CN103305582B - 一种从座壳孢菌中提取17(21)-藿烯-12β-醇的方法 - Google Patents
一种从座壳孢菌中提取17(21)-藿烯-12β-醇的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种从座壳孢菌中提取17(21)-藿烯-12β-醇的方法。所述方法包括代谢产物提取和分离纯化，即冷浸提取、浓缩得粗提物，粗提物过160-200目硅胶柱，正己烷：乙酸乙酯梯度洗脱，再过200-300目硅胶柱，用石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，最后利用重结晶得到座壳孢菌中的17(21)-藿烯-12β-醇。本发明的方法取材方便、过程简单、易操作、成本低、纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种从座壳孢菌中提取17(21)-藿烯-12β-醇的方法
背景技术
座壳孢菌为子囊菌门、粪菌纲、肉座菌目、麦角菌科， 是虫生真菌，其代谢产物具有杀粉虱、桃蚜等活性，并具有广谱抑菌性，而且代谢产物不受季节、温度、雨水等影响，具有较好的应用前景。
其代谢产物医学方面也有潜在的应用价值，如从座壳孢代谢物中分离到的三萜类物质泽喔萜、杜斯塔宁具有抗结核杆菌的活性，IC50为12.5 μM；蒽醌类物质细皱青霉素、醌莃素具有抗动物细胞Sf9的细胞毒活性，ID50为1.2 μM和9.6 μM；三萜类物质17（21）-hopene-6,12β-diol具有抗疟原虫活性，IC50为15 μM。
本次分离到的17(21)-藿烯-12β-醇，是一种五元环三萜物质，分子式C30H50O，具有一定的抗耶尔森氏菌的活性，耶尔森氏菌是一种革兰氏阴性菌，为人畜共患病，临床表现以急性胃肠炎小肠结肠炎和败血症等类型为主亦有急性阑尾炎、脑膜炎、多发性关节炎、猩红热型、黄疸型和淋巴细胞白血病等多种临床类型，因此可以应用该方法扩大规模生产，用于医疗研究。
发明内容
本发明的目的是公开一种从座壳孢菌(Jun-Zhi Qiu & Xiong Guan, A new species of Aschersonia (Clavicipitaceae, Hypocreales) from China. MYCOTAXON, 2010, 111: 471-475)中提取17(21)-藿烯-12β-醇的方法，以促进医药领域的研究和开发。
据图1（1H-NMR）数据知，δH（1.18s、1.06s、1.04s、1.04s、1.09s、1.00d、0.94s、0.93d）为甲基氢信号，在δH3.87（1H，dt，J=5.39,10.09Hz）处有连氧次甲基信号，在图2（13C-NMR）数据中，只在化学位移δC70.99处有饱和碳原子连氧的信号，与氢谱数据吻合，说明有1个连氧次甲基（δC70.99/δH3.87），从13C-NMR和图3的DEPT135数据知，该物质含有7个季碳、10个亚甲基碳、4个次甲基，8个甲基碳，推测该物质是藿烷型三萜，在碳谱中有双键信号（δC139.4和δC137.1）。
通过上述数据分析并文献对比，发现该物质与文献（Isaka M et al. Hopane-Type Triterpenes and Binaphthopyrones from the Scale Insect Pathogenic Fungus Aschersonia paraphysata BCC 11964. J. Nat. Prod., 2010, 73 (4): 688–692）中的数据一致，所以该物质是17(21)- 藿烯-12β-醇，其结构式如图4。
本发明的技术方案：
本发明公开一种从座壳孢菌中提取17(21)-藿烯-12β-醇的方法，其特征包括：
1） 初级、次级培养：座壳孢菌活化后，取菌块接种到摇瓶培养基中，在120~200r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天即初级培养，按8％~10％接种量再次转接到摇瓶培养基中，在20~28℃条件下静止培养35~40天即次级代谢产物。
2） 冷浸提取：菌液和菌丝体过滤分离，菌丝体在3℃～10℃的有机溶剂中浸泡48～72小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在35℃～40℃得浸膏，回收有机溶剂；
3） 摇瓶萃取：加水溶解浸膏，水与浸膏重量比为50:1～100:1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入1～2倍的乙酸乙酯摇瓶萃取，摇30分钟，静止30分钟，再摇30分钟，静止30分钟，待分成后取乙酸乙酯部分，旋转浓缩得粗提物；
4） 分离纯化：粗提物上160～200目硅胶柱，以正己烷：乙酸乙酯梯度洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯体积比=10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得粗提物A，将粗提物A上200～300目硅胶柱，以石油醚：丙酮梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=15：1部分洗脱液，得白色含晶体的物质，再将白色含晶体的物质用氯仿溶解，放在4℃冰箱里自然挥干，最后经甲醇重结晶得17(21)-藿烯-12β-醇。
本发明步骤1）中的摇瓶培养基可以为沙氏培养基。
本发明步骤2）中的有机溶剂为丙酮、乙醇、甲醇中的任一种。
本发明的优点：
1） 取材方便，周期短；
2） 过程简单、易操作；
3） 成本低、纯度高。
附图说明
图1 17(21)-藿烯-12β-醇的氢谱
图2 17(21)-藿烯-12β-醇的碳谱
图3 17(21)-藿烯-12β-醇的DEPT135谱
图4 17(21)-藿烯-12β-醇的化学结构
具体实施方式
实施例1
1）初级、次级培养：座壳孢菌活化后，取菌块接种到沙氏培养基中，在120r/min、22℃条件下连续培养6天即初级培养，按8％接种量再次转接到沙氏培养基中，在22℃条件下静止培养36天即次级代谢产物；
2）冷浸提取：菌液和菌丝体过滤分离，菌丝体在4℃的丙酮溶剂中浸泡50小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在36℃得浸膏，回收丙酮溶剂；
3）摇瓶萃取：加水溶解浸膏，水与浸膏重量比为50:1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入1.5倍的乙酸乙酯摇瓶萃取，摇30分钟，静止30分钟，再摇30分钟，静止30分钟，待分成后取乙酸乙酯部分，旋转浓缩得粗提物；
4）分离纯化：粗提物上160～200目硅胶柱，以正己烷：乙酸乙酯梯度洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯体积比=10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得粗提物A，将粗提物A上200～300目硅胶柱，以石油醚：丙酮梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=15：1部分洗脱液，得白色含晶体的物质，再将白色含晶体的物质用氯仿溶解，放在4℃冰箱里自然挥干，最后经甲醇重结晶得17(21)-藿烯-12β-醇；
5）提取率%=纯17(21)-藿烯-12β-醇重量/浸膏总量×100%=3.98%
实施例2
1）初级、次级培养：座壳孢菌活化后，取菌块接种到沙氏培养基中，在 180r/min、28℃条件下连续培养7天即初级培养，按9％接种量再次转接到沙氏培养基中，在28℃条件下静止培养37天即次级代谢产物。
2）冷浸提取：菌液和菌丝体过滤分离，菌丝体在8℃的甲醇中浸泡70小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在38℃得浸膏，回收甲醇溶剂；
3）摇瓶萃取：加水溶解浸膏，水与浸膏重量比为80：1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入1.5倍的乙酸乙酯摇瓶萃取，摇30分钟，静止30分钟，再摇30分钟，静止30分钟，待分成后取乙酸乙酯部分，旋转浓缩得粗提物；
4）分离纯化：粗提物上160～200目硅胶柱，以正己烷：乙酸乙酯梯度洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯体积比=10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得粗提物A，将粗提物A上200～300目硅胶柱，以石油醚：丙酮梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=15：1部分洗脱液，得白色含晶体的物质，再将白色含晶体的物质用氯仿溶解，放在4℃冰箱里自然挥干，最后经甲醇重结晶得17(21)-藿烯-12β-醇
5）提取率%=纯17(21)-藿烯-12β-醇重量/浸膏总量×100%=4.02%
实施例3
1) 初级、次级培养：座壳孢菌活化后，取菌块接种到沙氏培养基中，在160r/min、27℃条件下连续培养8天即初级培养，按9％接种量再次转接到沙氏培养基中，在27℃条件下静止培养38天即次级代谢产物；
2）冷浸提取：菌液和菌丝体过滤分离，菌丝体在6℃的乙醇中浸泡60小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在37℃得浸膏，回收乙醇溶剂；
3）摇瓶萃取：加水溶解浸膏，水与浸膏重量比为100：1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入1.5倍的乙酸乙酯摇瓶萃取，摇30分钟，静止30分钟，再摇30分钟，静止30分钟，待分成后取乙酸乙酯部分，旋转浓缩得粗提物；
4）分离纯化：粗提物上160～200目硅胶柱，以正己烷：乙酸乙酯梯度洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯体积比=10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得粗提物A，将粗提物A上200～300目硅胶柱，以石油醚：丙酮梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=15：1部分洗脱液，得白色含晶体的物质，再将白色含晶体的物质用氯仿溶解，放在4℃冰箱里自然挥干，最后经甲醇重结晶得17(21)-藿烯-12β-醇；
5）提取率%=纯17(21)-藿烯-12β-醇重量/浸膏总量×100%=4.04%
实施例4
1）初级、次级培养：座壳孢菌活化后，取菌块接种到沙氏培养基中，在200r/min、20℃条件下连续培养10天即初级培养，按10％接种量再次转接到沙氏培养基中，在20℃条件下静止培养40天即次级代谢产物；
2）冷浸提取：菌液和菌丝体过滤分离，菌丝体在3℃的乙醇中浸泡72小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在40℃得浸膏，回收乙醇溶剂；
3）摇瓶萃取：加水溶解浸膏，水与浸膏重量比为100：1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入1.0倍的乙酸乙酯摇瓶萃取，摇30分钟，静止30分钟，再摇30分钟，静止30分钟，待分成后取乙酸乙酯部分，旋转浓缩得粗提物；
4）分离纯化：粗提物上160～200目硅胶柱，以正己烷：乙酸乙酯梯度洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯体积比=10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得粗提物A，将粗提物A上200～300目硅胶柱，以石油醚：丙酮梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=15：1部分洗脱液，得白色含晶体的物质，再将白色含晶体的物质用氯仿溶解，放在4℃冰箱里自然挥干，最后经甲醇重结晶得17(21)-藿烯-12β-醇；
5）提取率%=纯17(21)-藿烯-12β-醇重量/浸膏总量×100%=4.02%
实施例5
1）初级、次级培养：座壳孢菌活化后，取菌块接种到沙氏培养基中，在200r/min、28℃条件下连续培养5天即初级培养，按10％接种量再次转接到沙氏培养基中，在28℃条件下静止培养35天即次级代谢产物；
2）冷浸提取：菌液和菌丝体过滤分离，菌丝体在10℃的乙醇中浸泡48小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在35℃得浸膏，回收乙醇溶剂；
3）摇瓶萃取：加水溶解浸膏，水与浸膏重量比为100：1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入2倍的乙酸乙酯摇瓶萃取，摇30分钟，静止30分钟，再摇30分钟，静止30分钟，待分成后取乙酸乙酯部分，旋转浓缩得粗提物；
4）分离纯化：粗提物上160～200目硅胶柱，以正己烷：乙酸乙酯梯度洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯体积比=10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得粗提物A，将粗提物A上200～300目硅胶柱，以石油醚：丙酮梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=15：1部分洗脱液，得白色含晶体的物质，再将白色含晶体的物质用氯仿溶解，放在4℃冰箱里自然挥干，最后经甲醇重结晶得17(21)-藿烯-12β-醇；
5）提取率%=纯17(21)-藿烯-12β-醇重量/浸膏总量×100%=4.03%。
Claims (1)
1. 一种从座壳孢菌中提取17(21)- 藿烯-12β- 醇的方法，其特征包括以下步骤：
1) 初级、次级培养：座壳孢菌活化后，取菌块接种到沙氏培养基中，在160r/min、27℃条件下连续培养8 天即初级培养，按9％接种量再次转接到沙氏培养基中，在27℃条件下静止培养38 天即得次级代谢产物；
2）冷浸提取：菌液和菌丝体过滤分离，菌丝体在6℃的乙醇中浸泡60 小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在37℃得浸膏，回收乙醇溶剂；
3）摇瓶萃取：加水溶解浸膏，水与浸膏重量比为100 ：1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入1.5 倍的乙酸乙酯摇瓶萃取，摇30 分钟，静止30 分钟，再摇30 分钟，静止30 分钟，待分层后取乙酸乙酯部分，旋转浓缩得粗提物；
4）分离纯化：粗提物上160 ～ 200 目硅胶柱，以正己烷：乙酸乙酯梯度洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯体积比=10:1 部分洗脱液，旋蒸浓缩得粗提物A，将粗提物A 上200 ～ 300 目硅胶柱，以石油醚：丙酮梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=15 ：1 部分洗脱液，得白色含晶体的物质，再将白色含晶体的物质用氯仿溶解，放在4℃冰箱里自然挥干，最后经甲醇重结晶得17(21)- 藿烯-12β- 醇。
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| Masahiko Isaka等.Hopane-type Triterpenes and Binaphthopyrones from the Scale Insect Pathogenic Fungus Aschersonia paraphysata BCC 11964.《J.Nat.Prod》.2010,第73卷(第4期),第688-692页. |
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