CN104878053B - 一种红曲菌代谢产物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种红曲菌代谢产物的制备方法，采用红曲菌PHDS26液态发酵获得的菌丝体，再从菌丝体中提取、分离、纯化得到Monascopyridine A和Monascopyridine B。本发明可使得MCA和MCB的产量分别达到2.07和1.96g/kg。比现有技术的提取率提高了约50％；本发明采用的HPLC分析方法不需要进行梯度洗脱，样品提取过程中不需要添加磷酸，操作较简便，且MCA和MCB的保留时间短。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。涉及天然活性产物的制备。
背景技术
红曲是我国的传统发酵产品，在我国一直被认为具有药用和食用双重功效，不仅是祖国宝贵的科学文化遗产，而且在世界微生物史上具有重要意义。20世纪30年代，自红曲流传到了欧美以后，世界各国都开始研究红曲菌的分类与鉴定、红曲色素的提取工艺优化及其在生产中的应用，并对红曲发菌酵组分的分离纯化、结构表征及代谢机理等方面进行了一些研究，但进展较慢。最近几十年，随着微生物学的发展、分析方法的进步和分析仪器的更加精确，国内外的学者对红曲菌的发酵进行了大量广泛而深入的研究，在红曲色素分离、结构鉴定、菌种改良、液态发酵工艺优化、代谢产物基因调控、功能性及安全性等理论和应用方面的研究都卓有成效，不断拓展着红曲色素的应用领域。近年来，随着对红曲中生物活性物质研究不断发展，各国学者对其进行深入而广泛研究，发现红曲能产生许多令人瞩目次级代谢产物，如红曲色素、胆固醇抑制剂、及具有降血压、抗菌、降血氨、抗肿瘤、降血糖等生理活性成分，使传统红曲增添新的内涵。一种天然物质能同时具有多项生物活性实属罕见，因此开发红曲新功能现已成为各国研究热点之一。
红曲菌两种代谢产物Monascopyridine A(MCA)和Monascopyridine B(MCB)是由德国科学家Wild等(Wild D,et al.New Monascus metabolites with a pyridinestructure in red fermented rice.J Agric Food Chem,2003,51,5493–5496)首次在红曲米或以红曲米粉为发酵培养基进行液态发酵得到的，并对其结构进行了表征，然而，对MCA和MCB的分离方法和生物活性未做具体研究。目前，我们发现橙色红曲菌AS3.4384在敲除pksCT基因后得到的PHDS26菌株(Fu G,Xu Y,et al.Construction of a replacementvector to disrupt pksCT gene for the mycotoxin citrinin biosynthesis inMonascus aurantiacus and maintain food red pigment production.Asia Pac J ClinNutr,2007,16(S1),137-142；付桂明；橙色红曲菌pksCT gene的敲除和长同源臂置换型打靶载体的构建[D]；南昌大学；2007年)，MCA和MCB的产量大大提高，且原始菌株AS3.4384几乎不产MCA和MCB。
发明内容
本发明的目的是提供红曲菌代谢产物MCA和MCB的制备方法。本发明提供橙色红曲菌AS3.4384几乎不产MCA和MCB，然而在敲除pksCT基因后，MCA和MCB的产量大大提高，分别达到2.07和1.96g/kg。
本发明所述的红曲菌代谢产物MCA和MCB的制备方法，包括如下步骤：
(1)红曲菌孢子悬液的制备。
将橙色红曲菌株AS3.4384和其pksCT基因缺失株PHDS26分别接种到MPPY液体培养基中(4％葡萄糖，0.2％酵母浸膏，0.3％NaNO3，0.05％KCl，pH 6.8)，恒温摇床培养2～4d，120～250r/min，28～35℃；用移液枪吸取1mL培养液接种在MES固体培养基上28～30℃培养10～12d；长出大量孢子后，用孢子洗液洗脱孢子；500目的双层尼龙布过滤后得到均一的孢子悬液。
(2)菌丝和发酵液的收集。
对菌株AS3.4384和PHDS26的孢子悬液进行适当的稀释后分别接种到50mL YES液体培养基(1～10％酵母浸膏，2～30％蔗糖)，摇匀，培养基中的孢子终浓度为(1～10)×103个/mL，30℃静置培养16～26d。发酵结束后，取出三角瓶，用滤纸将菌体和发酵液过滤，收集发酵液，将湿菌体在60℃下烘干后研碎，收集干燥的菌体，研磨成粉后备用。
(3)MCA和MCB的提取与初分离。
菌丝体粉末用超声波辅助提取，提取条件：60～100％甲醇、30～60℃、10～30min、固液比1:25(w/v,kg/L)，两者提取液皆8000r/min离心20min，收集提取液，提取液在60℃下旋转蒸发，浓缩至干，残渣用乙酸乙酯复溶得到初提液，作硅胶柱分离用。采用硅胶柱层析法对样品进行初步分离，称取一定量的200-300目的硅胶，加入正己烷:乙酸乙酯(7:3，v/v,L/L)用玻璃棒充分搅拌，装柱；沉降完成后，将一定量的初提液上样，用正己烷:乙酸乙酯(7:3，v/v,L/L)洗涤，收集洗脱液，60℃浓缩至干，加入乙醇复溶，用本发明的技术效果中的HPLC方法检测，以确定含有目标产物的溶液，待收集到一定量后，旋转浓缩至干，用无水乙醇复溶，0.22μm微孔滤膜过滤，备用。
(4)MCA和MCB的纯化。
采用半制备高效液相色谱法对MCA和MCB进行纯化，半制备型HPLC条件为：色谱柱：Zorbax SB-C18(9.4×150mm,5μm)；流动相：乙腈/水(75:25，v/v，mL/mL)；检测波长：300nm；温度：室温(25℃)；样量：200μl。分别收集两种目标产物洗脱液，并将两者的洗脱溶液于60℃下旋转蒸发浓缩至干，得到纯度大于95％的MCA和MCB。
本发明MCA和MCB的生物活性测定。
采用MTT法检测了MCA和MCB对HepG2细胞增殖抑制的影响，结果显示，MCA和MCB能明显抑制HepG2细胞的增殖，MCA和MCB对HepG2细胞抑制的IC50值分别为40.0和20.0μg/mL。
发酵液用同体积的甲醇萃取，菌丝用超声波辅助提提取，提取条件：60～100％甲醇、30～60℃、10～30min、固液比1:25，两者提取液皆8000r/min离心20min，0.22μm微孔滤膜过滤后用HPLC检测两种代谢产物。
HPLC测定条件经过优化如下：
色谱柱：Hypersil ODS-2(5μm，250×4.6mm，Thermo公司)；流动相：乙腈-水(60:40，v/v)；检测波长：300nm；柱温：25℃；流速：0.8mL/min；进样量：20μL。
本发明的技术效果:目前文献报道(Wild D,et al.New Monascus metaboliteswith a pyridine structure in red fermented rice.J Agric Food Chem,2003,51,5493–5496.)中采用大米或大米粉发酵得到该红曲菌代谢产物，通过本发明的方法采用红曲菌PHDS26液态发酵获得的菌丝体，使得MCA和MCB的产量分别达到2.07和1.96g/kg。本发明采用超声波辅助提取，优化后的提取条件：90％甲醇、40℃、20min、固液比1:25(w/v,kg/L)，比上述文献报道的提取方法(采用乙腈作为提取剂)提取率提高了约50％。另外，本发明采用的HPLC分析方法不需要进行梯度洗脱，样品提取过程中不需要添加0.25M的磷酸，操作较上述文献简便，且MCA和MCB的保留时间较文献中保留时间短。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
实施例1。橙色红曲菌AS3.4384及其pksCT基因缺失株PHDS26MCA和MCB产量的比较。
1.1按照上述红曲菌代谢产物MCA和MCB的制备方法分别制备橙色红曲菌AS3.4384及其pksCT基因缺失株PHDS26的菌丝体，然后采用HPLC方法对不同菌丝样品中MCA和MCB含量进行测定。
1.2色谱条件。
采用色谱柱Hypersil ODS-2(5μm，250×4.6mm)为检测用色谱柱，乙腈-水(60:40，v/v)为流动相，柱温为25℃，流速为0.8mL/min，检测波长为300nm。
1.3结果分析。
对于橙色红曲菌AS3.4384，菌丝和发酵液中均未检测出MCA和MCB；在基因缺失株PHDS26的发酵液中也未检测到MCA和MCB，但在其菌丝中却检出较多的MCA和MCB，结果显示，在发酵到16天时，基因缺失株PHDS26的菌丝粉中MCA和MCB的产量达到最大值，分别为2.07g/kg和1.96g/kg，
实施例2。MCA和MCB超声波辅助提取条件的优化。
1.1对影响超声波提取效果的溶剂浓度、超声波频率、提取时间、提取温度、固液比等进行了单因素实验，以确定各影响因素的范围。
1.1.1溶剂的影响。
取0.50g干燥菌丝粉7份，于7个10mL容量瓶中，分别加入甲醇、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、丙酮，石油醚、氯仿各5mL，震荡均匀，50℃、超声提取30min，上清液8000r/min离心20min，0.22μm微孔滤膜过滤后，按照实施例1中HPLC方法检测，研究不同提取溶剂对MCA和MCB含量的影响。
1.1.2甲醇浓度的影响。
取0.50g菌体粉末10份，于10个10ml容量瓶中，分别加入10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇各5ml，振荡均匀，50℃、150W超声提取提取30min，上清液8000r/min离心20min，0.22μm微孔滤膜过滤后，按照实施例1中HPLC方法检测，研究不同甲醇浓度对MCA和MCB含量的影响。
1.1.3超声波提取时间的影响。
取0.50g菌体粉末7份，于7个10ml容量瓶中，按照固液比1:10、甲醇浓度80％、提取温度50℃，分别提取5min、10min、20min、30min、40min、50min和60min，上清液8000r/min离心20min，0.22μm微孔滤膜过滤后，按照实施例1中HPLC方法检测，研究不同超声对MCA和MCB含量的影响。
1.1.4提取温度的影响。
取0.50g菌体粉末7份，于7个10mL容量瓶中，按照固液比1:10、甲醇浓度80％、超声功率150W、提取时间20min，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃下提取，上清液8000r/min离心20min，0.22μm微孔滤膜过滤后，按照实施例1中HPLC方法检测，研究不同提取温度对MCA和MCB含量的影响。
1.1.5固液比的影响。
取7个10mL容量瓶，分别加入菌丝粉0.14g、0.17g、0.2g、0.25g、0.33g、0.5g、1g，各加入5mL 80％甲醇，在提取时间20min提取温度40℃下提取，上清液8000r/min离心20min，0.22μm微孔滤膜过滤后，按照实施例1中HPLC方法检测，研究不同固液比对MCA和MCB含量的影响。
1.1.6超声波辅助提取条件的优化。
以菌丝粉为原料，取甲醇溶液体积分数、提取时间、提取温度、料液比4个影响因素，设计四因素三水平正交实验，进一步优化菌丝粉中MCA和MCB提取的最佳工艺条件。
1.1.7提取次数的影响。
取0.50g菌体粉末置于离心管中，以最优单因素(提取溶剂为80％甲醇、提取时间为20min、提取温度为40℃、料液比为1:25)为提取条件提取1、2、3次，上清液8000r/min离心20min，0.22μm微孔滤膜过滤后，按照实施例1中HPLC方法检测，研究提取次数对MCA和MCB含量的影响。
1.2结果分析。
MCA和MCB的最佳提取条件可以确定为：甲醇浓度90％、提取温度40℃、提取时间10min，提取次数为2次，料液比1:25，此条件下MCA的得率为95.2％，MCB的得率为94.3％。
实施例3。MCA和MCB的生物活性测定。
3.1细胞培养
将保存于液氮罐中细胞复苏，并接种于DMEM培养基中，该培养基含0.1g/L的链霉素、13.4g/L的DMEM、100000U/L的青霉素、15％的小牛血清(NBCS)及3％(v/v)的谷氨酰胺。于5％CO2培养箱中，37℃培养48～72h。
待细胞生长至80％汇合，吸除旧培养基，加适量胰蛋白酶消化液。待细胞变得轮廓分明，呈稍回缩变圆时吸除消化液，加入血清终止消化。再加入适量完全DMEM培养液，吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×104个/mL，接种到新培养瓶内，于培养箱中37℃、5％CO2培养。
3.2MTT法测定MCA和MCB对HepG2细胞增殖的抑制作用
(1)取生长状态良好的HepG2，0.125％胰酶消化后，用DMEM培养液(含15％小牛血清)调整细胞浓度为2×104个/mL。
(2)将细胞接种于细胞培养板中，每孔50-200μL，于37℃，5％CO2常规培养24h。
(3)弃去孔中培养液，分别添加含不同浓度MCA和MCB的细胞培养液(DMSO溶解)，对照组为含0.4％(v/v)的DMSO的完全培养液，每组重复3次，于5％CO2培养箱，37℃培养48h。
(4)弃去孔中培养液，每孔加入25-100μL MTT(储备液1.0mg/mL)溶液，于37℃培养4h后，弃去微孔中液体，每孔加入100μL DMSO终止反应，充分振摇，立即在酶联免疫检测仪上测定吸光度(A)，测定波长为570nm。细胞存活率按下式计算：细胞存活率＝(实验组A570值/对照组A570值)×100％。
结果显示：MCA和MCB对HepG2细胞抑制的IC50值分别为40.0和20.0μg/mL。
Claims (1)
1.一种红曲菌代谢产物的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1) 红曲菌孢子悬液的制备：
将橙色红曲菌株AS3.4384的pksCT基因缺失株PHDS26接种到4% 葡萄糖、0.2% 酵母浸膏、0.3%NaNO3、0.05%KCl、pH 6.8的MPPY 液体培养基中，恒温摇床培养2～4 d，120～250r/min，28～35℃；用移液枪吸取1 mL培养液接种在MES固体培养基上28～30℃培养10～12d；长出大量孢子后，用孢子洗液洗脱孢子；500目的双层尼龙布过滤后得到均一的孢子悬液；
(2) 菌丝和发酵液的收集：
对菌株PHDS26的孢子悬液进行适当的稀释后接种到50 mL YES液体培养基，培养基中含1～10%酵母浸膏、2～30%蔗糖；摇匀，培养基中的孢子终浓度为(1～10)×103个/mL，30℃静置培养16～26 d；发酵结束后，取出三角瓶，用滤纸将菌体和发酵液过滤，收集发酵液，将湿菌体在60 ℃下烘干后研碎，收集干燥的菌体，研磨成粉后备用；
(3) Monascopyridine A和Monascopyridine B的提取与初分离：
菌丝体粉末用超声波辅助提取，提取条件：60～100%甲醇、30～60℃、10～30 min、固液比（kg/L）1:25，两者提取液皆8000 r/min离心20 min，收集提取液，提取液在60℃下旋转蒸发，浓缩至干，残渣用乙酸乙酯复溶得到初提液，作硅胶柱分离用；采用硅胶柱层析法对样品进行初步分离，称取一定量的200-300目的硅胶，加入正己烷:乙酸乙酯(L/L)7:3用玻璃棒充分搅拌，装柱；沉降完成后，将一定量的初提液上样，用正己烷:乙酸乙酯(L/L) 7:3洗涤，收集洗脱液，60℃浓缩至干，加入乙醇复溶，检测，以确定含有目标产物的溶液，待收集到一定量后，旋转浓缩至干，用无水乙醇复溶，0.22 µm微孔滤膜过滤，备用；
(4) Monascopyridine A和Monascopyridine B的纯化：
采用半制备高效液相色谱法对Monascopyridine A和Monascopyridine B进行纯化，半制备型HPLC条件为：色谱柱：Zorbax SB-C18：9.4×150 mm，5µm；流动相：乙腈/水(mL/mL)75:25；检测波长：300 nm；温度：室温25℃；样量：200 µl；分别收集两种目标产物洗脱液，并将两者的洗脱溶液于60 ℃下旋转蒸发浓缩至干，得到纯度大于95%的Monascopyridine A和Monascopyridine B。
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