CN107955819A - 一种莫勒菌发酵生产三萜的培养基及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺，本发明涉及一种莫勒菌发酵生产三萜的培养基及方法。所述产三萜发酵培养基的原料包括：蔗糖40‑200 g/L，酵母提取粉0.06‑1 g/L，Cu²⁺ 1‑16 g/L，维生素C 0.000625‑0.07 g/L，茉莉酸甲酯50µmol/L，pH 2‑4。将发酵种子液10mL接种于发酵培养基中，于150 r/m、25℃±1条件下发酵培养13天。将摇瓶培养好的菌体抽滤，冷冻干燥，用95%的乙醇1：60提取总三萜，于4℃、10000 r/m的条件下离心10 min，取上清进行总三萜含量的测定。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；培养基具有三萜产率高等优点。

Description

一种莫勒菌发酵生产三萜的培养基及方法

技术领域

本发明属于真菌的发酵培养及工艺技术领域，具体涉及一种莫勒菌发酵生产三萜的培养基及方法。

背景技术

萜类物质是具有（C₅H₈）n通式的化合物及其衍生物。Wallach提出异戊二稀法则，按异戊二稀的数量将萜类化合物分为单萜、倍半萜、二萜、三萜等。三萜类化合物是一类以6个异戊二烯为单位，母核由30个碳原子组成的聚合体。目前已发现的三萜化合物，多数为四环三萜和五环三萜。常见的四环三萜主要有环阿屯烷型、达玛烷型、甘遂烷型和羊毛脂烷型等，五环三萜主要分为齐墩果烷型、羽扇豆烷型和乌苏烷型结构。

莫勒菌(Moelleriella)隶属于子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌目、麦角菌科，已从该类真菌代谢产物中筛选出了多种具有杀虫、抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性的三萜类物质，预示该菌在生物农药或医药上存在很大应用价值。因此莫勒菌三萜的相关研究可以为发现新颖结构和独特活性提供科学依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种莫勒菌发酵生产三萜的培养基及方法，具有易培养，三萜产量高等优点。

本发明采取的技术方案如下：

一种莫勒菌发酵生产三萜的培养基，所述培养基的原料包括：蔗糖40-200 g/L，酵母提取粉0.06-1 g/L，Cu²⁺ 1-16 g/L，维生素C 0.000625-0.07 g/L，茉莉酸甲酯50µmol/L，pH2-4。

优选的，一种莫勒菌发酵生产三萜的培养基，其原料包括：蔗糖200 g/L，酵母提取粉0.5 g/L，Cu²⁺ 4 g/L，维生素C 0.07 g/L，茉莉酸甲酯50µmol/L，pH 2.3。

利用上述培养基生产三萜的方法，具体包括以下步骤：

（1）将莫勒菌接种于PDB培养基中，培养直至产生黄色孢子液，即活化；

（2）将步骤（1）活化后的菌株接种至种子培养基中培养，得到种子液；

（3）取10ml步骤（2）制得的的种子液接种于产三萜的发酵培养基中，接种量为10%，于150 r/m、25℃±1条件下培养13d，再经抽滤、冷冻干燥、离心和蒸干制得所述产品。

步骤（2）所述的种子培养基的原料包括：土豆 200g/L，葡萄糖 20.0g/L，自然pH。

步骤（1）所述的培养条件为：培养温度为25℃±1，培养时间为7-8d。

步骤（2）所述的培养条件为：培养温度为25℃±1，转速150 r/min，培养时间为8d。

本发明的有益效果在于：本发明的发酵方法具有发酵周期短、条件温和、易控制等特点；提供的莫勒菌发酵生产三萜的培养基具有三萜产率高等特点。

附图说明

图1为不同碳源对莫勒菌发酵生产三萜的影响；

图2为不同氮源对莫勒菌发酵生产三萜的影响；

图3为不同金属离子对莫勒菌发酵生产三萜的影响；

图4为不同维生素对莫勒菌发酵生产三萜的影响；

图5为不同pH对莫勒菌发酵生产三萜的影响；

图6为不同诱导剂对莫勒菌发酵生产三萜的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。

实施例1：

单因素实验确定培养基最优成分

1）种子培养基配制：土豆 200g/L，葡萄糖 20.0g/L，自然pH，121℃灭菌20 min；

2）发酵种子的制作：将莫勒菌接种于PDB固体平板培养基上，于25℃下培养7天直至产生黄色孢子液，即活化；将活化后的菌株用打孔器将菌体接种至种子培养基，25℃，转速150r/min 下培养8d，即为发酵种子液；

3）样品的制备

取步骤2）的种子液10 ml接种于发酵培养基中，25℃，转速150 r/min培养13d，将发酵培养的菌体抽滤出来，冷冻干燥，用95%的乙醇1：60浸提24h，于4℃、10000 r/m的条件下离心10 min，取上清100µL在 100℃水浴上蒸干即为待测样品；所述发酵培养基的原料包括：蔗糖200 g/L，酵母提取粉0.5 g/L，Cu²⁺ 4 g/L，维生素C 0.07 g/L，茉莉酸甲酯50µmol/L，pH 2.3。

4）三萜含量的测定

取待测样品加入 0.20mL的5%香草醛-冰乙酸溶液（称取香草醛 0.5g，用适量冰醋酸溶解并定容至10mL，现配现用）和0.80mL高氯酸摇匀，于70℃水浴保温反应15min，冷却至室温加入乙酸乙酯定量至5mL，摇匀，在551nm处测定吸光度。根据白桦脂醇标准曲线得出的线性回归方程计算出相应吸光度值(Y)所对应的三萜含量。

5）标准曲线的制作

精确吸取以无水乙醇为溶剂溶解的白桦脂醇对照品标准溶液（160µg/mL） 0.10mL，0.15mL，0.20mL，0.25mL，0.30mL，0.35mL，0.40mL，0.45mL， 0.50mL，0.55mL，分别置于5mL容量瓶，在100℃水浴上蒸干后加入 0.20mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL 高氯酸摇匀，于70℃水浴反应 15min 后却至室温，加入乙酸乙酯定量到5mL，摇匀，同时作试剂空白，以空白对照和不同浓度水平白桦脂醇对照品溶液测定551nm处吸光值。以白桦脂醇含量为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。通过试验得出线性回归方程：Y=4.6728X，R² = 0.9992。

6）不同碳源、氮源、金属离子、维生素、诱导剂、pH对产三萜的影响

在基础发酵培养基中分别更换不同单因素的营养条件 (不同碳源、氮源、维生素、金属离子等)，接种相同的黄单胞杆菌菌液，测定其三萜含量。（实验结果见图1-6）

实施例 2

正交实验确定最优发酵条件

正交实验确定最佳培养基

1）从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分的溶度，配置不同的培养基，五因素四水平配制配方见表1，将相同量的接种量（10ml）菌种接种于 250mL，装有100mL 培养液，在25℃±1，转速 150 r/min 下培养。然后测定三萜含量，选取正交实验最优结果和其含量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘，实施例中的培养基配法、样品的制备、含量测定方法均与实施例 1 的方法相同。（正交实验结果见表2）

表1 正交试验设计方案

表2 正交试验结果

注: Ⅰ 1 为各因素水平 1 的所有酶活力之和，Ⅱ 2 为各因素水平 2 的所有酶活力之和，Ⅲ 3 为各因素水平 3 的所有酶活力之和，Ⅳ 4 为各因素水平 4 的所有酶活力之和，R 为极差，酶活力的数字代表 3 次重复的平均值 (mean)± 标准差 (S.D)。

表3 培养基优化验证试验

从6因素5水平的16个组合中显示最优组合为A₄B₅C₃D₄E₄F₂，即最优产三萜的培养基组成为蔗糖 200 g/L，酵母提取粉 0.5 g/L，Cu²⁺ 4 g/L，维生素C 0.07 g/L，茉莉酸甲酯 50µmol/L，pH 2.3，且结果与验证试验相符合。根据极差R可知，蔗糖、维生素C和pH的变化与莫勒菌发酵生产三萜息息相关，其中碳源蔗糖浓度的改变对产三萜影响在5个因素非常显著，氮源酵母提取粉的变化对产酶影响最小。最终优化后从最初的0.367mg/100µL达到了0.503mg/100µL，提高了1.37倍。

该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种莫勒菌发酵生产三萜的培养基，其特征在于：所述培养基的原料包括：蔗糖40-200 g/L，酵母提取粉0.06-1 g/L，Cu²⁺ 1-16 g/L，维生素C 0.000625-0.07 g/L，茉莉酸甲酯50µmol/L，pH 2-4。

2.根据权利要求1所述的莫勒菌发酵生产三萜的培养基，其特征在于：所述培养基的原料包括：蔗糖200 g/L，酵母提取粉0.5 g/L，Cu²⁺ 4 g/L，维生素C 0.07 g/L，茉莉酸甲酯50µmol/L，pH 2.3。

3.一种利用权利要求1或2所述的培养基生产三萜的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

（1）将莫勒菌接种于PDB培养基中，培养直至产生黄色孢子液，即活化；

（2）将步骤（1）活化后的菌株接种至种子培养基中培养，得到种子液；

（3）取10ml步骤（2）制得的的种子液接种于产三萜的发酵培养基中，接种量为10%，于150 r/m、25℃±1条件下培养13d，再经抽滤、冷冻干燥、离心和蒸干制得所述产品。

4. 根据权利要求3所述的生产三萜的方法，其特征在于：步骤（2）所述的种子培养基的原料包括：土豆 200g/L，葡萄糖 20.0g/L，自然pH。

5.根据权利要求3所述的生产三萜的方法，其特征在于：步骤（1）所述的培养条件为：培养温度为25℃±1，培养时间为7-8d。

6. 根据权利要求3所述的生产三萜的方法，其特征在于：步骤（2）所述的培养条件为：培养温度为25℃±1，转速150 r/min，培养时间为8d。