菌属(Stygiolobus)、硫化小球菌属(Sulfurococcus)、硫磺球形菌属(Sulfurisphaera)、热变形菌属(Thermoproteus)、热棒菌属(Pyrobaculum)、热丝菌属(Thermofilum)、热分支菌属(Thermocladium)、暖枝菌属(Caldivirga)、硫还原球菌属(Desulfurococcus)、葡萄热球菌属(Staphylothermus)、厌硫球菌属(Sulfophobococcus)、施铁特菌属(Stetteria)、气火菌属(Aeropyrum)、燃球菌属(Ignicoccus)、热球形菌属(Thermosphaera)、热盘菌属(Thermodiscus)、热网菌属(Pyrodictium)、超热菌属(Hyperthermus)、火叶菌属(Pyrolobus)、高温球菌属(Thermococcus)、火球菌属(Pyrococcus)、古生球菌属(Archaeoglobus)、铁球菌属(Ferroglobus)、甲烷嗜热菌属(Methanothermus)、产甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷火菌属(Methanopyrus)。
在一些优选的实施例中，热稳定性内肽酶可以获得自火球菌属。在一些优选的实施例中，热稳定性内肽酶可以获得自强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)。
拟诺卡氏菌属和火球菌属的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service PatentCulture Collection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
在本发明的方法中使用的热稳定性内肽酶的量优选地是1-5000mg的酶蛋白/千克的蛋白质，更优选地1-2500、甚至更优选地1-1000、并且最优选地1-500、例如5-500mg的酶蛋白/千克的蛋白质。
剂量以mg EP/kg蛋白质给出，即底物中每一定量蛋白质的mg酶蛋白。
人造肉产品的生产
在本发明的一个优选的实施例中，在即将进行步骤a)之前或在该步骤期间，将内肽酶添加到非动物蛋白中。应当理解，在即将进行步骤a)之前或在该步骤期间将内肽酶添加到非动物蛋白中意指没有预孵育。
在一个优选的实施例中，将非动物蛋白添加到挤出机或剪切池技术装置中，并随后添加内肽酶的水溶液。
在特定的优选的实施例中，通过使非动物蛋白通过挤出机将其进行组织化，并且将内肽酶直接进料到挤出机中，优选地将内肽酶的水溶液直接进料到挤出机中。优选地，将非动物蛋白和内肽酶的水溶液单独添加到挤出机的进料区。
也可以将内肽酶添加到非动物蛋白的水溶液或悬浮液中,然后立即将其进料到挤出机，即，没有预孵育步骤。
在本发明的其他实施例中，在步骤a)之前将内肽酶添加到非动物蛋白的至少一部分中并与其一起孵育。在这样的实施例中，与其他成分的混合可以在非动物蛋白的至少一部分与内肽酶的孵育之前或期间但在步骤a)之前进行。并且/或者与其他成分的混合可以是在步骤a)之后但在任选的步骤c)之前进行。并且/或者与其他成分的混合可以是在任选的步骤c)之后进行。
在一些实施例中，在步骤a)之前将内肽酶添加到非动物蛋白的一部分中并与其一起孵育。这样的孵育之后可以任选地将已经与内肽酶一起孵育的非动物蛋白的部分进行至少部分地干燥。将已经与内肽酶一起孵育并任选地干燥的非动物蛋白的部分与剩余的非动物蛋白混合，然后再将其进料到挤出机。非动物蛋白与内肽酶一起孵育的部分可以是非动物蛋白的5％-60％，例如10％-50％。
在一些实施例中，可以将已进行步骤a)和b)的非动物蛋白与已在组织化之前或期间不添加热稳定性内肽酶的情况下组织化的非动物蛋白混合。如实例11所示，汉堡肉饼(其中只有部分组织化的非动物蛋白在组织化期间已经受热稳定性内肽酶)仍然具有较高的持水能力，并且因此具有较高的多汁性以及在蒸煮之前较高的粘附性。
在本发明的方法中，将非动物蛋白与其他成分混合以获得人造肉产品。与其他成分的混合可以在步骤a)之前，它可以在步骤a)之后但在任选的步骤c)之前，并且/或者它可以在任选的步骤c)之后进行。例如，它可以在步骤a)之前与一种或多种成分混合，并且在步骤a)和b)之后(例如在任选的步骤c)之前或之后)与一种或多种其他成分混合。
一种或多种成分可以选自非组织化的植物蛋白(例如大豆蛋白分离物、小麦面筋蛋白)、纤维(例如果胶)、淀粉(例如玉米淀粉、豌豆淀粉和/或马铃薯淀粉)、盐、着色剂、芳香剂、调味剂、香味料、和/或油或脂肪(例如椰子脂、葵花油和/或菜籽油)。
非组织化的植物蛋白(例如像大豆蛋白分离物)可以作为成分添加到例如汉堡肉饼中作为粘合剂。
通过本发明的方法生产的人造肉产品可以是，例如，人造肉末产品、汉堡肉饼、香肠、人造肉丸产品、人造鸡块产品、人造古拉食肉产品或人造炸肉排(schnitzel)产品。在一个优选的实施例中，通过本发明的方法生产的人造肉产品是汉堡肉饼。
相比于使用本发明的方法但没有添加内肽酶而获得的人造肉产品，通过相同方法获得的人造肉产品的粘附性优选地好至少20％，更优选地好至少50％。
技术人员将知晓如何确定粘附性。可以优选地根据实例中描述的内容来确定。负数越大意味着粘附性越好。
相比于使用本发明的方法但没有添加内肽酶而获得的人造肉产品，通过相同方法获得的人造肉产品优选地具有最多降低5％、优选地最多降低3％的咀嚼性。
技术人员将知晓如何确定咀嚼性。可以优选地根据实例中描述的内容来确定。
通过本发明的方法获得的人造肉产品在蒸煮之前优选地包含5％-40％、更优选地12％-40％、甚至更优选地15％-40％、最优选地15％-25％(w/w)的组织化的非动物蛋白。
通过本发明的方法获得的人造肉产品优选地包含5％-40％、更优选地12％-40％、甚至更优选地15％-40％、最优选地15％-25％(w/w)的已进行本发明的方法的步骤a)和b)的非动物蛋白。
在通过本发明的方法获得的人造肉产品中，除水以外的其他成分在蒸煮之前优选地占2％-50％，更优选地3％-30％(w/w)。
通过本发明的方法获得的人造肉产品优选地不包含甲基纤维素。
优选的实施例
1.一种用于生产人造肉产品的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过以下将非动物蛋白组织化：(i)使其通过挤出机，该挤出机包括机筒、至少一个螺杆和喷嘴或冷却模具，或(ii)剪切池技术，从而形成至少一条或一块组织化的蛋白材料，将该蛋白材料任选地切成颗粒，
b)在步骤a)之前或期间，将热稳定性内肽酶添加到该非动物蛋白的至少一部分中，
c)任选地将该组织化的蛋白材料切碎或切条，以及
d)将该非动物蛋白与其他成分混合以获得该人造肉产品，
其中该与其他成分的混合可以在步骤a)之前、在步骤a)之后但在任选的步骤c)之前和/或在任选的步骤c)之后进行。
2.如实施例1所述的方法，其中该非动物蛋白是植物蛋白，优选地豆科作物蛋白，更优选地大豆蛋白或豌豆蛋白。
3.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非动物蛋白是非动物蛋白粉、非动物蛋白薄片、非动物蛋白浓缩物或非动物蛋白分离物。
4.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非动物蛋白是粒度为100-3,000微米的非动物蛋白粉。
5.如实施例1-4中任一项所述的方法，其中该非动物蛋白是非动物蛋白浓缩物或非动物蛋白分离物，优选地豆科作物蛋白浓缩物或豆科作物蛋白分离物，更优选地大豆蛋白浓缩物、豌豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物或豌豆蛋白分离物。
6.如实施例1-3中任一项所述的方法，其中该非动物蛋白是大豆粕或脱脂大豆粉。
7.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，使该非动物蛋白通过挤出机，优选地双螺杆挤出机，例如同向旋转的或反向旋转的双螺杆挤出机，更优选地同向旋转的双螺杆挤出机。
8.如前述实施例所述的方法，其中使该非动物蛋白在20℃-180℃、优选地50℃-170℃的温度下通过挤出机。
9.如前述两个实施例中任一项所述的方法，其中该挤出机具有多于一个温度区，例如2-10个、优选地5-9个温度区。
10.如前述三个实施例中任一项所述的方法，其中在步骤a)中使用高水分挤出工艺，并且优选地其中该挤出机包括冷却模具。
11.如前述实施例所述的方法，其中该非动物蛋白通过该挤出机时的水分含量为40％-90％，优选地为50％-75％(w/w)。
12.如实施例7-9中任一项所述的方法，其中在步骤a)中使用低水分挤出工艺，并且优选地其中该挤出机包括喷嘴。
13.如前述实施例所述的方法，其中该非动物蛋白通过该挤出机时的水分含量为1％-35％，优选地为5％-30％(w/w)。
14.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该人造肉产品是人造肉末产品、汉堡肉饼、香肠、人造肉丸产品、人造鸡块产品、人造古拉食肉产品或人造炸肉排产品。
15.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该热稳定性内肽酶是非特异性内肽酶。
16.如前述实施例所述的方法，其中该非特异性内肽酶的特征在于在该内肽酶展现出其最大活性的至少40％的温度和pH下，将0.5％(w/w)BSA与该内肽酶一起孵育4小时产生至少10％的水解度。
17.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该热稳定性内肽酶是如下内肽酶，在80℃和pH 9下孵育15分钟后，相对于其在37℃下孵育后的活性，该内肽酶具有至少80％的残余活性。
18.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该热稳定性内肽酶(i)与SEQ ID NO:1或2中的任一个的多肽具有至少60％序列同一性，优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性，(ii)由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或2中的任一个的编码序列具有至少60％序列同一性，优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性，或(iii)是SEQ ID NO:1或2中的任一个的多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入。
19.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该热稳定性内肽酶获得自火球菌属，优选地强烈火球菌，或获得自拟诺卡氏菌，优选地拟诺卡氏菌属物种。
20.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤a)之前最多5分钟，优选地最多3分钟，更优选地最多1分钟，将该内肽酶添加到该非动物蛋白中。
21.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在即将进行步骤a)之前或在该步骤期间，将内肽酶添加到非动物蛋白中。
22.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在即将进行步骤a)之前或在该步骤期间，将该内肽酶添加到该非动物蛋白中，而无需在步骤a)之前将该非动物蛋白与该内肽酶一起预孵育。
23.如实施例1-20中任一项所述的方法，其中在步骤a)之前，将该内肽酶添加到该非动物蛋白的至少一部分中并与其一起孵育。
24.如前述实施例所述的方法，其中该与其他成分的混合(i)在该非动物蛋白的至少一部分与该内肽酶一起孵育之前或期间但在步骤a)之前进行，(ii)在步骤a)之后但在任选的步骤c)之前进行，并且/或者(iii)在任选的步骤c)之后进行。
25.如前述两个实施例中任一项所述的方法，其中在步骤a)之前，将该内肽酶添加到该非动物蛋白的一部分中并与其一起孵育，任选地然后将与该内肽酶一起孵育的该非动物蛋白的部分进行至少部分地干燥，并且将已经与该内肽酶一起孵育并任选地干燥的该非动物蛋白的部分与剩余的该非动物蛋白混合。
26.如前述实施例所述的方法，其中该非动物蛋白与该内肽酶一起孵育的部分是该非动物蛋白的5％-60％，例如10％-50％。
27.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤a)和b)之后，将该非动物蛋白与已进行步骤a)但没有进行步骤b)的非动物蛋白混合。
28.如前述实施例中任一项所述的方法，其中将已进行步骤a)和b)的该非动物蛋白与已在组织化之前或期间不添加热稳定性内肽酶的情况下组织化的非动物蛋白混合。
29.如前述实施例中任一项所述的方法，其中这些其他成分包含已在组织化之前或期间不添加热稳定性内肽酶的情况下组织化的非动物蛋白。
30.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该人造肉产品中至少5％(w/w)、优选地至少10％(w/w)的组织化的非动物蛋白在组织化之前或期间已添加了热稳定性内肽酶。
31.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该人造肉产品中5％-100％(w/w)、优选地10％-100％(w/w)的组织化的非动物蛋白在组织化之前或期间已添加了热稳定性内肽酶。
32.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该人造肉产品中10％-50％(w/w)、优选地20％-40％(w/w)的组织化的非动物蛋白在组织化之前或期间已添加了热稳定性内肽酶。
33.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非动物蛋白与选自以下的一种或多种成分混合：非组织化的植物蛋白例如大豆蛋白分离物、小麦面筋蛋白，纤维例如果胶，淀粉例如玉米淀粉、豌豆淀粉和/或马铃薯淀粉，盐，着色剂，芳香剂，调味剂，香味料，和/或油或脂肪例如椰子脂、葵花油和/或菜籽油。
34.如前述实施例中任一项所述的方法，其中相比于使用相同方法但没有添加内肽酶而获得的人造肉产品，获得的该人造肉产品的粘附性好至少20％，优选地好至少50％。
35.如前述实施例中任一项所述的方法，其中相比于使用相同方法但没有添加内肽酶而获得的人造肉产品，获得的该人造肉产品具有最多降低5％、优选地最多降低3％的咀嚼性。
36.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该人造肉产品在蒸煮之前包含5％-40％、优选地12％-40％、更优选地15％-40％、甚至更优选地15％-25％(w/w)的组织化的非动物蛋白。
37.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该人造肉产品在蒸煮之前包含5％-40％、优选地12％-40％、更优选地15％-40％、甚至更优选地15％-25％(w/w)的已进行步骤a)和b)的非动物蛋白。
38.如前述实施例中任一项所述的方法，其中除水以外的这些其他成分在蒸煮之前占该人造肉产品的2％-50％，优选地3％-30％(w/w)。
39.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该人造肉产品不包含甲基纤维素。
实例
概述
为了改善底物的功能性，已经测试了几种蛋白酶。挤出物已被配制成与可商购的肉饼类似的肉饼。挤出物和肉饼都已通过化学和物理分析方法进行分析。所应用的方法在现有的食品和肉类行业中是熟知的。
尽管挤出期间条件苛刻，但在此工艺期间直接添加蛋白酶产生了显著的蛋白质水解，其通过挤出物的水解度(％DH)测量(实例3)。即使％DH的适度增加也产生更好的溶解度，并且因此在最终应用中产生更好的功能性。此外，通过测试的蛋白酶增加了干燥挤出物的密度(实例4)。更高的密度被认为是更像肉的结构。
FT-IR分析显示蛋白酶处理的挤出物具有更高的分子间蛋白质相互作用水平(实例5)，反映了更好的溶解，随后工艺诱导形成更高程度的共价和非共价键。
肉饼的质地分析表明，对于HM和LM挤出物，添加蛋白酶比添加甲基纤维素提高的肉末粘附性的程度更高(实例6和7)。因此，添加蛋白酶会产生更容易成型的汉堡肉饼，并且更容易保持凝聚。
此外，如通过LF-NMR测量的，在基于蛋白酶处理的挤出物的肉饼的持水能力增加方面，观察到了功能性改变(实例8)。观察到的更松散结合的水的存在反过来将使得配制的肉饼更具粘附性和多汁性。
在最终挤出物中未观察到残余蛋白酶活性(实例9)。因此，酶处理可以定义为加工助剂，并且因此最终食品产品上的标签是不需要的。
材料
使用的蛋白酶如下：
蛋白酶1是具有如SEQ ID NO：1所示的序列的来自强烈火球菌的热稳定性内肽酶。
蛋白酶2是具有如SEQ ID NO：2所示的序列的来自拟诺卡氏菌物种的热稳定性内肽酶。
蛋白酶3是包括在内用于比较的来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的商业内肽酶Alcalase Pure。
实例1
使用热稳定性蛋白酶进行高水分和低水分挤出(试验1-3)的挤出设置
使用中试规模的挤出机(科倍隆公司(Coperion)，ZsK，斯图加特，德国)进行了测试蛋白酶1和蛋白酶2的挤出试验。挤出机是具有KT20重力双螺杆进料器(科倍隆K-Tron公司(Coperion K-Tron)，斯图加特，德国)的相互啮合、同向旋转的双螺杆挤出机。挤出机的螺杆直径为27mm，其中长度/直径比率为40∶1。挤出机机筒由九个加热区组成。高水分(HM)挤出物使用冷却模具制成，而低水分(LM)挤出物通过常规模具离开挤出机。将LM挤出的产品在带式干燥器(Dry Mate公司，维比(Viby)，丹麦)中在135℃下干燥14分钟。
挤出物由以下产生：来自Eurosoy公司的大豆蛋白浓缩物(SPC)Vegacon 70(其中蛋白质含量为67g/100g dm(干物质))、来自Eurosoy公司的大豆蛋白分离物(SPI)Vegacon90(其中蛋白质含量为86g/100g dm)、或来自Vestkorn公司的豌豆蛋白浓缩物(PPC)E1155X(其中蛋白质含量为55g/100g dm)。
将原材料进料至挤出机的第一区中。将蛋白酶混合到水中，将其进料至挤出机的2区中。
使用表1的设置运行三组不同的试验。有关试验的另外的详细信息和结果可以参见实例3-9。
表1：挤出设置
实例2
使用Alcalase Pure进行高水分挤出(试验4)的挤出设置
使用实验室规模的挤出机(工艺11，赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，卡尔斯鲁厄，德国)进行了测试蛋白酶3的挤出试验。挤出机是相互啮合、同向旋转的双螺杆挤出机。机筒直径及其长度与直径比分别为11mm和40∶1。原材料通过重力双螺杆进料器(MT-S，MiniTwin，布拉本德技术公司(Brabender Technologie)，杜伊斯堡，德国)计量到挤出机中。挤出机具有7个内部加热区和1个外部加热区。高水分(HM)挤出物使用冷却模具制成。
使用表2中给出的设置，从来自Eurosoy公司的大豆蛋白浓缩物(SPC)Vegacon 70生产挤出物。有关试验的另外的详细信息以及结果可以参见实例3。
表2：挤出设置
实例3
HM和LM挤出物的水解度(DH)
DH是指切割的肽键与肽键的起始数目的百分比。例如，如果含有五百个肽键的起始蛋白质被水解直到将五十个肽键切割，则所得水解产物的DH为10％。水解度越高，蛋白质的溶解度越好(SE Molina Ortiza和JR Wagner，Food Research International[国际食品研究]35(2002)511-518)。然而，即使DH的适度增加也改善了溶解度和功能性，参见例如US20080305212。
为了测量挤出物中蛋白酶的特定作用，使用以下程序确定DH：
通过使用邻苯二甲醛(OPA)测定来确定DH。为此，将各水解产物(和非水解起始材料)稀释至2.5％的干物质，并随后以1：20稀释。将每个样品/标准品的20μl等分试样转移到微量滴定板(MTP)中，并添加200μl OPA试剂(OPA试剂：在100ml量瓶中称量以下试剂，并溶解在milli-Q水中，将milli-Q水添加至100ml：0.504g碳酸氢钠、0.4293g十水碳酸钠、100mg十二烷基硫酸钠(SDS)、88g二硫代醇(DTT)、溶于2ml 96％乙醇的80mg邻苯二甲醛(OPA))。
在340nm处读取吸光度。以L-丝氨酸(0-0.5mg/ml)制作了标准曲线：将125mg L-丝氨酸混合在250ml MQ水中并且稀释2、4、8、16、32和64倍。
计算与丝氨酸标准品相关的DH：
结果在表3-5中给出。
表3：HM挤出的SPC(试验1和4)的DH
表4：HM挤出的SPI(试验2)的DH
表5：LM挤出的PPC(试验3)的DH
结论：对于热稳定性蛋白酶(蛋白酶1和2)，在HM和LM挤出物中以及在使用SPC、SPI和PPC作为底物时，均观察到增加的％DH。增加的DH产生更好的溶解度，并且因此在最终应用中产生更好的功能性。热稳定性蛋白酶(蛋白酶1和2)比中等温度稳定的蛋白酶AlcalasePure(蛋白酶3)给出更高的DH增加。
实例4
LM挤出物的密度
通过在2000ml烧杯中称量200g的每种挤出物并测量每种处理的体积来评估LM挤出物的密度。然后以g/l计算密度。结果在表6中给出。
表6：LM挤出的PPC(试验3)的密度
结论：蛋白酶处理的作用使得挤出物密度的显著增加。人造肉专家认为，密度的增加与质量的改善有关，因为密度越高，最终的肉饼或香肠将看起来肉更多，更紧实。
实例5
HM挤出的SPC的二级蛋白质结构(通过FT-IR)
进行FT-IR分析以研究HM挤出物的二级蛋白质结构(M Carbonaro等人(2012)Amino Acids.[氨基酸]第43卷，第911-921页)。
使用具有DTGS检测器并配备有具有单反射金刚石晶体的ATR(衰减全反射比)装置的MB3000 MID FT-IR分光仪(ABB公司)进行吸光度测量。所有样品从挤出物中心获取，均以一式三份进行。将样品定位在晶体表面上，并通过使用凹针压缩机向金刚石晶体挤压。使用4cm-1的光谱分辨率在4000-550cm-1的范围内记录IR光谱。每个光谱代表相对于用空晶体收集的背景(64次扫描)的32次扫描的平均值，并储存为吸光度光谱。
使用LatentiX(2.13版本)分析光谱。研究了含有肽键中C＝O的伸缩振动引起的酰胺I带(1700-1600cm-1)的光谱区域。羧基基团的振动能量取决于蛋白质的不同构象，例如β-折叠和α-螺旋结构，β-和α-转角，以及分子间或分子内聚集体。计算光谱的二阶导数使得可以分配酰胺I带的光谱成分。进行主成分分析(PCA)，并且检查得分和荷载，以研究不同样品和变量之间或内部的关系，并检测趋势、分组和异常值。PCA分析用作探索性分析，而不是直接用作定量测量。PCA得分图的结果已转化为半定量测量，以多个加号给出。表7总结了自PCA得出的结论。
表7：通过FT-IR确定的SPC的HM挤出物(试验1)中的蛋白质的二级结构
结论：由于挤出期间蛋白酶作用而导致的蛋白质水解水平增加，使得最终挤出物具有较少的分子内α-螺旋和β-折叠结构以及更高的分子间蛋白质相互作用水平。尽管用低浓度蛋白酶2处理的挤出物在PCA得分图中没有显示出与对照的显著差异，但通过定量分析％DH(实例3)测量的差异仍然有效。
实例6
肉饼的配制品及HM挤出的SPC的质地分析
将包含23％蛋白质(w/w)和67％水(w/w)的高水分SPC挤出物在凯伍德(Kenwood)绞肉机(具有8mm孔的研磨板)中切碎。将以下成分混合以制备汉堡肉饼：90g挤出的SPC(包含20.5g蛋白质)、2.2g马铃薯淀粉、1.1g NaCl和22.5ml水。包括包含甲基纤维素的对照。将挤出物与马铃薯淀粉和盐混合。对于含有甲基纤维素的肉饼，添加1.1g甲基纤维素。第一次混合后，添加水，并且将肉末再次混合并在冰箱中储存30min。从每种肉末中称量5x20g，并使用金属环(直径4.5cm)将其成型为肉饼。在测量质地之前，将一组肉饼在冰箱中储存1h。另一组肉饼在煎锅上蒸煮2x4分钟，达到80℃的核心温度。在测量质地之前，使煮熟的肉饼达到25℃。
使用质地分析仪(Ta.XT.Plus，稳定微系统公司(Stable Micro Systems)，英国)进行质地分析，该分析仪配备有华纳布拉茨勒(Warner Bratzler)刀片，厚度为3mm，末端为圆形。所有汉堡肉饼都经受双周期压缩测试(TPA)(Breene WM，Application of textureprofile analysis to instrumental food texture evaluation[全质构分析在仪器食品质地评估中的应用].J Texture Stud[质地研究杂志]6：53-82(1975))。将样品压缩至其原始高度的50％，其中测试速度为5mm s-1，并且测试后速度为5mm s-1。咀嚼性计算为：最大峰值力*(面积2/面积1)*距离2/距离1。使用第一次压缩后负应力-应变曲线上的面积(面积3)计算粘附性。
结果在表8中给出。
表8：来自SPC的HM挤出物(试验1)的质地分析
结论：对生肉饼的质地分析表明，湿法挤出期间添加蛋白酶比添加甲基纤维素更能增加肉末的粘附性(负值越大意味着粘附性越高)。因此，添加蛋白酶会产生更容易成型的汉堡肉饼，并且更容易保持凝聚。未观察到对煮熟的产品的质地的不良作用，并且咀嚼性略高于对照，与含有甲基纤维素的汉堡肉饼类似。
实例7
肉饼的配制品及LM挤出的PPC的质地分析
将包含46％(w/w)蛋白质和16％(w/w)水的100g的低水分PPC挤出物在过量的水中浸泡30min。将水排干，并将浸泡好的挤出的PPC切碎，如实例6中针对HM挤出物所描述。
将以下成分混合以制备汉堡肉饼：110g浸泡的挤出的PPC(包含17g蛋白质)、2.2g马铃薯淀粉和1.1g NaCl。包括包含甲基纤维素的对照。将挤出的PPC与马铃薯淀粉和盐混合，并且对于含有甲基纤维素的肉饼，添加1.1g甲基纤维素。第一次混合后，将肉末在冰箱中储存30min。从每种肉末中称量5x20g，并使用金属环(直径4.5cm)将其成型为肉饼。在测量质地之前，将一组肉饼在冰箱中储存1h。另一组肉饼在煎锅上蒸煮2x4分钟，达到80℃的核心温度。在测量质地之前，使煮熟的肉饼达到25℃。
结果在表9中给出。
表9：来自PPC的LM挤出物(试验3)的质地分析
结论：对生肉饼的质地分析表明，PPC的LM挤出期间添加蛋白酶比配制期间添加甲基纤维素更能提高肉末的粘附性。因此，少量添加蛋白酶会产生更容易成型的汉堡肉饼，并且更容易保持凝聚。如通过咀嚼性测量的，与对照相比，未观察到对煮熟的产品的质地产生不利作用。
实例8
HM和LM挤出物的持水能力(通过低场NMR)
由基于植物的人造肉制成的肉饼的持水能力(WHC)对于食用时的凝聚性和多汁性都很重要。基于低场1H核磁共振(LF-NMR)的横向弛豫T2与持水能力(WHC)之间的相关性已在各种论文(例如，HC Bertram等人在Meat Science[肉类科学]57(2001)125-132中和Massimo Lucarini等人在Foods[食品](2020)9，480中)中得到证实。
食品产品中水和生物聚合物的分子迁移率可以通过质子核磁共振LF-NMR来研究，检测质子在磁场中的纵向或自旋-晶格弛豫时间(T1)和横向或自旋-自旋弛豫时间(T2)两者。
如实例6中所述制备肉饼，并在5℃下分析。在Minispec mq20脉冲NMR分光仪(布鲁克拜厄斯宾有限公司(Bruker Biospin)，赖因斯特滕(Rheinstetten)，德国)上进行弛豫测量，其中磁场强度为0.47特斯拉，质子的相应共振频率为20MHz。使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列测量横向弛豫T2。总共采集了2000个数据点，其中90-180脉冲间隔(τ)值为60μs。累积四次扫描，再循环延迟为1s。
通过离散多指数拟合(包括将弛豫曲线去卷积为n个指数分量)来确定弛豫时间常数T2n和相应的相对群体大小fn。通过检查拟合后的残差来确定质子群体的数量。残差揭示了曲线是否由正确数量的分量建模。
结果在表10、11和12中给出。
表10：HM挤出的SPC(试验1)的弛豫时间常数T21、T22和T23以及相对群体大小f1、f2和f3(通过LF-NMR确定)
表11：HM挤出的SPI(试验2)的弛豫时间常数T21、T22和T23以及相对群体大小f1、f2和f3(通过LF-NMR确定)
表12：LM挤出的PPC(试验3)的弛豫时间常数T21、T22和T23以及相对群体大小f1、f2和f3(通过LF-NMR确定)
结论：鉴定了三个具有不同T2值的质子群体，它们被分配给不同迁移率的水群体。具有较低迁移率水的级分被指定为T21和T22，而代表较高迁移率水的级分被指定为T23。
蛋白酶处理的样品展现出更高的T23群体相对量(f3)，而f1和/或f2降低。这指示与对照相比，蛋白酶处理的样品中高迁移率/游离水的相对量更高。作为蛋白酶处理的作用，更松散结合的水的存在预期与WHC增加有关。这反过来将使得配制的肉饼更具粘附性和多汁性。
实例9
HM和LM挤出物中的残余蛋白酶活性
通过使用以下描述的测定来测试蛋白酶的残余活性。
制备了代表所用剂量的标准品。
0.2M硼酸钠缓冲液：将12.366g H3BO4+100ml 1N NaOH转移到1000ml容量瓶中。添加MQ水并且用HCl将pH调节至9.1。在使用前将缓冲液以1∶2稀释(＝0.1M硼酸钠)。
底物：将1.5g脱脂乳粉转移到50ml容量瓶中，并且用0.1M硼酸钠缓冲液充满。
对每种酶进行稀释系列(标准曲线)。对每个样品进行2次确定。MQ水用作空白对照。
将50μl样品移液到微量滴定板中，并且在测量前添加200μl的底物。在405nm处测量吸光度10-12min。每次测量前摇动样品，并且每30s测量一次。
吸光度的降低对应于蛋白酶活性。即，如果不含蛋白酶的对照和蛋白酶处理的挤出物样品随时间推移显示出相似的吸光度(测量为0至12min在405nm处的Δ吸收(在405nm处A12min-A0min的Δ吸收))，则可以得出结论，鉴于标准品显示吸收的剂量依赖性减少，挤出物中不存在残余活性。
结果以在405nm处A12min-A0min的Δ吸收给出，并且如表13-15所示。
表13：SPC的HM挤出物(试验1)
表14：SPI的HM挤出物(试验2)
表15：PPC的LM挤出物(试验3)
由于不含蛋白酶的对照和蛋白酶处理的挤出物样品随着时间推移显示出相似的低Δ吸光度(在405nm处A12min-A0min的Δ吸收)，可以得出结论，挤出物中不存在残余活性。然后，在挤出机的后段应用的温度范围如预期的那样足以确保蛋白酶样品的完全失活。
实例10
使用热稳定性蛋白酶进行的高水分挤出(试验5)的挤出设置
使用中试规模的挤出机(科倍隆公司，ZsK，斯图加特，德国)进行了挤出试验以重复测试蛋白酶1。挤出机是具有KT20重力双螺杆进料器(科倍隆K-Tron公司，斯图加特，德国)的相互啮合、同向旋转的双螺杆挤出机。挤出机的螺杆直径为26mm，其中长度/直径比率为40∶1。挤出机机筒由五个加热区组成。高水分(HM)挤出物使用具有三个部分的冷却模具制成。
挤出物由来自ADM公司的大豆蛋白浓缩物(SPC)生产，其中蛋白质含量为71.5g/100g dm(干物质)。
将原材料进料至挤出机的第一区中。将蛋白酶混合到水中，将其进料至挤出机的2区中。挤出设置在表16中给出。有关试验的另外的详细信息和结果可以参见实例11。
表16：挤出设置
实例11
具有不同量的蛋白酶处理的HM挤出的SPC(试验5)的肉饼的配制以及持水能力分析、质地分析和LF-NMR
在食品加工机(博西公司(Bosch)Multitalent 3)中将包含18％(w/w)蛋白质和72％(w/w)水的高水分SPC挤出物(来自试验5)切条(脉冲约10-30sec，目视检查)。将以下成分混合以制备汉堡肉饼：80g挤出的SPC(包含14.4g蛋白质)、80ml水、20g菜籽油、14g大豆分离物、4g马铃薯淀粉、2g NaCl。挤出物的添加量是蛋白酶处理的和蛋白酶未处理的挤出物的组合。制备了4种不同的肉饼，如表17中所给出，用量不同。
表17：来自SPC的蛋白酶处理的和未处理的HM挤出物(试验5)的量
通过将大豆分离物、盐、马铃薯淀粉和水添加到油中，同时用手动混合器以1档搅拌1min来制备乳液。将切条的挤出物添加到乳液中，并且以1档混合30sec。将肉末冷藏过夜。
通过使用以下方法在25℃下测量持水能力(WHC)：
称量50ml管(每个样品进行三次确定)。称量5g样品到每个管中。添加过量去离子水(16ml)。将样品在室温下置于旋转器(20rpm)中15min。将样品在20℃下以4600rpm离心10min。将上清液小心地丢弃，使用棉签去除管内侧的脂肪残余物。再次称量含有沉淀物的管并计算WHC。
如实例8中所述，在5℃和75℃下直接在肉末上测量LF-NMR。
从每种肉末中，使用金属环(直径6.5cm)将50g肉饼成型。将一组肉饼在平底锅中以500W每面各煎6min。在煎炸前，将平底锅轻轻喷油。在测量质地之前，使煮熟的肉饼达到25℃。如实例6中所述进行质地分析。
结果在表18-20中给出。
表18：具有不同量的蛋白酶处理的HM挤出的SPC的肉末和肉饼的WHC和质地分析
结论：包含蛋白酶处理的挤出物的生肉末显示出生肉末中WHC的增加和/或更高的粘附性，而当包括蛋白酶处理的挤出物时，煎肉饼的粘附性较低。如实例8中所述，WHC预期与最终肉饼的更高的多汁性相关。生肉饼的粘附性增加和煎肉饼的粘附性降低是希望的，因为在配制期间需要粘附性，但在最终产品中不需要。
表19：通过LF-NMR在5℃下确定的弛豫时间常数T21、T22和T23以及相对群体大小f1、f2和f3
表20：通过LF-NMR在75℃下确定的弛豫时间常数T21、T22和T23以及相对群体大小f1、f2和f3
结论：所有包含蛋白酶处理的挤出物的样品展现出更高的T23群体相对量(f3)，而f1和/或f2降低。这指示与仅包含未处理的HM挤出物的对照相比，包含蛋白酶处理的挤出物的样品中高迁移率/游离水的相对量更高。作为蛋白酶处理的作用，更松散结合的水的存在预期与WHC增加有关。这反过来将使得配制的肉饼更具粘附性和多汁性。
Claims (14)
1.一种用于生产人造肉产品的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过以下将非动物蛋白组织化：(i)使其通过挤出机，该挤出机包括机筒、至少一个螺杆和喷嘴或冷却模具，或(ii)剪切池技术，从而形成至少一条或一块组织化的蛋白材料，将该蛋白材料任选地切成颗粒，
b)在步骤a)之前或期间，将热稳定性内肽酶添加到该非动物蛋白的至少一部分中，
c)任选地将该组织化的蛋白材料切碎或切条，以及
d)将该非动物蛋白与其他成分混合以获得该人造肉产品，
其中该与其他成分的混合可以在步骤a)之前、在步骤a)之后但在任选的步骤c)之前和/或在任选的步骤c)之后进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中该非动物蛋白是植物蛋白，优选地豆科作物蛋白，更优选地大豆蛋白或豌豆蛋白。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该非动物蛋白是非动物蛋白粉、非动物蛋白薄片、非动物蛋白浓缩物或非动物蛋白分离物。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，使该非动物蛋白通过挤出机，优选地双螺杆挤出机，例如同向旋转的或反向旋转的双螺杆挤出机，更优选地同向旋转的双螺杆挤出机。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该人造肉产品是人造肉末产品、汉堡肉饼、香肠、人造肉丸产品、人造鸡块产品、人造古拉食肉产品或人造炸肉排产品。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该热稳定性内肽酶是非特异性内肽酶。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该热稳定性内肽酶(i)与SEQ ID NO:1或2中的任一个的多肽具有至少60％序列同一性，优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性，(ii)由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或2中的任一个的编码序列具有至少60％序列同一性，优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性，或(iii)是SEQID NO:1或2中的任一个的多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤a)之前最多5分钟，优选地最多3分钟，更优选地最多1分钟，将该内肽酶添加到该非动物蛋白中。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在即将进行步骤a)之前或在该步骤期间，将该内肽酶添加到该非动物蛋白中。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将已进行步骤a)和b)的该非动物蛋白与已在组织化之前或期间不添加热稳定性内肽酶的情况下组织化的非动物蛋白混合。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该人造肉产品中至少5％(w/w)、优选地至少10％(w/w)的组织化的非动物蛋白在组织化之前或期间已添加了热稳定性内肽酶。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该人造肉产品在蒸煮之前包含5％-40％、优选地12％-40％、更优选地15％-40％、甚至更优选地15％-25％(w/w)的组织化的非动物蛋白。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中除水以外的这些其他成分在蒸煮之前占该人造肉产品的2％-50％、优选地3％-30％(w/w)。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该人造肉产品不包含甲基纤维素。
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