CN102325872A - 发酵肉汤制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有有机酸和/或有机酸盐的发酵肉汤制剂、和制备和使用所述制剂的方法。

Description

发酵肉汤制剂
与相关申请的交叉引用
本申请要求2009年2月20日递交的美国临时申请序列号61/154,235，2009年6月10日递交的61/185,865和2010年2月12日递交的61/304,219的优先权，上述每一个临时申请在此处以其整体引入作为参考。
1.发明领域
本发明涉及发酵肉汤制剂、制造其的方法及其用途。
2.背景技术
在多种培养或发酵微生物的工艺中，有时候必须在发酵过程中或结束时杀死混合物中的活细胞。特别是当把含有重组DNA的微生物作为生产宿主来培养并且希望避免任何活的重组生物被释放至环境中时。即使微生物不包含重组DNA，也常常希望在加工前杀死细胞以保证活细胞不被释放到环境中，无论是在生产的产物中或在废产物中。
许多需要杀死微生物的常规方法，例如加热，过于剧烈，可能在杀死细胞前破坏或改变期望的分泌产物。在这种情况下，必须在不杀死细胞的情况下回收产物，这需要使用繁重且代价高的防泄漏工艺和设备。美国专利号5,801,034和5,378,621描述了使用具有1至5个碳原子的单一有机酸杀死微生物细胞的方法。然而，根据这些专利的实施例，高水平的有机酸和低pH是最适的。低pH条件对发酵培养基中的许多目的酶产物的稳定性经常是不利的，并且高水平的有机酸经常抑制希望使用酶产物的下游应用，例如，在由酶产物通过酶催化作用已经产生的底物上产生有机物的微生物发酵。此外，使用高浓度的化学剂杀死微生物细胞可能显著增加从发酵培养基中回收产物的成本。
由此，仍然需要开发在较不剧烈的条件下杀死细胞的方法，其中使用较低浓度的化学剂是所期望的。
3.发明概述
许多工业蛋白质，例如酶，经常在产生其的发酵肉汤中商业提供。通常，蛋白质由细胞(重组或非重组)表达和分泌至包含发酵培养基和细胞的发酵肉汤中。常常希望在将蛋白质用于工业应用之前失活例如杀死细胞，以避免将复制性细胞释放至环境中。本发明公开满足了此需要，以基本上不干扰蛋白质例如酶的活性的方式失活细胞。
在一些方面，本发明公开提供了制造发酵肉汤制剂的方法，其包括在一定条件下孵育第一混合物一段时间，所述第一混合物包含：(a)一种或多种发酵肉汤，(b)占第一混合物的0.1％至15％重量的量的第一有机酸成分，所述第一有机酸成分包含至少一种1-5碳有机酸(即，在其主链和侧链中共具有1-5个碳的有机酸)和/或其盐，和(c)占第一混合物的0.025％至5％重量的量的第二有机酸成分，所述第二有机酸成分包含至少一种6碳或更多碳有机酸(即，在其主链和侧链中共具有6个或更多个碳的有机酸)和/或其盐，其中所述孵育条件和时间导致所述一种或多种发酵肉汤中至少4log的活细胞减少，由此产生发酵肉汤制剂。
在特定的实施方案中，第一有机酸成分的量在如下范围中，所述范围的下限选自按重量计第一混合物的0.1％，0.2％，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％，0.5％，0.75％或1％，而上限独立地选自按重量计第一混合物的0.3％，0.4％，0.5％，0.75％，1％，2％，3％，5％，7％，10％，12％或15％，例如按重量计第一混合物的0.2％至1％，0.2％至0.5％，0.1％至10％，0.25％至5％或0.3％至3％的量，等等。
在特定的实施方案中，第二有机酸成分的量在如下范围中，所述范围的下限选自按重量计第一混合物的0.025％，0.03％，0.04％，0.045％，0.05％，0.075％，0.1％，0.2％，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％，0.5％，0.75％或1％，而上限独立地选自按重量计第一混合物的0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.75％，1％，2％，3％或5％，例如，按重量计第一混合物的0.04％至3％，0.2％至0.5％，0.1％至1％，0.25％至5％或0.3％至3％的量，等等。该有机酸可合适地为6-至10-碳有机酸，6-至9-碳有机酸或6-至8-碳有机酸。因此，在特定的实施方案中，第二有机酸成分包含6-碳酸和/或其盐，7-碳酸和/或其盐，8-碳酸和/或其盐，9-碳酸和/或其盐，或10-碳酸和/或其盐，或由之组成。
孵育时间适宜在下述范围中，所述范围的下限选自4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，14小时，16小时，18小时或20小时，而上限独立地选自12小时，16小时，20小时，24小时，28小时，32小时或36小时，例如从4小时至36小时，例如从8小时至36小时，从20小时至28小时，从8小时至16小时，从10小时至20小时，从16小时至30小时，等等。
孵育条件包括温度，所述温度适宜在下述范围中，该范围的下限选自20℃，22℃，25℃，28℃，30℃，32℃，34℃，36℃，38℃或40℃，而上限独立地选自28℃，33℃，35℃，40℃，45℃，50℃或55℃，例如从20℃至50℃，从25℃至40℃，从28℃至33℃，等等。
孵育条件包括pH，所述pH适宜在下述范围中，该范围的下限选自3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4或4.2，而上限独立地选自3.8，4，4.2，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5，5.2或5.5，例如从3.5至5，从4至4.7，或4.2至4.5的pH。可在孵育开始时和/或在孵育期间一次或多次调节pH，例如加入pH调节剂。在特定的实施方案中，pH调节剂是磷酸、硫酸或氢氧化钠。本文也考虑在某些实施方案中第一和/或第二有机酸成分可在孵育开始时和/或孵育期中起调节pH的作用，并因此部分或完全地消除对另外的pH调节剂的需要。
在某些方面，本发明方法在混合物中实现一种或多种发酵肉汤中的活细胞数的至少5log减少、6log减少、7log减少或8log减少。
在特定的实施方案中，所述第一混合物中的活细胞减少，比接受所述条件的第二混合物或替代混合物中的减少，高至少0.25倍，至少0.5倍，至少1倍，至少2倍，至少5倍或至少10倍，其中所述第二混合物或替代混合物只包含一种有机酸成分，该一种有机酸成分的量达到在第一混合物中的第一和第二有机酸成分的总重量百分比。例如，使用与本发明方法有关的第一有机酸成分的第一量(例如以重量计1％)和第二有机酸成分的第二量(以重量计0.5％)，比在相同或类似条件下以达到所述第一和第二量的总和的第三量(例如1.5％重量百分比)使用单独第一有机酸成分或第二有机酸成分，导致活细胞数的更大减少。
本发明方法可用于失活真菌细胞，例如丝状真菌细胞。在特定的实施方案中，丝状真菌细胞来自木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、金孢霉属(Chrysosporium)或脉孢霉属(Neurospora)。在以下章节5.2.1中描述了适于本公开的方法、制剂和组合物的其他细胞类型。
在特定实施方案中，第一有机酸成分包含下述或由下述组成：醋酸、醋酸盐、甲酸、甲酸盐、丙酸、丙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。在一个实施方案中，第一有机酸成分包含醋酸和/或其盐，或由醋酸和/或其盐组成。
在特定实施方案中，第二有机酸成分包含下述或由下述组成：苯甲酸、苯甲酸盐、环己烷羧酸、环己烷羧酸盐、4-甲基戊酸、4-甲基戊酸盐、苯乙酸、苯乙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。在一个实施方案中，第二有机酸成分包含苯甲酸和/或其盐，或由苯甲酸和/或其盐组成。
在本发明方法的一些实施方案中，第一有机酸成分包含所述1-5碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐，和/或第二有机酸成分包含所述6碳或更多碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐。
在某些特定的实施方案中，第一有机酸成分包含以重量计0.2％-0.4％浓度的醋酸，和第二有机酸成分包含以重量计0.2％-0.4％浓度的苯甲酸钠，和/或孵育时间是24小时，和/或孵育条件包括40℃的温度和/或孵育条件包括4至4.6的pH。
在本发明方法中，第一混合物也可包含一种或多种抗微生物剂，例如以抑制污染性细菌或真菌的生长。在特定的实施方案中，该一种或多种抗微生物剂的量为第一混合物的0.0005至0.05％重量，例如，所述混合物的0.001至0.025％重量的量。在特定的实施方案中，抗微生物剂包含含有异-α酸、四-异α酸(tetra-iso alpha acids)和/或β酸的啤酒花提取物。本文也考虑在特定实施方案中第一和/或第二有机酸成分可起抗微生物剂的作用，并因此部分或全部地消除对另外的抗微生物剂的需要。
本发明方法还包括在上述孵育步骤前制备第一混合物的步骤，例如通过组合一种或多种发酵肉汤以及至少一种1-5碳有机酸和/或其盐、至少一种6碳或更多碳有机酸和/或其盐、和任选地一种或多种其他试剂，例如pH调节剂和/或抗微生物剂。
在特定的实施方案中，本文描述的方法还包括培养细胞以产生在本发明中使用的发酵肉汤中的一种或多种的步骤。例如(但不限于)，可根据以下章节5.2.2中描述的任一种细胞培养方法，制备发酵肉汤。由此，本公开的组合物和制剂可包括通过本文公开的方法制备的发酵肉汤。
不受任何理论约束，本发明人相信，使用本文描述的2种有机酸成分与使用单一有机酸成分相比，导致实现细胞失活(例如，如本文描述的，使活细胞数减少4或更多log倍)所需的总有机酸成分的减少，并允许孵育反应在比原可能的情况更高的pH进行，由此最小化对起始发酵肉汤中的蛋白质例如酶的折叠和稳定性的副作用。因此，在某些方面，在导致如下发酵肉汤制剂的条件下进行本发明方法，所述发酵肉汤制剂中的一种或多种酶维持其至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％的起始酶活性。
本发明还提供了通过本文描述的方法得到的或可通过本文描述的方法得到的发酵肉汤制剂。
因此，在某些方面，本发明提供了组合物，其包含(a)一种或多种含有细胞的发酵肉汤；(b)包含至少一种1-5碳有机酸和/或其盐的第一有机酸成分，其量为所述组合物的0.2％至1.5％重量；(c)包含至少一种6碳或更多碳有机酸和/或其盐的第二有机酸成分，其量为所述组合物的0.04％至0.6％重量。
在特定的实施方案中，第一有机酸成分的量在如下范围中，该范围的下限选自以重量计组合物的0.1％，0.2％，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％，0.5％，0.75％或1％，而上限独立地选自以重量计组合物的0.3％，0.4％，0.5％，0.75％，1％，2％，3％，5％，7％，10％，12％或15％，例如以重量计组合物的0.2％至1％，0.2％至0.5％，0.1％至10％，0.25％至5％或0.3％至3％的量，等等。
在特定的实施方案中，第二有机酸成分的量在如下范围中，该范围的下限选自以重量计组合物的0.025％，0.03％，0.04％，0.045％，0.05％，0.075％，0.1％，0.2％，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％，0.5％，0.75％或1％，而上限独立地选自以重量计组合物的0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.75％，1％，2％，3％或5％，例如，以重量计组合物的0.04％至3％，0.2％至0.5％，0.1％至1％，0.25％至5％或0.3％至3％的量，等等。
应当理解，在本发明的制剂和组合物中有机酸成分通常至少部分是离解的形式，当这些成分是离解的形式时，成分的重量百分比不是指离解的离子(例如钙)的重量而是指用于制备该组合物或制剂的干物质(例如酸或盐)的重量。这些成分离解的程度将取决于其各自的pKa值。优选在使有机酸成分的至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％或至少70％离解的pH条件和温度下制造制剂或组合物。
在某些方面，本发明组合物的pH适宜在下述范围，该范围的下限选自3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4或4.2，而上限独立地选自3.8，4，4.2，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5，5.2或5.5，例如从3.5至5，从4至4.7，或4.2至4.5的pH。
在某些方面，本发明的组合物中的细胞主要或完全是非存活的细胞。例如，在某些实施方案中，如果在组合物中存在活细胞，那么在所述组合物中非存活细胞与活细胞的比例是至少10∶1，至少50∶1，至少100∶1，至少1000∶1，至少10,000∶1，至少100,000∶1或至少1,000,000∶1。
在某些方面，细胞包括真菌细胞，例如丝状真菌细胞。在特定的实施方案中，丝状真菌细胞来自木霉属、曲霉属、青霉属、腐质霉属、金孢霉属或脉孢霉属。
在本发明的组合物的某些实施方案中，第一有机酸成分包含下述或由下述组成：醋酸、醋酸盐、甲酸、甲酸盐、丙酸、丙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。在特定实施方案中，第一有机酸成分包含醋酸和/或其盐，或由醋酸和/或其盐组成。
在本发明的组合物的某些实施方案中，第二有机酸成分包含下述或由下述组成：苯甲酸、苯甲酸盐、环己烷羧酸、环己烷羧酸盐、4-甲基戊酸、4-甲基戊酸盐、苯乙酸、苯乙酸盐，或前述两种或更多种的混合物。在特定实施方案中，第二有机酸成分包含苯甲酸和/或其盐，或由苯甲酸和/或其盐组成。
在某些实施方案中，第一有机酸成分包含1-5碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐，和/或第二有机酸成分包含6碳或更多碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐。
在以下章节5.2.4中描述了适用于本发明的方法和组合物的有机酸的其他细节和实施方案。
在特定的实施方案中，第一有机酸成分包含以重量计0.2％-0.4％浓度的醋酸，和/或第二有机酸成分包含以重量计0.2％-0.4％浓度的苯甲酸钠。
本发明的组合物可包含一种或多种抗微生物剂。在特定的实施方案中，该一种或多种抗微生物剂的量是以重量计组合物的0.0005至0.05％，例如是以重量计所述组合物的0.001至0.025％的量。在特定的实施方案中，抗微生物剂包含含有异-α-酸、四-异α酸和/或β酸的啤酒花提取物。
在本发明的方法、制剂和组合物中使用的发酵肉汤通常包含一种或多种由细胞分泌的蛋白质。所述一种或多种蛋白质中的至少一种可为重组表达的和/或为酶，例如外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或β-葡糖苷酶。在某些实施方案中，发酵肉汤包含由细胞重组表达和分泌的多种酶，例如外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或β-葡糖苷酶中的2种或更多种。在以下章节5.2.3中描述了适合在本发明的组合物和制剂中存在的其他酶。在某些方面，蛋白质占本发明制剂或组合物的3至30重量百分比。在特定的实施方案中，蛋白质占本发明制剂或组合物的5至15重量百分比，7至10重量百分比，6至12重量百分比，5至20重量百分比，10至25重量百分比，10至20重量百分比，8至15重量百分比，或6至10重量百分比。
在某些特定的实施方案中本发明的制剂或组合物具有1、2或所有3种以下活性：
(a)内切葡聚糖酶活性，范围从选自2000，2100，2200，2350，2500或2650CMC U/g的下限至独立地选自2400，2600，2800，3000，3200，3500，3750或4000CMC U/g的上限，例如从2200CMC U/g至2800CMC U/g，从2200CMC U/g至3200CMC U/g，从2500至3500CMC U/g，等等；
(b)β-葡糖苷酶活性，范围从选自300，375，450，475，500，525，550，600，650，或700pNPG U/g的下限至独立地选自475，525，575，635，700，775，800，850，900或950pNPG U/g的上限，例如从525pNPG U/g至775pNPGU/g，从300pNPG U/g至800pNPG U/g，从350pNPG U/g至850pNPGU/g，等等；和
(c)木聚糖酶活性，范围从选自1000，1250，1500，1750，2000，2250，2500，2750或3000ABX U/g的下限至独立地选自2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000或7000ABX U/g的上限，例如从2000ABX U/g至5000ABX U/g，从1500ABX U/g至4500ABX U/g，从3500ABX U/g至5500ABX U/g，等等。
在另一个方面，本发明提供了水解纤维素物料的方法，其包括将纤维素物料和任意前述发酵肉汤制剂或组合物接触。在一些实施方案中，纤维素物料是植物生物质物质，例如木质素纤维素物质，其任选地已被预处理以提高酶促水解。由此，在某些方面本发明的制剂和组合物还包含未水解的纤维素物料，部分水解的纤维素物料或基本上完全水解的(例如＞90％水解的或＞95％水解的)纤维素物料。在特定实施方案中，部分水解的纤维素物料(i)是高达40％，高达50％，高达60％，高达70％，高达80％或高达90％水解的纤维素物料；(ii)是至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，或至少70％水解的纤维素物料；或(iii)水解至落入独立地选自(i)和(ii)的一对值之间的范围中，例如30％-80％或40％-90％水解的。注意本文描述的制剂和组合物的成分(例如有机酸)的重量范围一般不包括纤维素物料或纤维素物料的水解产物。
在以下章节5.3描述了本发明的制剂和组合物的其他细节和实施方案。
在一些方面，本发明提供了通过在本发明的制剂或组合物中发酵可以生产有机物质的微生物来制备有机物质的方法。在一个实施方案中，所述微生物是产乙醇微生物，所述有机物质是乙醇。本发明的组合物可在同时糖化和发酵反应(“SSF”)或分开的糖化和发酵反应(“SHF”)中使用。
不受任何理论约束，相比于与本发明的组合物类似或相同但仅包含一种有机酸成分的制剂或组合物(在此分别称为“替代制剂”或“替代组合物”，在该替代制剂或组合物中所述一种有机酸成分为可失活或杀死发酵肉汤中的细胞的量)，本发明的制剂和组合物有利地包含较少的发酵微生物的抑制剂。由此，在某些实施方案中，在本发明的制剂或组合物存在下由发酵微生物产生的有机物质的产率，比在替代制剂或组合物存在下有机物质的产率，高至少0.25倍，至少0.5倍，至少1倍，至少2倍，至少5倍或至少10倍。例如，当对发酵微生物使用包含酶、第一量(例如1％重量)的第一有机酸成分和第二量(0.5％重量)的第二有机酸成分的本发明组合物或制剂时，由发酵微生物产生的有机物质的产率，比在相同或类似条件下使用包含相同酶和高达所述第一和第二量之和(例如1.5％重量百分比)的第三量的单独第一有机酸成分或第二有机酸成分的组合物时的产率，更高。
因此，在某些实施方案中，本发明制剂和组合物用于SSF反应。该方法包括使包含本发明的制剂或组合物、发酵微生物和纤维素底物的SSF反应混合物经历SSF条件。任选地，所述方法包括形成SSF反应混合物的步骤，例如通过组合本发明的制剂或组合物、乙醇生产者(ethanologen)和任选地纤维素底物。在特定的实施方案中，SSF条件包括缺乏补充的氮源。在另一个特定实施方案中，所述条件有助于纤维素水解为葡萄糖和/或半纤维素糖(例如木糖、阿拉伯糖和/或甘露糖)和有助于葡萄糖和/或半纤维素转化为有机物质(例如乙醇)。包含本发明的制剂或组合物、发酵微生物和任选地纤维素物料的SSF反应混合物也是本发明的一部分，本发明也涵盖其中纤维素物料已被部分水解和发酵的SSF反应产物。
在其他实施方案中，本发明制剂和组合物用于SHF反应。该方法包括使包含本发明的制剂或组合物和纤维素底物的SHF反应混合物经历SHF条件。任选地，所述方法包括形成SHF反应混合物的步骤，例如通过组合本发明的制剂或组合物和纤维素底物。在特定的实施方案中，SHF条件有助于纤维素水解为葡萄糖和/或半纤维素糖(例如木糖、阿拉伯糖和/或甘露糖)。任选地，然后将SHF反应产物用于发酵反应中以将得到的葡萄糖和/或半纤维素转化为有机物质(例如乙醇)。包含本发明的制剂或组合物和纤维素物料的SHF反应混合物也是本发明的一部分，本发明也涵盖其中纤维素物料已被部分水解的SHF反应产物。
在以下章节5.4和5.5中描述了水解纤维素物料的方法和制备有机物质的方法的其他细节和实施方案。
在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含包装和根据本发明的制剂、组合物、SSF反应混合物、SSF反应产物、SHF反应混合物或SHF反应产物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含在用发酵微生物制备有机物质的方法中使用的说明书，例如在用产乙醇微生物和以试剂盒中的细胞灭活的全肉汤或组合物水解的纤维素底物制备乙醇的方法中使用的说明书。在以下章节5.6中描述了本发明的试剂盒的其他细节和实施方案。
在以下章节5.7中提供了本发明的方法、制剂和组合物的其他特定实施方案。
4.附图简述
图1显示了温度和制剂化学浓度对杀死里氏木霉(T.Reesei)细胞的影响。
图2显示了在40℃和pH 4下苯甲酸钠浓度对杀死里氏木霉(T.Reesei)细胞的影响。
图3显示了细胞灭活条件对杀死真菌细胞的影响。
图4显示了具有6个或更多碳的有机酸的化学结构和pKa值。
图5显示了在40℃和pH 4下具有6个或更多碳的不同有机酸对杀死里氏木霉(T.Reesei)细胞的影响。
图6显示了在如实施例2描述的洗过的APB水解物上由鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)产生的乳酸。
图7显示了在如实施例2描述的洗过的APB水解物上由Thermosacc酵母产生的乙醇。
图8显示了在于如实施例2描述的洗过的APB水解物上进行Thermosacc酵母发酵期间葡萄糖的积累。
5.发明详述
5.1定义
如本文使用的，术语“宿主细胞”指可转染用于产生多肽的重组表达载体以表达该多肽的细胞或细胞系。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然、偶然或有意的突变，该后代可能不一定和原始的亲本细胞完全相同(在形态学上或在总基因组互补DNA(genomic DNA complement)上)。宿主细胞包括被表达载体体内转染或转化的细胞。“宿主细胞”指细胞和从丝状真菌菌株，特别是木霉属物种菌株，的细胞产生的原生质体。
当用于细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过异源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或所述细胞来源于这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中不存在的基因，或表达原本异常表达的、不足表达的或完全不表达的天然基因。
“丝状真菌”指真菌门(Eumycotina)和卵菌门(Oomycota)的所有丝状形式(见Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，Wiley，NewYork)。这些真菌的特征在于具有由几丁质、β-葡聚糖和其他复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上和酵母截然不同。丝状真菌的营养生长是菌丝的伸长，并且碳分解代谢是专性需氧的。
如本文使用的，术语“木霉属”或“木霉属物种”指以前或目前被归类为木霉属的任何真菌属。
术语“培养”指在合适生长的条件下在液体或固体培养基中微生物细胞群体的增长。
如本文使用的，在本文中可互换使用的术语“纤维素底物”或“纤维素物料”指含有纤维素和/或半纤维素的物料。纤维素底物可为木质素纤维素物料，所述木质素纤维素物料含有彼此交联的和与木质素交联的纤维素、半纤维素和β-葡聚糖。这些纤维素底物也可含有其他物质，例如果胶、蛋白质、淀粉和脂质，但通常含有纤维素、半纤维素和β-葡聚糖作为主要成分。
“发酵微生物”指适用于在期望的发酵过程中生产有机物质的任何微生物。
如本文使用的术语“发酵肉汤”是指由细胞发酵产生的制品，该制品未经历过回收和/或纯化、或经历过最低程度的回收和/或纯化。例如，当微生物培养物被培养至饱和，并在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如由宿主细胞表达酶)并分泌至细胞培养基中时，产生发酵肉汤。发酵肉汤可含有在发酵结束时得到的发酵物质的未分级分离的或已分级分离的内容物。通常，发酵肉汤是未分级分离的，包含用过的培养基和在去除(例如通过离心)微生物细胞(例如丝状真菌细胞)后存在的细胞碎片。在一些实施方案中，发酵肉汤含有用过的细胞培养基、细胞外酶、和活的和/或非存活的微生物细胞。
“产乙醇的”指微生物从碳水化合物产生乙醇作为主要发酵产物的能力。在一些实施方案中，产乙醇微生物也可用于产生其他有机物质。
“羧甲基纤维素单位”或“CMC U”指在50℃和pH 4.8下在1分钟内释放1μmol还原糖(表示成葡萄糖当量)的内切葡聚糖酶活性的单位。
“pNP-葡糖苷单位”或“pNPG U”指在50℃和pH 4.8下从对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷释放1μmol硝基酚的β-葡糖苷酶活性的单位。
“ABX单位”或“ABX U”指，如使用二硝基水杨酸(DNS)方法(Miller，1959，Anal Chem.，31：426-428)测定的，在50mM柠檬酸钠缓冲液pH 5.3中在50℃从1％的木聚糖(来自桦树木材)溶液中释放1μmol木糖还原糖当量的木聚糖酶活性的单位。
5.2杀死细胞的方法
本发明提供了杀死培养基中的细胞的方法，由此产生细胞被灭活的全肉汤。在一些实施方案中，该方法包括使细胞接触具有1至5个碳原子的第一有机酸(以重量计约0.2％至约1％的浓度)和具有6个或更多个碳原子的第二有机酸(以重量计约0.04％至约0.3％的浓度)的组合。在一些实施方案中，该方法包括使细胞接触具有1至5个碳原子的第一有机酸(以重量计约0.2％至约0.5％的浓度)和具有6个或更多个碳原子的第二有机酸(以重量计约0.2％至约0.5％的浓度)的组合。在其他实施方案中，方法包括使细胞接触具有6个或更多个碳原子的有机酸(以重量计约0.25％至约0.5％的浓度)。可以在合适的pH和温度下将所述方法进行合适的一段时间，以达到基本上完全(即处理后至少约4、5或6log的活细胞减少)或完全(即处理后没有活细胞)的细胞灭活。通常，pH为约3.5至约4.5，约4至约4.4，或约3.9至约4.2，温度为约30℃至约40℃，并且在此pH和温度下进行方法约8至约24小时。在一个实施方案中，在pH约4和温度约40℃下进行方法约24小时。在一些实施方案中，细胞被杀死但不裂解。在一些实施方案中，一些或全部的细胞被裂解。
5.2.1微生物细胞
细胞通常是微生物细胞，例如细菌或真菌细胞，并通常产生至少一种目的分子，例如酶或有机化合物。在一些实施方案中，细胞产生至少一种重组表达的酶。在一些实施方案中，目的分子被分泌至细胞外培养基。在一些实施方案中，目的分子在细胞内产生且不被分泌至细胞外培养基中。当分子在细胞内产生且不被分泌至细胞外，可能需要裂解已杀死的细胞以将分子释放至液体培养基。
在一些实施方案中，微生物细胞是丝状真菌细胞，包括天然存在的丝状真菌，具有天然存在的或诱导的突变的丝状真菌，和已被遗传改造的丝状真菌。
在一些实施方案中，真菌细胞是曲霉属(Aspergillus)，枝顶孢属(Acremonium)，短梗霉属(Aureobasidium)，白僵菌属(Beauveria)，烟管菌属(Bjerkandera)，头孢霉属(Cephalosporium)，拟蜡菌属(Ceriporiopsis)，毛壳菌属(Chaetomium)，金孢霉属(Chrysosporium)，麦角菌属(Claviceps)，旋孢腔菌属(Cochiobolus)，鬼伞属(Coprinus)，革盖菌属(Coriolus)，棒囊壳属(Corynascus)，隐球酵母属(Cryptococcus)，黑蛋巢菌属(Cyathus)，内座壳属(Endothia)，线黑粉菌属(Filobasidium)，镰孢属(Fusarium)，粘帚霉属(Gilocladium)，腐质菌属(Humicola)，Magnaporthe，毁丝霉属(Myceliophthora)，漆斑菌属(Myrothecium)，毛菌属(Mucor)，Neocallimastix，脉孢霉属(Neurospora)，拟青霉属(Paeilomyces)，青霉属(Penicillium)，原毛平革菌属(Phanerochaete)，射脉菌属(Phlebia)，Piromyces，侧耳属(Pleurotus)，柄孢壳属(Podospora)，拟青霉属(Paecilomyces)，梨孢属(Pyricularia)，根毛霉属(Rhizomucor)，根霉属(Rhizopus)，裂褶菌属(Schizophylum)，侧孢霉属(Sporotrychum)，壳多孢属(Stagonospora)，篮状菌属(Talaromyces)，Toypoladium，木霉属(Trichoderma)，嗜热丝孢菌属(Thermomyces)，嗜热子囊菌属(Thermoascus)，梭孢壳属(Thielavia)，Tolypocladium，发癣菌属(Trichophyton)和栓菌属(Trametes)物种或衍生自上述的物种。在一些实施方案中，真菌细胞是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)或米曲霉(Aspergillusoryzae)。在一些实施方案中，真菌细胞是杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)，禾谷镰孢(Fusarium cerealis)，Fusarium crookwellense，大刀镰孢(Fusarium culmorum)，禾本科镰孢(Fusarium gramin earum)，禾赤镰孢(Fusarium graminum)，异孢镰孢(Fusarium heterosporum)，合欢木镰孢(Fusarium negundi)，尖镰孢(Fusarium oxysporum)，多枝镰孢(Fusarium reticulatum)，粉红镰孢(Fusarium roseum)，接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)，肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)，拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrich ioides)，硫色镰孢(Fusarium sulphureum)，Fusarium torulosum，Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum。在一些实施方案中，真菌细胞是苍烟管菌(Bjerkandera adusta)，干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirin a)，Ceriporiopsis caregiea，浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsis gilvescens)，Ceriporiopsis pannocinta，Cerporiopsis rivulosa，Ceriporiopsis subrufa，Ceriporiopsis subvermispora，毛革盖菌(Coriolushirsutus)，特异腐质霉(Humicola insolens)，柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)，米赫毛霉(Mucor miehei)，嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)，粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)，Scytalidium thermophilum，太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)，Trametes pleurotus，Trametes villosa，Trametes versicolor，Chaetomium paecilomyces，Endothia mucor，产紫青霉(Penicillium purpurogenum)，绳状青霉(Penicillium funiculosum)，黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，脉射菌(Phlebia radiate)或刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)。在一些实施方案中，真菌细胞是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，康氏木霉(Trichoderma koningii)，长梗木霉(Trich oderma longibrachiatum)，里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)。
5.2.2微生物细胞的培养
可通过本领域已知的任何培养方法培养微生物细胞，导致表达。通常，使用适于产生一种或多种目的分子(例如一种或多种酶和/或有机化合物)的条件，例如适于表达能够水解纤维素底物的酶的条件。微生物培养物的发酵可包括摇瓶培养，小或大规模发酵，例如在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基和允许表达纤维素酶的条件下进行的，连续、分批、补料分批或固态发酵。培养在包含碳和氮源和无机盐的合适营养培养基中使用本领域已知的程序进行。合适的培养基、温度范围和适于生长和生产目的分子例如生物分子，例如酶或其它蛋白质，或有机化合物的其他条件是本领域已知的。
发酵，例如丝状真菌细胞的发酵，经常以这样的方式进行，即，可以控制含碳底物作为限制性因素，由此对细胞提供含碳底物的良好转化和避免细胞污染实质量的未转化底物。后者对水溶性底物不是问题，因为任何剩余的痕量可容易地被洗掉。然而在非水溶性底物的情况下，这可能是个问题，并需要加入产物处理步骤，例如合适的洗涤步骤。
可如下进行发酵，即培养微生物细胞例如丝状真菌细胞至稳定期，并在限碳条件下维持细胞足以表达一种或多种目的分子的一段时间。
5.2.3微生物细胞表达的酶
在本发明的方法中使用的微生物细胞可为非重组的和/或重组的，例如非重组的和/或重组的丝状真菌。在一些实施方案中微生物细胞含有一个或多个可与微生物细胞同源或异源的基因。
在一些实施方案中，微生物细胞例如丝状真菌细胞含有一个或多个可与所述细胞同源或异源的基因，其中所述一个或多个基因编码可降解纤维素底物的酶。编码纤维素物料降解酶的基因是本领域技术人员已知的。编码降解纤维素底物的酶的基因的合适非限制性实例包括，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、葡糖水解酶、β-葡糖苷酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、果胶酸裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶乙酰酯酶、果胶甲基酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、木糖半乳糖醛酸糖苷酶(xylogalacturonosidase)、木糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、木质素过氧化物酶、锰依赖性过氧化物酶和漆酶。
在本发明的一些实施方案中，重组微生物细胞例如重组丝状真菌细胞过表达酶(一种或多种)，以改进纤维素底物的降解。可选地，微生物细胞可为非重组细胞和过表达酶以改进纤维素底物降解的重组细胞的混合物。在本发明的一些实施方案中，微生物细胞例如丝状真菌细胞过表达β-葡糖苷酶。可选地，微生物细胞可为非重组细胞和过表达β-葡糖苷酶的重组细胞的混合物。
在本文中，术语“β-葡糖苷酶”定义为：分类为EC 3.2.1.21的β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶、和/或在某些GH家族，包括但不限于GH家族1，3，7，9或48中催化纤维二糖水解并释放β-D-葡萄糖的那些酶。过表达的β-葡糖苷酶可来自与宿主细胞相同或不同的物种。值得注意地是，过表达的β-葡糖苷酶不必是在真菌细胞中表达的真菌β-葡糖苷酶。
在一些实施方案中，可通过表达编码β-葡糖苷酶的基因，产生β-葡糖苷酶。例如，β-葡糖苷酶可，例如由革兰氏阳性生物(例如芽孢杆菌(Bacillus)和放线菌(Actinomycetes))或真核宿主(例如木霉、曲霉、酵母(Saccharomyces)和毕赤酵母(Pichia))，分泌至细胞外空间。应当理解，在一些实施方案中，可在重组微生物中相对天然水平过表达β-葡糖苷酶。在一些实施方案中，如果使用宿主细胞表达β-葡糖苷酶，细胞可经遗传修饰以减少一种或多种细胞内源蛋白质的表达。在一些实施方案中，细胞可含有一个或多个已被缺失或失活的天然基因，特别是编码分泌蛋白质的基因。例如，可缺失或失活一个或多个蛋白酶编码基因(例如天冬酰胺蛋白酶编码基因；见Berka等人，Gene 199086：153-162和USP 6,509,171)或纤维素酶编码基因。在一个实施方案中，木霉属物种宿主细胞例如里氏木霉宿主细胞在cbh1、cbh2和egl1、和egl2基因中含有失活性缺失，如在PCT申请号WO05/001036中描述的。编码β-葡糖苷酶的核酸可存在于木霉属物种宿主细胞的核基因组中或可存在于在木霉宿主细胞中复制的质粒中。
可使用的β-葡糖苷酶的实例包括：来自棘孢曲霉(Kawaguchi等人，1996，Gene 173：287-288)，河内曲霉(Aspergillus kawachi)(Iwashita等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：5546-5553)，米曲霉(WO2002/095014)，双氮纤维单胞菌(Cellulomonas biazotea)(Wong等人，1998，Gene 207：79-86)，扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)(Machida等人，1988，Appl.Environ.Microbiol.54：3147-3155)，栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Wood等人，2002，Nature 415：871-880)，里氏木霉β-葡糖苷酶1(美国专利号6,022,725)，里氏木霉β-葡糖苷酶3(美国专利号6,982,159)，里氏木霉β-葡糖苷酶4(美国专利号7,045,332)，里氏木霉β-葡糖苷酶5(美国专利号7,005,289)，里氏木霉β-葡糖苷酶6(USPN20060258554)，和里氏木霉β-葡糖苷酶7(USPN 20040102619)的β-葡糖苷酶。
在一些实施方案中，由微生物细胞分泌至细胞外的目的酶可溶于细胞外培养基和/或细胞灭活的发酵肉汤中。在一些实施方案中，由微生物细胞分泌至细胞外的目的酶不可溶于细胞外培养基和/或细胞灭活的发酵肉汤中。在一些实施方案中，细胞外培养基和/或细胞灭活的肉汤含有可溶和不可溶的目的酶的混合物。
5.2.4有机酸
本发明的方法包括在如本文描述的条件下，以本文所述的量，例如以实现活细胞数量的至少4log，5log，6log，7log或8log减少的量，使有机酸或其盐接触培养基中的细胞，以失活细胞。
在一些实施方案中，方法包括使细胞接触以重量计约0.1％至约15％，0.2％至约1％，或约0.2％至约0.5％浓度的含有1至5个碳原子的第一有机酸(或其盐)和以重量计约0.025％至5％，以重量计0.04％至约0.3％，或以重量计约0.2％至约0.5％的含有6个或更多个碳原子的第二有机酸(或其盐)。在多个实施方案中，组合使用以重量计约0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.5，0.55，0.6，0.65，0.7，0.75，0.8，0.85，0.9，0.95或1％中任一浓度的第一有机酸和以重量计约0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.15，0.2，0.25或0.3，0.35，0.4，0.45或0.5％中任一浓度的第二有机酸。在一个实施方案中，第一有机酸是以重量计约0.2％至约0.5％，或以重量计约0.28％浓度的醋酸，第二有机酸是以重量计约0.04％至约0.06％，或约0.044％浓度的苯甲酸。在一个实施方案中，第一有机酸是以重量计约0.2％至约0.5％，或以重量计约0.28％浓度的醋酸，第二有机酸是以重量计约0.2％至约0.5％，或约0.22％浓度的苯甲酸。
在一些实施方案中，方法包括使细胞接触以重量计约0.25％至约0.5％浓度的含有6个或更多个碳原子的有机酸(或其盐)。在多个实施方案中，使用以重量计约0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，或0.5％中任一浓度的含有6个或更多个碳原子的有机酸。在一个实施方案中，含有6个或更多个碳原子的有机酸是以重量计约0.5％浓度的苯甲酸。
在一些实施方案中，含有1至5个碳原子的有机酸是醋酸、甲酸、丙酸(或其盐)，或其组合。在一个实施方案中，含有1至5个碳原子的有机酸是醋酸。
在一些实施方案中，含有6个或更多个碳原子的有机酸是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、己二酸、3-甲基戊二酸、苯乙酸(或其盐)，或其组合。在一个实施方案中，含有6个或更多个碳原子的有机酸是苯甲酸(或其盐，例如苯甲酸钠)。在一些实施方案中，含有6个或更多个碳原子的有机酸含有6至8(即6、7或8)个碳原子。在一些实施方案中，含有6个或更多个碳原子的有机酸含有1或2个羧酸官能团。在一些实施方案中，含有6个或更多个碳原子的有机酸是芳香族有机酸。在一些实施方案中，含有6个或更多个碳原子的有机酸含有7或8个碳和1个苯基基团。
5.3组合物
本发明提供了由如本文描述的用于杀死细胞的方法产生的组合物。在一些实施方案中，组合物是含有如本文描述的有机酸、已杀死的细胞和/或细胞碎片、和培养基的细胞灭活的全肉汤。在一些实施方案中，组合物含有如本文描述的有机酸，和任选地还含有已杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施方案中，从如本文描述的细胞灭活的全肉汤中移出已杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些成分的组合物。本发明的细胞灭活的全肉汤或组合物通常含有由用于产生该细胞灭活的全肉汤或组合物的微生物细胞产生的至少一种目的分子(例如生物分子，例如蛋白质，例如酶和/或有机物质)。
任选地可向细胞灭活的全肉汤或组合物中加入额外的防腐剂和/或抗微生物剂(例如制菌剂)，包括但不限于山梨糖醇、氯化钠、山梨酸钾和本领域已知的其他防腐剂和/或抗微生物剂。
在一些实施方案中，可对细胞灭活的全肉汤或组合物补充一种或多种微生物细胞不内源表达的或以相对低的水平表达的酶活性。例如，可加入一种或多种酶以改进纤维素底物的降解，例如降解为可发酵的糖例如葡萄糖或半纤维素糖(例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖)。补充的酶可作为补充剂加入细胞灭活的全肉汤或组合物中，且该酶可为分开的发酵肉汤的成分，或可为纯化的或被最低程度地回收和/或纯化的。补充的酶的合适的非限制性实例包括纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、内切--β-1，3(4)-葡聚糖酶、葡糖水解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶乙酰酯酶、果胶甲基酯酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、阿魏酸(ferrulic acid)酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、木糖半乳糖醛酸糖苷酶、木糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、木质素过氧化物酶、锰依赖性过氧化物酶、具有木质素过氧化物酶和锰依赖性过氧化物酶的组合性能的杂合过氧化物酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、蛋白酶和漆酶。
在一些实施方案中，细胞灭活的全肉汤或组合物包括纤维素分解酶，包括但不限于：(i)内切葡聚糖酶(EG)或1，4--d-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.4)，(ii)外切葡聚糖酶，包括1，4--d-葡聚糖葡聚糖水解酶(又称纤维糊精酶)(EC 3.2.1.74)和1，4--d-葡聚糖纤维二糖水解酶(外切纤维二糖水解酶，CBH)(EC 3.2.1.91)，和(iii)β-葡糖苷酶(BG)或β-葡萄糖苷葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)。
在一些实施方案中，细胞灭活的全肉汤或组合物含有一种或多种选自外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和β-葡糖苷酶的酶。在一个实施方案中，细胞灭活的全肉汤或组合物含有约1000至约2000，约1500至约2500，约2200至约2800，或约2500CMC U/g内切葡聚糖酶活性和约450至约775，约525至约775，约400至约800，或约650pNPG U/gβ-葡糖苷酶活性。可使用本领域已知的方法测定羧甲基纤维素(CMC)活性和对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)活性(见例如Ghose，T.K.，“Measurement ofCellulase Activities，”Pure & Appl. Chem.59，pp.257-268，1987；Chen，H.，Hayn，M.，Esterbauer，H.“Purification and characterization of twoextracellular b-glucosidases from Trichoderma reesei，”Biochimica etBiophysica Acta，1992，1121，54-60)。
在一些实施方案中，细胞灭活的全肉汤或组合物含有以重量计约0.2％至约1％，约0.2％至约0.5％，或约0.28％浓度的醋酸和以重量计约0.2％至约0.5％，或约0.22％浓度的苯甲酸，pH为约3.9至约4.3，约3.5至约4.5，约4至约5，约4.5至约5.5，约4.8至约5.2，或约4。
在一些实施方案中，细胞灭活的全肉汤或组合物含有在发酵结束时得到的发酵物质的未分级分离的内容物。通常，细胞灭活的全肉汤或组合物含有在将微生物细胞(例如丝状真菌细胞)培养至饱和并在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如纤维素酶和/或葡糖苷酶表达)后存在的用过的培养基和细胞碎片。在一些实施方案中，细胞灭活的全肉汤或组合物含有用过的细胞培养基、细胞外酶和已杀死的丝状真菌细胞。在一些实施方案中，可使用本领域已知的方法，透化和/或裂解在细胞灭活的全肉汤或组合物中存在的微生物细胞。
本发明也提供了反应组合物，其含有纤维素物料、如本文描述的细胞灭活的全肉汤或组合物、和在培养基中的发酵微生物的混合物。在一些实施方案中，反应组合物基本上不含补充的氮源。在一些实施方案中，发酵微生物是产乙醇微生物。在一些实施方案中，该反应组合物与含有以重量计约1.4％醋酸和约0.22％苯甲酸的反应组合物相比，其中产生的有机物质增加至少约50％。在一个实施方案中，发酵微生物是产乙醇微生物，有机物质是乙醇，并且该反应组合物与含有以重量计约1.4％醋酸和约0.22％苯甲酸的反应组合物相比，乙醇的产生增加至少约10倍。
如本文描述的细胞灭活的全肉汤或组合物通常是液体，但可含有不溶性成分，例如已杀死的细胞、细胞碎片、培养基成分和/或不溶性酶。在一些实施方案中，可去除不溶性成分以提供澄清的液体组合物。
5.4水解纤维素物料的方法
本发明提供了水解纤维素物料的方法。方法包括使纤维素物料接触从如本文描述的杀死细胞的方法得到的细胞灭活的全肉汤或组合物，其中所述细胞灭活的全肉汤或组合物为足以使纤维素物料被细胞灭活的全肉汤或组合物中的一种或多种酶酶促水解的量。
纤维素底物的合适的非限制性实例包括但不限于，生物质、草本物质、农业废料、林业废料、城镇固体废物、废纸、和纸浆和纸渣。在本发明中使用的纤维素底物的通常形式包括但不限于，树、灌木和草、小麦、麦秸、甘蔗渣、玉米、玉米壳、玉米核(包括来自玉米核的纤维)、来自谷物例如玉米研磨(包括湿磨和干磨)的产品和副产品、以及城镇固体废物、废纸、和庭院废物。可从“原始生物质”(例如树、灌木、草、水果、花、草本作物、硬木和软木)，“非原始生物质”(例如农业副产品、商业有机废物、建筑和拆除垃圾、城镇固体废物和庭院废物)或“混合生物质”(其是原始和非原始生物质的混合物)得到纤维素底物。
在一些实施方案中，纤维素底物包括木材、木浆、造纸泥、纸浆废液、刨花板、玉米秆、玉米纤维、稻、纸和纸浆加工废物、木本或草本植物、果浆、蔬菜浆、浮石(pumice)、酒糟、草、稻壳、甘蔗渣、棉花、黄麻、大麻、亚麻、竹子、剑麻、马尼拉麻(abaca)、稻草、玉米棒、酒糟、叶、麦杆、椰子毛、藻类、柳枝稷和其混合物。
纤维素底物可就此使用或可以使用本领域已知的常规方法进行预处理。这些预处理包括化学、物理和生物预处理。例如，物理预处理技术可包括但不限于各种类型的研磨、粉碎、汽蒸/蒸气爆破、辐射和水热解(hydrothermolysis)。化学预处理技术可包括但不限于，稀酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳和pH-控制的水热解。生物预处理技术可包括但不限于，使用溶木质素微生物。
5.5在微生物中生产有机物质的方法
本发明提供了在微生物，例如发酵微生物中生产有机物质的方法。方法包括用细胞灭活的全肉汤或组合物(如上所述)生产水解的纤维素物料，和在水解的纤维素物料存在下在适于发酵微生物产生一种或多种目的有机物质的条件下培养发酵微生物。在一些实施方案中，发酵微生物是产乙醇微生物，该方法用于产生乙醇。在一些实施方案中，使用预处理的纤维素物料。
纤维素物料的水解和用于产生有机物质的发酵微生物的发酵可同时或相继进行。
在一些实施方案中，与用含有以重量计约1.4％的醋酸和约0.22％的苯甲酸的组合物水解纤维素物料并在其上培养发酵微生物的方法相比，使用本文描述的细胞灭活的全肉汤或组合物可以导致有机物质的产量增加至少约50％。在一些实施方案中，与用含有以重量计约1.4％的醋酸和约0.22％的苯甲酸的组合物水解纤维素物料和在其上培养发酵微生物的方法相比，有机物质(例如乙醇或其它有机分子)的产量增加至少约0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10倍。
合适的发酵微生物能够将糖例如葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖或寡糖发酵或转化成期望的发酵产物(一种或多种)。发酵微生物的合适的非限制性实例包括真菌生物，例如酵母和细菌。
在一些实施方案中，发酵微生物是产乙醇微生物，例如天然存在的产乙醇生物，具有天然存在的或诱导的突变的产乙醇生物、或已被遗传修饰的产乙醇生物。
在一些实施方案中，产乙醇微生物是可将葡萄糖有效发酵成乙醇的酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁酵母(S.uvarum)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fagilis)、拟热带假丝酵母(candida pseudotropicalis)和管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。合适的菌株包括但不限于酿酒酵母D5A(ATCC200062)，酿酒酵母Y567(ATCC24858)，ACA 174(ATCC 60868)，MY91(ATCC 201301)，MY138(ATCC 201302)，C5(ATCC 201298)，ET7(ATCC 201299)，LA6(ATCC201300)，OSB21(ATCC 201303)，F23(球形酵母(S.globosus)ATCC90920)，ACA 174(ATCC 60868)，A54(ATCC 90921)，NRCC 202036(ATCC 46534)，ATCC 24858，ATCC 24858，G 3706(ATCC 42594)，NRRL，Y-265(ATCC 60593)，Sa28(ATCC 26603)和ATCC 24845-ATCC 24860。在本发明中适用的其他非酿酒酵母的酵母菌株包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(tozony ID 4922)，S.pastorianus SA 23(卡尔酵母(S.carlsbergensis)ATCC 26602)，S. pastorianus(卡尔酵母ATCC 2345)，Candida acidothermophilum(东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)，ATCC 20381)。在一些实施方案中，产乙醇微生物是重组酵母菌株。合适的重组酵母可含有编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和/或木酮糖激酶的基因(见例如USPN 5,789,210)。
在一些实施方案中，产乙醇微生物是细菌细胞，例如革兰氏阴性、兼性厌氧细菌细胞，例如来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌细胞。在一些实施方案中，产乙醇微生物来自埃希氏菌属(Escherichia)或克雷伯氏菌属(Klebsiella)，例如大肠杆菌B，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌KO4(ATCC 55123)，大肠杆菌KO11(ATCC 55124)，大肠杆菌KO12(ATCC55125)，大肠杆菌LY01，产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)M5A1，或产酸克雷伯氏菌P2(ATCC 55307)。在一些实施方案中，产乙醇微生物是发酵单胞菌属(Zymomonas)物种，或来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(ATCC31821)。在一些实施方案中，重组发酵单胞菌菌株可含有例如编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的基因。
尽管将纤维素物料水解成葡萄糖和其他小糖是重要的步骤，但同时糖化和发酵(SSF)依赖于产乙醇微生物的活培养物将这些糖转化为乙醇。
通常将发酵微生物加至水解产物，允许发酵进行12-96小时，例如30-80小时。温度通常是26-40℃，例如约32℃，pH通常是3-6。
发酵后，可以通过本领域已知的任何方法，回收目的有机物质。这些方法包括但不限于蒸馏、提取、层析、电泳程序和差异溶解度。例如，在乙醇发酵中，可通过常规蒸馏方法分离和纯化乙醇。根据本发明的方法得到的乙醇可用作燃料乙醇、饮用乙醇或作为工业乙醇。
虽然不受理论的约束，但相信，未澄清的、细胞灭活的全肉汤可以为产乙醇微生物提供剩余的营养物。这可导致更快的乙醇发酵和改进乙醇产率。除了糖化的纤维素以外可以不需要向产乙醇微生物提供营养培养基或可以减少补充营养物的量的能力，导致用于乙醇发酵工艺的原材料成本的降低。
在一些实施方案中，在发酵微生物中生产有机物质的方法中使用如本文描述的细胞灭活的全肉汤或组合物，可减少用于发酵微生物的补充氮源的量和/或类型。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可降低用于发酵微生物生长所需的酵母提取物、蛋白胨和/或尿素的量。
在一些实施方案中，如本文描述的用于在发酵微生物中生产有机物质的方法缺乏或基本上不含用于发酵微生物的补充氮源和/或营养源。在一些实施方案中，方法和组合物缺乏或基本上不含酵母提取物、蛋白胨和/或尿素。本领域技术人员理解，本发明的方法和组合物可以无或基本上不含补充氮源，但是痕量的氮源和/或营养源可作为杂质存在或以不实质性增加全发酵肉汤的营养值的量加入发酵微生物。
在一个实施方案中，本发明提供了通过同时糖化和发酵产生有机物质的方法。方法包括在缺乏补充氮源的情况下组合纤维素物料(例如预处理的纤维素物料)、如本文描述的含有一种或多种能够水解所述纤维素物料的酶(例如外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和/或β-葡糖苷酶)的细胞灭活的全肉汤或组合物、和发酵微生物。在有助于纤维素水解成葡萄糖和/或半纤维素糖(例如木糖、阿拉伯糖和/或甘露糖)和有助于葡萄糖和/或半纤维素糖转化为有机物质的条件下孵育纤维素物料、细胞灭活的全肉汤或组合物、和发酵微生物。在一些实施方案中，和使用含有以重量计约1.4％醋酸和约0.22％苯甲酸的细胞灭活的全肉汤或组合物的方法相比，有机物质的产量增加至少约50％。在一个实施方案中，发酵微生物是产乙醇微生物，有机物质是乙醇，并且和使用含有以重量计约1.4％醋酸和约0.22％苯甲酸的细胞灭活的全肉汤或组合物的方法相比，乙醇的产量增加至少约10倍。在一个实施方案中，使用含有约1000至约2000，约1500至约2500，约2200至约2800，或约2500CMC U/g内切葡聚糖酶活性和约450至约775，约525至约775，约400至约800，或约650pNPG U/g β-葡糖苷酶活性、以重量计约0.2％至约1％，约0.2％至约0.5％，或约0.28％的醋酸、以重量计约0.2％至约0.5％，或约0.22％的苯甲酸(或约0.26％苯甲酸钠)、pH为约3.9至约4.3，约3.5至约4.5，约4至约5，约4.5至约5.5，约4.8至约4.2，或约4的细胞灭活的全肉汤。
5.6试剂盒
本发明也提供试剂盒。本发明的试剂盒包含含有如本文描述的有机酸组合的细胞灭活的全肉汤或组合物。提供了合适的包装。如本文使用的，“包装”是指，通常系统使用的并能够将如本文描述的试剂盒组分容纳在固定边界内的固体基质、材料或容器。
试剂盒也可含有使用细胞灭活的全肉汤或组合物的说明书。例如，可提供在水解纤维素底物的方法中使用细胞灭活的全肉汤或组合物的说明书、或在如本文描述的在发酵微生物中生产有机物质的方法中使用的说明书。可以以印刷的形式或以电子介质的形式例如软盘、CD或DVD，或以可得到该说明书的网站地址的形式，提供说明书。
5.7具体实施方案
在一个方面，本发明提供了杀死发酵培养物中的细胞的方法。方法包括使在培养基中含有细胞的发酵培养物接触含有1至5个碳原子的第一有机酸或其盐和含有6个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐。在一个实施方案中，第一有机酸的浓度是以重量计约0.2％至约1％，第二有机酸的浓度是以重量计约0.04％至约0.3％。在一个实施方案中，第一有机酸的浓度是以重量计约0.2％至约0.5％，第二有机酸的浓度是以重量计约0.2％至约0.5％。以足以实现基本上完全的细胞杀死的温度和pH和时间，进行该方法，由此产生细胞灭活的全肉汤。在一些实施方案中，时间是约8至约24小时，温度是约30℃至约40℃，pH是约3.5至约4.5，约3.9至约4.2，或约4至约4.4。在一个实施方案中，时间是约24小时，温度是约40℃，pH是约4。基本上完全的细胞杀死通常涉及至少约4log，5log，6log，7log，或8log的活细胞减少。
在杀死细胞的方法的一些实施方案中，细胞是微生物细胞(即真菌或细菌)。在一些实施方案中，细胞是真菌细胞，例如丝状真菌细胞。在一些实施方案中，细胞是丝状真菌细胞，可以选自木霉属、曲霉属、青霉属、腐质霉属、金孢霉属和脉孢霉属。
在杀死细胞的方法的一些实施方案中，第一有机酸选自醋酸、甲酸或丙酸。在一个实施方案中，第一有机酸是醋酸。在一些实施方案中，第二有机酸选自苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸和苯乙酸。在一个实施方案中，第二有机酸是苯甲酸。在一些实施方案中，使用有机酸的盐，例如苯甲酸钠。在一个实施方案中，第一有机酸是以重量计约0.28％浓度的醋酸，第二有机酸是以重量计约0.044％浓度的苯甲酸(或以重量计约0.052％浓度的苯甲酸钠)。在一个实施方案中，第一有机酸是以重量计约0.28％浓度的醋酸，第二有机酸是以重量计约0.22％浓度的苯甲酸(或以重量计约0.26％浓度的苯甲酸钠)。
在杀死细胞的方法的一些实施方案中，细胞分泌至少一种目的酶至细胞外的培养基中。在一些实施方案中，目的酶是重组表达的。在一些实施方案中，细胞分泌至少一种选自外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和β-葡糖苷酶的目的酶。
在另一个方面，本发明提供了通过本文描述的任何杀死细胞的方法产生的细胞灭活的全肉汤。在一个实施方案中，细胞灭活的全肉汤含有一种或多种在杀死细胞前由细胞分泌至细胞外培养基中的酶。在一些实施方案中，细胞灭活的全肉汤含有在细胞外培养基中的至少一种选自外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和β-葡糖苷酶的酶。在一些实施方案中，细胞灭活的全肉汤含有约1000至约2000，约1500至约2500，约2200至约2800，或约2500CMC U/g内切葡聚糖酶活性和约450至约775，约525至约775，约400至约800，或约650pNPG U/g β-葡糖苷酶活性。在一个实施方案中，组合物含有约2200至约2800CMC U/g内切葡聚糖酶活性和约450至约775pNPG U/g β-葡糖苷酶活性、和约3.9至约4.3的pH。
在一些实施方案中，与使用含有以重量计约1.4％醋酸和约0.22％苯甲酸的细胞灭活的全肉汤的方法相比，由发酵微生物产生的有机物质增加至少约50％。在一个实施方案中，发酵微生物是产乙醇微生物。在一个实施方案中，与使用含有以重量计约1.4％醋酸和约0.22％苯甲酸的细胞灭活的全肉汤的方法相比，由发酵产乙醇生物产生的乙醇增加至少约10倍。
在另一个方面，本发明提供了包含含有1至5个碳原子的第一有机酸或其盐和含有6个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、和目的酶的组合物。在一些实施方案中，组合物也含有已杀死的细胞和培养基，其中细胞在接触第一和第二有机酸之前在该培养基中生长并产生目的酶。在一个实施方案中，第一有机酸以约0.2％至约1％重量的浓度存在于组合物中，第二有机酸以约0.04％至约0.3％重量的浓度存在。在一个实施方案中，第一有机酸以约0.2％至约0.5％重量的浓度存在于组合物中，第二有机酸以约0.2％至约0.5％重量的浓度存在。在一些实施方案中，第一有机酸选自醋酸、甲酸或丙酸。在一个实施方案中，第一有机酸是醋酸。在一些实施方案中，第二有机酸选自苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸和苯乙酸。在一个实施方案中，第二有机酸是苯甲酸。在一些实施方案中，使用有机酸的盐，例如苯甲酸钠。在一个实施方案中，第一有机酸是以重量计约0.28％浓度的醋酸，第二有机酸是以重量计约0.044％浓度的苯甲酸(或以重量计约0.052％浓度的苯甲酸钠)。在一个实施方案中，第一有机酸是以重量计约0.28％浓度的醋酸，第二有机酸是以重量计约0.22％浓度的苯甲酸(或以重量计约0.26％浓度的苯甲酸钠)。在一些实施方案中，组合物含有一种或多种选自外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和β-葡糖苷酶的酶。在一个实施方案中，组合物含有约1000至约2000，约1500至约2500，约2200至约2800，或约2500CMC U/g内切葡聚糖酶活性和约450至约775，约525至约775，约400至约800，或约650pNPG U/g β-葡糖苷酶活性。在一些实施方案中，pH是约3.9至约4.3，约3.5至约4.5，约4至约5，约4.5至约5.5，约4.8至约5.2，或约4。在一个实施方案中，组合物含有约2200至约2800CMC U/g内切葡聚糖酶活性和约450至约775pNPG U/g β-葡糖苷酶活性。以及约3.9至约4.3的pH。
在另一个方面，本发明提供了水解纤维素物料的方法，包括使纤维素物料接触通过如本文描述的杀死细胞的方法产生的细胞灭活的全肉汤、或接触包含含有1至5个碳原子的第一有机酸或其盐、含有6个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、和至少一种目的酶的如本文描述的组合物，其中细胞灭活的全肉汤或组合物为有效地引起纤维素物料被细胞灭活的全肉汤或组合物中的一种或多种酶酶促水解的量。在一些实施方案中，使用的组合物还包括培养基和已杀死的细胞，其中细胞在接触第一和第二有机酸之前在该培养基中生长并产生目的酶。在一些实施方案中，纤维素物料是植物生物质物质。在一个实施方案中，纤维素物料是木质素纤维素物质。在一些实施方案中，预处理纤维素物料以增强酶促水解。本发明也提供：用通过如本文描述的杀死细胞的方法产生的细胞灭活的全肉汤、或用如本文描述的包含含有1至5个碳原子的第一有机酸或其盐、含有6个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、至少一种目的酶和任选地发酵培养基及已杀死的细胞的组合物进行水解而产生的、水解的纤维素物料。
在另一个方面，本发明提供了产生有机物质的方法。方法包括将生产有机物质的微生物在培养基中在水解的纤维素物料存在的情况下在适于该微生物产生所述有机物质的条件下进行发酵，其中所述水解的纤维素物料通过用由如本文描述的杀死细胞的方法产生的细胞灭活的全肉汤、或用如本文描述的包含含有1至5个碳原子的第一有机酸或其盐、含有6个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、至少一种目的酶和任选地发酵培养基及已杀死的细胞的组合物进行水解而产生。在一个实施方案中，微生物是产乙醇微生物，有机物质是乙醇。在一个实施方案中，和用下述细胞灭活的全肉汤或组合物水解纤维素物料的方法相比，在培养基中的有机物质的浓度增加至少约50％，其中所述细胞灭活的全肉汤或组合物，除了含有以重量计约1.4％的醋酸和约0.22％的苯甲酸外，与在本方法中使用的细胞灭活的全肉汤或组合物相比含有类似、基本上相同或完全相同的成分。在一个实施方案中，和使用含有以重量计约1.4％的醋酸和约0.22％的苯甲酸的细胞灭活的全肉汤或组合物的方法相比，由发酵产乙醇生物产生的乙醇增加至少约10倍。
在一些实施方案中，纤维素物料的酶促水解和微生物的发酵同时进行。在其他实施方案中，纤维素物料的酶促水解在微生物发酵之前发生。
在另一个方面，本发明提供了通过同时糖化发酵产生有机物质的方法。方法包括(a)在缺乏补充氮源的情况下组合纤维素底物、通过如本文描述的杀死细胞的方法产生的细胞灭活的全肉汤或如本文描述的包含含有1至5个碳原子的第一有机酸或其盐、含有6个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、至少一种目的酶和任选地发酵培养基及已杀死的细胞的组合物、和发酵微生物；在有助于纤维素水解成葡萄糖和/或半纤维素糖(例如木糖、阿拉伯糖和/或甘露糖)和有助于葡萄糖和/或半纤维素转化成有机物质的条件下在培养基中孵育纤维素底物、细胞灭活的全发酵肉汤或组合物、和发酵微生物，其中和用下述细胞灭活的全肉汤或组合物水解纤维素物料的方法相比，在培养基中的有机物质的浓度增加至少约50％，所述细胞灭活的全肉汤或组合物，与在本方法中使用的细胞灭活的全肉汤或组合物相比，除了含有以重量计约1.4％的醋酸和约0.22％的苯甲酸外，含有类似、基本上相同或完全相同的成分。在一个实施方案中，发酵微生物是产乙醇微生物，有机物质是乙醇。在一个实施方案中，和使用含有以重量计约1.4％的醋酸和约0.22％的苯甲酸的细胞灭活的全肉汤或组合物的方法相比，由发酵产乙醇生物产生的乙醇增加至少约10倍。
在另一个方面，本发明提供了用于产生有机物质的反应组合物。反应组合物含有纤维素底物、通过如本文描述的杀死细胞的方法产生的细胞灭活的全肉汤或如本文描述的包含含有1至5个碳原子的第一有机酸或其盐、含有6个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、至少一种目的酶和任选地发酵培养基和已杀死的细胞的组合物、和在培养基中的发酵微生物的混合物。反应组合物基本上不含补充氮源，并且和用下述细胞灭活的全肉汤或组合物水解纤维素物料的方法相比，在培养基中的有机物质的浓度增加至少约50％，其中，所述细胞灭活的全肉汤或组合物，除了含有以重量计约1.4％的醋酸和约0.22％的苯甲酸外，与在本方法中使用的细胞灭活的全肉汤或组合物相比含有类似、基本上相同或完全相同的成分。在一个实施方案中，发酵微生物是产乙醇微生物，有机物质是乙醇。在一个实施方案中，和含有以重量计约1.4％的醋酸和约0.22％的苯甲酸的细胞灭活的全肉汤或组合物的反应组合物相比，由发酵产乙醇生物产生的乙醇增加至少约10倍。
在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含在包装中的通过如本文描述的杀死细胞的方法产生的细胞灭活的全肉汤或如本文描述的包含含有1至5个碳原子的第一有机酸或其盐、含有6个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、至少一种目的酶和任选地发酵培养基和已杀死的细胞的组合物。在一些实施方案中，试剂盒还包含在用发酵微生物制备有机物质的方法中使用的说明书，例如在用产乙醇微生物和以试剂盒中的细胞灭活的全肉汤或组合物水解的纤维素底物制备乙醇的方法中使用的说明书。
以下实施例旨在举例说明本发明，而非限制本发明。
6.实施例
实施例1
杀死细胞的条件
真菌细胞计数的确定
用无菌水连续稀释等分试样的里氏木霉150小时发酵物至103的稀释系数。然后将100μl稀释物样品在购自DifcoTM(REF#213200)的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上涂板并在25℃孵育。然后在孵育3天后计数孵育的PDA板上的菌落形成单位(CFU)。通过琼脂上存在的分开的生长的单细胞群来表征CFU，在琼脂上存在的CFU的数乘以涂板的稀释度就是在原始样品中存在的CFU数。
将黑曲霉和绳状青霉的分开的孢子悬浮物在购自DifcoTM(REF#213200)的PDA上涂板并在25℃孵育3天。然后在无菌情况下将含有黑曲霉和绳状青霉菌落的PDA的部分分别地移出，并分别置于含有由5g/L酵母提取物和20g/L葡萄糖组成的酵母提取物葡萄糖(YEG)培养基的分开摇瓶中。然后在设定为200rpm和33℃的旋转摇床上孵育摇瓶3天。移出生长培养物样品并用无菌水连续稀释至104的稀释系数。然后将100μl稀释物样品在PDA上涂板并在25℃孵育。然后计数孵育的PDA板上的CFU。在不同温度下用醋酸和苯甲酸钠杀死里氏木霉细胞
将里氏木霉发酵肉汤分成5份等分试样并如下表1所述配制。然后使用10％(w/w)硫酸将配制的肉汤调整为pH 4.0。然后将每份制剂再分成3份等分试样，一份等分试样在10℃孵育，另一份等分试样在25℃孵育，第三份等分试样在40℃孵育。孵育24小时后使用10％(w/w)氢氧化钠将所有等分试样调整为pH4.8。然后用无菌水将每份等分试样连续稀释，在PDA上涂板并在25℃孵育。然后计数孵育的PDA板上的CFU。
表1
里氏木霉发酵肉汤的配制描述
 等分试样#   制剂
 1   11.2g/L醋酸，2.06g/L苯甲酸钠
 2   8.4g/L醋酸，1.55g/L苯甲酸钠
 3   5.6g/L醋酸，1.03g/L苯甲酸钠
 4   2.8g/L醋酸，0.52g/L苯甲酸钠
 5   20g/L醋酸
所有制剂在40℃的温度下达到完全的细胞杀死。可在较低的温度下实现里氏木霉细胞杀死但需要较高浓度的有机酸。图1中的图说明了温度和制剂化学浓度对里氏木霉细胞杀死的影响。
苯甲酸钠的影响
向分开的里氏木霉等分试样加入苯甲酸钠至2.5g/L苯甲酸钠或5g/L苯甲酸钠的终浓度。然后将等分试样调整为pH4并在40℃孵育24小时。孵育24小时后使用10％(w/w)氢氧化钠将所有等分试样调整为pH4.8。然后用无菌水将每份等分试样连续稀释，在PDA上涂板并在25℃孵育。然后计数孵育的PDA板的CFU。结果在图2中显示。
配制为2.5g/L苯甲酸钠，pH4的里氏木霉在40℃孵育24小时后发生了5log的活细胞减少，而具有5g/L苯甲酸钠，pH4的里氏木霉制剂在40℃孵育24小时后经历了7log的活细胞减少且存在低于10的CFU。
对黑曲霉和绳状青霉培养物应用细胞杀死条件
对里氏木霉、黑曲霉和绳状青霉生长培养物的分开等分试样加入醋酸和苯甲酸钠分别至2.8g/L和2.6g/L的终浓度。然后将等分试样调整为pH4并在40℃孵育24小时。孵育24小时后使用10％(w/w)氢氧化钠将所有等分试样调整为pH4.8。然后用无菌水将每份等分试样连续稀释，在PDA上涂板并在25℃孵育。然后计数孵育的PDA板的CFU。结果在图3中显示。
在暴露于细胞杀死条件24小时后，自里氏木霉、黑曲霉和绳状青霉，无活细胞存在。
使用具有6个或更多个碳的有机酸杀死细胞
将分开的未经配制的里氏木霉发酵肉汤等分试样再分成10份等分试样并如下表2所述用具有6个或更多个碳的有机酸配制。有机酸的化学结构和pKa在图4中显示。
表2
使用具有6个或更多个碳原子的有机酸配制里氏木霉发酵肉汤
  里氏木霉等分试样#   制剂组合物
  1   5g/L环己烷羧酸
  2   15g/L环己烷羧酸
  3   5g/L L-抗坏血酸
  4   15g/L L-抗坏血酸
  5   5g/L己二酸(pH 5)
  6   15g/L己二酸(pH 5)
  7   5g/L 4-甲基戊酸
  8   15g/L 4-甲基戊酸
  9   5g/L 3-甲基戊二酸
  10   15g/L 3-甲基戊二酸
  11   5g/L苯乙酸
然后用10％(w/w)硫酸将配制的培养物调整为pH4.0。然后在40℃孵育配制的培养物。孵育2和4小时后，测量配制的培养物的pH并用10％(w/w)硫酸调整为4.0并返回40℃孵育。孵育24小时后移出配制的培养物，然后将100μl配制的培养物以100，101，102和103的稀释度在PDA上涂板并在25℃孵育。然后计数孵育的PDA板的CFU。结果在图5中显示。
实施例2
细胞灭活的全肉汤对在微生物中生产有机物质的影响
从分泌外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和β-葡糖苷酶至细胞外培养基的里氏木霉细胞的发酵培养物，制备细胞灭活的全肉汤。如实施例1中描述的，发酵培养物用以重量计0.28％的醋酸和0.052％的苯甲酸钠在pH4和40℃处理24小时(“肉汤A”)，或用以重量计1.4％醋酸、0.26％苯甲酸钠和0.5％山梨酸钾在pH4和10℃处理24小时(“肉汤B”)。调查了这两种肉汤对微生物发酵生产有机物质的影响。使用肉汤水解纤维素底物以产生用作微生物生长碳源的葡聚糖水解物。评估了在该葡聚糖水解物上生长的微生物的有机物质生产。
产生水解物
从国家再生能源实验室(NREL)得到预处理的甘蔗渣。NREL用稀硫酸和增加的温度预处理了甘蔗渣(Schell等人(2004)BioresourceTechnology 91，179-188)。然后用去离子水洗涤经酸预处理的甘蔗渣，直到pH大于4.2，然后通过真空过滤去除残余的水。然后在121℃高压灭菌洗过的酸预处理的甘蔗渣(wAPB)20分钟，以从wAPB底物中去除任何微生物污染物。然后按照每克底物葡聚糖使用80mg蛋白质剂量的肉汤A或肉汤B，从高压灭菌的wAPB产生13％(w/w)葡聚糖水解物。在下述糖化条件下产生每种水解物，所述糖化条件为：在设定为200rpm的旋转摇床中在50℃孵育5天。然后遵照在下面HPLC测定章节中概述的程序，分析每种水解物中的葡萄糖浓度。在糖化wAPB后，将每种水解物分至3个烧瓶，并用无菌过滤的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.8)稀释以产生1％(w/w)葡聚糖、7％(w/w)葡聚糖、和13％(w/w)葡聚糖水解物混合物。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)培养物的制备
从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到冻干的鼠李糖乳杆菌(ATCC7469)，并用无菌水再水化。然后将再水化的鼠李糖乳杆菌在购自DifcoTM的乳杆菌MRS琼脂(REF#288210)上涂板并在37℃孵育2天以得到鼠李糖乳杆菌菌落。然后将鼠李糖乳杆菌菌落无菌地加入含有购自DifcoTM的乳杆菌MRS液体培养基(REF#288130)的摇瓶中。然后在设定为33℃和150rpm的旋转摇床中孵育鼠李糖乳杆菌摇瓶1天以得到生长培养物。鼠李糖乳杆菌水解物发酵
以3％(v/w)浓度接种鼠李糖乳杆菌生长培养物至分开的具有用肉汤A和B产生的wAPB(7％(w/w)葡聚糖)的水解物烧瓶中。在设定为37℃和150rpm的旋转摇床中在厌氧条件下发酵接种了鼠李糖乳杆菌的烧瓶5天。在孵育1、2、3和5天后对发酵混合物取样，并遵照在下面HPLC测定章节中概述的程序，分析乳酸和葡萄糖浓度。结果在图6中显示。
Thermosacc酵母同时糖化发酵(SSF)
以每克底物葡聚糖80mg蛋白质的浓度，将洗过的酸预处理甘蔗渣、50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.8)和肉汤A或B加入分开的烧瓶中。然后在每个烧瓶中接种1％(v/w)再水化的Thermosacc酵母，然后接种1％(v/w)酵母营养物(由10％(w/w)酵母提取物，10％(w/w)蛋白胨和1％(w/w)葡萄糖组成)。然后在设定为38℃和150rpm的旋转摇床中孵育每个烧瓶。在孵育2、3、4和5天后对发酵混合物取样，并遵照在下面HPLC测定章节中概述的程序，分析乙醇和葡萄糖浓度。结果在图7和8中显示。
HPLC测定
在5mM硫酸中10倍稀释所有用于HPLC分析的样品，并在注射至HPLC以前过滤通过0.2μm滤器。使用BioRad Aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm x 7.8mm)进行HPLC分析。
结果
肉汤A和B产生的水解物都产生了超过130g/L的葡萄糖，分别具有90.4％和92.6％的葡萄糖转化百分比。在任一水解物中都未检测到乳酸。
随着wAPB的葡聚糖载荷(loading)的降低，从鼠李糖乳杆菌产生的乳酸浓度增加，这提示了来自底物的强抑制作用。在13％葡聚糖载荷的由肉汤A和B产生的wAPB水解物，产生的乳酸水平彼此没有显著差异。在自肉汤A产生的7％葡聚糖载荷的wAPB上鼠李糖乳杆菌产生的乳酸，比自肉汤B产生的水解物得到的乳酸产量，高1.5倍。图6中的图比较了在自肉汤A和B产生的wAPB水解物上鼠李糖乳杆菌产生的乳酸。
与自肉汤B产生的水解物相比，在肉汤A产生的13％葡聚糖的wAPB水解物上Thermosacc酵母产生的乙醇高12.5倍(图7)。图7中的图比较了在肉汤A和B产生的13％葡聚糖wAPB水解物上Thermosacc酵母产生的乙醇。在5天的Thermosacc酵母发酵后，与肉汤A产生的水解物相比，来自肉汤B产生的水解物的残余葡萄糖蓄积大4倍。图8中的图比较了在Thermosacc酵母发酵自肉汤A和B产生的水解物期间葡萄糖的蓄积量。
尽管为了清楚理解的目的已通过举例说明和实施例的方式一定详细地描述了前述发明，但对本领域技术人员显而易见的是，可以实施某些变化和修改而不背离本发明的精神和范围。因此，不应将说明书理解为限制本发明的范围。
为了所有的目的，所有在此引用的出版物、专利和专利申请以其整体引入作为参考，其引入程度就如同特异地且单独地指出将每一出版物、专利或专利申请引入作为参考一样。

Claims (75)

1.一种制备发酵肉汤制剂的方法，其包括孵育第一混合物，所述第一混合物包含：
(a)一种或多种发酵肉汤，
(b)以重量计所述混合物的0.1％至15％的量的第一有机酸成分，其包含至少一种1-5碳有机酸和/或其盐，和
(c)以重量计所述混合物的0.025％至5％的量的第二有机酸成分，其包含至少一种6碳或更多碳有机酸和/或其盐，
其中孵育时间和条件导致所述一种或多种发酵肉汤中至少4log的活细胞减少，由此产生发酵肉汤制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述第一有机酸成分为以重量计所述第一混合物的0.2％至1％，0.2％至0.5％，0.1％至10％，0.25％至5％，或0.3％至3％的量。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述第二有机酸成分为以重量计所述第一混合物的0.04％至3％，0.2％至0.5％，0.1％至1％，0.25％至5％，或0.3％至3％的量。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述时间是8小时至36小时。
5.权利要求2的方法，其中所述时间是20小时至28小时。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述条件包括20℃至50℃的温度。
7.权利要求6的方法，其中所述条件包括25℃至40℃的温度。
8.权利要求7的方法，其中所述条件包括28℃至33℃的温度。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述条件包括3.5至5的pH。
10.权利要求9的方法，其中所述条件包括4至4.7的pH。
11.权利要求10的方法，其中所述条件包括4.2至4.5的pH。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中，以导致所述一种或多种发酵肉汤中活细胞数量的至少5log减少、6log减少、7log减少或8log减少的时间和条件，进行所述孵育。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述活细胞的减少，与接受所述条件的第二混合物相比，高至少0.5倍，至少1倍，至少2倍，至少5倍或至少10倍，
其中所述第二混合物只包含所述第一有机酸成分和所述第二有机酸成分中的一种，其量达到在所述第一混合物中的第一和第二有机酸成分的总重量百分比。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述细胞是真菌细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述真菌细胞是丝状真菌细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述丝状真菌细胞来自木霉属、曲霉属、青霉属、腐质霉属、金孢霉属或脉孢霉属。
17.权利要求1至16中任一项的方法，其中第一有机酸成分包含下述或由下述组成：醋酸、醋酸盐、甲酸、甲酸盐、丙酸、丙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。
18.权利要求17的方法，其中第一有机酸成分包含醋酸和/或其盐，或由醋酸和/或其盐组成。
19.权利要求1至18中任一项的方法，其中第二有机酸成分包含下述或由下述组成：苯甲酸、苯甲酸盐、环己烷羧酸、环己烷羧酸盐、4-甲基戊酸、4-甲基戊酸盐、苯乙酸、苯乙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。
20.权利要求19的方法，其中第二有机酸成分包含苯甲酸和/或其盐，或由苯甲酸和/或其盐组成。
21.权利要求1至20中任一项的方法，其中所述第一有机酸成分包含所述1-5碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐，和/或其中所述第二有机酸成分包含所述6碳或更多碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐。
22.权利要求1至16中任一项的方法，其中所述第一有机酸成分包含以重量计0.2％-0.4％浓度的醋酸和第二有机酸成分包含以重量计0.2％-0.4％浓度的苯甲酸钠。
23.权利要求22的方法，其中所述时间是24小时，所述条件包括40℃的温度，和4至4.6的pH。
24.权利要求1至23中任一项的方法，其中所述一种或多种发酵肉汤中的至少一种含有由所述细胞分泌的一种或多种蛋白质。
25.权利要求24的方法，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种由所述细胞重组表达。
26.权利要求24或权利要求25的方法，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种是酶。
27.权利要求26的方法，其中所述酶是外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或β-葡糖苷酶。
28.权利要求26的方法，其中所述一种或多种发酵肉汤中的至少一种含有由细胞重组表达和分泌的多种酶。
29.权利要求28的方法，其中所述多种酶各自是外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或β-葡糖苷酶。
30.权利要求1至29中任一项的方法，其中所述条件导致发酵肉汤制剂具有所述一种或多种发酵肉汤的酶活性的至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％。
31.权利要求1至30中任一项的方法，其中蛋白质占所述第一混合物的5至15重量百分比。
32.权利要求1至31中任一项的方法，还包括在所述孵育期中对所述第一混合物加入pH调节剂的步骤。
33.权利要求32的方法，其中所述pH调节剂是磷酸。
34.权利要求32的方法，其中所述pH调节剂是硫酸。
35.权利要求32的方法，其中所述pH调节剂是氢氧化钠。
36.权利要求1至35中任一项的方法，其中所述第一混合物还包含一种或多种抗微生物剂。
37.权利要求36的方法，其中所述一种或多种抗微生物剂是以重量计所述第一混合物的0.0005至0.05％的量。
38.权利要求37的方法，其中所述一种或多种抗微生物剂是以重量计所述第一混合物的0.001至0.025％的量。
39.权利要求37或权利要求38的方法，其中抗微生物剂包含含有异-α-酸、四-异α酸和/或β酸的啤酒花提取物。
40.权利要求1至39中任一项的方法，还包括在所述孵育步骤之前制备所述第一混合物。
41.权利要求40的方法，其中通过如下程序制备所述第一混合物，所述程序包括组合一种或多种发酵肉汤和至少一种1-5碳有机酸和/或其盐，至少一种6碳或更多碳有机酸和/或其盐、和任选地一种或多种其他试剂。
42.权利要求41的方法，其中所述一种或多种其他试剂包括pH调节剂和/或抗微生物剂。
43.通过权利要求1至42中任一项的方法得到的或可通过权利要求1至42中任一项的方法得到的发酵肉汤制剂。
44.权利要求43的发酵肉汤制剂，其包含一种或多种选自外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和β-葡糖苷酶的细胞外酶。
45.权利要求43或权利要求44的发酵肉汤制剂，其具有2200至2800CMC U/g的内切葡聚糖酶活性和525至775pNPG U/g的β-葡糖苷酶活性。
46.权利要求43或权利要求44的发酵肉汤制剂，其具有2200至3200CMC U/g的内切葡聚糖酶活性，300至800pNPG U/g的β-葡糖苷酶活性，和2000至5000ABX U/g的木聚糖酶活性。
47.一种组合物，其包含(a)一种或多种包含细胞的发酵肉汤；(b)以重量计所述组合物的0.2％至1.5％的量的、包含至少一种1-5碳有机酸和/或其盐的第一有机酸成分；(c)以重量计所述组合物的0.04％至0.6％的量的、包含至少一种6碳或更多碳有机酸和/或其盐的第二有机酸成分。
48.权利要求47的组合物，其中所述第一有机酸成分是以重量计所述组合物的0.2％至1％，0.2％至0.5％，0.1％至10％，0.25％至5％、或0.3％至3％的量。
49.权利要求47或权利要求48的组合物，其中所述第二有机酸成分是以重量计所述组合物的0.04％至3％，0.2％至0.5％，0.1％至1％，0.25％至5％，或0.3％至3％的量。
50.权利要求47至权利要求49中任一项的组合物，其中所述细胞主要或完全是非存活细胞。
51.权利要求50的组合物，其中如果在所述组合物中存在活细胞，那么在所述组合物中非存活细胞与活细胞的比例是至少10∶1，至少50∶1，至少100∶1，至少1000∶1，至少10,000∶1，至少100,000∶1或至少1,000,000∶1。
52.权利要求47至51中任一项的组合物，其具有3.5至5的pH。
53.权利要求52的组合物，其具有4至4.7的pH。
54.权利要求53的组合物，其具有4.2至4.5的pH。
55.权利要求47至54中任一项的组合物，其中所述细胞包含真菌细胞。
56.权利要求55的组合物，其中所述真菌细胞是丝状真菌细胞。
57.权利要求56的组合物，其中所述丝状真菌细胞来自木霉属、曲霉属、青霉属、腐质霉属、金孢霉属或脉孢霉属。
58.权利要求47至57中任一项的组合物，其中所述第一有机酸成分包含下述或由下述组成：醋酸、醋酸盐、甲酸、甲酸盐、丙酸、丙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。
59.权利要求58的组合物，其中所述第一有机酸成分包含醋酸和/或其盐，或由醋酸和/或其盐组成。
60.权利要求47至59中任一项的组合物，其中所述第二有机酸成分包含下述或由下述组成：苯甲酸、苯甲酸盐、环己烷羧酸、环己烷羧酸盐、4-甲基戊酸、4-甲基戊酸盐、苯乙酸、苯乙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。
61.权利要求60的组合物，其中所述第二有机酸成分包含苯甲酸和/或其盐，或由苯甲酸和/或其盐组成。
62.权利要求47至61中任一项的组合物，其中所述第一有机酸成分包含所述1-5碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐和/或其中所述第二有机酸成分包含所述6碳或更多碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐。
63.权利要求47至57中任一项的组合物，其中所述第一有机酸成分包含以重量计0.2％-0.4％浓度的醋酸和第二有机酸成分包含以重量计0.2％-0.4％浓度的苯甲酸钠。
64.权利要求47至63中任一项的组合物，其包含由所述细胞分泌的一种或多种蛋白质。
65.权利要求64的组合物，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种由所述细胞重组表达。
66.权利要求64或权利要求65的组合物，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种是酶。
67.权利要求66的组合物，其中所述酶是外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或β-葡糖苷酶。
68.权利要求64的组合物，其含有由细胞重组表达和分泌的多种酶。
69.权利要求68的组合物，其中所述多种酶各自是外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或β-葡糖苷酶。
70.权利要求47至69中任一项的组合物，其中蛋白质占所述组合物的5至15重量百分比。
71.权利要求47至70中任一项的组合物，其还包含一种或多种抗微生物剂。
72.权利要求71的组合物，其中所述一种或多种抗微生物剂是以重量计所述组合物的0.0005至0.05％的量。
73.权利要求72的组合物，其中所述一种或多种抗微生物剂是以重量计所述组合物的0.001至0.025％的量。
74.权利要求72或权利要求73的组合物，其中抗微生物剂包括含有异-α-酸、四-异α酸和/或β酸的啤酒花提取物。
75.一种试剂盒，其包含(a)包装和(b)权利要求43或45中任一项的发酵肉汤制剂或权利要求47至74中任一项的组合物。
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