CN104619850B - 在利用运动发酵单胞菌的发酵中使用啤酒花酸进行细菌污染控制 - Google Patents

在利用运动发酵单胞菌的发酵中使用啤酒花酸进行细菌污染控制 Download PDF

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Abstract

本发明通过添加啤酒花酸，在使用运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)作为生物催化剂的发酵中控制了污染，而没有对发酵生产的负面影响。啤酒花酸的有效浓度被发现依赖于所使用的发酵培养基的类型。

Description

在利用运动发酵单胞菌的发酵中使用啤酒花酸进行细菌污染 控制
技术领域
本发明涉及微生物学和发酵的领域。更具体地，开发了在发酵单胞菌(Zymomonas)被用作生物催化剂时用于控制发酵中的污染的方法。
背景技术
从可再生资源中生产燃料乙醇是针对全球化石燃料短缺、能源成本增加、以及与大气二氧化碳含量提高相关的全球变暖效应的其中一种长期解决方案。来自可再生资源的燃料乙醇通过利用生物催化剂的糖发酵进行生产。当前，酵母是最广泛地用于乙醇生产的生物催化剂。可发酵的糖类最典型地是得自经处理的生物材料，包括玉米粒、甜菜、和甘蔗。替代性的丰富的生物材料糖源是纤维素类或木质纤维素类生物质。利用物理的、化学的、和/或酶学的处理，用于加工纤维素类和木质纤维素类生物质，以生产可发酵的糖类的方法正在被开发。
在大规模发酵过程中维持无菌是困难的，尤其是当生物材料被用作碳水化合物源时。大规模发酵过程通常被可能来自经处理的生物材料、设备、工艺用水或其它来源的细菌污染。通常，污染性细菌是乳酸菌(LAB)，如乳杆菌类。污染性细菌通过利用糖类和降低主要产物生物催化剂的效果而使发酵产物的收率降低。污染性细菌产生非期望的产物如乙酸和乳酸，它们增强了培养物中的胁迫条件，导致较差的生长和/或较差的生物催化剂产物生产。
污染性细菌主要为乳酸菌，它们已经成为通常为糊料或糖浆的酵母发酵用于燃料或酿酒的乙醇生产中的一个问题。由于酵母和污染性细菌对一些抗微生物剂的不同敏感度，一些抗微生物剂能够被用于在酵母发酵中控制细菌。成功地在酵母发酵中被用于控制LAB污染的抗微生物剂包括青霉素(Day等人(1954)Agricultural and Food Chemistry，2：252-258)、维吉霉素(Hynes等人(1997)J.of Industrial Microbiology&Biotechnology18：284-291；Bischoff等人(2009)Biotechnology and Bioengineering，103：117-122；WO2007145857)、啤酒花酸(US20040044087；Ruckle和Senn，(2006)International Sugar Journal 108：139-147)、FermaSureTM、以及红霉素、泰乐菌素、和四环素。
通过工程化菌株的改进，包括除葡萄糖之外还利用木糖和阿拉伯糖、以及使竞争性代谢途径失活，开发了发酵单胞菌，作为有效的生物催化剂用于生产乙醇。此外，通过提高对纤维素类生物质水解产物中存在的抑制剂的耐受性，已使发酵单胞菌适合用于水解产物发酵培养基中。然而，使用发酵单胞菌作为用于乙醇发酵的生物催化剂显示了在污染控制方面另外的挑战，因为这种生物催化剂与主要的污染物一样是细菌。
对于与酵母一起使用安全的许多抗生素的浓度对于运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)菌株ZM4的生长是抑制性的，包括四环素、卡那霉素、多粘菌素和链霉素(Agrawanand Basappa，Biotechnology Letters(1996)，18：673-678)。仅有青霉素G显示在与发酵单胞菌一起使用时是安全的。苄基青霉素成功地用于控制用于乙醇生产的分批运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)发酵中的细菌污染(Grote和Rogers，Journal of FermentationTechnology(1985)63：287-290)。在另一篇综述中，发酵单胞菌被报道为苹果酒和啤酒的污染物，并且发现了对包括卡那霉素、多粘菌素、和链霉素在内的一些抗生素通常使用的水平具有抗性的发酵单胞菌菌株(Swings和De Ley，Bacteriological Reviews(1977)，41：1-46)。不同菌株之间的差异可能与抗性在质粒上的编码相关，如在运动发酵单胞菌(Z.mobilis)菌株CP4中针对链霉素、卡那霉素、和庆大霉素所发现的(Walia等人(1984)Applied and Environmental Microbiology，47：198-200))。
仍然存在对在使用针对乙醇生产开发的发酵单胞菌细菌生物催化剂的发酵中控制细菌污染的方法的需求。
发明内容
本发明提供了发酵液组合物和在发酵单胞菌在其中是生物催化剂的培养基中控制细菌污染的方法。
因此，本发明提供了发酵液组合物，其包含：
a)发酵培养基；
b)啤酒花酸；和
d)发酵单胞菌细胞的生长群体。
在另一个实施例中，本发明提供了用于在利用发酵单胞菌生物催化剂的发酵中控制细菌污染的方法，所述方法包括：
a)提供发酵培养基；
b)向发酵培养基添加啤酒花酸；
c)向所述发酵培养基添加发酵单胞菌细胞的种菌，从而产生发酵液；以及
d)将所述发酵液维持在适合发酵单胞菌细胞的生长的条件下。
在另一个实施例中本发明提供生产乙醇的方法，该方法包括：
a)提供发酵培养基；
b)向所述发酵培养基添加在啤酒花酸的存在下生长的发酵单胞菌细胞的种菌，从而产生发酵液；以及
c)将所述发酵液维持在适合发酵单胞菌细胞的生长和通过所述发酵单胞菌细胞生产乙醇的条件下；
其中没有啤酒花酸独立于(b)的种菌被添加到所述发酵培养基，并且其中产生乙醇。
附图说明
图1显示了在针对木糖的利用工程化的发酵单胞菌中的乙醇发酵途径的图表。
图2是显示在水解产物培养基中生长的ZW705细胞的葡萄糖利用率的图，该培养基在不同商业制剂中包含不同量的啤酒花酸，如标示所示，其完全制剂名在实例1中给出。BT：BetaTec
图3示出在种子培养基中的乳酸浓度(A)和乙醇浓度(B)，该培养基无啤酒花酸或具有25ppm Iso-Extract-30％，其以1∶100的比率接种有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：运动发酵单胞菌(Z.mobilis)菌株ZW705。
图4示出在水解产物培养基中的乳酸浓度(A)和乙醇浓度(B)，该培养基用种子培养物接种，初始以1∶100的比率接种有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：运动发酵单胞菌(Z.mobilis)菌株ZW705并在无啤酒花酸的情况下生长；或者种子培养物初始以1∶100的比率接种有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：运动发酵单胞菌(Z.mobilis)菌株ZW705并在具有25ppm Iso-Extract-30％的情况下生长。
图5示出在水解产物培养基中的葡萄糖利用率(A)和木糖利用率(B)，该培养基用种子培养物接种，初始以1∶100的比率接种有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：运动发酵单胞菌(Z.mobilis)菌株ZW705并在无啤酒花酸的情况下生长，或者种子培养物初始以1∶100的比率接种有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：运动发酵单胞菌(Z.mobilis)菌株ZW705并在具有25ppm Iso-Extract-30％的情况下生长。
图6示出在水解产物培养基中的乳酸浓度(A)和乙醇浓度(B)，该培养基用种子培养物接种，初始以1∶100的比率接种有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：运动发酵单胞菌(Z.mobilis)菌株ZW705并在无啤酒花酸的情况下生长，并且在不同量Iso-Extract-30％的存在下发酵。
具体实施方式
本发明涉及在利用发酵单胞菌作为生物催化剂(例如用于生产乙醇的)的发酵中，用于控制污染性细菌的抗微生物剂的使用。啤酒花酸在有效控制污染性细菌的同时对于发酵单胞菌细胞是安全的这一发现，使得其能够在发酵单胞菌在其中是生物催化剂的发酵中被使用。具体地，比对于通过酵母生产乙醇的发酵中通常使用的水平更高的高水平的啤酒花酸，被发现是在包含纤维素类生物质水解产物的发酵培养基中有效地控制污染性细菌所需要的。所述高水平可以被用于发酵单胞菌发酵中而不减少乙醇的生产。就用作燃料添加剂而言，乙醇从可再生的资源如纤维素类生物质水解产物的高效生产，将解决化石添加剂的短缺、降低能源成本和影响全球变暖。
下列定义和缩写用于解释权利要求和说明书。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或者其任何其它变型旨在包括非排他的包括。例如，包含要素列表的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备的固有元素。此外，除非相反地明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下中任一者均满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
此外，涉及元素或组分实例(即出现)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在为非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个/一种或至少一个/一种，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施例。
如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；通过在生产组合物或进行所述方法所使用的成分的制造、来源、或纯度方面的差异等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值的10％范围内，优选在报告数值的5％范围内。
术语“产乙醇生物”指通过代谢碳水化合物原料而产生乙醇的生物。
术语“可发酵糖”指在发酵过程中能被微生物用作碳源的低聚糖和单糖。
术语“同步糖化和发酵(SSF)”指生物质被糖化并且同时糖化产生的可发酵糖通过生物催化剂被用于产生某种产物的方法，其通常在相同反应容器中进行。
术语“纤维素类”指包含纤维素和附加组分的组合物，其可包括半纤维素和木质素。
术语“木质纤维质”指包含木质素和纤维素两者的组合物。木质纤维素类材料也可包含半纤维素。
术语“糖化”指由多糖生产可发酵糖。
术语“生物材料”是指是可用于通过生物催化剂的发酵中的碳水化合物源的任何生物来源的材料。生物材料包括纤维素类生物质以及被用作碳水化合物源的其它植物材料和植物来源的材料，例如谷物、糊料、糖浆、和原汁(例如来自甜菜和甘蔗的)。
术语“预处理的生物质”意指在糖化之前已经经过预处理的生物质。
术语“纤维素类生物质”指任何纤维质或木质纤维质材料，并且包括包含纤维素的材料，以及任选还包含半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的材料。纤维素类生物质还可包含附加的组分，例如蛋白质和/或脂质。纤维素类生物质可来源于单一的源，或者能够包括来源于多于一种的源的混合物；例如，纤维素类生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。纤维素类生物质包括但不限于生物能源作物、农业残留物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。纤维素类生物质的例子包括但不限于玉米棒、作物残渣如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、棕榈叶、棕榈空果串、废纸、甘蔗渣、高粱或大豆纤维类植物材料、从谷物的研磨中获得的纤维素类组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥。
术语“纤维素类生物质水解产物”是指产生自纤维素类或木质纤维素类生物质的糖化作用的产物。也可在糖化前预处理生物质。纤维素类生物质水解产物是包含生物质固体的产物。
术语“澄清的纤维素类生物质水解产物”或“清澈的纤维素类生物质水解产物”是指已经经过加工以去除固体并且不被认为是纤维素类生物质水解产物的纤维素类生物质水解产物。此外，任何制备物均包含来源于纤维素类生物质的糖类。
术语“糖化酶”指能够催化生物质组分转化成可发酵糖的酶。如果生物质为预处理的，所述酶通常更有效。
术语“实质污染”是指发酵液中乳酸菌污染物的水平，如果所述发酵液在没有抗微生物剂的情况下被温育约40小时，其将产生大于约5g/L的乳酸。
术语“乳酸菌”是指产生作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的乳酸的细菌。乳酸菌(LAB)是属于乳杆菌目(Lactobacillales)的革兰氏阳性细菌，并且包括，例如，乳杆菌(Lactobacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)、乳球菌(Lactococcus)、片球菌(Pediococcus)、链球菌(Streptococcus)、和肠球菌(Enterococcus)。
术语“发酵培养基”是指包含支持被用作生物催化剂的微生物的生长的、诸如营养物质的组分的组合物。发酵培养基可以以任何规模被使用，包括小规模培养和大规模生产发酵。
术语“发酵液”是指包含发酵培养基和生物催化剂细胞的组合物，在其中发酵正在发生或已经发生。根据生物催化剂在发酵液中已生长的时间长短，该发酵液还可包括由生物催化剂产生的产物如乙醇。
术语“种子培养物”是指被用于接种更大体积的发酵培养基以制备发酵液的生物催化剂细胞的培养物。通常，种子培养物种菌为发酵液终体积的约0.01％至20％v/v。
术语“污染”是指不是有意地被引入的微生物的存在。通常，所期望的生物催化剂被引入生长培养基以制备发酵液。除被引入的生物催化剂之外的存在于发酵液中的微生物被认为是污染。
术语“啤酒花酸”是指获取自啤酒花的产物，其为啤酒花属植物啤酒花(Humuluslupulu)的雌花簇(常称为种子球果或球果)，通过二氧化碳(CO2)提取获得。CO2提取的啤酒花酸由α酸(也称为葎草酮)和β酸构成，这两种酸均被认为是啤酒花酸。CO2提取物的啤酒花α酸级分通常分离自啤酒花提取物的剩余部分。异构化的啤酒花α酸(异-α酸)通过沸腾制备，并且也被认为是啤酒花酸。啤酒花异-α酸的衍生物也通过化学还原制备，产生ρ-异-α酸、四氢异-α-酸、和六氢异-α-酸，它们均被认为是啤酒花酸。啤酒花β酸包括但不限于类蛇麻酮、蛇麻酮、和伴蛇麻酮。啤酒花酸常用于啤酒酿造，其中平均化α酸导致啤酒的苦味，并且还具有对革兰氏阳性菌轻度的抗菌/抑菌效应，同时不影响酿造酵母的活性。啤酒花β酸导致啤酒的苦香味。
本发明的组合物和方法提供了对发酵单胞菌细菌在其中是生物催化剂的培养物中非期望的细菌的控制，例如在用于乙醇生产的发酵中。非期望的污染性细菌通常存在于大规模工艺中，尤其是当培养基包含经处理的生物材料时。用于培养基中的经处理的生物材料可包括碳水化合物源，例如玉米或小麦糊、甜菜或甘蔗糖浆、和纤维素类或木质纤维素类生物质水解产物。污染性细菌可以从生物材料、加工设备、接种培养物、工艺用水、空气、或其它来源被引入发酵过程中。在生产发酵中控制污染通常使得生物催化剂能够以比在污染性细菌的存在下所实现的更高的水平生长和生产产物，提供了更有效的和经济的发酵工艺。
用于发酵单胞菌发酵的抗微生物剂
由于发酵单胞菌自身是细菌，对于将用于发酵单胞菌发酵中的抗微生物剂而言，其必须选择性地靶向污染性细菌，同时不影响发酵单胞菌细菌。使用生物材料来源的碳水化合物源的大规模发酵中的主要污染性细菌是乳酸菌(LAB)，例如乳杆菌(Lactobacillus)的菌株。LAB是革兰氏阳性菌，而发酵单胞菌是革兰氏阴性菌。因此，挑战性的是鉴定在发酵培养基中控制LAB，而对发酵单胞菌细胞的生长和乙醇的生产没有负面影响的抗微生物剂。除LAB之外，其它污染性细菌也可被这种类型的抗微生物剂控制。
本方法使用啤酒花酸作为选择性的抗微生物剂，用于发酵单胞菌发酵。本文发现啤酒花酸对于用于在发酵单胞菌培养物中控制污染是安全的。啤酒花酸获取自啤酒花属植物啤酒花(Humulus lupulu)的雌花簇，通过二氧化碳(CO2)提取获得。提取的材料可进一步被分离和/或化学改性以制备不同类型的啤酒花酸。不同类型的啤酒花酸制剂可商购获得，诸如购自BetaTec，Hop Products Inc.(John I.Haas，Inc.，Washington，DC)的知和购自S.S.Steiner，Inc.(New York，NY)的Beta Bio 45％、 Iso-Extract-30％、Tetra Iso-Extract、和Hexa Iso-Extract。
在每种商业产品中的实际啤酒花酸含量可使用制造商的技术说明书确定，其提供产品制剂中的啤酒花酸百分比和类型如下。是具有8.5％-9.5％的啤酒花苦味酸的制剂。是具有29.5％-30.5％的异-α酸的制剂。Beta Bio 45％是具有45％的天然啤酒花β-酸(包括类蛇麻酮、蛇麻酮、和伴蛇麻酮)的制剂。Iso-Extract-30％是通过沸腾异构化的啤酒花α-酸制剂，其具有30.0+/-1.0％(W/W)的异-α-酸浓度。Tetra Iso-Extract(四氢异-α-酸)和Hexa Iso-Extract六氢异-α-酸是啤酒花异α-酸的衍生物制剂，其通过分别化学还原包含9.0％的四氢异-α-酸或六氢异-α-酸的衍生物来制备。Hexa Iso-Extract也包含1.0％的四氢异-α-酸。啤酒花酸的任何这些或其它制剂可用于本发明的组合物和方法。
啤酒花酸的制剂推荐用于乙醇发酵，其使用酵母作为生物催化剂，剂量如下：添加糖浆基进料原液的Beta Bio 45％为5ppm，以5-10ppm(等同于2.75-4.5ppm啤酒花β-酸)作为有效剂量；添加酵母繁殖罐、糊料罐、和谷类发酵车间的发酵罐的IsoExtract-30％为50ppm(等同于15ppm啤酒花α-酸)。Tetra Iso-Extract和Hexa-Iso Extract已经显示在40ppm(约3.6ppm啤酒花酸)下抑制革兰氏阳性菌的生长。
在一个方面，在本发明的方法中，啤酒花酸和发酵单胞菌细胞的种菌被添加到发酵培养基，以制备发酵液，发酵液被维持在适合发酵单胞菌细胞生长的条件下。啤酒花酸和种菌可以以任何次序或者同时地被添加到培养基中。本发明的发酵液组合物包含发酵培养基、啤酒花酸、和发酵单胞菌细胞的生长群体，如下文所述。一旦以诸如来自冷冻储液的细胞、从冷冻储液复苏的细胞、或种子培养物中的细胞的发酵单胞菌细胞接种了发酵培养基，发酵单胞菌细胞即生长形成发酵单胞菌细胞的生长群体。
发酵培养基可以是支持通过发酵单胞菌细胞的生长和生产的任何类型。本领域技术人员将知道根据下文的信息如何制备任何所描述的类型的培养基。在一个实施例中，所述发酵培养基是确定成分培养基。该培养基包含典型的购买的组分，包括诸如葡萄糖的碳水化合物源、氨基酸源和诸如酵母提取物的其它营养成分、以及可包括痕量元素、氮、和磷的其它组分，如KH2PO4和MgSO4。确定成分培养基经常用于培养实验室规模的培养物以及被用作大规模发酵的种菌的种子培养物。
在另一个实施例中，所述发酵培养基包含得自非纤维素类材料如糊料、原果汁、或糖浆的糖类。这些糖类制备自诸如谷物(如玉米、小麦、大麦、和黑麦)的生物材料、和诸如甜菜和蔗糖的糖料作物。用于发酵的水解的糊料是从谷物制备的，通常通过加热至高于糊化温度的温度、用α淀粉酶处理以液化、和使用诸如葡糖淀粉酶的酶糖化。来自甜菜和甘蔗的糖浆或原汁可被用作发酵培养基中的糖源。这种类型的糖源是非纤维素类生物材料糖源(纤维素类包括木质纤维素类)，因为所述糖源主要是淀粉或糖汁。这种类型的糖源通常用于种子培养物中和使用酵母作为生物催化剂的乙醇生产中、以及其它非纤维素类的大规模发酵中。
确定成分培养基和具有来自非纤维素类源的糖的培养基不含纤维素类(包括木质纤维素类)生物质水解产物。另外，包含得自纤维素类生物质并经高度纯化以去除诸如固体的其它纤维素类组分的糖源的培养基，被认为是不含纤维素类生物质水解产物的培养基。这种类型的培养基包含澄清的纤维素类生物质水解产物。
在另一个实施例中，所述发酵培养基包含从纤维素类(包括木质纤维素类)生物材料制备的纤维素类生物质水解产物。纤维素类生物质水解产物包含生物质固体。纤维素类生物质水解产物是通过纤维素类(包括木质纤维素类)生物质的糖化制备的。所述生物质通常在糖化前进行了预处理。生物质可用本领域技术人员已知的任何方法处理，以在水解产物中产生可发酵糖。通常所述生物质采用物理的和/或化学的处理，以及酶促糖化进行预处理。物理的和化学的处理可包括碾磨、铣削、切割、碱处理如用氨或氢氧化钠、和/或酸处理。在其中生物质与包含氨的水性溶液接触的情况下，低氨预处理是特别有用的，以形成生物质-氨水混合物，其中氨的浓度足够维持生物质-氨水混合物的碱性pH，但相对于生物质干重其小于约12重量％，并且生物质的干重至少约为15重量％固体(相对于生物质-氨水混合物的重量)，如共同拥有的美国专利US 7,932,063所公开的，其以引用方式并入本文。
酶解糖化通常利用酶组合物或共混物来降解纤维素和/或半纤维素并且产生水解产物，其包含糖，诸如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。糖化酶见Lynd，L.R.等人的综述(Microbiol.Mol.Biol.Rev.，66：506-577，2002)。使用至少一种酶，并且通常使用糖化酶共混物，其包括一种或更多种糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚键，并且存在于广义“水解酶”(EC 3.)的酶分类EC 3.2.1.x(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego，CA)，以及增补1(1993)、增补2(1994)、增补3(1995)、增补4(1997)和增补5[分别在Eur.J.Biochem.，223：1-5，1994；Eur.J.Biochem.，232：1-6，1995)；Eur.J.Biochem.，237：1-5，1996)；Eur.J.Biochem.，250：1-6，1997)；和Eur.J.Biochem.，264：610-6501999)中])。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它们水解的生物质组分进行分类。可用于本发明方法中的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡萄糖醛酸糖苷酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。此外，将其它活性剂添加到糖化酶聚生体(如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶(EC3.1.1.x和3.1.4.x)、木素酶(EC 1.11.1.x)或阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73))中以促进从生物质的其它组分中释放多糖是可用的。本领域熟知生产多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，如降解纤维素的能力，该活性由具有不同底物特异性的若干种酶或一组酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶，其中一种或多种或所有酶可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业酶制备物，如纤维素酶，可包括多种酶。对于糖化有用的许多糖基水解酶和它们的组合物公开于WO2011/038019中。
糖化酶可商购获得。此类酶包括，例如， CP纤维素酶、木聚糖酶、1500、和 DUET(Danisco U.S.Inc.，GenencorInternational，Rochester，NY)、和Novosyme-188(Novozymes，2880Bagsvaerd，Denmark)。此外，糖化酶可以是未经纯化的并以细胞提取物或全细胞制备物的形式提供。可使用已经进行工程改造以表达一种或多种糖化酶的重组微生物制备所述酶。例如，本文用于经预处理纤维素类生物质的糖化的H3A蛋白质制备物是由里氏木霉(Trichoderma reesei)的遗传工程菌株生产的酶的未纯化的制备物，其包括纤维素酶和半纤维素酶的组合，并且描述于WO 2011/038019中，该文献以引用方式并入本文。
用于糖化的另外的酶类包括，例如，糖基水解酶，诸如GH3、GH39、GH43、GH55、GH10和GH11家族的成员。GH是一组酶，其水解两个或更多个碳水化合物间的糖苷键，或碳水化合物与非碳水化合物部分间的糖苷键。GH家族基于序列类似性进行分类，并且所述分类可在碳水化合物-活性酶(CAZy)数据库中得到(Cantarel等人(2009)Nucleic Acids Res.37(Database issue)：D233-238)。这些酶的某一些能够作用于多种底物并且作为糖化酶表现出效能。糖苷水解酶家族3(“GH3”)的酶具有大量的已知活性，包括，例如，β-葡糖苷酶(EC：3.2.1.21)；β-木糖苷酶(EC：3.2.1.37)；N-乙酰基β-氨基葡糖苷酶(EC：3.2.1.52)；葡聚糖β-1，3-葡糖苷酶(EC：3.2.1.58)；纤维糊精酶(EC：3.2.1.74)；外切-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC：3.2.1)；和/或β-半乳醣苷酶(EC 3.2.1.23)的活性。糖苷水解酶家族39(“GH39”)酶还具有大量已知活性，包括，例如α-L-艾杜糖醛酸酶(EC：3.2.1.76)和/或β-木糖苷酶(EC：3.2.1.37)的活性。糖苷水解酶家族43(“GH43”)的酶具有大量已知活性，包括，例如，L-α-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)；β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；聚阿拉伯糖内切酶(EC3.2.1.99)；和/或半乳聚糖1，3-β-半乳醣苷酶(EC 3.2.1.145)的活性。糖苷水解酶家族51(“GH51”)的酶已知具有，例如，L-α-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)和/或内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)的活性。糖苷水解酶家族10(“GH10”)详细的描述于Schmidt等人，1999，Biochemistry38：2403-2412和Lo Leggio等人，2001，FEBS Lett 509：303-308)中，并且糖苷糖水解酶家族11(“GH11”)描述于Hakouvainen等人，1996，Biochemistry 35：9617-24中。
包含生物质水解产物的发酵培养基可包含一定百分比的水解产物以及一种或多种另外的糖类和/或其它添加的组分，或者所述培养基可包含90％或更多的水解产物以及少量的添加物如山梨醇，如下文所述。在各种实施例中，纤维素类生物质水解产物为发酵液终体积的至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％。通常发酵液终体积的约10％是种菌。
根据所采用的预处理和糖化方法，生物质水解产物的固体含量通常在介于约10％和40％之间。更典型地，固体含量为约25％，即包含90％纤维素类生物质水解产物的培养基具有约23％的固体。
在发酵液中的啤酒花酸浓度
控制发酵单胞菌发酵液中的污染所需的啤酒花酸浓度在本文中被发现是变化的，取决于发酵培养基是否包含纤维素类生物质水解产物。本文发现在缺乏纤维素类生物质水解产物的培养基中(如上所述)，约7.5ppm的啤酒花酸浓度对于控制污染性细菌是有效的，同时不影响发酵单胞菌细胞。啤酒花酸可用于本发明的方法和组合物，其培养基缺乏纤维素类生物质水解产物，浓度为至少约2、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ppm或更高，包括介于它们之间的任何整数或分数。控制污染所需的啤酒花酸的量取决于诸如污染的量、培养基的类型、啤酒花酸的具体制备、接种后发酵单胞菌细胞的浓度、和发酵条件的因素，并且能够由本领域的技术人员针对具体情况确定。
污染性细菌的控制可通过测定发酵液中的乳酸的水平来评估，其中在约40小时的发酵之后小于约5g/L的乳酸的存在表明污染被控制。污染可以被控制在发酵液中小于约5g/L的乳酸，或小于4g/L或3g/L或2g/L或1g/L的乳酸。发酵液中的乳酸的量通常通过HPLC测定，如本领域的技术人员所已知的。
本文发现当存在于种子培养物中的污染通过使用啤酒花酸被控制(如上文所述)，并且所述种子培养物被用于接种大规模发酵时，在没有独立于种菌地向发酵培养基中添加啤酒花酸或其它抗微生物剂的情况下，大规模发酵中的污染仍然被控制。因此，在一个实施例中，通过在被用于接种发酵培养基的种子培养物中包括啤酒花酸，控制了发酵中的污染。发酵培养基可包含纤维素类生物质水解产物、或不含纤维素类生物质水解产物。在生长于不含纤维素类生物质水解产物的培养基中的种子培养物中，啤酒花酸的浓度可以如上文所述：至少约2、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ppm或更高，包括介于它们之间的任何整数或分数。典型的实施例使用浓度介于约2ppm和20ppm之间的啤酒花酸。更典型的实施例以介于约3ppm和约10ppm之间的浓度使用啤酒花酸。
然而，当污染在种子培养物中未被控制时，污染是用被污染的种子培养物接种的大规模发酵中的一个因素。在一个实施例中，当使用不含纤维素类生物质水解产物的培养基时，被污染的种菌接种的发酵中的污染如上文所述被控制。
本文发现在包含含有纤维素类生物质水解产物的培养基的发酵液中，需要大于约30ppm的啤酒花酸浓度以控制污染性细菌。在本文实验中，当使用受污染的种子培养物接种水解产物培养基时，150ppm和750ppm的浓度能够将乳酸生产水平保持在低于5g/L。在包含含有纤维素类生物质水解产物的培养基的发酵液，使用大于约30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750ppm或更高的啤酒花酸浓度(包括介于它们之间的任何整数或分数)来控制发酵单胞菌细胞发酵中的污染。
在含纤维素类生物质水解产物的培养基中相对高的固体的存在、以及固体对混合的效应，可有助于对控制污染所需的与在不含纤维素类生物质水解产物的培养基中有效的水平相比更高水平的啤酒花酸的需求。各种生物质降解产物在水解产物中的存在也可能有所帮助。啤酒花酸的高水平高于啤酒花酸产品的生产商针对在酵母乙醇生产中的使用所建议的那些。
在用于发酵的任何类型的培养基中，需要达到的有效污染控制结果的啤酒花酸的具体量将取决于包括所使用的发酵单胞菌菌株的生长和生产性能、所存在的污染性微生物、初始的污染水平、啤酒花酸的具体制剂、若存在时培养基中的纤维素类生物质水解产物的类型和量(包括固体百分比以及水解产物副产物对污染性的和发酵单胞菌细胞的毒性)、和包括混合在内的培养条件的因素。本领域的技术人员能够容易地确定对于控制特定发酵单胞菌发酵液中的污染有效，同时维持最大发酵单胞菌细胞生产能力的相对于本文所公开的量的啤酒花酸浓度。
发酵单胞菌细胞的种菌
在本发明的方法中，发酵单胞菌细胞的种菌可以是对于生长培养物的起始有效的发酵单胞菌细胞的任何来源。通常，发酵单胞菌细胞作为冷冻储液被储存，并且细胞通过在确定成分培养基中的少量培养物中生长而被复苏。上述少量培养物被用作添加到发酵培养基以制备发酵液或培养物的种菌。少量培养物还可被用于接种种子培养物。发酵单胞菌细胞在种子培养物中生长，然后其作为种菌被添加到更大规模的发酵。用作种菌的种子培养物可包含无菌的确定成分培养基，而不含控制污染所需的啤酒花酸。作为另外一种选择，用作种菌的种子培养物可包含确定成分培养基或不含纤维素类生物质水解产物的其它培养基，如从糊料或糖浆制备的培养基，其可能被例如加工设备污染，其中啤酒花酸被添加以控制污染，如上文所述。此外，用作种菌的种子培养物可包含纤维素类生物质水解产物和啤酒花酸以控制污染，如上文所述。
发酵单胞菌细胞
发酵单胞菌细胞的任何菌株可被用于本发明的组合物和方法中，并且基于包括将要使用的培养基的类型和发酵过程所期望的产物在内的因素被选择。对于所期望的生产过程是有效的生物催化剂的任何发酵单胞菌菌株均可使用。例如，发酵单胞菌细胞天然地利用葡萄糖、果糖和/或蔗糖作为发酵底物生产乙醇，但木糖不被代谢。在一个实施例中，用于本发明的方法和组合物中的发酵单胞菌细胞已经针对木糖的利用经过工程化改造，当使用包含木糖的纤维素类生物质水解产物时这是尤其期望的。
产乙醇的发酵单胞菌的菌株，例如运动发酵单胞菌(Z.mobilis)，已被工程化以将木糖发酵为乙醇。通常，四种基因被引入运动发酵单胞菌(Z.mobilis)，用于表达参与木糖代谢的四种酶，以创建木糖利用代谢途径(图1)，如美国专利5,514,583、美国专利5,712,133、美国专利6,566,107、WO 95/28476、Feldmann等人((1992)Appl MicrobiolBiotechnol 38：354-361)、和Zhang等人((1995)Science 267：240-243)中所述。这些基因包括编码木糖异构酶的基因，该酶催化木糖转化成木酮糖，以及木酮糖激酶，该酶磷酸化木酮糖以形成5-磷酸木酮糖。另外还表达了戊糖磷酸途径中的两种酶，转酮醇酶和转醛醇酶，它们将5-磷酸木酮糖转化成联接戊糖代谢与Entner-Douderoff糖酵解途径的中间体，该途径使木糖代谢成乙醇(参见图1)。编码这些酶的DNA序列可从能够代谢木糖的多种微生物中的任何一种获得，例如肠细菌和一些酵母以及真菌。编码区的来源可包括黄单胞菌(Xanthomonas)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、埃希氏菌(Escherichia)、红细菌(Rhodobacter)、黄杆菌(Flavobacterium)、醋杆菌(Acetobacter)、葡糖杆菌(Gluconobacter)、根瘤菌(Rhizobium)、农杆菌(Agrobacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、假单胞菌(Pseudomonads)、和发酵单胞菌。通常使用大肠杆菌的编码区。
将编码DNA序列可操作地连接至在发酵单胞菌细胞中表达的启动子如运动发酵单胞菌(Z.mobilis)甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAP启动子)和运动发酵单胞菌(Z.mobilis)烯醇酶启动子(ENO启动子)。如以引用的方式并入本文的US 7,989,206所公开的具有提高表达的突变型GAP启动子也可用于在发酵单胞菌中的表达。编码区可单个地从启动子表达，或者两个或更多个编码区可在操纵子中接合，从相同启动子表达。可将所得的嵌合基因导入发酵单胞菌细胞并保持在质粒中，或者使用例如同源重组、定点整合、或随机整合而整合进基因组中。经工程化改造以表达木糖利用代谢途径的菌株的例子包括CP4(pZB5)(US 5514583)、ATCC31821/pZB5(US 6566107)、8b(US 20030162271；Mohagheghi等人，(2004)Biotechnol.Lett.25；321-325)，和ZW658(ATTCC#PTA-7858)。经工程化以表达木糖利用代谢途径的发酵单胞菌细胞，在能够在包含作为唯一糖类的木糖的培养基中生长之前，一般需要在含木糖的培养基中适应一段时间。
在附加的实施例中，所述发酵单胞菌细胞具有改进了菌株的一个或多个另外的遗传修饰，例如提高生长速率和/或细胞群、提高木糖的利用和/或使得能够使用其它糖类如阿拉伯糖、提高对抑制性化合物如乙酸盐的耐受性、或提高乙醇的生产。
在一个实施例中，发酵单胞菌细胞可以是针对US 5,843,760(该文献以引用方式并入本文)中描述的阿拉伯糖的利用被另外地工程化的。为了允许阿拉伯糖的利用，除木糖利用途径的基因之外还表达的基因包括：1)使L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的L-阿拉伯糖异构酶，2)使L-核酮糖转化为L-核酮糖-5-磷酸的L-核酮糖激酶，和3)使L-核酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(US 5,843,760)。如US2011/0143408(该文献以引用方式并入本文)中所公开的，通过附加地表达阿拉伯糖-质子协同载体，例如通过表达来自araE基因的编码区，可实现改善的阿拉伯糖利用。
在另一个实施例中，编码整合宿主因子的α亚基的内源性himA基因经过了遗传修饰以减少其表达，这改善了在包含乙酸盐的培养基中的生长，如US 7,897,396中所述(该文献以引用方式并入本文)。乙酸盐存在于生物质水解产物中，因此当使用包含生物质水解产物的培养基时，对这种组分的提高的耐受性是所期望的。
在另一个实施例中，进行了使葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)活性降低的遗传修饰，如US7,741,119中所述(该文献以引用方式并入本文)。GFOR以及himA基因的表达的降低，可以是通过任何方法，例如上文关于降低醛糖还原酶活性所描述的那些。
在另一个实施例中，进行了使核糖-5-磷酸异构酶(RPI)活性升高的遗传修饰，如在共同拥有和共同未决的美国专利申请#13/161734中所公开的，该文献以引用方式并入本文。RPI表达的提高可通过提高内源性RPI编码基因的表达，例如用比天然启动子活性更高的启动子，或通过在发酵单胞菌中表达编码具有核糖-5-磷酸异构酶活性的任何蛋白质或多肽的异源性基因而实现。有两组核糖-5-磷酸异构酶，称为RPI-A和RPI-B，如美国专利申请13/161734中所述，二者中任何一种均可被表达。
在另一个实施例中，使用US 7,989,206和US 7,998,722(这些文献以引用方式并入本文)中所公开的突变的、高活性的启动子，表达了作为木糖利用代谢途径的部分被表达的木糖异构酶。本文所公开的突变体启动子是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子。
在另一个实施例中，作为木糖利用代谢途径的部分表达的木糖异构酶是包括在按照EC 5.3.1.5鉴定的酶分类中的组I木糖异构酶，如共同拥有和共同未决的美国专利公布US 2011-0318801中所公开的。在其中公开了组I的木糖异构酶，例如从分离自密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)的编码区表达的，在发酵单胞菌中具有比组2的木糖异构酶更高的活性。组I木糖异构酶是通过分子系统发育生物信息学分析(使用PHYLIP邻接算法，如在PHYLIP(Phylogeny Inference Package版本3.5c；Felsenstein(1989)Cladistics 5：164-166)、GroupSim分析(Capra和Singh(2008)Bioinformatics 24：1473-1480)、和剖面隐马尔科夫模型(使用HMMER软件包的hmmsearch算法；Janelia FarmResearch Campus，Ashburn，VA)而限定于其中的。
在另一个实施例中，发酵单胞菌细胞已适应了在包含乙醇和乙酸铵的胁迫培养物中生长，如美国专利申请公布2011-0014670-A1中所公开的，该文献以引用方式并入本文。当使用包含纤维素类生物质水解产物的发酵培养基(其包含乙酸盐)时，具有改善的乙酸盐耐受性的这些发酵单胞菌菌株是尤其有用的。
上文的参考文献中公开的菌株提供了可用于本发明的方法中的菌株的例子，包括ATCC31821/pZB5、ZW658(ATCC#PTA-7858)、ZW800、ZW801-4、ZW801-4：：ΔhimA、AcR#3、和ZW705。
发酵单胞菌发酵
在本发明的方法中，经接种的培养物培养基或发酵液在适合发酵单胞菌细胞的生长的条件下被温育。在一个实施例中，发酵单胞菌细胞是对于在发酵中使用的条件下的乙醇生产而言是有效的生物催化剂的发酵单胞菌菌株，并且乙醇在所述发酵液中被生产。当发酵培养基中的糖类浓度高，使得生长被抑制时，培养基包括山梨醇、甘露糖醇、或它们的混合物，如共同拥有的美国专利U.S.7,629,156中所公开的，该文献以引用方式并入本文。通常，培养基中存在终浓度约5mM的山梨醇或甘露糖醇。
通常，使用温度为介于约30℃和约37℃之间、pH为约4.5至约7.5的条件。通常，培养物没有补充空气、氧气、或其它气体地被温育(这可包括诸如厌氧、微氧、或微需氧发酵的条件)至少约20小时，并可进行约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70小时或更久。通常种子培养物温育约20小时，而发酵生产培养物温育约40小时或更久。为使发泡最小化，可根据需要向培养基内添加消泡剂(任何类别基于硅氧烷的、基于有机物的等等)。就商业生产发酵培养而言，多种培养方法可被采用。
例如，大规模生产可使用分批和连续培养方法。经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需的生物接种培养基，并且不向系统中添加任何物质可以允许发生生长或代谢活性。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。处于对数期的细胞通常负责乙醇的批量生产。
标准的分批体系的变型是补料-分批体系。分批补料培养方法也适用于本发明的方法和组合物，并且包括典型的分批系统，不同的是底物随着培养进行以递增方式添加。补料-分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并因此根据可测量因素例如pH和废气如CO2的分压的改变来评估。分批和补料-分批培养方法在本领域内是常用的且熟知的，并且例子可见于Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Crueger，Crueger和Brock，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，或Deshpande，MukundV.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)
本发明的方法和组合物还可用于连续培养工艺中。连续培养是一种开放式系统，其中将培养物培养基连续添加到生物反应器里，并同时移出等量经调理培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养物质，并且连续从细胞群中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由本领域技术人员已知的天然材料和/或合成材料组成。
在生产过程中，生产发酵培养通常相继地进行，直到需要对系统进行清理。
本发明的方法和组合物还可用于同时糖化和发酵(SSF)工艺中。例如，可使用公开于美国专利申请公布20110318803中的工艺，该文献以引用方式并入本文。在这种SSF工艺中，发酵单胞菌细胞在糖化-发酵混合物中有高浓度不溶性固体的情况下，于低叶轮搅拌条件下在同时糖化和发酵反应过程中生长，以生产高浓度的乙醇。此外，可使用混合糖化和发酵(HSF)工艺，在其中部分糖化在发酵单胞菌细胞的添加之前进行，然后进一步的糖化和发酵同时发生。
实例
本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上文的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本发明的特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。
缩写的含义如下：“hr”是指小时，“min”是指分钟，“sec”是指秒，“d”是指天，“L”是指升，“mL”是指毫升，“pL”是指微升，“g”是指克，“pg”是指微克，“ng”是指纳克，“g/L”是指克每升，“mM”是指毫摩尔，“pM”是指微摩尔，“nm”是指纳米，“pmol”是指微摩尔，“pmol”是指皮摩尔，“OD600”是指在600nm测得的光密度，“EFT”是指经过的发酵时间，“ppm”是指份每一百万份。
一般方法
培养基
MRS培养基具有10g/L蛋白胨、8g/L肉提取物、4g/L酵母提取物、20g/L葡萄糖、5g/L三水乙酸钠、1g/L Tween 80、2g/L K2HPO4、2g/L柠檬酸三铵、0.2g/L MgSO4*7H2O、0.05g/LMnSO4*4H2O、pH 6.2。
玉米棒组合物
使用ASTM E1758-01方法“通过HPLC测定碳水化合物的标准方法”，如在《国家可再生能源实验室》(Golden，CO)技术报告NREL/TP-510-42618(2008年4月修订)中进一步详述的，测定了起始玉米棒中的纤维素和木聚糖的量。组分经测定为以干重计34.8％纤维素、29.2％木聚糖、12.8％木质素。
糖化酶
CP纤维素酶和来自Danisco U.S.Inc.(GenencorInternational，Rochester，NY)。
Novozyme-188来自Novozymes(2880Bagsvaerd，Denmark)。
H3A蛋白
H3A蛋白由里氏木霉(Trichoderma reesei)的遗传工程H3A菌株制备。菌株H3A如US 7,666,648所述进行制备。简而言之，使用电穿孔对来源于RL-P37(Sheir-Neiss，G等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.1984，20：46-53)并针对高的纤维素酶生产经过选择的里氏木霉(Trichoderma reesei)突变型菌株与β-葡糖苷酶表达盒和木聚糖内切酶表达盒一起进行了共转化。一个转化体称为菌株#229。使用电穿孔对菌株#229与β-木糖苷酶Fv3A表达盒、β-木糖苷酶Fv43D表达盒、和Fv51Aα-阿拉伯呋喃糖酶表达盒一起进行了共转化。从这个转化步骤中分离出菌株H3A。
在菌株H3A发酵期间产生的细胞外蛋白通过离心从细胞群中分离出来，通过经由Millipore 10kD分子截留分子量膜进行的膜超滤进行浓缩，并将pH调节至4.8。使用Weichselbaum和Gornall修改的改性的缩二脲方法测定总蛋白，该方法使用牛血清白蛋白作为校准物(Weichselbaum，1960年，Amer.J.Clin.Path.16∶40；Gornall等人，1949年，J.Biol.Chem177∶752)。这种H3A细胞外蛋白制备物本文也称为H3A蛋白，它用作组合纤维素酶和半纤维素酶制备物，在SSF期间影响络合碳水化合物水解。
玉米棒水解产物MD07#3
预处理
用锤磨机(Glen Mills Inc.，Clifton，NH)处理了玉米棒的批次，通过3/8英寸(0.95cm)或3/16英寸(0.48cm)筛网，并在保持在145℃的170L Jaygo反应器(JaygoManufacturing，Inc.，Mahwah，NJ)中用相对于生物质干重6％、8％、或10％的氨处理20分钟。在注入含水的氨之前，将反应器抽真空至～0.1巴(10千帕斯卡)，并在上述20分钟时期之后，在2个阶段中将反应器快速抽至～0.1巴(10千帕斯卡)。经预处理的玉米棒混合物最终的固体浓度为约60％。
糖化
在配备了再循环套环的1000L发酵器中生成了MD07#3水解产物。将水底液(542.3kg)添加到发酵器并在121℃灭菌20分钟。将水冷却至47℃，并通过位于罐顶部的进料器添加经预处理的玉米棒混合物；此时添加了112.1kg。用9.8重量％H2SO4将pH调节至5.3，并添加第一剂量的酶。关于所使用的酶物质和相应的剂量，参见表2。经过接下来的九个小时，添加了另外的317.6kg经预处理的玉米棒，在整个添加过程中用9.8重量％H2SO4将pH控制在5.3。这次运行的目标固体载量是25重量％。在第一次添加酶之后12小时，添加第二剂量的酶(参见表1)。将发酵器控制在47℃和pH 5.3约96小时，并使浆液循环通过再循环套环进行循环。从第一次添加酶之后三小时开始，间歇地使用再循环套环中的转子-定子研磨器，以减小浆液中的经预处理玉米棒的粒度。在从30至110分钟的每次任意的时间使用了研磨器九次。在96小时的运行结束时，移出一些水解产物材料用于这些实验。分析了水解产物的样品，并冷冻储存剩余的直到使用。样品分析的结果包括在表2中。
表1：MD07#3糖化中使用的酶
表2：糖化结束时MD07#3的水解产物属性
玉米棒水解产物FRF13预处理
首先使用US 7,932,063中描述的低氨方法，通过对研磨的玉米棒的稀释氨预处理制备了玉米棒水解产物。使用包括围绕容器主体用于传输蒸汽的夹套的水平LittlefordDay 130L反应容器(Littleford Day，Inc.，Florence，KY)进行预处理，以生成称为SSL34的预处理玉米棒。向容器中装入来自种子玉米加工的玉米棒以达到基于湿玉米棒的46体积％的反应器填充度(51磅)。使用大型微粒粉磨机(Model#1SH，Serial#10019；PulverizingMachinery Co.，Summit，NJ)，用1.0mm的筛网将所述玉米棒减小到小于1mm的尺寸。在碾磨前按需添加一匙干冰到所述棒中以防止设备升温。该微粒粉磨机的主驱动装置是5马力的马达，最大转速为9,600RPM。其具有六个转锤、外壳、并排列有对置的冲击边缘。
所述玉米棒具有0.385g/cm3的松散湿堆积密度和7.4重量％的水分。在添加28.9重量％的氢氧化铵溶液(9.8磅)和水(17.9磅)到靠近容器顶部以提供容器中相对于生物质干重6重量％的NH3和60重量％的固体之前，向容器施加真空以达到0.1atm。以相同的方式进行了被称为SSL35和SSL36的第二和第三预处理批次，以产生足够用于后续的糖化的材料。在全部的批次中，均将反应器搅拌器设为70rpm并且蒸汽通过容器的夹套。当容器达到内部温度80℃时，将蒸汽导入靠近容器顶部以提高容器内部温度至145℃。保持这一温度20分钟。在保持15分钟后，停止流经夹套的蒸汽流。在预处理末期，通过排气冷凝器将反应器压力降至大气压。随后，在打开容器的底部阀门并回收经预处理的生物质之前，施加真空(大约小于1atm)15分钟以将温度降至小于60℃并从预处理玉米棒中除去多余的氨和水。对于经预处理的玉米棒批次SSL34、SSL35、和SSL36，最终的固体重量％分别是67.4％、66.2％、和68.0％。
糖化
使用来自SSL34、SSL 35和SSL36制备物的经预处理玉米棒的混合物，通过与上文所述的H3A蛋白的糖化，在200L发酵器中生成了水解产物(FRF13)。将水底液(120.0kg)添加到发酵器并将夹套加热至121℃维持20分钟灭菌。将水冷却至47℃，并通过罐顶部的开口添加经预处理的玉米棒混合物；此时添加了20.0kg。以1N H2SO4将pH调节至5.3，并添加酶制备物。酶剂量为4.53kg，相当于将被添加到反应器的总的玉米棒中的每克葡聚糖+木聚糖14mg蛋白质。经过接下来的12小时，每三小时一次，向反应器添加了四次15.0kg玉米棒，在每次添加后用1N H2SO4将pH调节至5.3。这次运行的目标固体载量是25重量％。将发酵器控制在47℃和pH 5.3约72小时。上述时期结束时，移出20升用于这些实验，容器内剩余的内容物被发酵。分析了水解产物的样品，并冷冻储存剩余的直到使用。样品分析的结果显示在表3中。
表3：糖化结束时FRF13的水解产物属性
葡萄糖单体(g/L) 49.20
葡萄糖低聚物(g/L) 20.45
木糖单体(g/L) 54.97
木糖低聚物(g/L) 27.24
阿拉伯糖单体(g/L) 5.92
阿拉伯糖低聚物(g/L) 4.58
固体含量(重量％) 24.1％
实例1
运动发酵单胞菌(z.mobilis)对啤酒花酸的耐受性
通过于33℃在35mL MRM3G6培养基(10g/L BBL酵母提取物、2g/L KH2PO4、1g/LMgSO4*7H2O、60g/L葡萄糖、pH 5.5)中复苏2mL的OD～10冷冻储液～8小时，制备了运动发酵单胞菌(Z.mobilis)菌株ZW705(描述于“一般方法”)种菌。上述培养物被用于以20％(终体积)接种比率接种包含补充了2g/L酵母提取物和多种啤酒花酸制备物(见表4)的澄清的MD07#3水解产物(参见“一般方法”)的管，得到～0.5的初始OD。知(BetaTec，Hop Products Inc.，John I.Haas，Inc.，Washington，DC)的含量为100ppm或500ppm。为约9％的啤酒花苦味酸并且为约30％的异-α酸，使得买验使用的实际浓度为约9或约45ppm的啤酒花苦味酸，并且实验使用的实际浓度为约30或约150ppm异-α酸。Beta Bio 45％(S.S.Steiner，Inc.，New York，NY)的含量为10ppm或50ppm。Beta Bio45％是45％的天然啤酒花β-酸，使得实际的β酸浓度为4.5或22.5ppm。 Iso-Extract-30％、Tetra Iso-Extract、和Hexa Iso-Extract的浓度为100ppm或500ppm。 Iso-Extract-30％是30％的异-α-酸钾盐水溶液，其由CO2啤酒花提取物制得，使得实际的异-α酸浓度为30或150ppm。 Tetra Iso-Extract是9.0％(w/w)的四氢异-α-酸钾盐水溶液，其由CO2啤酒花提取物制得。因此100ppm的Tetra Iso-Extract是9ppm四氢异-α酸，并且500ppm的TetraIso-Extract是45ppm四氢异-α酸。 Hexa Iso-Extract是9％(w/w)的六氢异-α-酸和1％的四氢异-α-酸的钾盐水溶液，其由CO2啤酒花提取物制得。因此100ppm的HexaIso-Extract是9ppm六氢异-α酸和1ppm四氢异-α酸，并且50ppm的Hexa Iso-Extract是45ppm六氢异-α酸和5ppm四氢异-α酸。
对照培养物不包括啤酒花酸。将管保持在33℃，振荡32小时，同时使用用葡萄糖进行过校准的YSI7100Multiparameter Bioanalytical System(YSI Life Sciences，YellowSprings，OH)监控葡萄糖消耗。如图2所示，ZW705的葡萄糖利用率类似于包含较少量各种啤酒花酸制剂的对照培养物的利用率。在包含较高量各种类型的啤酒花酸制剂的培养基中具有较低的葡萄糖利用率。
表4：在商业啤酒花酸制剂中的啤酒花酸
*六氢异-α-酸量+四氢异-α-α-酸量
实例2
啤酒花酸对控制运动发酵单胞菌(运动发酵单胞菌(Z.mobilis))种子培养基中的污染的效应运动发酵单胞菌(Z.mobilis)菌株ZW705种菌如实例1所述进行制备，生长至约2的OD。通过用单菌落接种MRS培养基并使其在33℃生长8小时，制备了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株ATCC 8014种菌，这时的OD为约1.0。
制备了种子培养基(10g/L Amberex695酵母提取物、2g/L KH2PO4、5g/L MgSO4*7H2O、10mM山梨醇、150g/L葡萄糖、pH 5.5)并通过高压灭菌(121℃、30分钟)。向一个25ppm Iso-Extract-30％(7.5ppm异-α酸)的种子培养基样品添加(F1075)并且不向其它样品添加啤酒花酸(对照物；F1074)。用运动发酵单胞菌(Z.mobilis)ZW705(至OD为0.05)和植物乳杆菌(L.plantarum)ATCC 8014(至OD为0.0005)的混合物接种各个样品，并且在33℃和pH 5.5条件下发酵，使用4N NH4OH进行pH控制。
在发酵期间通过HPLC(Aminex 87H柱，0.01N H2SO4，0.6mL/min)定期分析培养基样品并且结果显示在图3A和B中。在缺乏啤酒花酸(样品F1074)的培养物中，在发酵18.0小时后，已经形成了2.1g/L乳酸和52.1g/L乙醇。在23.8小时的发酵后，形成了2.9g/L的乳酸和67.6g/L的乙醇。在培养基中添加了25ppm Iso-Extract的培养物中(样品F1075)，在18.0小时产生了0.36g/L的乳酸并且在23.8小时产生了0.45g/L乳酸，显示了25ppm Iso-Extract剂量在减少植物乳杆菌(L.plantarum)生长中的有效性，如降低的乳酸浓度所表明的。在23.8小时的乙醇浓度在添加 Iso-Extract培养物中为68.3g/L，在未添加的培养物中为67.6，指示不存在对运动发酵单胞菌(Z.mobilis)的乙醇生产的有害效应。
实例3
使用啤酒花酸处理的运动发酵单胞菌(Z.mobilis)种子作为水解产物培养基种菌 的效应
来自实例2(F1074)，在EFT＝18.0小时取样的缺乏啤酒花酸的一部分培养物被用作种子培养物，用于接种10体积％(最终体积)的FRF13玉米棒水解产物(在一般方法中描述)培养基(调节至pH 5.8，+10mM山梨醇)，其在33℃(在EFT＝22小时时降至30℃)和pH 5.8(用4N NaOH调节)下发酵。在发酵期间定期分析培养基样品，并且结果显示于图4中(运行F1076)。在45.8小时的发酵后，形成了26.3g/L的乳酸(图4A)和31.4g/L的乙醇(图4B)。也有显著量的木糖未被消耗(图5B)。
在一个平行实验中，在18.0小时取样的带有25ppm Iso-Extract-30％(实例2；F1075)的一部分培养物用作利用相同条件发酵的种子培养物。在发酵期间定期分析培养基样品，并且结果显示于图4中(运行F1077)。在发酵45.7小时后，已经形成了66.6g/L乙醇(图4B)，仅有1.3g/L乳酸(图4A)，显示向故意污染的种子中添加小剂量 Iso-Extract-30％足以阻止种子-接种的水解产物发酵的污染。在这个运行中，与运行F1076相比，葡萄糖利用更快速(图5(A))并且木糖利用更完全(图5(B))。在种子中包含的啤酒花酸允许在玉米棒水解产物培养基中较好地利用葡萄糖和木糖，并且提高了乙醇产量。
实例4
在运动发酵单胞菌(Z.mobilis)水解产物中的啤酒花酸效果
为了确定在 Iso-Extract-30％中用于阻止乳酸在水解产物培养基中形成所需的啤酒花酸剂量，使用来自实例2(F1074)，在EFT＝18.0小时取样的在无啤酒花酸条件下生长的一部分故意污染的培养物作为种子培养物，用于接种10体积％(最终体积)的FRF13玉米棒水解产物(在一般方法中描述)培养基(调节至pH 5.8，+10mM山梨醇)。向一个培养物(运行F1078)添加25ppm Iso-Extract-30％(7.5ppm异-α酸)，并且另一个培养物(运行F1076)不添加啤酒花酸制剂。培养物随后在33℃(在EFT＝21小时时降至30℃)和pH 5.8(用4N NaOH调节)条件下发酵。
为了研究较高浓度的 Iso-Extract-30％，以与如上所述相似的方式制备类似于F1074的种子培养物并用于接种FRF13玉米棒水解产物，在存在100、500、或2500ppm Iso-Extract-30％的条件下(分别为30、150、或750ppm异-α酸；运行F1084-1086)。在发酵期间定期分析培养基样品，并且结果显示于图6中。大量(＞在44.7小时为20g/L)乳酸在包含0、25、和100ppm Iso-Extract-30％(分别等同于0、7.5、30ppm异-α酸)的培养基中产生。包括500ppm Iso-Extract-30％(150ppm异-α酸)将在44.7小时时的乳酸形成减少至2.5g/L。包括2500ppm Iso-Extract(750ppm iso-α酸)将乳酸浓度保持在少于1g/L，示出在水解产物发酵的污染生物控制方面对较高浓度啤酒花酸的需求。在包含500或2500ppm Iso-Extract的运行中，在48.7小时的乙醇浓度高于70g/L，而较低剂量的运行在相同时间具有＜40g/L的乙醇浓度(图6(B))，这进一步示出在抗污染和改善污染批中的乙醇生产方面对较高浓度啤酒花酸的需求。

Claims (10)

1.一种发酵液组合物，所述发酵液组合物包含：
a) 发酵培养基；
b) 啤酒花酸；和
c) 发酵单胞菌（Zymomonas）细胞的生长群体;
其中所述啤酒花酸以至少500ppm的浓度存在于所述发酵液中。
2.根据权利要求1所述的发酵液，其中乳酸的浓度小于5g/L。
3.根据权利要求1所述的发酵液，其中所述发酵培养基缺乏纤维素类生物质水解产物。
4.根据权利要求1所述的发酵液，其中所述发酵培养基包含纤维素类生物质水解产物。
5.一种利用发酵单胞菌细胞生物催化剂来控制发酵中的细菌污染的方法，所述方法包括：
a) 提供发酵培养基；
b) 向所述发酵培养基添加啤酒花酸；
c) 向所述发酵培养基添加发酵单胞菌细胞的种菌，从而产生发酵液；以及
d) 将所述发酵液维持在适合所述发酵单胞菌细胞的生长的条件下；
其中所述啤酒花酸以至少500ppm的浓度存在于所述发酵液中，并且从而控制细菌污染。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述发酵单胞菌细胞在所述发酵液中产生乙醇。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述发酵培养基缺乏纤维素类生物质水解产物。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述发酵培养基包含纤维素类生物质水解产物。
9.一种生产乙醇的方法，所述方法包括：
a) 提供发酵培养基；
b) 向所述发酵培养基添加在啤酒花酸的存在下生长的发酵单胞菌细胞的种菌，从而产生发酵液；以及
c) 将所述发酵液维持在适合所述发酵单胞菌细胞的生长和通过所述发酵单胞菌细胞产生乙醇的条件下；
其中所述啤酒花酸以至少500ppm的浓度存在于所述发酵液中，并且其中没有啤酒花酸独立于（b）的种菌被添加到所述发酵培养基，并且其中产生乙醇。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述发酵培养基包含纤维素类生物质水解产物或缺乏纤维素类生物质水解产物。
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