CN115433089B - Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的分离提取方法 - Google Patents
Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的分离提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的提取分离方法,包括:活化菌株,初级培养,次级培养,菌体研磨,乙酸乙酯萃取,浓缩得粗提物,将粗提物进行反相硅胶柱层析,以甲醇:水梯度洗脱,再通过200‑300目硅胶柱层析纯化,收集洗脱液浓缩,得到目标产物。经1H NMR、13C NMR、COSY、HMBC、HSQC谱图分析证明邻苯二甲酸二辛酯首次在该菌种代谢物中提取到。
Description
技术领域
本发明涉及Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的提取分离方法。
背景技术
Raffaelea lauricola是食菌小蠹(Ambrosia beetle)携带的高致病性伴生真菌,是引起桂树、栎树枯萎病的病原真菌,研究者们长期致力于揭示其致病机理,随着研究的不断深入,在该属其他物种中已分离到一些抑制植物生长、抗菌等活性物质,这展示该菌在生物农药或医药上存在极大应用潜力。
迄今为止,尚未有在Raffaelea lauricola中发现bis(2-ethylhexl)benzene-1,2-dicarboxylate(邻苯二甲酸二辛酯,CAS No.117-81-7)的报道。
发明内容
本发明的目的是公开Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的提取分离方法,以促进其进一步在医药领域的研究和开发,为人类造福。
本发明采取的技术方案如下:
Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的提取分离方法,包括以下步骤:
1)将Raffaelea lauricola活化后,取菌块接种到PDB培养基中,在160~180r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天即初级培养,按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中,继续在20~28℃条件下静置培养28~40天即次级培养;
2)将步骤1)得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状,用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时,超声40~60分钟,收集萃取液,残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯,超声40~60分钟,收集萃取液,重复以上步骤,共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏;
3)将浸膏用尽可能少的氯仿或二氯甲烷溶解(可适当超声,以促进其溶解),然后用反相硅胶C18进行拌样,干法装柱,以甲醇:水自体积比1:9梯度洗脱,收集甲醇:水体积比为9:1部位洗脱液,旋蒸浓缩得组分A;
4)用1倍体积的氯仿溶解组分A,上200-300 目硅胶柱,石油醚:乙酸乙酯体积比30:1 开始梯度洗脱,收集石油醚:乙酸乙酯体积比15:1 部分洗脱液,旋蒸浓缩得浸膏,再过200-300目硅胶柱,以石油醚:氯仿体积比20:1开始梯度洗脱,收集石油醚:氯仿体积比8:1部分洗脱液,旋蒸得到白色粉末状邻苯二甲酸二辛酯;
所述步骤1)中改良的大米培养基:大米100g,木屑10g,加入纯水120mL,121℃高压灭菌20min。
所述步骤1)中接种菌块的大小为0.5×0.5cm,接种量为4块。
所述步骤2)中超声的功率为400 W,频率为35 KHz。
所述步骤3)中使用的反相硅胶C18粒径40-60μm,孔径120Å。
所述步骤3)中梯度洗脱比例为甲醇:水体积比1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3,8:2,9:1。
所述步骤4)中洗脱比例为石油醚:乙酸乙酯体积比30:1,20:1,15:1,石油醚:氯仿体积比20:1,10:1,8:1。
所述邻苯二甲酸二辛酯化合物的结构如下所示:
。
本发明的显著优点:
(1)分离纯化简单,成本低;
(2)过程简单,易操作;
(3)制得的化合物纯度高,且重复性好。
附图说明
图1邻苯二甲酸二辛酯化合物的1H NMR谱(CD3OD);
图2邻苯二甲酸二辛酯化合物的13C NMR谱(CD3OD);
图3邻苯二甲酸二辛酯化合物的DEPT135谱(CD3OD);
图4邻苯二甲酸二辛酯化合物的COSY谱(CD3OD);
图5邻苯二甲酸二辛酯化合物的HMBC谱(CD3OD);
图6邻苯二甲酸二辛酯化合物的HSQC谱(CD3OD)。
具体实施方式
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂,下文特举实施例,作详细说明。本发明的方法如无特殊说明,均为本领域常规方法。
本发明所使用的Raffaelea lauricola菌株编号为Hulcr7161。
实施例1
1)取Raffaelea lauricola(本实验室保存菌株)为材料,无菌条件下挑取大小为0.5×0.5cm的菌块4块接种到PDB 培养基(马铃薯葡萄糖粉3.9g,纯水100mL,装入250 mL锥形瓶,在121℃高压下灭菌20min)中,在140r/min、20℃条件下连续培养5天即初级培养,按10wt%接种量转接到改良的大米培养基(大米100g,木屑10g,加入纯水120mL,121℃高压灭菌,20min)中,继续在20℃条件下静置培养28天即次级培养。
2)收集培养28天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎,加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时,超声40分钟,过滤得萃取液,残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯,超声40分钟,收集萃取液,再次重复上述步骤,共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
3)将浸膏溶解于氯仿,使用40-60μm粒径反相C18硅胶拌样,干法装柱,以甲醇:水自1:9体积比开始梯度洗脱(甲醇:水比例为1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1),收集甲醇:水9:1部分旋蒸得粗品。
4)粗品用1倍体积的氯仿溶解,上200-300目硅胶柱,石油醚:乙酸乙酯体积比30:1开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为30:1,20:1,15:1),收集石油醚:乙酸乙酯体积比15:1 部分洗脱液,旋蒸浓缩得浸膏,再过200-300目硅胶柱,以石油醚:氯仿体积比20:1开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为20:1,10:1,8:1),收集石油醚:氯仿体积比8:1部分洗脱液,旋蒸得到白色粉末状产物邻苯二甲酸二辛酯。
经计算其提取率为0.135%(提取率%=重量/菌丝体浸膏总量×100%)。
本实施例中,步骤2)中超声的功率为400 W,频率为35 KHz。
实施例2
1)取Raffaelea lauricola(本实验室保存菌株)为材料,无菌条件下挑取大小为0.5×0.5cm的菌块4块接种到PDB 培养基(马铃薯葡萄糖粉3.9g,纯水100mL,装入250mL锥形瓶,在121℃高压下灭菌20min)中,在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养,按20wt% 接种量转接到改良的大米培养基(大米100g,木屑10g,加入纯水120mL,121℃高压灭菌,20min)中,继续在25℃条件下静置培养35天即次级培养。
2) 收集培养35天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎,加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时,超声60分钟,过滤得萃取液,残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯,超声40分钟,收集萃取液,再次重复上述步骤,共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
3) 将浸膏溶解于氯仿,使用40-60μm粒径反相C18硅胶拌样,干法装柱,以甲醇:水自1:9体积比开始梯度洗脱(甲醇:水比例为1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1),收集甲醇:水体积比为9:1部分旋蒸得粗品。
4) 粗品用1倍体积的氯仿溶解,上200-300目硅胶柱,石油醚:乙酸乙酯体积比30:1 开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为30:1,20:1,15:1),收集石油醚:乙酸乙酯体积比15:1 部分洗脱液,旋蒸浓缩得浸膏,再过200-300目硅胶柱,以石油醚:氯仿体积比20:1开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为20:1,10:1,8:1),收集石油醚:氯仿体积比8:1部分洗脱液,旋蒸得到白色粉末状产物邻苯二甲酸二辛酯。
经计算其提取率为0.167%(提取率%=重量/菌丝体浸膏总量×100%)。
本实施例中,步骤2)中超声的功率为400 W,频率为35 KHz。
实施例3
1)取Raffaelea lauricola(本实验室保存菌株)为材料,无菌条件下挑取大小为0.5×0.5cm的菌块4块接种到PDB培养基(马铃薯葡萄糖粉3.9g,纯水100mL,装入250mL锥形瓶,在121℃高压下灭菌20min)中,在180r/min、28℃条件下连续培养10天即初级培养,按25wt% 接种量转接到改良的大米培养基(大米100g,木屑10g,加入纯水120mL,121℃高压灭菌,20min)中,继续在28℃条件下静置培养40天即次级培养。
2) 收集培养40天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎,加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时,超声90分钟,过滤得萃取液,残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯,超声90分钟,收集萃取液,再次重复上述步骤,共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
3) 将浸膏溶解于氯仿,使用40-60μm粒径反相C18硅胶拌样,进行减压粗分,以甲醇:水自1:9体积比开始梯度洗脱(甲醇:水比例为1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1),收集甲醇:水体积比为9:1部分旋蒸得粗品。
4) 粗品用1倍体积的氯仿溶解,上200-300目硅胶柱,石油醚:乙酸乙酯体积比30:1 开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为30:1,20:1,15:1),收集石油醚:乙酸乙酯体积比15:1 部分洗脱液,旋蒸浓缩得浸膏,再过200-300目硅胶柱,以石油醚:氯仿体积比20:1开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为20:1,10:1,8:1),收集石油醚:氯仿体积比8:1部分洗脱液,旋蒸得到白色粉末状产物邻苯二甲酸二辛酯。
经计算其提取率为0.171%(提取率%=重量/菌丝体浸膏总量×100%)。
本实施例中,步骤2)中超声的功率为400 W,频率为35 KHz。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的分离提取方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
1)将Raffaelea lauricola活化后,取菌块接种到PDB培养基中,在160~180r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天,按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中,继续在20~28℃条件下静置培养28~40天;
2)将步骤1)得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状,用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时,超声40~60分钟,收集萃取液,残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯,超声40~60分钟,收集萃取液,重复以上步骤,共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏;
3)将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解,然后用反相硅胶C18进行拌样,干法装柱,以甲醇:水自体积比1:9→9:1梯度洗脱,收集甲醇:水体积比为9:1部位洗脱液,旋蒸浓缩得组分A;
4)用1倍体积的氯仿溶解组分A,上200-300 目硅胶柱,石油醚:乙酸乙酯体积比30:1开始梯度洗脱,收集石油醚:乙酸乙酯体积比15:1 部分洗脱液,旋蒸浓缩得浸膏,再过200-300目硅胶柱,以石油醚:氯仿体积比20:1开始梯度洗脱,收集石油醚:氯仿体积比8:1部分洗脱液,旋蒸得到白色粉末状邻苯二甲酸二辛酯;
所述步骤1)中改良的大米培养基:大米100g,木屑10g,加入纯水120mL,121℃高压灭菌,20min;
所述邻苯二甲酸二辛酯的结构如下所示:
。
2.根据权利要求1所述的Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的分离提取方法,其特征在于:所述步骤1)中接种菌块的大小为0.5×0.5cm,接种量为4块。
3.根据权利要求1所述的Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的分离提取方法,其特征在于:所述步骤2)中超声的功率为400 W,频率为35 KHz。
4.根据权利要求1所述的Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的提取分离方法,其特征在于:所述步骤3)中使用的反相硅胶C18粒径40-60μm,孔径120Å。
5.根据权利要求1所述的Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的提取分离方法,其特征在于:所述步骤3)中梯度洗脱比例为甲醇:水体积比1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1。
6.根据权利要求1所述的Raffaelea lauricola中邻苯二甲酸二辛酯的提取分离方法,其特征在于:所述步骤4)中梯度洗脱比例为石油醚:乙酸乙酯体积比30:1,20:1,15:1,石油醚:氯仿体积比20:1,10:1,8:1。
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