CN104797701A - 用于增加植物的有效磷酸盐的微生物菌株、组合物、和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于增加植物磷酸盐利用率的新颖的溶解磷酸盐的菌株连同其组合物和方法。

Description

用于增加植物的有效磷酸盐的微生物菌株、组合物、和方法
发明领域
在此披露了新颖的微生物菌株。进一步披露了包含该新颖的微生物菌株的组合物和使用该新颖的微生物菌株的方法，特别是用来增加植物的有效磷酸盐的组合物和方法。
发明背景
为了维持健康生长，植物必须从它们生长的土壤获取大量元素。这些元素包括磷和所谓的微量养分(例如铜、铁、锌等)，但是很多土壤此类元素不足或这些土壤仅以不能被植物容易地摄取的形式包含它们(一般认为，植物不能容易地摄取必需元素，除非这些必需元素在土壤中以溶解的形式存在)。
为了克服此类不足，通常将不足元素的来源施加至土壤以改进获得自作物植物的生长速率和产量。例如，通常将磷酸盐添加至土壤以克服有效磷的缺乏。作为商品肥料添加至土壤的磷酸盐(例如磷酸二氢铵、三过磷酸盐等)是易于植物获取的，但是它在土壤中迅速转化为相对难获取的形式。据估计，在施加磷肥的一年中，仅有10％-30％的磷肥被植物利用，并且三分之一至一半的施加的磷肥可能永远不会被植物回收。
过去已经做出尝试，试图使用微生物来改进土壤系统中必需元素的利用率。具体地，出于此目的，已经使用了青霉属真菌的物种。
例如，美国专利号5,026,417披露了拜莱青霉菌(P.bilaii)的分离菌株，当施加至土壤时，它能够改进植物的磷摄取。
美国专利申请公开号2010/0099560披露了通过使植物生长在包含磷源和青霉属真菌的至少两个菌株的土壤(接近植物根部)中，来增强植物的生长条件的方法。
美国专利号5,484,464披露了用于增加豆科植物：根瘤菌属共生生物的可溶磷酸盐和固定氮的利用率的方法和组合物，涉及在种植之前，用溶磷土壤真菌(拜莱青霉菌)，和根瘤菌共接种豆科植物种子。
然而，仍存在对改进植物的生长条件的系统，特别是通过增加土壤系统中有效磷的水平的需要。
发明概述
在此描述了溶解磷的新颖的真菌菌株。本发明的诸位发明人已经分离了相当数量的真菌菌株，并且测试了它们的溶解磷的能力。
如贯穿本文所披露的那样，分离的菌株是青霉属的菌株。具体地，分离的菌株是拜赖青霉(Penicillium bilaiae)的菌株。甚至更具体地，分离的菌株是选自下组的分离的拜赖青霉菌株，该组由以下各项组成
具有保藏登录号NRRL B-50776的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50777的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50778的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50779的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50780的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50781的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50782的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50783的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50784的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50785的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50786的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50787的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50788的菌株，以及
它们的菌株中的两种或更多种的混合物。
还在此描述的是包含一种载体和在此描述的真菌菌株中的一种或更多种的组合物。这些组合物可以进一步包含一个磷源，例如磷矿石或含磷肥料，用于这些组合物的真菌菌株的磷溶解。磷源或含磷肥料可以作为同一组合物的一部分或通过分开的处理过程使用。
在另一实施例中，该组合物包含一种或更多种植物信号分子。在一个实施例中，该组合物包含至少一种-脂质几丁寡糖(LCO)。在另一实施例中，该组合物包含至少一种壳寡糖(CO)。仍在另一实施例中，该组合物包含至少一种类黄酮。仍在另一实施例中，该组合物包含茉莉酸或其衍生物。在另一实施例中，该组合物包含亚油酸或其衍生物。仍在另一实施例中，该组合物包含亚麻酸或其衍生物。仍在另一实施例中，该组合物包含一种卡里金(karrikin)。
在此进一步描述的是用于增加植物从土壤中摄取的磷的利用率的方法。该方法包括将在此描述的真菌菌株中的一种或更多种的接种物引入土壤。在另一实施例中，该方法可以包括添加磷的来源至土壤。仍在另一实施例中，该方法包括将真菌菌株中的一种或更多种的接种物作为种子包衣引入土壤。
还在此描述的是用于增加一种或更多种植物中的磷摄取的方法，包括使一种或更多种植物生长在包含磷源和一种或更多种在此描述的真菌菌株的土壤中。在一个实施例中，该一种或更多种植物是一种或更多种豆科植物、一种或更多种非豆科植物、或其组合。在另一实施例中，该植物是选自下组的植物，该组由以下各项组成：大豆、豆、苜蓿、三叶苜蓿、玉米、莴苣、番茄、马铃薯、黄瓜、及其组合。
在此进一步描述的是包衣有在此描述的真菌菌株的种子。
发明详细说明
已经分离了披露的真菌菌株，并且测试了它们的溶解磷的能力。在以下提供的“实例”部分中，对此作了详细描述。披露的实施例进一步涉及用于增加植物从土壤中摄取的磷的利用率的组合物、种子包衣、方法，并且用于增加植物中磷摄取的方法包括使植物生长在包含磷源的土壤中。
定义：
如在此所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。
如在此使用，术语“生物学纯培养物”旨在指基本上不含有生物污染并且具有遗传一致性的培养物，这样使得从它所取的不同次代培养物将展示基本上相同的基因型和表型(例如培养物具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、高达100％纯的纯度)。
如在此使用，术语“分离(isolate、isolates、isolating)和/或分离的(isolated)等”旨在指从正常发现它的环境移除引用的材料。
如在此使用，术语“接种物”旨在指任何形式的真菌细胞、菌丝体、或孢子，当温度、湿度等的条件利于真菌生长时，它们能够在土壤上或其中繁殖。
如在此使用，术语“孢子”具有本领域普通技术人员熟知并且理解的它的正常含义，并且一般是指处于它的休眠性、受保护状态的微生物。
如在此所使用的，术语具体元素的“来源”旨在意指具有该元素的化合物，至少在考虑到的土壤条件中，该化合物不能使得该元素完全被植物摄取。
如在此使用，术语“有效量”、“有效浓度”、或“有效剂量”旨在指足以引起磷源溶解的一种或更多种真菌分离物的量、浓度、或剂量。处于绝对值的实际有效剂量取决于以下因素，这些因素包括但不局限于用于施加真菌分离物的土地的大小(例如面积、总英亩数等)，可以增加或减少真菌分离物的溶磷活性的其他活性的或惰性的成分之间的协同的或拮抗的相互作用，以及在组合物中的和/或作为种子处理剂的真菌分离物的稳定性。可以确定真菌杀有害生物剂的“有效量”、“有效浓度”、或“有效剂量”，例如通过常规剂量反应实验。
如在此使用，术语“载体”旨在指能够支持如在此描述的一种或更多种真菌分离物的介质。
如在此使用，术语“土壤可兼容的载体”旨在指可以添加至土壤，而不引起/具有植物生长、土壤结构、土壤排水等的有害影响的任何材料。
如在此使用，“至少一种生物学活性成分”旨在指除了在此描述的一种或更多种真菌分离物之外的生物学活性成分(例如信号分子、其他微生物等)。
如在此使用，可以与“一种或更多种植物生长-增强剂”可互换地使用的术语“一种或更多种信号分子”或“一种或更多种植物信号分子”宽泛地指任何试剂，它们是在植物或微生物中天然存在的以及合成的(并且它们可以是非-天然存在的)，直接地或间接地激活或灭活植物生物化学通路，与未处理的植物或获得自未处理的种子的植物相比，导致增加的或增强的植物生长。
如在此使用，术语“增加的植物生长”或“增强的植物生长”旨在指增加的植物产量(例如，如通过每英亩的蒲式耳数测量，增加的生物质、增加的果实数、或其组合)，增加的根的数量、增加的根的质量、增加的根的体积、增加的叶面积、增加植物直立、增加的植物活力、或其组合。
如在此使用，术语“一种或更多种植物”和“一种或更多种植物部分”旨在指所有植物和植物群体，例如希望的和不希望的野生植物或作物植物(包括天然存在的作物植物)。作物植物可以是可通过常规的植物育种与优化方法或通过生物技术与基因工程方法或通过这些方法的组合获得的植物，包括转基因植物并且包括可受或可不受植物育种人权利保护的植物栽培品种。应该将植物部分理解为意指地面上下的所有植物部分和器官，如芽、叶、花以及根，可以提及的实例是叶、针叶、秆、茎、花、子实体、果实、种子、根、块茎以及根茎。植物部分还包括收获的材料以及营养繁殖和有性繁殖材料(例如，插条、块茎、根茎、侧枝以及种子等)。
如在此使用，术语“磷酸盐溶解”或“溶解磷酸盐”等旨在指不可溶的磷酸盐(例如磷矿石等)转化为可溶的磷酸盐形式。
如在此使用，术语“溶解磷酸盐的有机体”旨在指能够将不溶的磷酸盐转化为可溶的磷酸盐形式的任何有机体。
如在此使用，术语“一种或更多种微量营养素”旨在指植物生长、植物健康、和/或植物发育所需的营养素。
如在此使用，术语“一种或更多种生物刺激素”旨在指能够增强植物和土壤内的代谢或生理过程的任何物质。
如在此使用，术语“一种或更多种润湿剂”旨在指能够降低和/或减小水的表面张力的任何物质。
菌株
在一个实施例中，在此描述的一种或更多种菌株是一种或更多种溶解磷酸盐的真菌菌株。在另一实施例中，该一种或更多种菌株是一种或更多种拜赖青霉菌株。如在此使用，物种名“拜赖青霉”旨在包括物种名“拜赖青霉”的所有迭代，例如贯穿本文公开的那些物种名(例如“拜拉吉青霉菌(Penicillium bilaji)”、“拜莱青霉菌”等)。
在另一实施例中，该一种或更多种菌株是具有保藏登录号V08/021001的拜赖青霉菌株的后代(保藏在国家计量研究所(National MeasurementInstitute))。在另一实施例中，该一种或更多种菌株是具有保藏登录号ATCC-20851的拜赖青霉菌株的后代(保藏在美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection))。在另一实施例中，该一种或更多种菌株是具有保藏登录号ATCC-22348的拜赖青霉菌株的后代(保藏在美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection))。仍在另一实施例中，该一种或更多种菌株是具有保藏登录号V08/021001的拜赖青霉菌株和具有保藏登录号ATCC-20851的拜赖青霉菌株的后代。仍在另一实施例中，该一种或更多种菌株是具有保藏登录号V08/021001的拜赖青霉菌株和具有保藏登录号ATCC-22348的拜赖青霉菌株的后代。仍在另一实施例中，该一种或更多种菌株是具有保藏登录号ATCC-20851的拜赖青霉菌株和具有保藏登录号ATCC-22348的拜赖青霉菌株的后代。
仍在另一实施例中，这些菌株是选自下组的青霉属菌株，该组由以下各项组成：
具有保藏登录号NRRL B-50776的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50777的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50778的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50779的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50780的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50781的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50782的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50783的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50784的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50785的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50786的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50787的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50788的菌株，以及
它们的菌株中的两种或更多种的混合物。
在一个具体实施例中，该一种或更多种菌株可以是上述保藏菌株中的一种或更多种(例如包括以上菌株中的至少两种、以上菌株中的至少三种、以上菌株中的至少四种、以上菌株中的至少五种、以上菌株中的至少六种、以上菌株中的至少七种、以上菌株中的至少八种、以上菌株中的至少九种、以上菌株中的至少十种、以上菌株中的至少十一种、以上菌株中的至少十二种、多达并且包括所有以上菌株)。
在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50776的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50777的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50778的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50779的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50780的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50781的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50782的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50783的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50784的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50785的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50786的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50787的菌株。在一个实施例中，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-50788的菌株。
在另一实施例中，该一种或更多种菌株可以是保藏菌株之一的后代。在另一实施例中，一种或更多种保藏菌株是生物学纯培养物(例如具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、高达100％纯的纯度的培养物)。
保藏的真菌培养物源自分离的天然存在的真菌菌株。在2012年，所有保藏菌株都收集在加拿大的萨斯卡通(Saskatoon)。保藏菌株的培养物可以由休眠真菌孢子和/或活真菌组成。
可以使用固态或液体发酵和适合碳源来生长在此描述的青霉属真菌，并且具体地，是具有以下保藏登录号的菌株：NRRL B-50776、NRRL B-50777、NRRL B-50778、NRRL B-50779、NRRL B-50780、NRRL B-50781、NRRL B-50782、NRRL B-50783、NRRL B-50784、NRRL B-50785、NRRL B-50786、NRRL B-50787和NRRL B-50788。可以使用本领域普通技术人员已知的任何适合方法来生长青霉菌分离物。例如，真菌可以培养在固体生长培养基(例如马铃薯葡萄糖琼脂或麦芽琼脂)上，或培养在包含适合液体培养基(例如察氏培养基或马铃薯葡萄糖肉汤)的烧瓶中。在制备青霉菌的接种物中可以使用这些培养方法，这些接种物用于包衣种子和/或施加至待被施加至土壤的载体。
可以通过接种固体培养基(例如泥炭或蛭石基的基质)，或谷物(包括但不局限于燕麦、小麦、大麦、或水稻)，来实现青霉属孢子的固态生产。用适当的青霉属的孢子悬液(1x 102-1x 107cfu/ml)接种灭菌培养基(通过高压灭菌或辐射灭菌达到)，并且取决于基质，将湿度调节至20％至50％。该材料在室温下孵育2至8周。还可以通过液体发酵生产孢子(坎宁安(Cunningham)等人，1990，加拿大植物学期刊(Can J Bot)68:2270-2274)。可以通过在适当pH和温度条件下，在任何适合培养基(例如马铃薯葡萄糖肉汤或蔗糖酵母提取物培养基)中培养真菌来达到液体生产(如可以由本领域任何普通技术人员来进行)。
生成的材料可以直接以组合物的形式使用，如种子处理剂，或可以收获孢子，通过离心进行浓缩，进行配制，并然后且使用风干的、冷冻干燥的、或流化床干燥的技术进行干燥(弗里森(Friesen T.)，希尔(Hill G.)，帕格斯利(Pugsley T.)，霍洛韦(Holloway G.)，和齐默尔曼(ZimmermanD.)，2005，实验确定在对流风干期间拜赖青霉分生孢子的活性损失(Experimental determination of viability loss of Penicillium bilaiae conidia duringconvective air-drying)，应用微生物学和生物技术(Appl MicrobiolBiotechnol)68:397-404)，以生产可湿性粉末。
如以下更详细地表明，在“材料&方法”部分中，根据国际承认用于专利程序的微生物菌种保藏布达佩斯条约，在2012年10月1日，将上述保藏菌株保藏在农业研究服务菌种保藏中心(the Agricultural Research Service CultureCollection)，北大学街(North University Street)1815号，皮奥瑞亚(Peoria)，伊利诺州，61604，美国。
组合物
在另一个方面，本发明涉及包含载体和在此描述的保藏的菌株中的一种或更多种的接种物(孢子形式或处于营养态)的组合物。在某些实施例中，该组合物可以是以下形式：液体、浆液、固体或粉末(可湿性粉末或干粉末)。在另一实施例中，该组合物可以是种子包衣的形式。处于液体、浆液、或粉末(例如可湿性粉末)形式的组合物都可以适合包衣种子。当用于包衣种子时，该组合物可以被施加至种子并且允许干燥。在其中该组合物是粉末(例如可湿性粉末)的实施例中，在施加至种子之前，需要将一种液体(例如水)添加至该粉末。
载体：
在此描述的载体将允许一种或更多种保藏的真菌菌株保持有效(例如能够溶解磷酸盐)并且一旦被配制就有活力。在此描述的载体的非限制性实例包括液体、浆液、或固体(包括可湿性粉末或干粉末)。在一个实施例中，该载体是如在此描述的土壤可兼容的载体。
在一个实施例中，该载体是液体载体。作为用于在此披露的组合物的载体有用的液体的非限制性实例包括水、水溶液、或非水溶液。在一个实施例中，该载体是水。在另一实施例中，该载体是水溶液，例如糖水。在另一实施例中，该载体是非水溶液。如果使用液体载体，则该液体(例如水)载体可以进一步包括生长培养基，用来培养保藏的真菌菌株。用于保藏的真菌菌株的适合生长培养基的非限制性实例包括察氏培养基或马铃薯葡萄糖肉汤，或本领域普通技术人员已知的与保藏的真菌菌株兼容的、和/或为其提供生长营养素的任何培养基。
在另一实施例中，该载体是浆液。在一个实施例中，该浆液可以包括粘合剂、液体、或其组合。预期粘合剂可以是能够将接种物(例如保藏的菌株中的一种或更多种)粘合至感兴趣的基质(例如种子)上的任何试剂。粘合剂的非限制性实例包括藻酸盐、矿物油、糖浆、阿拉伯胶、蜂蜜、甲基纤维素、乳、墙纸浆糊、及其组合。适合用于浆液的液体的非限制性实例包括水或糖水。
在另一实施例中，该载体是固体。在一个具体实施例中，该固体是粉末。在一个实施例中，该粉末是可湿性粉末。在另一实施例中，该粉末是干粉末。在另一实施例中，该固体是颗粒。作为用于在此披露的组合物的载体有用的固体的非限制性实例包括泥炭、小麦、小麦壳、研磨的麦秸、粗麸、蛭石、纤维素、淀粉、土壤(巴氏消毒的或未巴氏消毒的)、石膏、滑石、粘土(例如，高岭土、膨润土、蒙脱石)、和硅胶。
任选成分：
在此披露的组合物可以包括一种或更多种任选成分。任选成分的非限制性实例包括一种或更多种磷源、一种或更多种生物活性成分、微量营养素、生物刺激素、防腐剂、聚合物、润湿剂、表面活性剂、或其组合。
一种或更多种磷源：
在此披露的组合物可以任选地包括一种或更多种磷源。可以使用能够被保藏的菌株溶解的磷的任何来源。
在一个实施例中，一种或更多种磷源是磷矿石。
在另一实施例中，一种或更多种磷源是包含一种或更多种磷源的肥料。可商购的制造的磷酸盐肥料具有多种类型。一些常见类型是包含以下项的那些：磷矿石、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钙、过磷酸盐、三过磷酸盐、和/或聚磷酸铵。通过在大规模肥料制造设施中对不溶天然磷矿石进行化学加工，生产所有这些肥料，并且产品是昂贵的。借助本发明，可能减小施加至土壤的这些肥料的量，同时仍维持从土壤摄取的磷的相同的量。
仍在另一个实施例中，一种或更多种磷源是有机磷源。在另一个具体实施例中，磷的来源是有机肥料。有机肥料是指来源于至少保证最低百分比的氮、磷酸盐和碳酸钾的天然来源的土壤改良剂。有机肥料的非限制性实例包括植物和动物副产品、石粉、海藻、接种体以及调节剂。这些有机肥料通常可以在园林中心和通过园艺供应公司获得。具体而言，磷有机来源可以来自骨粉、肉粉、畜肥、堆肥、污水污泥、或鸟粪、或其组合。
仍在另一实施例中，一种或更多种磷源可以是以下磷源的一个组合，这些磷源包括但不局限于：磷矿石、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钙、过磷酸盐、三过磷酸盐、聚磷酸铵，包含一种或更多种磷源、一种或更多种有机磷源的肥料，及其组合。
一种或更多种生物活性成分：
除了在此描述的真菌杀有害生物剂，在此描述的真菌组合物可以任选地包括一种或更多种如在此描述的生物活性成分。生物活性成分的非限制性实例包括信号分子(例如脂质几丁寡糖(LCO)、壳寡糖(CO)、几丁质化合物、类黄酮、茉莉酸或其衍生物、亚油酸或其衍生物、亚麻酸或其衍生物、卡里金等)和有益的微生物(例如根瘤菌属、慢生根瘤菌属、中华根瘤菌属、固氮根瘤菌属等)。
一种或更多种信号分子：
在一个实施例中，在此描述的组合物可以包括一种或更多种信号分子。在一个实施例中，该一种或更多种信号分子是一种或更多种LCO。在另一实施例中，该一种或更多种信号分子是一种或更多种几丁质化合物。仍在另一实施例中，该一种或更多种信号分子是一种或更多种CO。仍在另一实施例中，该一种或更多种信号分子是一种或更多种类黄酮或其衍生物。仍在另一实施例中，该一种或更多种信号分子是一种或更多种非类黄酮结瘤基因诱导物(例如，茉莉酸、亚油酸、亚麻酸、及其衍生物)。仍在另一实施例中，该一种或更多种信号分子是一种或更多种卡里金或其衍生物。仍在另一实施例中，该一种或更多种信号分子是一种或更多种LCO、一种或更多种几丁质化合物、一种或更多种CO、一种或更多种类黄酮及其衍生物、一种或更多种非类黄酮结瘤基因诱导物及其衍生物、一种或更多种卡里金及其衍生物、或其任何信号分子组合。
LCO：
脂-壳寡糖化合物(LCO)(在本领域中还称为共生性结瘤信号或结瘤因子)由具有缩合在非-还原端的N-连接的脂酰基链的β-l,4-连接的N-乙酰基-D-葡糖胺(“GicNAc”)残基的寡糖骨架组成。LCO的区别在于骨架中GIcNAc残基的数目、脂酰基链的长度和饱和度以及还原和非-还原糖残基的取代。LCO的一个实例在下文以化学式I呈现：
其中：
G是可以被例如氮上的乙酰基、硫酸基团、乙酰基和/或氧上的醚基取代的己糖胺，
可以相同或不同的R1、R2、R3、R5、R6以及R7表示H、CH3CO--、CxHy CO--，其中x是一个在0与17之间的整数并且y是一个在1与35之间的整数，或任何其他酰基(例如像氨甲酰基)，
R4表示包含至少12个碳原子的单-、二-、或三不饱和的脂肪链，并且n是一个在1与4之间的整数。
LCO可以获得(分离和/或纯化)自细菌，例如根瘤菌，例如根瘤菌属、慢生根瘤菌属、中华根瘤菌属以及固氮根瘤菌属。每个这样的细菌种类的LCO结构都是具有特征的，并且每种菌株都可以产生多种具有不同结构的LCO。例如，来自苜蓿中华根瘤菌的特定LCO还已经在美国专利5,549,718中描述为具有化学式II：
其中R表示H或CH3CO--并且n等于2或3。
甚至更特定的LCO包括NodRM、NodRM-1、NodRM-3。当被乙酰化时(R＝CH3CO--)，它们分别变为AcNodRM-1和AcNodRM-3(美国专利5,545,718)。
来自慢生型大豆根瘤菌的LCO描述于美国专利5,175,149和5,321,011中。宽泛地，它们是包括甲基呋喃的戊糖植物激素。描述了许多这些慢生型大豆根瘤菌衍生的LCO-：BjNod-V(C18:1)；BjNod-V(AC，C18:1)，BjNod-V(C16:1)；以及BjNod-V(AC，C16:0)，其中“V”表示存在五个N-乙酰葡糖胺；“Ac”表示乙酰化；“C”后的数字表示脂肪酸侧链中的碳数；并且“:”后的数字表示双键数。
用于本发明的组合物中的LCO可以获得(即，分离和/或纯化)自产生LCO的细菌菌株，例如固氮根瘤菌属、慢生根瘤菌属(包括慢生型大豆根瘤菌)、中慢生根瘤菌属、根瘤菌属(包括豌豆根瘤菌)、中华根瘤菌属(包括苜蓿中华根瘤菌)的菌株，以及被基因工程而产生LCO的细菌菌株。
本发明还涵盖使用获得(即，分离和/或纯化)自菌根真菌(如球囊菌门(Glomerocycota)群组的真菌，例如根内球囊霉(Glomus intraradicus))的LCO的组合物。获得自这些真菌的代表性LCO的结构描述于WO2010/049751和WO 2010/049751中(其中描述的LCO也称为“Myc因子”)。
本发明的组合物进一步涵盖的是使用合成的LCO化合物(例如，描述于WO 2005/063784中的那些)以及通过基因工程产生的重组LCO。基本的天然存在的LCO结构可以包含发现于天然存在的LCO中的修饰或取代，例如描述于斯帕英克(Spaink)，植物科学评论(Crit.Rev.Plant Sci.)54:257-288(2000)和德哈斯(D'Haeze)等人，糖生物学(Glycobiology)12:79R-105R(2002)中的那些。用于构建LCO的前体寡糖分子(在下文描述的CO在本发明中也可用作植物信号分子)还可以由基因工程化的生物来合成，例如如在萨曼(Samain)等人，碳水化合物研究(Carb.Res.)302:35-42(1997)；萨曼等人，生物技术杂志(J.Biotechnol.)72:33-47(1999)中。
LCO可以按不同纯度形式加以利用并且可以单独使用或以产LCO的细菌或真菌的培养物的形式使用-。用于提供基本上纯的LCO的方法包括从LCO和微生物的混合物中简单地除去微生物细胞，或通过LCO溶剂相分离、随后通过HPLC色谱法继续分离和纯化LCO分子，如例如美国专利5,549,718中所述。可以通过重复的HPLC来增强纯化，并且纯化的LCO分子可以冷冻干燥，以便长期存储--。
CO：
壳寡糖(CO)在本领域中作为鉴定为几丁质寡聚体的β-1-4连接的N-乙酰葡糖胺结构而已知，还称为N-乙酰壳寡糖。CO具有独特且不同的侧链修饰，这些修饰使得它们不同于几丁质分子[(C8H13NO5)n，CAS编号1398-61-4]和壳聚糖分子[(C5H11NO4)n，CAS编号9012-76-4]。描述了CO的结构与产生的代表性文献如下：范德霍尔斯特(Van der Holst)等人，结构生物学当前观点(Current Opinion in Structural Biology)，11:608-616(2001)；罗宾娜(Robina)等人，四面体(Tetrahedron)58:521-530(2002)；哈奈尔(Hanel)等人，植物学(Planta)232:787-806(2010)；罗赫(Rouge)等人第27章，实验医学与生物学进展(Advances in Experimental Medicine andBiology)中的“复合碳水化合物的分子免疫学(The Molecular Immunology ofComplex Carbohydrates)”，施普林格科学(Springer Science)；温(Wan)等人，植物细胞(Plant Cell)21:1053-69(2009)；PCT/F100/00803(9/21/2000)；以及德蒙特科雷特(Demont-Caulet)等人，植物生理学(Plant Physiol.)120(1):83-92(1999)。这些CO可以是合成的或重组的。用于制备重组CO的方法在本领域是已知的。参见例如，萨曼(Samain)等人(见上文)；科塔兹(Cottaz)等人，工程方法(Meth.Eng.)7(4):311-7(2005)以及萨曼等人，生物技术杂志(J.Biotechnol.)72:33-47(1999)。
几丁质化合物：
作为真菌的细胞壁和虫与甲壳动物的外骨骼的主要组分的几丁质和壳聚糖也由GIcNAc残基构成。几丁质化合物包括几丁质(IUPAC：N-[5-[[3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)噁烷-2基]甲氧基甲基]-2-[[5-乙酰氨基-4,6-二羟基-2-(羟基甲基)噁烷-3-基]甲氧基甲基]-4-羟基-6-(羟基甲基)噁烷-3-基]乙酰胺)，以及壳聚糖(IUPAC：5-氨基-6-[5-氨基-6-[5-氨基-4,6-二羟基-2(羟基甲基)噁烷-3-基]氧基-4-羟基-2-(羟基甲基)噁烷-3-基]氧基-2(羟基甲基)噁烷-3,4-二醇)。
这些化合物可以商业地获得自例如西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)或制备自昆虫、甲壳动物壳或真菌细胞壁。用于制备几丁质和壳聚糖的方法在本领域是已知的并且已经描述于例如美国专利4,536,207(制备自甲壳动物壳)；伯查纳瓦里奇(Pochanavanich)等人，应用微生物学快报(Lett.Appl.Microbiol.)35:17-21(2002)(制备自真菌细胞壁)；以及美国专利5,965,545(制备自蟹壳和商业壳聚糖的水解)中。可以获得范围从小于35％至大于90％脱乙酰化的脱乙酰化几丁质和壳聚糖，并且包括广谱的分子量，例如小于15kD的低分子量壳聚糖寡聚体和0.5至2kD的几丁质寡聚体；分子量约15kD的“实用等级”壳聚糖；以及高达70kD的高分子量壳聚糖。用于种子处理的配制的几丁质和壳聚糖组合物也是可商购的。商品包括例如(植物防御支持公司(Plant Defense Boosters,Inc.))和BEYONDTM(Agrihouse公司)。
类黄酮：
类黄酮是具有两个由三-碳桥连接的芳环的一般结构的酚类化合物。类黄酮是由植物产生并且具有许多功能，例如作为有益的信号传导分子以及作为保护剂以免受虫、动物、真菌以及细菌。类黄酮的种类包括查耳酮、花色素、香豆素、黄酮、黄烷醇、黄酮醇、黄烷酮以及异黄酮。参见，杰恩(Jain)等人，植物生物化学与生物技术杂志(J.Plant Biochem.&Biotechnol.)11:1-10(2002)；绍尔(Shaw)等人，环境微生物学(Environmental Microbiol.)11:1867-80(2006)。
可以用于本发明的组合物中的代表性类黄酮包括木犀草素、芹菜素、柑橘黄酮、槲皮素、山奈酚、杨梅素、漆黄素、异鼠李素、霍香黄酮醇、甲基鼠李素、橙皮素、柚皮素、刺芒柄花素、圣草素、高圣草素、黄杉素、二氢槲皮素、二氢山萘酚、染料木素、大豆黄酮、黄豆黄素、儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素3-没食子酸酯、没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素3-没食子酸酯、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、氰化、翠雀花素、锦葵色素、天竺葵色素、芍药花青素、甲花翠素或其衍生物。类黄酮化合物可商购自例如纳特兰德国际公司(Natland InternationalCorp.)，三角科学园(Research Triangle Park)，北卡罗来纳州；MP生物医药公司(MP Biomedicals)，欧文，加州；LC实验室(LC Laboratories)，沃本，马萨诸塞州。类黄酮化合物可以分离自植物或种子，例如如美国专利5,702,752；5,990,291；以及6,146,668中所述。类黄酮化合物还可以由基因工程化的生物(例如酵母)产生，如，描述于罗尔斯顿(Ralston)等人，植物生理学(Plant Physiology)137:1375-88(2005)中。
一种或更多种非类黄酮结瘤基因诱导物：
茉莉酸(JA，[1R-[1α,2β(Z)]]-3-氧代-2-(戊烯基)环戊烷乙酸)及其衍生物、亚油酸((Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸)及其衍生物和亚麻酸((Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸)及其衍生物也可以用于本发明的组合物中。统称为茉莉酸酯的茉莉酸及其甲酯(茉莉酸甲酯(MeJA))是天然存在于植物中的类十八烷基化合物-。茉莉酸由小麦幼苗的根产生，并且由真菌微生物(如可可球二孢和藤仓赤霉菌(Gibbrella fujikuroi)、酵母(酿酒酵母)以及大肠杆菌的致病和非致病菌株产生-。亚油酸和亚麻酸是在茉莉酸的生物合成过程中产生。据报道，茉莉酸酯、亚油酸和亚油酸(及其衍生物)是根际细菌表达结瘤基因或产生LCO的诱导物。参见例如，马布德(Mabood)，法兹利(Fazli)，茉莉酸酯诱导结瘤基因在慢生型大豆根瘤菌中的表达(Jasmonatesinduce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum)，2001年5月17日；和马布德(Mabood)，法兹利(Fazli)，“亚油酸和亚麻酸诱导结瘤基因在慢生型大豆根瘤菌中的表达(Linoleic and linolenic acid induce theexpression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum)”，USDA 3，2001年5月17日。
可以用于本发明的组合物中的亚油酸、亚麻酸和茉莉酸的有用衍生物包括酯、酰胺、糖苷以及盐。代表性酯是以下化合物，其中亚油酸、亚麻酸或茉莉酸的羧基已经被--COR基团替代，其中R是--OR1基团，其中R1是：烷基，如C1-C8直链或支链烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，如C2-C8直链或支链烯基；炔基，如C2-C8直链或支链炔基；具有例如6至10个碳原子的芳基；或具有例如4至9个碳原子的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是例如N、O、P或S。代表性酰胺是以下化合物，其中亚油酸、亚麻酸或茉莉酸的羧基已经被--COR基团替代，其中R是NR2R3基团，其中R2和R3独立地是：氢、烷基，如C1-C8直链或支链烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，如C2-C8直链或支链烯基；炔基，如C2-C8直链或支链炔基；具有例如6至10个碳原子的芳基；或具有例如4至9个碳原子的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是例如N、O、P或S。可以通过已知的方法制备酯，例如酸-催化的亲核加成，其中使羧酸在催化量的矿物酸的存在下与醇反应。也可以通过已知的方法制备酰胺，例如通过使羧酸在偶联剂(例如二环己基碳二亚胺(DCC))的存在下与适当的胺在中性条件下反应。亚油酸、亚麻酸和茉莉酸的适合的盐包括例如碱加成盐。可以用作制备这些化合物的代谢上可接受的碱盐的试剂的碱包括来源于阳离子(如碱金属阳离子(例如，钾和钠)和碱土金属阳离子(例如，钙和镁))的那些。这些盐可以通过将亚油酸、亚麻酸或茉莉酸的溶液与碱溶液混合在一起而容易地制备。盐可以通过过滤从溶液中沉淀并收集，或可以通过其他手段(例如通过蒸发溶剂)回收。
一种或更多种卡里金：
卡里金是插烯4H-吡喃酮，例如2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮，包括其衍生物和类似物。这些化合物的实例由以下结构表示：
其中；Z是O、S或NR5；R1、R2、R3以及R4各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、羟基、羟烷基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、CN、COR6、COOR＝、卤素、NR6R7或NO2；并且R5、R6和R7各自独立地是H、烷基或烯基，或其生物学上可接受的盐。这些化合物的生物学上可接受的盐的实例可以包括与生物学上可接受的酸形成的酸加成盐，其实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐、乙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐；甲磺酸盐、苯磺酸盐以及对甲苯磺酸。另外的生物学上可接受的金属盐可以包括与碱形成的碱金属盐，其实例包括钠盐和钾盐。由该结构涵盖且可以适于在本发明中使用的化合物的实例包括以下各项：3-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1＝CH3，R2、R3、R4＝H)、2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R2、R3、R4＝H)、7-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R2、R4＝H，R3＝CH3)、5-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R2、R3＝H，R4＝CH3)、3,7-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R3＝CH3，R2、R4＝H)、3,5-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R4＝CH3，R2、R3＝H)、3,5,7-三甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R3、R4＝CH3，R2＝H)、5-甲氧基甲基-3-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1＝CH3，R2、R3＝H，R4＝CH2OCH3)、4-溴-3,7-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R3＝CH3，R2＝Br，R4＝H)、3-甲基呋喃并[2,3-c]吡啶-2(3H)-酮(其中Z＝NH，R1＝CH3，R2、R3、R4＝H)、3,6-二甲基呋喃并[2,3-c]吡啶-2(6H)-酮(其中Z＝N--CH3，R1＝CH3，R2、R3、R4＝H)。参见美国专利7,576,213。这些分子又称卡里金。参见，哈尔福德(Halford)，化学与工程新闻(Chem.Eng.News)(2010年4月12日)，第37-38页中的“烟雾信号(Smoke Signals)”(报道到森林火灾后，包含在烟雾中的卡里金或丁烯羟酸内酯充当生长刺激剂并刺激种子萌发，并且可以使已经被存储的种子(例如玉米、番茄、莴苣以及洋葱)健壮)。这些分子是美国专利7,576,213的主题。
一种或更多种有益的微生物：
在一个实施例中，在此描述的组合物可以包括一种或更多种有益的微生物。该一种或更多种有益的微生物可以具有一种或更多种有益特性(例如，产生一种或更多种在此描述的信号分子、增强营养素和水的吸收、促进和/或增强固氮作用、增强生长、增强种子萌发、增强出苗、打破植物的休眠或静止等)。
在一个实施例中，该一种或更多种有益的微生物是一种或更多种细菌。在另一实施例中，这些细菌是固氮生物(即，作为共生固氮细菌的细菌)。仍在另一实施例中，这些细菌是来自根瘤菌属(例如，解纤维素根瘤菌、大田市根瘤菌(R.daejeonense)、艾利特根瘤菌(R.etli)、山羊豆根瘤菌(R.galegae)、高卢根瘤菌(R.gallicum)、贾氏根瘤菌(R.giardinii)、海南根瘤菌(R.hainanense)、胡特兰根瘤菌(R.huautlense)、木兰根瘤菌(R.indigoferae)、豌豆根瘤菌、黄土根瘤菌(R.loessense)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、葡萄牙根瘤菌(R.lusitanum)、苜蓿根瘤菌、内蒙根瘤菌(R.mongolense)、汨罗江根瘤菌(R.miluonense)、苏拉根瘤菌(R.sullae)、热带根瘤菌(R.tropici)、R.undicola和/或杨陵根瘤菌(R.yanglingense))、慢生根瘤菌属(例如，贝特慢生根瘤菌(B.bete)、B.canariense、埃氏慢生根瘤菌(B.elkanii)、B.iriomotense、慢生型大豆根瘤菌、豆薯慢生根瘤菌(B.jicamae)、辽宁慢生根瘤菌(B.liaoningense)、B.pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌(B.yuanmingense))、固氮根瘤菌属(例如，茎瘤固氮根瘤菌和/或德贝莱纳固氮根瘤菌(A.doebereinerae))、中华根瘤菌属(例如，阿布里中华根瘤菌(S.abri)、附着剑中华根瘤菌(S.adhaerens)、美洲中华根瘤菌(S.americanum)、木本树中华根瘤菌(S.aboris)、费氏中华根瘤菌(S.fredii)、S.indiaense、柯斯第中华根瘤菌(S.kostiense)、鸡眼草中华根瘤菌(S.kummerowiae)、苜蓿中华根瘤菌(S.medicae)、草木樨中华根瘤菌(S.meliloti)、墨西哥中华根瘤菌(S.mexicanus)、莫雷兰中华根瘤菌(S.morelense)、撒哈拉中华根瘤菌(S.saheli)、好客中华根瘤菌(S.terangae)和/或新疆中华根瘤菌(S.xinjiangense))、中慢生根瘤菌属(合欢中慢生根瘤菌(M.albiziae)、紫穗槐中慢生根瘤菌(M.amorphae)、查科中慢生根瘤菌(M.chacoense)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(M.ciceri)、中慢生华癸根瘤菌(M.huakuii)、中慢生型百脉根根瘤菌(M.loti)、地中海中慢生根瘤菌(M.mediterraneum)、M.pluifarium、北方中慢生根瘤菌(M.septentrionale)、温带中慢生根瘤菌(M.temperatum)和/或天山中慢生根瘤菌(M.tianshanense))的细菌或其组合。在一个具体实施例中，该有益的微生物选自下组，该组由以下各项组成：慢生型大豆根瘤菌、豌豆根瘤菌、草木樨根瘤菌(R meliloti)、草木樨中华根瘤菌及其组合。在另一实施例中，该有益的微生物是慢生型大豆根瘤菌。在另一实施例中，该有益的微生物是豌豆根瘤菌。在另一实施例中，该有益的微生物是草木樨根瘤菌。在另一实施例中，该有益的微生物是草木樨中华根瘤菌。
在另一实施例中，该有益的微生物是一种或更多种菌根。具体而言，该一种或更多种菌根是内生菌根(亦称泡囊-丛枝状菌根、VAM、丛枝菌根或AM)、外生菌根或其组合。
在一个实施例中，该一种或更多种菌根是球囊菌门和球囊霉与巨孢囊霉属的内生菌根。仍在一个另外的实施例中，该内生菌根是聚丛球囊霉(Glomus aggregatum)、巴西球囊霉(Glomus brasilianum)、明球囊霉(Glomus clarum)、沙漠球囊霉(Glomus deserticola)、幼套球囊霉(Glomus etunicatum)、聚生球囊霉(Glomus fasciculatum)、根内球囊霉、单孢球囊霉(Glomus monosporum)或摩西球囊霉(Glomus mosseae)、珠状巨孢囊霉(Gigaspora margarita)的菌株，或其组合。
在另一实施例中，该一种或更多种菌根是担子菌门、子囊菌门和接合菌门的外生菌根。仍在另一实施例中，该外生菌根是双色蜡蘑、漆蜡蘑(Laccaria laccata)、彩色豆马勃、Rhizopogon amylopogon、Rhizopogonfulvigleba、浅黄根须腹菌(Rhizopogon luteolus)、Rhizopogon villosuli、光硬皮马勃(Scleroderma cepa)、黄硬皮马勃(Scleroderma citrinum)的菌株，或其组合。
仍在另一实施例中，该一种或更多种菌根是杜鹃花类(ecroid)菌根、丛枝类(arbutoid)菌根或水晶兰类(monotropoid)菌根。丛枝菌根和外生菌根与许多属于杜鹃花目的植物形成杜鹃花类菌根，而一些杜鹃花目形成丛枝类菌根和水晶兰类菌根。所有兰花在其生命周期过程中的某一阶段都是真菌异养的(mycoheterotrophic)并且与一系列担子菌真菌形成兰花菌根。在一个实施例中，该菌根可以是一种杜鹃花类菌根，优选子囊菌门的杜鹃花类菌根，例如灰斑膜盘菌(Hymenoscyphous ericae)或树粉孢属。在另一实施例中，该菌根可以是一种丛枝类菌根，优选担子菌门的丛枝类菌根。仍在另一实施例中，该菌根可以是一种水晶兰类菌根，优选担子菌门的水晶兰类菌根。仍在另一实施例中，该菌根可以是一种兰花菌根，优选丝核菌属的兰花菌根。
一种或更多种微量营养素：
仍在另一实施例中，在此描述的组合物可以包括一种或更多种有益的微量营养素。用于在此描述的组合物中使用的微量营养素的非限制性实例包括维生素(例如，维生素A、复合维生素B(即，维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B8、维生素B9、维生素B12、胆碱)、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、类葫萝卜素(α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、隐黄质、叶黄素、番茄红素、玉米黄质等)、常量矿物质(例如，钙、镁、钾、钠、铁等)、痕量矿物质(例如，硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、硒、锌等)、有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、牛磺酸等)及其组合。
在一个具体实施例中，这些组合物包括硼、氯、铜、铁、锰、钼、锌或其组合。
一种或更多种生物刺激剂：
在一个实施例中，在此描述的组合物可以包括一种或更多种有益的生物刺激剂。生物刺激剂可以增强代谢或生理过程，例如呼吸作用、光合作用、摄取核酸、摄取离子、输送营养或其组合。生物刺激剂的非限制性实例包括海藻提取物(例如，球型褐藻)、腐植酸(例如，腐殖酸钾)、富里酸、肌醇(myo-inositol)、甘氨酸及其组合。在另一个实施例中，这些组合物包括海藻提取物、腐植酸、富里酸、肌醇、甘氨酸及其组合。
一种或更多种聚合物：
在一个实施例中，在此描述的组合物可以进一步包括一种或更多种聚合物。聚合物在农业产业中的非限制性用途包括输送农用化学品、去除重金属、保水和/或输送水及其组合。包斯(Pouci)等人，美国农业与生物科学杂志(Am.J.Agri.&Biol.Sci.)，3(1):299-314(2008)。在一个实施例中，该一种或更多种聚合物是天然聚合物(例如，琼脂、淀粉、藻酸盐、果胶、纤维素等)、合成聚合物、可生物降解的聚合物(例如，聚己内脂、聚交酯、聚(乙烯醇)等)或其组合。
对于有用于在此描述的组合物的聚合物的非限制性列表，参见包斯(Pouci)等人，美国农业与生物科学杂志(Am.J.Agri.&Biol.Sci.)，3(1):299-314(2008)。在一个实施例中，在此描述的组合物包括纤维素、纤维素衍生物、甲基纤维素、甲基纤维素衍生物、淀粉、琼脂、藻酸盐、果胶、聚乙烯吡咯烷酮及其组合。
一种或更多种润湿剂：
在一个实施例中，在此描述的组合物可以进一步包括一种或更多种润湿剂。通常将润湿剂应用至土壤上，具体地是疏水性土壤上，以改进进入土壤的水的浸润和/或穿透。该润湿剂可以是辅助剂、油、表面活性剂、缓冲剂、酸化剂、或其组合。在一个实施例中，该润湿剂是表面活性剂。在一个实施例中，该润湿剂是一种或更多种非离子表面活性剂、一种或更多种阴离子表面活性剂、或其组合。仍在另一实施例中，该润湿剂是一种或更多种非离子表面活性剂。
在“表面活性剂”部分中提供了适合在此描述的组合物的表面活性剂。
一种或更多种表面活性剂：
适用于在此描述的组合物的表面活性剂可以是非离子表面活性剂(例如，半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子的)。预期该一种或更多种表面活性剂将对该一种或更多种保藏的菌株和/或一种或更多种有益的微生物的活性造成尽可能小的伤害。这些表面活性剂可以湿润并乳化一处或多处土壤和/或一处或多处泥土。预期用于所描述的组合物中的表面活性剂对于包含在配制物中的微生物而言具有低的毒性。进一步预期用于所描述的组合物中的表面活性剂具有低的植物毒性(即，物质或物质的组合对植物具有的毒性程度)。可以使用单个的表面活性剂或若干表面活性剂的共混物。
阴离子表面活性剂
阴离子表面活性剂或阴离子和非离子表面活性剂的混合物也可以用于这些组合物中。阴离子表面活性剂是在水性溶液中具有处于阴离子或带负电荷状态的亲水性部分的表面活化剂。在此描述的组合物可以包括一种或更多种阴离子表面活性剂。该一种或更多种阴离子表面活性剂可以是水溶性阴离子表面活性剂、水不可溶的阴离子表面活性剂，或水溶性阴离子表面活性剂和水不可溶的阴离子表面活性剂的组合。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括磺酸、硫酸酯、羧酸及其盐。水溶性阴离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基酰氨基醚硫酸盐、烷基芳基聚醚硫酸盐、烷基芳基硫酸盐、烷基芳基磺酸盐、单甘油酯硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基酰胺磺酸盐、烷基芳基磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、异丙苯磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基二苯醚磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基萘磺酸盐、石蜡磺酸盐、木质素磺酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、乙氧基化磺基琥珀酸盐、烷基醚磺基琥珀酸盐、烷基酰胺磺基琥珀酸盐、烷基磺基琥珀酰胺酸盐、烷基磺基乙酸盐、烷基磷酸盐、磷酸酯、烷基醚磷酸盐、酰基肌氨酸盐、酰基羟乙基磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、N-酰基-N-烷基牛磺酸盐、烷基羧酸盐或其组合。
非离子表面活性剂
非离子表面活性剂是当溶解或分散于水性介质中时不带电荷的表面活性剂。在此处描述的组合物的至少一个实施例中，使用一种或更多种非离子表面活性剂，因为它们提供希望的湿润和乳化作用并且不显著抑制孢子的稳定性和活性。该一种或更多种非离子表面活性剂可以是水溶性非离子表面活性剂、水不可溶的非离子表面活性剂，或水溶性非离子表面活性剂和水不可溶的非离子表面活性剂的组合。
水不可溶的非离子表面活性剂
水不可溶的非离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基和芳基：甘油醚、乙二醇醚、乙醇酰胺、磺酰胺、醇、酰胺、醇乙氧基化物、甘油酯、乙二醇酯、甘油酯和乙二醇酯的乙氧基化物、糖基烷基多糖苷、聚氧乙烯化脂肪酸、烷醇胺冷凝物、烷醇酰胺、三级炔属乙二醇、聚氧乙烯化硫醇、羧酸酯、聚氧乙烯化聚氧丙烯乙二醇、山梨糖醇脂肪酸酯或其组合。还包括EO/PO嵌段共聚物(EO是环氧乙烷，PO是环氧丙烷)、EO聚合物与共聚物、聚胺以及聚乙烯吡咯烷酮。
水溶性非离子表面活性剂
水溶性非离子表面活性剂的非限制性实例包括山梨糖醇脂肪酸醇乙氧基化物和山梨糖醇脂肪酸酯乙氧基化物。
非离子表面活性剂的组合
在一个实施例中，在此描述的组合物包括至少一种或更多种非离子表面活性剂。在一个实施例中，这些组合物包括至少一种水不可溶的非离子表面活性剂和至少一种水溶性非离子表面活性剂。在再另一个实施例中，这些组合物包括具有基本上相同的长度的烃链的非离子表面活性剂的组合。
其他表面活性剂
在另一个实施例中，在此描述的组合物还可以包括有机硅表面活性剂，其是在硅酮基和矿物油基消泡剂中用作表面活性剂的硅酮基消泡剂。在又另一个实施例中，在此描述的组合物还可以包括脂肪酸的碱金属盐(例如，脂肪酸的水溶性碱金属盐和/或脂肪酸的水不可溶的碱金属盐)。
一种或更多种除草剂：
在一个实施例中，在此描述的组合物可以进一步包括一种或更多种除草剂。在一个具体实施例中，该除草剂可以是萌发前除草剂、萌发后除草剂或其组合。
适合的除草剂包括化学除草剂、天然除草剂(例如，生物除草剂、有机除草剂等)或其组合。适合的除草剂的非限制性实例包括灭草松、氟羧草醚、氯嘧磺隆、克阔乐、异噁草酮、吡氟禾草灵、草丁磷、草甘膦、烯禾啶、咪草烟、甲氧咪草烟、氟黄胺草醚、酰亚胺苯氧乙酸、灭草喹、烯草酮、二甲戊乐灵；3,4-二甲基-2,6-二硝基-N-戊-3-基-苯胺；N-(1-乙基丙基)-2,6-二硝基-3,4-二甲基代苯胺；拿草特；戊炔草胺；3,5-二氯-N-(1,1-二甲基丙炔基)苯甲酰胺；3,5-二氯-N-(1,1-二甲基-2-丙炔基)苯甲酰胺；N-(1,1-二甲基丙炔基)-3,5-二氯苯甲酰胺；S-乙基N-乙基硫代环己烷氨基甲酸酯；氟乐灵；2,6-二硝基-N,N-二丙基-4-(三氟甲基)苯胺；草甘膦；N-(膦酰基甲基)甘氨酸；及其衍生物。在一个实施例中，用于根据本披露进行使用的一种或更多种除草剂包括拿草特(商业上称为)；戊炔草胺；3,5-二氯-N-(1,1-二甲基丙炔基)苯甲酰胺；3,5-二氯-N-(1,1-二甲基-2-丙炔基)苯甲酰胺；N-(1,1-二甲基丙炔基)-3,5-二氯苯甲酰胺；环草特，S-乙基N-乙基硫代环己烷氨基甲酸酯(商业上称为)；氟乐灵；2,6-二硝基-N,N-二丙基-4-(三氟甲基)苯胺；草甘膦；N-(膦酰基甲基)甘氨酸；及其衍生物。包含这些化合物中的每种的商品是可容易地获得的。组合物中的除草剂浓度通常将对应于具体除草剂的标记使用比率。
一种或更多种杀真菌剂：
在一个实施例中，在此描述的组合物可以进一步包括一种或更多种杀真菌剂。可用于在此描述的组合物的杀真菌剂将对宽范围的病原体适合地展示出活性，包括但不限于疫霉属、丝核菌属、镰刀菌属、腐霉属、拟茎点霉属或核盘菌属(Selerotinia)以及层锈菌属及其组合。
可以适于在此披露的组合物的商业杀真菌剂的非限制性实例包括RIVAL或ALLEGIANCE FL或LS(古斯塔夫森公司(Gustafson)，普莱诺(Plano)，德克萨斯州)，WARDEN RTA(阿勒兰斯公司(Agrilance)，圣保罗，明尼苏达州)，APRON XL、APRON MAXXRTA或RFC、MAXIM 4FS或XL(先正达公司(Syngenta)，威明顿(Wilmington)，特拉华州)，CAPTAN(阿维斯塔公司(Arvesta)，圭尔夫(Guelph)，安大略省)以及PROTREAT(阿根廷根瘤菌剂公司(NitraginArgentina)，布宜诺斯艾利斯，阿根廷)。这些以及其他商业杀真菌剂中的活性成分包括但不限于咯菌腈、精甲霜灵、嘧菌酯以及甲霜灵。商业杀真菌剂最适合地根据厂商的说明书以推荐的浓度使用。
一种或更多种杀昆虫剂：
在一个实施例中，在此描述的组合物可以进一步包括一种或更多种杀昆虫剂。有用于在此描述的组合物的杀昆虫剂将对宽范围的虫适合地展示出活性，包括但不限于金针虫、地老虎、蛴螬、玉米根虫、玉米种子蛆虫、跳甲、麦长蝽、蚜虫、叶甲、椿象及其组合。
可以适于在此披露的组合物的商业杀昆虫剂的非限制性实例包括CRUISER(先正达公司，威明顿(Wilmington)，特拉华州)、GAUCHO和PONCHO(古斯塔夫森公司(Gustafson)，普莱诺(Plano)，德克萨斯州)。这些以及其他商业杀昆虫剂中的活性成分包括噻虫嗪、噻虫胺和吡虫啉。商业杀昆虫剂最适合地根据厂商的说明书以推荐的浓度使用。
方法
在另一方面中，披露了使用在此描述的保藏的菌株和组合物的方法。
在一个实施例中，描述了用于增加植物从土壤中摄取的磷的利用率的方法。该方法包括将选自下组的一种或更多种真菌菌株引入土壤中，该组由以下各项组成：
具有保藏登录号NRRL B-50776的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50777的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50778的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50779的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50780的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50781的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50782的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50783的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50784的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50785的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50786的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50787的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50788的菌株，以及
它们的菌株中的两种或更多种的混合物。
在一个具体实施例中，该方法包括引入上述保藏菌株中的一种或更多种(例如包括以上菌株中的至少两种、以上菌株中的至少三种、以上菌株中的至少四种、以上菌株中的至少五种、以上菌株中的至少六种、以上菌株中的至少七种、以上菌株中的至少八种、以上菌株中的至少九种、以上菌株中的至少十种、以上菌株中的至少十一种、以上菌株中的至少十二种、多达并且包括所有以上菌株)的接种物。
在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50776的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50777的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50778的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50779的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50780的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50781的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50782的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50783的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50784的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50785的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50786的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50787的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50788的菌株。
仍在另一实施例中，将保藏的真菌菌株中的一种或更多种的接种物引入土壤的步骤包括将在此描述的组合物中的一种或更多种引入土壤。根据本领域普通技术人员已知的方法，可以将该一种或更多种接种物或组合物引入土壤。非限制性实例包括沿沟引入、喷洒、包衣种子、叶面引入等。在一个具体实施例中，引入步骤包括在此描述的接种物或组合物的沿沟引入。
在一些实施例中，将保藏的真菌菌株中的一种或更多种引入土壤的步骤包括引入一个有效量的保藏的真菌菌株中的一种或更多种。在某些实施例中，将保藏的真菌菌株中的一种或更多种的接种物引入土壤的步骤包括按以下量将接种物引入土壤：每公顷1x 101-1x 108个集落形成单位，更优选地1x106-1x 1012个集落形成单位。在某些其他实施例中，将保藏的真菌菌株中的一种或更多种的接种物引入土壤的步骤包括引入按以下量包衣种子的保藏的真菌菌株：每个种子1x 101-1x 108个集落形成单位，更优选地1x 102-1x 106个集落形成单位。
仍进一步，该方法可以包括使真菌菌株与一种或更多种磷源接触，例如通过将一种或更多种磷源添加至土壤。添加磷源的步骤可以发生在将接种物引入土壤的步骤之前、之后或过程中。仍在另一实施例中，一种或更多种磷源可以是在此描述的组合物中的一种成分。根据在此描述的方法，可以使用能够被保藏的菌株溶解的磷的任何来源。
在一个实施例中，一种或更多种磷源是磷矿石。
在另一实施例中，一种或更多种磷源是包含一种或更多种磷源的肥料。可商购的制造磷肥具有很多类型。一些常见类型是包含以下项的那些：磷矿石、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钙、过磷酸盐、三过磷酸盐、和/或聚磷酸铵。通过在大规模肥料制造设施中对不溶天然磷矿石进行化学加工，生产所有这些肥料，并且产品是昂贵的。借助本发明，可能减小施加至土壤的这些肥料的量，同时仍维持从土壤摄取的磷的相同的量。
仍在另一个实施例中，一种或更多种磷源是有机磷源。在另一个具体实施例中，磷的来源是有机肥料。有机肥料是指来源于至少保证最低百分比的氮、磷酸盐和碳酸钾的天然来源的土壤改良剂。有机肥料的非限制性实例包括植物和动物副产品、石粉、海藻、接种体以及调节剂。这些有机肥料通常可以在园林中心和通过园艺供应公司获得。具体而言，磷有机来源可以来自骨粉、肉粉、畜肥、堆肥、污水污泥、或鸟粪、或其组合。
仍在另一实施例中，一种或更多种磷源可以是以下磷源的一个组合，这些磷源包括但不局限于：磷矿石、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钙、过磷酸盐、三过磷酸盐、聚磷酸铵，包含一种或更多种磷源、一种或更多种有机磷源的肥料，或其组合。
在另一方面，该方法包括使植物生长在包含一种或更多种磷源和选自下组的一种或更多种真菌菌株的土壤中，该组由以下各项组成：
具有保藏登录号NRRL B-50776的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50777的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50778的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50779的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50780的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50781的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50782的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50783的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50784的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50785的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50786的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50787的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50788的菌株，以及
它们的菌株中的两种或更多种的混合物。
在一个具体实施例中，该方法包括上述保藏的菌株中的一种或更多种(例如包括以上菌株中的至少两种、以上菌株中的至少三种、以上菌株中的至少四种、以上菌株中的至少五种、以上菌株中的至少六种、以上菌株中的至少七种、以上菌株中的至少八种、以上菌株中的至少九种、以上菌株中的至少十种、以上菌株中的至少十一种、以上菌株中的至少十二种、多达并且包括所有以上菌株)的接种物。
在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50776的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50777的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50778的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50779的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50780的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50781的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50782的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50783的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50784的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50785的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50786的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50787的菌株。在一个实施例中，该接种物包括具有保藏登录号NRRL B-50788的菌株。
在一个具体实施例中，将保藏的真菌菌株中的一种或更多种引入土壤的步骤包括将在此描述的组合物中的一种或更多种引入土壤。在一些实施例中，该组合物包括一个有效量的保藏的真菌菌株中的一种或更多种。在某些实施例中，将保藏的真菌菌株中的一种或更多种的接种物引入土壤的步骤包括按以下量将接种物引入土壤：每公顷1x 101-1x 108个集落形成单位，更优选地1x 106-1x 1012个集落形成单位。在某些其他实施例中，将保藏的真菌菌株中的一种或更多种的接种物引入土壤的步骤包括引入按以下量包衣种子的保藏的真菌菌株：每个种子1x 101-1x 108个集落形成单位，更优选地1x 102-1x 106个集落形成单位。
在一个实施例中，该方法进一步包括在生长步骤之前或过程中引入一种或更多种磷源、以及在生长步骤之前或过程中引入保藏的菌株中的一种或更多种的接种物的步骤。引入一种或更多种磷源和引入保藏的菌株中的一种或更多种的接种物可以发生在同一时间、在基本上同一时间、或在不同时间。在另一实施例中，必要时可以重复引入步骤。
在一个实施例中，一种或更多种磷源是磷矿石。
在另一实施例中，一种或更多种磷源是包含一种或更多种磷源的肥料。可商购的制造磷肥具有很多类型。一些常见类型是包含以下项的那些：磷矿石、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钙、过磷酸盐、三过磷酸盐、和/或聚磷酸铵。通过在大规模肥料制造设施中对不溶天然磷矿石进行化学加工，生产所有这些肥料，并且产品是昂贵的。借助本发明，可能减小施加至土壤的这些肥料的量，同时仍维持从土壤摄取的磷的相同的量。
仍在另一个实施例中，一种或更多种磷源是有机磷源。在另一个具体实施例中，磷的来源是有机肥料。有机肥料是指来源于至少保证最低百分比的氮、磷酸盐和碳酸钾的天然来源的土壤改良剂。有机肥料的非限制性实例包括植物和动物副产品、石粉、海藻、接种体以及调节剂。这些有机肥料通常可以在园林中心和通过园艺供应公司获得。具体而言，磷有机来源可以来自骨粉、肉粉、畜肥、堆肥、污水污泥、或鸟粪、或其组合。
仍在另一实施例中，一种或更多种磷源可以是以下磷源的一个组合，这些磷源包括但不局限于：磷矿石、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钙、过磷酸盐、三过磷酸盐、聚磷酸铵，包含一种或更多种磷源、一种或更多种有机磷源的肥料，或其组合。
对于改进生长条件，在此描述的方法是潜在地有用的，导致任何类型的植物的增加的磷摄取和/或产量。在一个具体实施例中，植物选自下组，该组由以下各项组成：非豆科植物、豆科植物、芸薹属、谷类、水果、蔬菜、坚果、花卉、和草皮。具体地，谷类是小麦、玉米、水稻、燕麦、黑麦、大麦。具体地，豆科植物是滨豆、鹰嘴豆、豆、大豆、豌豆、和苜蓿。
在另一具体实施例中，这些植物选自下组，该组由以下各项组成：苜蓿、水稻、小麦、大麦、黑麦、燕麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、豆、豌豆、鹰嘴豆、扁豆、菊苣、莴苣、苦苣、甘蓝、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风草、芜菁、菜花、西兰花、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、辣椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、绿皮西葫芦、黄瓜、苹果、梨、西瓜、柑橘、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱以及甘蔗。
种子包衣
在另一方面，种子包衣有选自下组的一种或更多种真菌菌株，该组由以下各项组成：
具有保藏登录号NRRL B-50776的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50777的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50778的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50779的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50780的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50781的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50782的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50783的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50784的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50785的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50786的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50787的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50788的菌株，以及
它们的菌株中的两种或更多种的混合物。
在一个具体实施例中，该一种或更多种的种子包衣有上述保藏的菌株中的一种或更多种(例如包括以上菌株中的至少两种、以上菌株中的至少三种、以上菌株中的至少四种、以上菌株中的至少五种、以上菌株中的至少六种、以上菌株中的至少七种、以上菌株中的至少八种、以上菌株中的至少九种、以上菌株中的至少十种、以上菌株中的至少十一种、以上菌株中的至少十二种、多达并且包括所有以上菌株)。
在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRLB-50776的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50777的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50778的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50779的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50780的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50781的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50782的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50783的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50784的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50785的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50786的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50787的菌株。在一个实施例中，该一种或更多种的种子包衣有具有保藏登录号NRRL B-50788的菌株。
在一个实施例中，可以按若干方式用在此描述的一种或更多种组合物处理种子，但是优选地经由喷洒或滴加。喷洒和滴加处理可以通过配制在此描述的组合物并经由连续处理系统(其被校准，以与种子的连续流成比例的预定义速率施加处理)(例如滚筒式处理器)将该一种或更多种组合物喷洒或滴加至一或多种的种子上。也可以利用间歇式系统，在这种系统中预定批量的种子和如在此描述的一种或更多种组合物被递送至混合器中。用于实施这些过程的系统和仪器可商购自许多供应商，例如拜耳作物科学(Bayer CropScience)(古斯塔夫森公司(Gustafson))。
在另一实施例中，该处理必需包衣种子。一种这样的过程涉及用在此描述的一种或更多种组合物包衣圆形容器的内壁，添加种子，然后旋转该容器，以使得这些种子与该壁和该一种或更多种组合物接触，即一种在本领域中称为“容器包衣(container coating)”的过程。可以通过包衣方法的组合来包衣种子。浸渍典型地必需使用在此描述的组合物的液体形式。例如，可以将种子浸渍约1分钟至约24小时(例如，持续至少1min、5min、10min、20min、40min、80min、3hr、6hr、12hr、24hr)。
在某些实施例中，包衣有在此描述的一种或更多种组合物的一种或更多种的种子将包括每个种子1x 101-1x 108个集落形成单位的，更优选地1x 102-1x 106个集落形成单位的保藏的真菌菌株中的一种或更多种。
通过以下编号的段落进一步定义本发明：
1.一种选自下组的分离的真菌菌株，该组由以下各项组成：
具有保藏登录号NRRL B-50777的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50778的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50779的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50780的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50781的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50782的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50783的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50784的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50785的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50786的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50787的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50788的菌株，以及
它们的菌株中的两种或更多种的混合物。
2.包含一种载体和如段落1所述的真菌菌株中的一种或更多种的组合物。
3.包含如段落1所述的真菌菌株中的一种或更多种的接种物的段落2的组合物。
4.如段落2-3中任一段所述的组合物，其中该组合物进一步包括一个磷源。
5.如段落4所述的组合物，其中该磷源是一种磷矿石。
6.如段落4所述的组合物，其中该磷源是一种肥料。
7.如段落6所述的组合物，其中该肥料包括磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钙、过磷酸盐、三过磷酸盐、聚磷酸铵、及其组合。
8.如段落4所述的组合物，其中该磷源是一种有机磷源。
9.如段落8所述的组合物，其中该有机磷源包括骨粉、肉粉、畜肥、堆肥、污水污泥、或鸟粪、或其组合。
10.如段落2-9中任一段所述的组合物，其中该组合物进一步包括一种或更多种植物信号分子。
11.如段落10所述的组合物，其中该一种或更多种植物信号分子是脂质几丁寡糖(LCO)。
12.如段落11所述的组合物，其中该LCO是合成的。
13.如段落11所述的组合物，其中该LCO是重组的。
14.如段落11所述的组合物，其中该LCO是天然存在的。
15.如段落11所述的组合物，其中LCO获得自选自以下项的根瘤菌的一个物种：根瘤菌属、慢生根瘤菌属、中华根瘤菌属、固氮根瘤菌属、或其组合。
16.如段落11所述的组合物，其中该LCO获得自慢生型大豆根瘤菌。
17.如段落11所述的组合物，其中该LCO获得自一种丛枝菌根真菌。
18.如段落10所述的组合物，其中该一种或更多种植物信号分子是一种几丁质化合物。
19.如段落18所述的组合物，其中该几丁质化合物是一种壳寡糖(CO)。
20.如段落19所述的组合物，其中该CO是合成的。
21.如段落19所述的组合物，其中该CO是重组的。
22.如段落19所述的组合物，其中该CO是天然存在的。
23.如段落10所述的组合物，其中该一种或更多种植物信号分子是一种类黄酮。
24.如段落23所述的组合物，其中该类黄酮是木犀草素、芹菜素、柑橘黄酮、槲皮素、山奈酚、杨梅素、漆黄素、异鼠李素、霍香黄酮醇、甲基鼠李素、橙皮素、柚皮素、圣草素、高圣草素、黄杉素、二氢槲皮素、二氢山萘酚、染料木素、大豆黄酮、黄豆黄素、儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素3-没食子酸酯、没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素3-没食子酸酯、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、氰化、翠雀花素、锦葵色素、天竺葵色素、芍药花青素、甲花翠素、或其衍生物。
25.如段落10所述的组合物，其中该一种或更多种植物信号分子是茉莉酸或其一种衍生物。
26.如段落10所述的组合物，其中该一种或更多种植物信号分子是亚油酸或其一种衍生物。
27.如段落10所述的组合物，其中该一种或更多种植物信号分子是亚麻酸或其一种衍生物。
28.如段落10所述的组合物，其中该一种或更多种植物信号分子是一种卡里金。
29.如段落2-28中任一段所述的组合物，其中该载体是一种土壤可兼容的载体。
30.如段落2-29中任一段所述的组合物，其中该载体包括滑石、粘土、高岭土、硅胶、淀粉、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、泥炭、秸秆、小麦、粗麸、阿拉伯胶、或其组合。
31.如段落2-30中任一段所述的组合物，其中该载体是一种液体介质。
32.如段落2-31中任一段所述的组合物，其中该组合物进一步包括一种或更多种微量营养素。
33.如段落32所述的组合物，其中该一种或更多种微量营养素包括铜、铁、锌、或其组合。
34.用于增加植物从土壤中摄取的磷的利用率的一种方法，包括将如段落1所述的一种或更多种真菌引入土壤。
35.如段落34所述的方法，其中该方法包括将一个有效量的如段落1所述的一种或更多种真菌菌株引入土壤。
36.如段落34所述的方法，其中该方法包括引入如段落1所述的一种或更多种真菌菌株的接种物。
37.如段落36所述的方法，其中该方法包括将一个有效量的如段落1所述的一种或更多种真菌菌株的接种物引入土壤。
38.如段落34-37中任一段所述的方法，其中该方法包括使如段落1所述的一种或更多种真菌菌株与磷的一个来源接触。
39.如段落34-38中任一段所述的方法，其中该方法进一步包括添加磷的一个来源至土壤。
40.如段落39所述的方法，其中该磷源是一种磷矿石。
41.如段落39所述的方法，其中该磷源是一种肥料。
42.如段落41所述的方法，其中该肥料包括磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钙、过磷酸盐、三过磷酸盐、聚磷酸铵、及其组合。
43.如段落39所述的方法，其中该磷源是一种有机磷源。
44.如段落43所述的方法，其中该有机磷源包括骨粉、肉粉、畜肥、堆肥、污水污泥、或鸟粪、或其组合。
45.如段落39所述的方法，其中添加磷的一个来源至土壤的步骤发生在将如段落1所述的一种或更多种真菌菌株的接种物引入土壤的步骤之前、之后或过程中。
46.如段落34-35中任一段所述的方法，其中将如段落1所述的一种或更多种真菌菌株引入土壤的步骤包括按以下量将如段落1所述的一种或更多种真菌菌株引入土壤：每公顷1x 101-1x 108个集落形成单位，更优选地1x 106-1x1012个集落形成单位。
47.如段落34-35中任一段所述的方法，其中将如段落1所述的一种或更多种真菌菌株引入土壤的步骤包括引入如段落1所述的一种或更多种真菌菌株作为一种种子包衣。
48.如段落47所述的方法，其中该种子包衣包含每个种子1x 101-1x 108个集落形成单位，更优选地1x 102-1x 106个集落形成单位。
49.如段落36-37中任一段所述的方法，其中将如段落1所述的一种或更多种真菌菌株的接种物引入土壤的步骤包括按以下量将该接种物引入土壤：每公顷1x 101-1x 108个集落形成单位，更优选地1x 106-1x 1012个集落形成单位。
50.如段落36-37中任一段所述的方法，其中将如段落1所述的一种或更多种真菌菌株的接种物引入土壤的步骤包括引入该接种物作为一种种子包衣。
51.如段落50所述的方法，其中该种子包衣包含每个种子1x 101-1x 108个集落形成单位，更优选地1x 102-1x 106个集落形成单位。
52.如段落34所述的方法，包括将如段落2-33所述的组合物中的任一种引入土壤。
53.增加植物中磷摄取的一种方法，包括使这些植物生长在包含一个磷源和如段落1所述的一种或更多种真菌菌株的土壤中。
54.如段落53所述的方法，其中该磷源是一种磷矿石。
55.如段落56所述的方法，其中该磷源是一种肥料。|
56.如段落55所述的方法，其中该肥料包括磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钙、过磷酸盐、三过磷酸盐、聚磷酸铵、及其组合。
57.如段落53所述的方法，其中该磷源是一种有机磷源。
58.如段落57所述的方法，其中该有机磷源包括骨粉、肉粉、畜肥、堆肥、污水污泥、或鸟粪、或其组合。
59.如段落53所述的方法，其中添加磷的一个来源至土壤的步骤发生在将如段落1所述的一种或更多种真菌菌株的接种物引入土壤的步骤之前、之后或过程中。
60.如第53段所述的方法，其中这些植物是豆科植物。
61.如段落60所述的方法，其中这些豆科植物选自下组，该组由以下各项组成：大豆、豆、苜蓿、和三叶苜蓿。
62.如第53段所述的方法，其中这些植物是非豆科植物。
63.如段落62所述的方法，其中该非豆科植物是玉米。
64.包衣有如段落1所述的一种或更多种真菌菌株的种子。
65.包衣有如段落2-33所述的组合物中的任一种的种子。
实例
以下实例出于说明性目的而提供，并非旨在限制如在此要求的本发明的范围。可以由熟练的技术人员想到的示例性实例的任何变体都旨在落入本发明的范围内。
材料与方法
生物材料保藏
已经根据布达佩斯条约，在农业研究服务菌种保藏中心(the AgriculturalResearch Service Culture Collection)，北大学街(North University Street)1815号，皮奥瑞亚(Peoria)，伊利诺州，61604，美国，保藏了以下生物材料，并且给出以下登录号：
该菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由专利与商标委员依据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授权的人能够获得该培养物。该保藏物代表了所保藏菌株的纯的培养物。需要按一些国家的国外专利法要求提供保藏物，在这些国家提交该主题申请的副本，或其后续文本。然而应理解，保藏物的可用性不构成将本发明主题用于由政府行为批准的专利权的实践的许可。
实例1：磷酸盐溶解测定
在96孔微小生物反应器板(EnzyScreen公司，荷兰)中，在1.5ml的无硝酸盐的基本盐培养基(表1)中，进行用于磷酸盐溶解测定的真菌生长。使用加热灭菌并且在转移前冷却的96针冷冻菌种复制器(cryo-replicator)，从储存在80℃的甘油孢子悬液保种平板(stock plate)接种这些板。在室温(20℃-25℃)和300rpm下使这些板生长14天。14天后，将这些板在5100rpm离心5分钟，并且将1ml的上清液转移至96孔滤板(AcroPrep Advance 96多孔滤板，1μm玻璃纤维，颇尔生命科学公司(Pall Life Sciences)#8231)。将该滤板放置在2ml接收板上(华特曼公司(Whatman)Uniplate 96孔圆底，华特曼公司#7701-5200)，并且使用多孔板真空歧管(颇尔生命科学公司(Pall LifeSciences)#5017)，在真空下过滤样品。用无菌水将过滤的上清液稀释100X，并且用生物视野公司(BioVision)磷酸盐比色测定试剂盒(生物视野公司研究产品，山景城(Mountain View)，加利福尼亚州)和所附说明书，使用读板分光光度计(美国伯腾仪器有限公司(Biotek)，威努斯基(Winooski)，佛蒙特州)来测量可溶磷酸盐。使每种分离物生长，并且一式三份测试其磷酸盐溶解，并且计算平均值和标准差。结果提供于表2中。
表1：无硝酸盐的基本盐培养基(NFMSM)
表2.杂交体及其亲本的来自羟基磷灰石的磷酸盐溶解。数字代表3次重复的平均值±标准差。
结果表明，与亲本菌株V08/021001相比，所有分离物溶解更多磷酸盐。结果进一步表明，与亲本菌株ATCC 20851相比，13种分离物中的11种溶解更多磷酸盐。与亲本菌株ATCC 22348相比，5种分离物溶解更多磷酸盐。
实例2：杂交体的葡糖酸生产
有机酸生产与溶解磷酸盐的能力相关。然而，一些有机酸对植物将是有毒性的(凡坎(J.A.L.van Kan)，植物科学发展趋势(Trends in PlantScience)11:247-253(2006))。葡糖酸对植物是无毒性的，并且它的通过拜赖青霉的生产示出与磷酸盐溶解的强烈相关。使用高效液相色谱法(HPLC)研究分离物及其对应亲本中的5种的葡糖酸生产。在15℃，使来自实例1的二十微升上清液运行通过HPLC柱(瑞斯泰克诱惑有机酸柱(Restek AllureOrganic Acids column)(250x 4.6mm，5μm))。使由25mM磷酸盐缓冲剂(用磷酸调节至pH 2.5)组成的移动相以1ml/min在装备有二极管阵列检测器(DAD)的安捷伦无穷大(Agilent Infinity)1260 HPLC上运行。通过与纯葡糖酸的标准比较，鉴定葡糖酸峰。测量葡糖酸峰下面积并且跨越三次重复实验取平均值。结果提供于表3中。
表3.5种杂交体及其亲本的葡糖酸生产。数字代表3次独立重复的葡糖酸峰下面积的平均值±标准差。
结果表明，与至少一种亲本相比，所有分离物生产更多葡糖酸，并且与任一亲本相比，5种分离物中的3种生产更多葡糖酸。
应该理解的是，本说明书和这些实例说明了本发明实施例并且在所要求的实施例的精神和范围内的其他实施例将也会使本领域的普通技术人员想到。尽管已经结合其具体形式和实施例对本发明进行了描述，但是应该意识到的是，可以在不偏离如所附权利要求书中所限定的本发明的精神或范围的情况下采取除了上文讨论的那些的各种修改。例如，可以用等效物取代具体描述的那些，并且在某些情况下，可以在不偏离如所附权利要求书中所限定的本发明的精神或范围的情况下将具体施用步骤全部颠倒或间插。

Claims (20)

1.一种选自下组的分离的真菌菌株，该组由以下各项组成：
具有保藏登录号NRRL B-50777的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50778的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50779的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50780的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50781的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50782的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50783的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50784的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50785的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50786的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50787的菌株，
具有保藏登录号NRRL B-50788的菌株，以及
这些菌株中的两种或更多种的一种混合物。
2.包含一种载体和如权利要求1所述的真菌菌株中的一种或更多种的一种组合物。
3.如权利要求2所述的组合物，其中该组合物进一步包括一个磷源。
4.如权利要求2所述的组合物，其中该组合物进一步包括一种或更多种植物信号分子。
5.如权利要求4所述的组合物，其中该一种或更多种植物信号分子是一种脂质几丁寡糖(LCO)。
6.如权利要求4所述的组合物，其中该一种或更多种植物信号分子是一种几丁质化合物。
7.如权利要求6所述的组合物，其中该几丁质化合物是一种壳寡糖(CO)。
8.如权利要求4所述的组合物，其中该植物信号分子是一种类黄酮。
9.如权利要求8所述的组合物，其中该类黄酮是木犀草素、芹菜素、柑橘黄酮、槲皮素、山奈酚、杨梅素、漆黄素、异鼠李素、霍香黄酮醇、甲基鼠李素、橙皮素、柚皮素、圣草素、高圣草素、黄杉素、二氢槲皮素、二氢山萘酚、染料木素、大豆黄酮、黄豆黄素、儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素3-没食子酸酯、没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素3-没食子酸酯、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、氰化、翠雀花素、锦葵色素、天竺葵色素、芍药花青素、甲花翠素、或其衍生物。
10.用于增加植物从土壤中摄取的磷的利用率的一种方法，包括将如权利要求1所述的一种或更多种真菌菌株的接种物引入土壤。
11.如权利要求10所述的方法，其中该方法进一步包括添加磷的一个来源至土壤。
12.如权利要求10所述的方法，其中添加磷的一个来源至土壤的步骤发生在将如权利要求1所述的一种或更多种真菌菌株的接种物引入土壤的步骤之前、之后或过程中。
13.如权利要求10所述的方法，其中将如权利要求1所述的一种或更多种真菌菌株的接种物引入土壤的步骤包括按以下量将该接种物引入土壤：每公顷1x101-1x108个集落形成单位，更优选地1x106-1x1012个集落形成单位。
14.如权利要求10所述的方法，其中将如权利要求1所述的一种或更多种真菌菌株的接种物引入土壤的步骤包括引入该接种物作为一种种子包衣。
15.如权利要求14所述的方法，其中该种子包衣包含每个种子1x101-1x108个集落形成单位，更优选地1x102-1x106个集落形成单位。
16.增加植物中磷摄取的一种方法，包括使这些植物生长在包含一个磷源和如权利要求1所述的一种或更多种真菌菌株的土壤中。
17.如权利要求16所述的方法，其中添加磷的一个来源至土壤的步骤发生在将如权利要求1所述的一种或更多种真菌菌株引入土壤的步骤之前、之后或过程中。
18.如权利要求16所述的方法，其中这些植物是豆科植物。
19.如权利要求16所述的方法，其中这些植物是非豆科植物。
20.一种包衣有如权利要求1所述的一种或更多种真菌菌株的种子。
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