CN103717734A - 酶功能改变方法及其突变体 - Google Patents

酶功能改变方法及其突变体 Download PDF

Info

Publication number
CN103717734A
CN103717734A CN201280030627.0A CN201280030627A CN103717734A CN 103717734 A CN103717734 A CN 103717734A CN 201280030627 A CN201280030627 A CN 201280030627A CN 103717734 A CN103717734 A CN 103717734A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
protein
sequence
dna
sequence number
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280030627.0A
Other languages
English (en)
Inventor
吉田慎一
平良俊一
西八条正克
野尻增俊
川野茂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kaneka Corp
Original Assignee
Kaneka Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corp filed Critical Kaneka Corp
Publication of CN103717734A publication Critical patent/CN103717734A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C07H19/207—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids the phosphoric or polyphosphoric acids being esterified by a further hydroxylic compound, e.g. flavine adenine dinucleotide or nicotinamide-adenine dinucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/36—Dinucleotides, e.g. nicotineamide-adenine dinucleotide phosphate
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的课题为提供变换中链脱氢酶/还原酶（MDR）家族酶的辅酶依赖性的酶改变方法。此外，本发明的课题为提供通过该改变方法转换辅酶依赖性的MDR家族酶突变体，以及提供应用该酶来以酶法制造光学活性醇的方法。本发明开发新的变换MDR家族酶的辅酶依赖性的酶改变方法，通过该酶改变方法，从将NADH作为辅酶利用的有用的MDR家族酶，合理地设计了将NADPH作为辅酶利用的酶突变体，并提供实际上具有这样的功能的突变体。

Description

酶功能改变方法及其突变体
技术领域
本发明涉及醇脱氢酶的辅酶依赖性的改变方法，特别是中链脱氢酶/还原酶（MDR：Medium-chain Dehyrdrogenase/Reductase）的辅酶依赖性的改变方法。
背景技术
一般而言，在使用了氧化还原酶的光学活性醇类的制造中辅酶是必要的，因此为了避免因反应进行而引起的辅酶枯竭，与氧化还原并行而进行辅酶的有效率的再生是重要的课题。作为光学活性醇类的制造中必要的辅酶，可举出还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH，其中，将氧化型记为NADP+）或者还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，其中，将氧化型记为NAD+）等的吡啶核苷酸辅酶。作为将这些辅酶再生的方法，例如，周知使用葡萄糖脱氢酶（GDH）、甲酸脱氢酶（FDH）等的方法。
以往，尽管存在具有优异的物性（稳定性、耐溶剂性、耐氧化性）、比活性的醇脱氢酶，但是其辅酶依赖性未被最优化，即使将NADPH或者NADH中的任一个再生，光学活性醇类的生产率也受到限制。考虑如果能够将醇脱氢酶的辅酶依赖性最优化为辅酶再生酶的辅酶依赖性，即NADPH型或NADH型中的任一个，则在光学活性醇等的制造中的工艺最优化会变得容易，能够提供更有效率的制造方法。
通过突变筛选取得辅酶依赖性被转换的酶是需要庞大的劳力的，因此进行了考虑酶的立体结构信息来合理地设计辅酶依赖性被转换的酶突变体的尝试（专利文献1、非专利文献1）。
醇脱氢酶（ADH）也可以说是通过该逻辑设计来取得辅酶依赖性被转换的突变体的代表性酶家族。其中，关于氨基酸残基数是250左右的短链脱氢酶/还原酶（SDR：Short-chain Dehydrogenase/Reductase）家族的酶，近年已报道了成功地进行辅酶依赖性的转换的例子（非专利文献2、非专利文献3）。但是，关于氨基酸残基数为350左右的中链脱氢酶/还原酶（MDR）家族，没有相同的报告例。
专利文献
专利文献1：国际公开第03/004653号小册子
非专利文献
非专利文献1：Penning T.M.等著，“Chem.Rev.”，2001年，第101卷，第3027-3046页
非专利文献2：Machielsen R.等著，“Eng.Life Sci.”，2008年，第9卷，第38-44页
非专利文献3：Zhang R.等著，“Appl.Environ.Microbiol.，2009年，第2176-2183页
发明内容
本发明的课题为将醇脱氢酶对NADPH或NADH中的任一个的依赖性最优化，提高使辅酶再生系统共同作用时的光学活性醇类的生产率。
但是，不可能将种类、同源性不同的酶的逻辑设计直接适应于MDR。进一步地，作为醇脱氢酶，使用由约350个氨基酸残基构成的MDR（中链脱氢酶/还原酶）家族酶的情况下，导入突变的位置的候补即使在导入1个突变的情况下也存在350处，在导入多个突变的情况下会存在庞大数量的候补。进一步地，在各自的位置中，能够向至少19种氨基酸进行置换，从这些无数的候补中鉴别使对辅酶的依赖性转换而成的突变体是非常困难的。
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果开发了新的变换属于MDR（中链脱氢酶/还原酶）家族的酶的辅酶依赖性的酶改变方法，成功地将导入突变的位置从多达350处的候补缩小成4处，且从19种存在的天然氨基酸中确定了最优的氨基酸来作为突变后的氨基酸。由此，成功地从NADH/NAD+依赖性MDR（中链脱氢酶/还原酶）家族酶取得的NADPH/NADP+依赖性酶突变体，并从NADPH/NADP+依赖性MDR（中链脱氢酶/还原酶）家族酶取得NADH/NAD+依赖性酶突变体。
即，本发明涉及：
[1]一种蛋白质，属于中链氧化还原酶家族，并具有选自下述的（a）～（d）中的至少一种氨基酸残基：
（a）与序列号1的Asp-201在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ala或Ser，
（b）与序列号1的Lys-202在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Arg，
（c）与序列号1的Lys-203在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ser，以及，
（d）与序列号1的Ala-206在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys;
[2]根据[1]所述的蛋白质，其由与序列号1所示的氨基酸序列具有85%以上的序列同源性的氨基酸序列构成;
[3]根据[1]或[2]所述的蛋白质，其中，由在序列号1所示的氨基酸序列中导入有选自下述的（e）～（h）中的至少一种突变的氨基酸序列构成：
（e）将Asp-201置换为Ala或Ser，
（f）将Lys-202置换为Arg，
（g）将Lys-203置换为Ser，以及，
（h）将Ala-206置换为Lys;
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的蛋白质，其由序列号2～8中任一项所述的氨基酸序列构成;
[5]由编码[1]～[4]中任一项所述的蛋白质的碱基序列构成的DNA;
[6]一种DNA，选自以下（A）、（B）以及（C）：
（A）由序列号25～31中的任一个所述的碱基序列构成的DNA，
（B）与包含与序列号25～31中的任一个所述的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA，
（C）与序列号25～31中的任一个所述的碱基序列具有85%以上的序列同源性、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA;
[7]一种载体，包含[6]所述的DNA;
[8]一种转化体，是用[7]所述的载体转换宿主细胞而得到的;
[9][8]所述的转化体的培养物;
[10]一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，包括如下工序：用[1]～[5]中任一项所述的蛋白质，使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸进行变换，得到氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸;
[11]一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，包括如下工序：用[1]或[2]所述的蛋白质，变换氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，得到还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸;
[12]一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，通过使还原酶作用于由[10]所述的方法得到的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸来进行;
[13]一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，通过使氧化酶作用于由[11]所述的方法得到的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸来进行;
[14]根据[10]～[13]中任一项所述的制造方法，其特征在于，利用权利要求8所述的转化体或权利要求9所述的培养物;
[15]通过[10]～[14]中任一项所述的制造方法制造的化合物。
由于醇脱氢酶（ADH），特别是中链脱氢酶/还原酶（MDR）家族的辅酶依赖性得到最优化，因此能够提高使辅酶再生系统共同作用时的光学活性醇类的生产率。
作为NADP+还原酶，近年发现物性优异的源自乳酸菌的GDH（国际公开第09/041415号小册子）。但是，源自麦芽糖假丝酵母（Candidamaltosa）的MDR家族酶RMA由于野生型是NADH依赖性的，因此难以将作为NADP+还原酶的源自乳酸菌的GDH用作辅酶再生酶。与此相对，如果是通过辅酶依赖性的转换而得到的本发明的蛋白质，则能够将源自乳酸菌的作为NADP+还原酶的GDH用作辅酶再生酶，制造工艺构建上的优点极其大。
此外，在将利用NADPH/NADP+依赖性酶的反应和利用NADH/NAD+依赖性酶的反应在一个反应溶液中实施的多阶段反应的情况下，能够改变辅酶依赖性，因此本技术达到反应工艺最优化的优点很大。
附图说明
图1为本发明的实施例4涉及的反应示意图。
图2为示出本发明的实施例4涉及的反应中的光学活性醇的变换率和光学纯度的分析结果的图。
具体实施方式
本说明书中，“蛋白质”这一术语是包含具有多肽结构的所有分子的物质，被片段化或通过肽键连接的多肽链也被包含在“蛋白质”这一术语中。
本发明的蛋白质是通过对属于中链脱氢酶/还原酶家族的蛋白质导入氨基酸置换突变而得到的。中链脱氢酶/还原酶（Medium-chainDehydrogenase/Reductase，MDR）家族是属于醇脱氢酶（ADH，EC1.1.1.1.）的家族之一，由350～375个残基构成，基本都含有锌（Zn）。中链脱氢酶/还原酶家族由各种生物信息学数据库（Bioinformaticsdatabase）进行了登记·分类·定义。例如，与Pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/）的家族ID“PF00107”相关联的酶全部属于中链脱氢酶/还原酶家族，在2011年4月这一时间点，超过20000个的序列得到登记。属于中链脱氢酶/还原酶家族的酶参与醇发酵、醛解毒、木质素的生物合成、脂肪酸的生物合成或免于氧化损伤的保护等广泛的生理功能。
就属于中链脱氢酶/还原酶家族的蛋白质而言，作为辅酶的吡啶核苷酸是必要的。所谓吡啶核苷酸是指β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（将还原型记为NADPH，将氧化型记为NADP+）或β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（将还原型记为NADH，将氧化型记为NAD+）。
此外，即使是新发现的未登记的序列，如果与中链脱氢酶/还原酶家族酶的序列同源性高，则也被分类为中链脱氢酶/还原酶家族酶。“序列同源性”是能够通过前述的使用了PROGRAM BLAST的氨基酸序列同源性解析来确定的。在BLAST分析中评价同源性时，可使用E-value这一统计值，同源性越高，该数值越无限接近于0。从序列同源性判断是否是MDR家族酶时，相对于公知的MDR家族酶，E-value优选为1×10-5以下，更优选为1×10-10以下，进一步优选为1×10-15以下。用于实施BLAST分析的软件可通过National Center for BiotechnologyInformation（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行利用。
作为成为导入氨基酸置换突变的对象的中链脱氢酶/还原酶家族酶，优选为蛋白质序列数据库UniProtKB（http：//www.uniprot.org/）收载的酶。作为能够应用变换成NADPH/NADP+依赖性的技术的NADH/NAD+依赖性中链脱氢酶/还原酶家族酶，例如可举出源自酵母的ADH1（P00330）、源自芽孢杆菌的ADH-HT（P42328）以及源自人的ADH1β（P00325）等。同样地，作为能够应用变换成NADH/NAD+依赖性的技术的NADPH/NADP+依赖性MDR家族酶，例如可举出源自酵母的ADH6（Q04894）、源自美国白杨的芥子（sinapyl）ADH（Q94G59）以及源自人的PIG3（Q53FA7）等。应予说明，括号内是前述数据库中的编码号码。
突变导入前的蛋白质优选为由相对于源自麦芽糖假丝酵母（Candida maltosa）的被包含在MDR家族中的酶（国际公开第08/066018号小册子，以下简写为RMA），具有高的序列同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。“序列同源性”是在相同的区域中完全一致的氨基酸残基数所占的比例，可通过前述的BLAST分析求出，由“Identities”标记。
突变导入前的蛋白质相对于序列号1的氨基酸序列的序列同源性优选为85%以上，更优选为90%以上，进一步优选为95%以上。突变导入前的蛋白质最优选为由序列号1的氨基酸序列构成的蛋白质，该蛋白质是源自麦芽糖假丝酵母（Candida maltosa）的MDR家族酶（国际公开第08/066018号小册子，以下简写为RMA）。RMA例如将NADH作为辅酶，将酮还原，催化生成光学活性醇的反应。在由序列号1的氨基酸序列构成的蛋白质（RMA）中导入氨基酸置换突变而设计本发明的蛋白质的情况下，能够将辅酶依赖性从NADH依赖性转换为NADPH依赖性。本发明是通过利用该RMA（序列号1）的模拟立体结构而实现的。
在立体结构上同等位置的氨基酸残基是指，基于氨基酸序列信息来预测突变导入前的蛋白质的立体结构，与由序列号1的氨基酸序列构成的蛋白质的立体结构进行比较时，与由序列号1的氨基酸序列构成的蛋白质中同等的位置存在的氨基酸残基。
以下，例示使用序列号1作为突变导入前的蛋白质时的氨基酸置换突变的逻辑设计方法。RMA的立体结构的逻辑设计可通过利用RMA的模拟立体结构来实现。应予说明，关于由序列号1所示的野生型RMA，未进行以X射线晶体结构分析为首的结构解析等实验，其立体结构是未知的。
基于RMA的氨基酸序列信息，利用Program ClustalX（Thompson、J.D.等著，“Nucleic Acid Res.”，1994年，第22卷，第4673-80页），完成与具有氨基酸序列同源性且立体结构被登记在蛋白质数据库（ProteinData Bank，PDB)的酶的多重氨基酸序列比对。与RMA具有氨基酸序列同源性的蛋白质能够通过如下方式进行选择，即，以被登记在PDB的蛋白质的氨基酸序列为对象，使用PROGRAM BLAST（Altschul，S.F.等著，“Nucleic Acid Res.”1997年，第25卷，第3389-3402页）或PSI-BLAST（Shaffer A.A.等著，“Bioinfomatics”，2000年，第164卷，第88-489页）进行氨基酸序列同源性的检索。
接下来，这些立体结构已知的蛋白质的三元立体结构比对可通过Swiss-PDBViewer（Guex N.等著，“Electrophoresis”，1997年，第18卷，2714-2723）等的三维绘图程序、VAST Search（Gibrat J.F.等著，“Curr.Opin.Struct.Biol.”，1996年，第6卷，377-）等的立体结构比较·类似结构检索服务器进行。首先将仅由氨基酸序列得到的多重比对，基于立体结构的类似性进行修正，将以得到的序列比对为基础被推定为立体结构的类似性高的蛋白质的立体结构（PDB编码：1LLU）作为分子模拟的模板蛋白质进行选择。使该模板蛋白质由Program SwissPDB-Viewer表示，按照序列比对，以适于RMA的氨基酸序列（序列号1）的方式进行氨基酸残基的置换。关于插入、缺失部位，从PDB检索最优的类似部分结构，置换为该部分结构，从而构建立体结构模型。
以该立体结构模型为基础，以辅酶结合口袋周围为中心，确定被预测为对与辅酶的结合产生较大影响、且对辅酶结合性以外的功能几乎没有影响的被预测部位（残基）。接下来，通过使NADH以及NADPH虚拟对接的立体结构的模型构建、以及利用了该对接结构的计算化学方法进行的自由能计算，设计对NADH的亲和性降低且对NADPH的亲和性变高的突变。一般而言，关于酶（蛋白质）和辅酶（底物）复合体的稳定性，能够根据自由能进行讨论（A.R.Leach著，“分子模拟概论”，2004年，第11章）。
若利用分子模拟结构（主链的骨架），则能够通过利用了分子力场法的分子模拟计算（能量极小化计算）来算出辅酶不结合的状态（apo）与辅酶结合的状态（holo）的自由能差分值。该逻辑的详细情况可以说是设计与目标蛋白质结合的药物的方法的应用。LBDD配体·基的自由能差与野生型相比，在NADH的情况下对apo有利，且在NADPH的情况下对holo有利这一趋势特别强的突变可以说对转换辅酶依赖性是有用的。具体地，通过使用Program Shrike（日本特许公开第2001-184381号公报）的计算机筛选，进行氨基酸突变候补的缩小。
通过上述方法，能够提取在由350个左右残基构成的MDR（中链脱氢酶/还原酶）家族酶中的对辅酶的识别重要的部位，且能够发现为了获得作为目标的辅酶依赖性而最优的各部位的氨基酸的种类（及其组合）。在MDR（中链脱氢酶/还原酶）家族酶中，容易确定与序列号1的第201位、第202位、第203位或第206位在立体结构上同等的位置。利用前述的VAST Search等立体结构比较·类似结构检索服务器，进行立体结构已知的氨基酸序列（例如，本次发明中使用的PDB编码：1LLU的氨基酸序列）与以立体结构为基础的氨基酸序列的比对，从而能够容易地鉴定在立体结构上同等的位置。该VAST Search也能够通过美国生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）进行利用。
本发明的蛋白质优选属于中链脱氢酶/还原酶家族，并具有选自下述（a）～（d）中的至少一种氨基酸残基：
（a）与序列号1的Asp-201在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ala或Ser，
（b）与序列号1的Lys-202在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Arg，
（c）与序列号1的Lys-203在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ser，以及，
（d）与序列号1的Ala-206在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys。
进一步地，更优选属于中链脱氢酶/还原酶家族，并包含下述（e）～（g）中的全部氨基酸残基：
（e）与序列号1的Asp-201在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ser，
（f）与序列号1的Lys-202在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Arg，以及，
（g）与序列号1的Ala-206在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys。
通过上述（a）～（d）或（e）～（g）的突变导入，能够将辅酶依赖性是NADH（或NAD+）依赖性的醇脱氢酶转换为NADPH（或NADP+）依赖性。
突变导入后的蛋白质相对于序列号1的氨基酸序列的序列同源性优选为85%以上，更优选为90%以上，进一步优选为95%以上。具体而言，突变导入后的蛋白质优选具有序列号2～8所示的氨基酸序列，更优选具有序列号2～3所示的氨基酸序列。
此外，本发明的蛋白质优选具有醇脱氢活性，并具有选自下述（i）～（l）中的至少一种氨基酸残基：
（i）与序列号1的Asp-201在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Asp，
（j）与序列号1的Lys-202在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys，
（k）与序列号1的Lys-203在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys，以及，
（l）与序列号1的Ala-206在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ala。
通过上述（i）～（l）的突变导入，能够将辅酶依赖性是NADPH（或NADP+）依赖性的醇脱氢酶转换为NADH（或NAD+）依赖性。
本发明的蛋白质优选相对于突变导入前显示高氧化（或还原，以后简写为“氧化/还原”）活性的辅酶的氧化/还原活性降低。或者，优选相对于突变导入前显示低的氧化/还原活性（或完全不显示）的辅酶的氧化/还原活性提高。进一步地，本发明的蛋白质更优选具有这两方的特征。
所谓辅酶氧化/还原活性比是指，将突变导入后显示依赖性的辅酶的氧化/还原活性，用突变导入前显示依赖性的其他的辅酶的氧化/还原活性去除而得的值。例如，RMA的情况下，辅酶氧化/还原活性比由氧化活性比（NADPH/NADH）表示。辅酶氧化/还原活性比优选为1以上，更优选为5以上，进一步优选为10以上。在希望仅将突变导入后显示依赖性的辅酶有选择地氧化/还原的情况下，可要求严密的辅酶选择性，因此进一步更优选为20以上，在要求更严密的辅酶选择性的情况下，最优选30以上。例如，同时进行利用烟酰胺辅酶依赖性的酶的两个反应时，在相互的酶的辅酶依赖性不同的情况下，通常要求严密的选择性。应予说明，突变导入前的辅酶氧化/还原活性比即使很高，也为0.1左右，如果大于该值，则原本就是在两方显示依赖性的酶。
辅酶氧化/还原活性，在RMA的情况下，是将在1分钟内将1μmol的NADPH（或NADH）氧化为NADP+(NAD+)的酶活性定义为1个单位而算出的。在突变导入前后，为了算出辅酶氧化/还原活性的反应液组成、酶浓度设为相同条件。辅酶氧化/还原活性的测定条件，在RMA的情况下，优选为pH4.0～10.0、温度为4℃～80℃的一定温度下，一定时间的通气搅拌处理的条件，但是也可以考虑组合的辅酶再生酶的物性来进行设定，并不受到这些条件的限制。本发明的蛋白质若除去辅酶依赖性被转换的特征，则维持例如底物特异性等本来的功能。
本发明的DNA是由编码本发明的蛋白质的碱基序列构成。只要是按照后述的方法，在被导入的宿主细胞内能表达本发明的蛋白质的DNA，就可以为任意的DNA，也可以包含任意的非翻译区域。只要能够设计蛋白质，就能够通过由作为导入突变前的蛋白质的起源的生物，按照本领域技术人员公知的方法取得导入突变前的DNA并导入突变，从而取得本发明的DNA。
向编码野生型MDR家族酶的DNA进行的部位特异性突变的导入，能够使用重组DNA技术、PCR法等进行。利用重组DNA技术的突变的导入，在野生型酶基因中的希望导入突变的目标部位的两侧存在适当的限制酶识别序列的情况下，能够通过盒式突变法进行，所述盒式突变法为用前述制限酶切断此处，将包含希望导入突变的部位的区域除去后，利用化学合成等仅在目标部位插入导入突变的DNA片段。此外，利用PCR进行的部位特异性突变的导入是通过如下方式进行的，即，用在野生型编码基因中的希望导入突变的目标部位导入了目标突变的突变引物和不具有包含前述基因的一个末端部位的序列的突变的扩增用引物来扩增前述基因的单侧，用具有相对于前述突变用引物互补的序列的突变用引物和不具有包含前述基因的另一个末端部位的序列的突变的扩增用引物来扩增另一侧，将得到的两个扩增片段进行退火操作，然后进一步地用前述2种扩增用引物进行PCR操作。除了这些重组DNA技术、PCR法之外，也可以通过化学合成来取得编码导入了突变的氨基酸序列的DNA。
作为这样得到的编码本发明的蛋白质的DNA，例如，可举出由序列号25～31中的任一个所述的碱基序列构成的DNA。
此外，作为本发明的DNA，可举出与包含与序列号25～31中的任一个所述的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA。
此外，作为本发明的DNA，可举出与序列号25～31中的任一个所述的碱基序列具有85%以上的序列同源性、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA。
此处，“与包含与序列号25～31中的任一个所述的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA”是通过将包含与序列号25～31中的任一个所述的碱基序列互补的碱基序列的DNA作为探针，在严格条件下使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或者SOUTHERN杂交法等而得到的DNA，且是指编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的DNA。
杂交可按照Molecular Cloning，A laboratory manual，secondedition（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）等中记载的方法进行。此处，“严格条件下杂交的DNA”可举出，例如通过如下方法取得的DNA，即，通过使用将源自菌落或者噬菌斑的DNA进行了固定化的过滤器，在0.7～1.0M的NaCl存在的条件下、65℃时进行杂交之后，使用2倍浓度的SSC溶液（1倍浓度的SSC溶液的组成由150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠构成），65℃的条件下，清洗过滤器而取得DNA。优选65℃时以0.5倍浓度的SSC溶液清洗，更优选65℃时以0.2倍浓度的SSC溶液清洗，进一步优选65℃时以0.1倍浓度的SSC溶液清洗而取得的DNA。
虽然记在了以上这样的杂交条件，但是本发明并不特别局限于这些条件。作为对杂交的严格性造成影响的要素，可考虑温度、盐浓度等多个要素，只要是本领域技术人员，就能够对这些要素进行适宜选择来实现最优的严格性。
作为通过上述条件能够杂交的DNA，可举出与序列号25～31中的任一个所述的碱基序列的序列同源性是85%以上，优选90%以上，更优选95%以上的DNA，被编码的多肽只要具有氧化还原酶活性，就被包括在上述DNA中。
此处，“序列同源性（%）”是由使被对比的两个DNA进行最优地比对排列，将核酸碱基（例如、A、T、C、G、U或I）在两个序列中一致的位置的数量用比较碱基的总数去除，然后将该结果乘以100而得到的数值表示。
本发明的载体可以通过将本发明的DNA插入适当的载体而得到。用于插入DNA的空载体，只要在宿主细胞中能够进行自主复制，就无特别限制，可将质粒DNA或噬菌体DNA作为载体使用。例如，在使用大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，可使用pBR322、pUC18、pBluescriptII等质粒DNA、EMBL3、M13、λgt11等噬菌体DNA等。在使用酵母作为宿主细胞的情况下，可使用YEp13、YCp50等。在使用植物细胞作为宿主细胞的情况下，可使用pBI121、pBI101等，在使用动物细胞作为宿主细胞的情况下，可使用pcDNAI等作为载体。
本发明的转化体可通过使用上述载体转化宿主细胞而得到。宿主生物，只要是能够由包含编码DNA的表达载体进行转化，将导入的DNA编码的蛋白质进行表达的生物，就无特别限制。作为能够利用的微生物，例如，可举出大肠埃希氏菌属（Escherichia）、芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）属、沙雷氏菌属（Serratia）、短杆菌属（Brevibacterium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、链球菌属（Streptococcus）以及乳杆菌属（Lactobacillus）等宿主载体系统中被开发的细菌；红球菌属（Rhodococcus）以及链霉菌属（Streptomyces）等宿主载体系统中被开发的放线菌；酵母菌属（Saccharomyces）、克鲁维氏酵母属（Kluyveromyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）属、接合酵母属（Zygosaccharomyces）属、耶氏酵母属（Yarrowia）、丝孢酵母属（Trichosporon）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、毕赤酵母属（Pichia）以及假丝酵母属（Candida）等宿主载体系统中被开发的酵母；脉孢菌属（Neurospora）、曲霉属（Aspergillus）、头孢菌属（Cephalosporium）以及木霉属（Trichoderma）等宿主载体系统中被开发的霉菌等。此外，除了微生物以外，植物、动物中各种宿主·载体系统也正被开发，特别是在使用了蚕的昆虫或菜籽、玉米、土豆等植物中大量开发表达不同种类蛋白质的系统，能够合适地利用。其中，从导入以及表达效率的观点出发，优选细菌，更优选大肠杆菌。
作为转化的方法，向细菌导入重组体DNA的情况下，例如可举出使用钙离子的方法、电穿孔法等。作为向酵母的导入重组体DNA的方法，例如，可举出电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法等。作为向植物细胞导入重组体DNA的方法，可举出农杆菌（Agrobacterium）感染法、基因枪（particle gun）法、聚乙二醇法等。作为向动物细胞导入重组体DNA的方法，例如，可举出电穿孔法、磷酸钙法等。
本发明的培养物可通过将上述转化体在培养基中培养而得到。将转化体在培养基中培养，使蛋白质在培养菌体中或培养上清中生成蓄积，采集前述酶突变体，从而能够得到包含本发明的蛋白质的培养物。
转化体的培养，按照在宿主培养中使用的常规方法进行。作为培养以大肠杆菌等细菌为宿主而得到的转换细胞的培养基，可举出完全培养基或合成培养基，例如，可举出LB培养基、TB培养基、M9培养基等。此外，通过在培养温度20～40℃下进行有氧培养，使本发明的酶突变体在菌体内蓄积并进行回收。酶突变体的精制可通过如下方式进行，即，将通过前述的养法得到的培养物进行离心分离并回收，对细胞用超声波仪等进行破碎，将亲和色谱法、阳离子或阴离子交换色谱法、凝胶过滤等单独或适当组合，从而进行酶突变体的精制。得到的精制物质是目标酶的确认可通过常规方法，例如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹法等进行。转化体的培养物的精制处理是指在不损失酶活性的情况下，将目标酶以外的杂质去除；精制处理物是通过前述处理而得到的含酶物。作为精制处理物，例如可举出通过破碎细胞而得到的无细胞提取液、精制得到的酶溶液、或者酶溶液的冷冻干燥物。
将在具有醇脱氢酶活性的蛋白质导入选自上述（a）～（d）中至少一种的氨基酸置换突变而得到的蛋白质，与置换突变导入前的蛋白质相比较，对NADPH的依赖性提高，对NADH的依赖性降低。因此，使用该蛋白质，能够变换还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），得到氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）。
此外，由于该反应是平衡反应，因此使用该蛋白质，也能够变换氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+），得到还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。
将具有醇脱氢酶活性的蛋白质导入选自上述（i）～（l）中的至少一种的氨基酸置换突变而得到的蛋白质，与置换突变导入前的蛋白质相比较，对NADH的依赖性提高，对NADPH的依赖性降低。因此，使用本发明的蛋白质能够变换还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），得到氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）。
此外，由于该反应是平衡反应，因此使用该蛋白质，也能够变换氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），得到还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。
在本发明的蛋白质的反应系统中通过使辅酶再生系统共同作用，能够提高光学活性醇的生产率。
使用本发明的蛋白质制造的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），通过与辅酶再生系统作用，能够制造还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。这样的辅酶再生系统是具有还原氧化型辅酶的活性的酶，作为具体例，可举出葡萄糖脱氢酶（GDH）、甲酸脱氢酶（FDH）、乳酸脱氢酶（LDH）以及苹果酸脱氢酶（MDH）。
此外，使用本发明的蛋白质制造的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），通过使辅酶再生系统起作用，能够制造氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）。这样的辅酶再生系统是具有将还原型辅酶进行氧化的活性的酶，作为具体例，可举出葡萄糖脱氢酶（GDH）、甲酸脱氢酶（FDH）、乳酸脱氢酶（LDH）以及苹果酸脱氢酶（MDH）。
这些还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、或者氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的制造，可使用上述的转化体及其培养物进行。
实施例
关于置换氨基酸的突变的标记，进行如下标记：在置换位置的序号之前，附上野生型或非突变型的氨基酸，在置换位置序号之后，附上突变的氨基酸。例如，将201位的Asp置换为Ala的突变记为D201A。
（实施例1）包含RMA突变体基因的重组载体的制作以及重组大肠杆菌的制作
为了使源自麦芽糖假丝酵母（Candida maltosa）的MDR（中链脱氢酶/还原酶）家族酶（国际公开第08/066018号小册子，以下简写为RMA）的突变体在大肠杆菌中表达，使用该文献中记载的pNCM载体（RMA野生型表达质粒），制备各种突变体的表达质粒。
关于突变的导入，将pNCM载体作为模板，通过使用以在意图的部位能够导入突变的方式而设计的2种合成引物的Quick Change法，得到包含各种RMA突变体基因的重组质粒。关于Quick Change法，使用QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene公司制），按照添加的程序进行。首先，将pNCM（序列号9）作为模板DNA，应用使用序列号10～11所示的2种合成引物，实施Quick Change法，制备导入突变A206K的RMA突变体表达质粒。得到的表达质粒的编码DNA序列如序列号12所示。应予说明，Quick Change法是转化也包含在实验方案中的突变导入法，本实施例中，转化大肠杆菌HB101（Takara公司制），制作重组大肠杆菌。将包含序列号9（野生型）或序列号12（突变体K206R）的编码DNA的表达质粒作为模板，将序列号13～22的合成引物实施通过与上述同样的方法仅利用了2种的QuickChange法，制备编码序列号2～8的氨基酸序列的各个表达质粒，以及转化的重组大肠杆菌（各个表达质粒的编码DNA序列由序列号25～31示出）。在该实验中，各种突变体表达质粒的氨基酸/编码DNA序列、以及制备时使用的模板DNA质粒/突变导入引物的序列号的对应关系汇总于表1。
突变体表达质粒序列号对应表
[表1]
Figure BDA0000442790100000171
（实施例2）利用重组大肠杆菌进行的RMA突变体的表达·无细胞提取液的制备
将由实施例1得到的各重组大肠杆菌HB101接种于半合成培养基（甘油1.5%（w/v）、酵母提取物0.3%（w/v）、Na2HPO40.6%（w/v）、KH2HPO40.3%（w/v）、NaCl0.2%（w/v）、MgSO4·7H2O0.5%（w/v）、100μg/ml氨苄西林、pH7.2），30℃下培养60小时，将各培养液收集细菌并去除培养上清之后，混悬于与培养基等量的缓冲液（100mM磷酸钾、pH7.0），利用超音波破碎法破碎，通过再次离心来回收上清，得到无细胞提取液。
（实施例3）吡啶核苷酸的氧化活性测定
向加入作为反应底物的酮化合物的下述的溶液中，添加由实施例2得到的含有各种RMA突变体的无细胞提取液，测定这些NADPH氧化活性以及NADH氧化活性。
向有100mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）、5mM NADPH、0.6M2-丁酮（甲基乙基酮，MEK）构成的反应溶液0.95mL中，添加酶溶液0.05mL，测定一定温度（25℃）下的波长340nm的吸光度的减少。将在该反应条件下，1分钟内将1μmol的NADPH氧化为NADP+的酶活性定义为1个单位。应予说明，为了测定的方便，根据需要，以1分钟内340nm的吸光度的减少成为0.1～0.4左右的方式，将无细胞提取液用上述磷酸钾缓冲液稀释后，作为酶溶液使用，考虑稀释倍率，算出酶活性。此外，上述反应中，仅将反应溶液的NADPH变换为NADH，之后通过同样的测定，也可求出将NADH氧化为NAD+的酶活性。
这些测定结果如表2所示。应予说明，氧化活性值用与野生型RMA的相对值（%）进行标记。各种RMA突变体相对于突变导入前显示高氧化活性的NADH的氧化活性降低为50分之1～500分之1左右，且相对于突变导入前显示低氧化活性的NADPH的氧化活性增加10倍～50倍左右。导入突变前为0.003左右的氧化活性比（NADPH/NADH）在导入突变后升高至100～2000倍左右。
RMA突变体的辅酶氧化活性
[表2]
Figure BDA0000442790100000181
（实施例4）利用RMA突变体进行的酮还原反应中NADPH再生循环的构建
使用RMA突变体（D201S/K202R/A206K，序列号2），进行将2-丁酮还原为（S）-2-丁醇（S-MEH）的反应。该反应系统中，NADPH被氧化为NADP+，改反应系统中，添加源自乳酸菌的NADP+依赖性GDH（GDHLP，国际公开第09/041415号小册子）和作为其底物的葡萄糖，使NADPH再生的循环同时进行反应。该酶反应的反应式（NADPH再生循环）如图1所示。源自乳酸菌的NADP+依赖性GDH的酶液通过与国际公开第09/041415号小册子记载的方法相同的方法制备。
反应液组成如以下所述。
[表3]
Figure BDA0000442790100000191
按照上述记载的顺序进行添加，30℃、pH5.5（使用NaOH控制下限）下反应35小时。反应产物的分析使用气相色谱法的方法实施。作为气相色谱法装置，利用SIMAZU GC-14B（株式会社岛津制作所制)。使用TC-WAX（GL Sciences株式会社制）分析向S-MEH的变换率，使用Cyclodex-β（Agilent Technology株式会社制）分析S-MEH的光学纯度。
分析系统的条件如以下所述。
［向S-MEH的变换率：气相色谱法分析条件］
柱：TC-WAX（60m×0.25mm）
检测：FID
氢：50kPa
柱温：50℃
注入温度：200℃
检测温度：200℃
载气：氦（300kPa）
洗脱时间：2-丁酮（MEK）4.8分钟
2-丁醇（MEH）7.1分钟
［S-MEH的光学纯度：气相色谱法分析条件］
柱：Cyclodex-β（60m×0.25mm）
检测：FID
氢：50kPa
柱温：35℃
注入温度：150℃
检测温度：150℃
载气：氦（300kPa）
洗脱时间：2-丁酮MEK6.5分钟
（R）-2-丁醇（R-MEH）11.0分钟
（S）-2-丁醇（S-MEH）11.4分钟
图2中示出分析结果。从反应开始4小时，变换率达到97.1%，此时的光学纯度是99.7%。由该结果示出：通过利用由本发明得到的RMA突变体，可利用物性优异的源自乳酸菌的NADP+依赖性GDH作为辅酶再生系统，实际上，仅将昂贵的NADPH以催化剂量加入，就能够生产目标光学活性醇。
（比较例1）野生型RMA
关于野生型RMA（序列号1），使用用于模板的表达质粒（pNCM载体），转化大肠杆菌HB101（Takara公司制），制作重组大肠杆菌。通过与实施例2相同的方法制备无细胞提取液，仿照实施例3，实施吡啶核苷酸的氧化活性测定。关于测定结果，在表2中一并进行记载。
Figure IDA0000442790160000011
Figure IDA0000442790160000021
Figure IDA0000442790160000041
Figure IDA0000442790160000051
Figure IDA0000442790160000061
Figure IDA0000442790160000071
Figure IDA0000442790160000081
Figure IDA0000442790160000091
Figure IDA0000442790160000101
Figure IDA0000442790160000111
Figure IDA0000442790160000121
Figure IDA0000442790160000141
Figure IDA0000442790160000151
Figure IDA0000442790160000161
Figure IDA0000442790160000171

Claims (15)

1.一种蛋白质，属于中链脱氢酶/还原酶家族，并具有选自下述的（a）～（d）中的至少一种氨基酸残基：
（a）与序列号1的Asp-201在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ala或Ser，
（b）与序列号1的Lys-202在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Arg，
（c）与序列号1的Lys-203在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ser，以及，
（d）与序列号1的Ala-206在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其由与序列号1所示的氨基酸序列具有85%以上的序列同源性的氨基酸序列构成。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其中，由在序列号1所示的氨基酸序列中导入有选自下述的（e）～（h）中的至少一种突变的氨基酸序列构成：
（e）将Asp-201置换为Ala或Ser，
（f）将Lys-202置换为Arg，
（g）将Lys-203置换为Ser，以及，
（h）将Ala-206置换为Lys。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的蛋白质，其由序列号2～8中任一项所述的氨基酸序列构成。
5.由编码权利要求1～4中任一项所述的蛋白质的碱基序列构成的DNA。
6.一种DNA，选自以下（A）、（B）以及（C）：
（A）由序列号25～31中的任一个所述的碱基序列构成的DNA，
（B）与包含与序列号25～31中的任一个所述的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA，
（C）与序列号25～31中的任一个所述的碱基序列具有85%以上的序列同源性、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA。
7.一种载体，包含权利要求5或6所述的DNA。
8.一种转化体，是用权利要求7所述的载体转化宿主细胞而得到的。
9.权利要求8所述的转化体的培养物。
10.一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，包括如下工序：用权利要求1～4中任一项所述的蛋白质，使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸进行变换，得到氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
11.一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，包括如下工序：用权利要求1或2所述的蛋白质，使氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸进行变换，得到还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
12.一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，通过使还原酶作用于由权利要求10所述的方法得到的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸来进行。
13.一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，通过使氧化酶作用于由权利要求11所述的方法得到的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸来进行。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的制造方法，其特征在于，利用权利要求8所述的转化体或权利要求9所述的培养物。
15.通过权利要求10～14中任一项所述的制造方法制造的化合物。
CN201280030627.0A 2011-06-28 2012-06-27 酶功能改变方法及其突变体 Pending CN103717734A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011143423 2011-06-28
JP2011-143423 2011-06-28
PCT/JP2012/066418 WO2013002277A1 (ja) 2011-06-28 2012-06-27 酵素機能改変方法及びその変異体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103717734A true CN103717734A (zh) 2014-04-09

Family

ID=47424167

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280030627.0A Pending CN103717734A (zh) 2011-06-28 2012-06-27 酶功能改变方法及其突变体

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9416350B2 (zh)
EP (1) EP2728001A4 (zh)
JP (1) JPWO2013002277A1 (zh)
CN (1) CN103717734A (zh)
WO (1) WO2013002277A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690629A (zh) * 2020-05-29 2020-09-22 浙江工业大学 一种内切葡聚糖苷酶突变体、基因、工程菌及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434612B (zh) * 2016-10-21 2020-01-17 江南大学 一种天冬酰胺酶突变体及其应用
CN109593748B (zh) * 2017-10-01 2022-03-04 宁波酶赛生物工程有限公司 工程化脱羧酶多肽及其在制备β-丙氨酸中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008066018A1 (en) * 2006-11-29 2008-06-05 Kaneka Corporation Novel alcohol dehydrogenase, gene for the alcohol dehydrogenase, vector, transformant, and method for production of optically active alcohol by using them
CN101407780B (zh) * 2008-08-30 2010-08-25 江南大学 利用定点突变改变辅酶特异性和立体选择性制备(r)-苯基乙二醇的方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05103697A (ja) 1991-10-17 1993-04-27 Toyobo Co Ltd アンモニウムイオン消去用組成物
US5334507A (en) 1991-09-20 1994-08-02 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Composition for measurement of potassium ion concentration and composition for elimination of ammonium ions
JP3574682B2 (ja) 1993-09-24 2004-10-06 ダイセル化学工業株式会社 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法
JPH08196281A (ja) 1995-01-30 1996-08-06 Nippon Paint Co Ltd 水生成型ｎａｄｈオキシダーゼをコードするｄｎａ
JP3964087B2 (ja) 1999-12-24 2007-08-22 株式会社カネカ 多重変異蛋白質アミノ酸配列の最適化解を算出する方法、装置、およびこの方法の処理を実行するプログラムを記憶する記憶媒体
US20040248250A1 (en) 2001-07-02 2004-12-09 Takahisa Nakai Method for modifying enzyme and oxidoreductive variant
DE10140088A1 (de) 2001-08-16 2003-03-13 Degussa NADH-Oxidase aus Lactobacillus
JP4257568B2 (ja) 2001-12-05 2009-04-22 東洋紡績株式会社 生体成分の測定方法およびそれに用いる試薬組成物
AU2003257438A1 (en) 2002-07-20 2004-02-09 Degussa Ag Two-phase alcohol dehydrogenase-based coupled enzymatic reaction system
JP2005102511A (ja) 2003-09-26 2005-04-21 Kaneka Corp 新規アルコール脱水素酵素、その遺伝子
JPWO2006013802A1 (ja) 2004-08-06 2008-05-01 株式会社カネカ エナンチオマー豊富化化合物の製造方法
WO2006033333A1 (ja) 2004-09-24 2006-03-30 Kaneka Corporation アルドン酸類の製造方法およびアルドース脱水素酵素
US20080038803A1 (en) 2005-02-25 2008-02-14 Akira Iwasaki Process for Producing Optically Active Secondary Alcohol
US9303280B2 (en) 2007-09-26 2016-04-05 Kaneka Corporation DNA coding for a novel glucose dehydrogenase
WO2011090054A1 (ja) * 2010-01-20 2011-07-28 株式会社カネカ 安定性が向上したｎａｄｈオキシダーゼ変異体とその利用法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008066018A1 (en) * 2006-11-29 2008-06-05 Kaneka Corporation Novel alcohol dehydrogenase, gene for the alcohol dehydrogenase, vector, transformant, and method for production of optically active alcohol by using them
CN101407780B (zh) * 2008-08-30 2010-08-25 江南大学 利用定点突变改变辅酶特异性和立体选择性制备(r)-苯基乙二醇的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDER E. SEROV等: "Engineering of coenzyme specificity of formate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae", 《BIOCHEM. J.》 *
GEORGE A. KHOURY等: "Computational design of Candida boidinii xylose reductase for altered cofactor specificity", 《PROTEIN SCIENCE》 *
董莉莉等: "毕赤酵母木糖还原酶定点突变改善其对双辅酶的亲和力", 《中国生物化学与分子生物学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690629A (zh) * 2020-05-29 2020-09-22 浙江工业大学 一种内切葡聚糖苷酶突变体、基因、工程菌及其应用
CN111690629B (zh) * 2020-05-29 2022-04-19 浙江工业大学 一种内切葡聚糖苷酶突变体、基因、工程菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013002277A1 (ja) 2013-01-03
US9416350B2 (en) 2016-08-16
EP2728001A4 (en) 2015-05-27
JPWO2013002277A1 (ja) 2015-02-23
US20140256930A1 (en) 2014-09-11
EP2728001A1 (en) 2014-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101535476B (zh) 修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶
Deng et al. Redirecting carbon flux through exogenous pyruvate kinase to achieve high ethanol yields in Clostridium thermocellum
Nie et al. Novel anti-Prelog stereospecific carbonyl reductases from Candida parapsilosis for asymmetric reduction of prochiral ketones
Hatrongjit et al. A novel NADP+-dependent formate dehydrogenase from Burkholderia stabilis 15516: screening, purification and characterization
US11655478B2 (en) Promoter derived from organic acid-resistant yeast and method for expression of target gene by using same
KR20110006698A (ko) 박테리움 아크로모박터 자일로족시단스로부터의 부탄올 데하이드로게나제 효소
CN103981158A (zh) 突变酶及其用途
WO2010053161A1 (ja) 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
CN104093836B (zh) 烃合成酶基因及其利用
CN105936909A (zh) 一种醇脱氢酶及其基因、重组酶和合成手性双芳基仲醇的应用
Yamamoto et al. Cloning and expression in Escherichia coli of a gene coding for a secondary alcohol dehydrogenase from Candida parapsilosis
US9422583B2 (en) Stereospecific carbonyl reductases
CN103717734A (zh) 酶功能改变方法及其突变体
CN110396509B (zh) 改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法及其应用
Obradors et al. Site‐directed mutagenesis studies of the metal‐binding center of the iron‐dependent propanediol oxidoreductase from Escherichia coli
EP2357222B1 (en) Scyllo-inositol-producing cell and scyllo-inositol production method using said cells
Yamamoto et al. Novel chiral tool,(R)-2-octanol dehydrogenase, from Pichia finlandica: purification, gene cloning, and application for optically active α-haloalcohols
US6218157B1 (en) Haloacetoacetate reductase, method for producing said enzyme, and method for producing alcohols using said enzyme
Trivić et al. Structure and function of yeast alcohol dehydrogenase
Schreiber et al. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of Clostridium acetobutylicum: isolation and purification of the enzyme, and sequencing and localization of the gap gene within a cluster of other glycolytic genes
JP5811521B2 (ja) フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの比活性を向上するための方法
JP5799534B2 (ja) フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定性を向上するための方法
Jiang et al. Catalytic site analysis and characterization of a solvent-tolerant aldo-keto reductase
EP1762621A1 (en) Novel glycerol dehydrogenase, gene therefor, and method of utilizing the same
JP4816103B2 (ja) グリセロールキナーゼ改変体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20170208

C20 Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned