WO2007108108A1 - 新規ステンフォン(Stemphone)類の化合物及びその製造法 - Google Patents

新規ステンフォン(Stemphone)類の化合物及びその製造法 Download PDF

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stenphone
compound
stemphone
culture
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Hiroshi Tomoda
Rokuro Masuma
Satoshi Omura
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The Kitasato Institute
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to a compound of a new stenphone (s. Temp. Ho rue.) Class which enhances its effect when used in combination with S-lactam antibiotic imipenem, which is used as an antibacterial agent, and its production Regarding the law.
  • a new stenphone s. Temp. Ho rue.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • yS-lactam antibiotics drugs that are generally a glycopeptide that has not been reported to be resistant to methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infections.
  • Antibiotics such as vancomycin-based aminoglycoside arbekacin are used.
  • S-lactam antibiotics, or a combination therapy with one lactam antibiotic and another antibiotic with a different action point Yama Hasegawa et al., Science of Antimicrobial Administration, 2 6 4 — 2 7 3, 1 9 9 8).
  • Conventional technology Conventional technology
  • Vancomycin and arbekacin have already emerged resistant to these drugs.
  • these drugs are known to have side effects such as hearing loss due to the eighth cranial nerve disorder, which is a problem.
  • a tea extract or its active fraction JP-A 9-500 077 that exhibits a synergistic effect when used in combination with antibacterial agents including ST lactam antibiotics corresponds to this. Disclosure of the invention The new stenphones are clearly distinguished in molecular formula and chemical structure from polyphenol compounds, which are active ingredients in tea extract or its active fraction.
  • stemphone B substance has a MIC of imipene from 16 g / ml to 0.03 g Zml, and has a 5 to 2-fold increase in activity. The increase in activity by 5 12 and 16 times was confirmed, respectively, and it is expected to be applied to a combination drug for raccoon antibiotics for methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MR SA) infection.
  • MR SA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • Drugs that enhance the activity of ⁇ -lactam antibiotics are expected to reduce the frequency of resistant bacteria by reducing the dose of / S-lactam antibiotics and shortening the administration period. At the same time, it is expected to overcome resistance to 8-lactum antibiotics by combining two drugs with different actions.
  • the object of the present invention is to provide a substance having an action of enhancing the activity of ⁇ -lactam antibiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MR SA), and methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MR SA) infection or ⁇ -It is useful as a new therapeutic agent for infectious diseases caused by multidrug-resistant bacteria including resistance to lactam antibiotics.
  • MR SA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • MR SA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • the present inventors examined the culture solution of the filamentous fungus FK 1-2 1 3 6 previously isolated from soil, and found that the imipene activity enhancing substance is different from the Stenphone B substance and the Stenphone C substance. Has been found to be produced. Next, three imipenem activity enhancing substances were separated and purified from the culture. Since no substance having such a chemical structure has been known at all, this substance is called Stenphone D substance, Stenphone E substance and Stenphone F substance, respectively. In addition, as for the Stenphone E substance, as a result of the preparation of derivatives, no substance having such a chemical structure has been known so far. It was decided to refer to the substance Opstenphone E 3 substance.
  • the present invention also belongs to the genus Aspergillus, and the phone according to claim 1.
  • a microorganism belonging to the genus Aspergillus and capable of producing a compound of a stenphone is an Aspergillus sp.
  • FK I— 2 1 36 (Aspergillus sp: F I- 2136 (NITE BP-83)
  • This strain grows well on the toppec 'yeast extract agar medium, wort agar medium, toppec yeast containing 20% sucrose, etc., and conidia is well established on each agar medium. .
  • Optimal growth conditions The optimal growth conditions for this strain are pH 4-8 and temperature 11.5-29 ° C.
  • the growth range of this strain is pH 3 to 10 and temperature 10 to 30.5 ° C.
  • FK 1-21 36 Based on the morphological characteristics of the FK 1-21 36 strain described above: based on the culture characteristics and physical characteristics, as a result of comparison with known bacterial species, this strain was identified as belonging to the genus Aspergillus). Aspergillus sp. It was named FK'4—21 36. This strain is Aspergillus sp. FK I-21 36 (Aspergillus sp.
  • FK I-2 1 36 substance-producing bacterium used in the present invention or the aforementioned Aspergillus sp. FK 1-21 36 strain is a preferred example.
  • the properties are highly variable and are not constant.
  • Natural or usual UV irradiation, X-ray irradiation or mutant derivatives such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, 2-aminopurine. It belongs to Aspergillus sp., Including the human soil mutants that use etc., and is represented by the above formulas [I], [I], [IE], [IV], [V] and [VI].
  • a strain having the ability to produce a compound of the stelphones is included in the present invention.
  • FK 1-2136 substance-producing bacteria are cultured in a medium.
  • a nutrient source suitable for the production of the compounds of the tenphones a nutrient medium containing a carbon source that can be assimilated by microorganisms, a nitrogen source that can be digested, and inorganic salts, vitamins, and the like as required.
  • Assimilable carbon above As sources glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, saccharides such as dextrin and starch, and vegetable oils and fats such as soybean oil are used alone or in combination.
  • Digestible nitrogen sources include peptone, yeast extract, meat extract, soy flour, cottonseed flour, corn steep liquor, malt extract, casein, amino acids, urea, ammonium salts, nitrates alone or nitrates Used in combination.
  • Other heavy metal salts such as phosphates, magnesium salts, calcium salts, sodium salts, potassium salts, iron salts, manganese salts, copper salts, cobalt salts, zinc salts, etc.
  • Mines and other compounds suitable for production of the present stenphone compounds are added as appropriate.
  • an antifoaming agent such as a surfactant such as liquid paraffin, animal oil, vegetable oil, silicone, etc. may be added as necessary.
  • the medium may be liquid or solid as long as it contains the above nutrient sources, but it is usually preferable to use a liquid medium for culture.
  • culture using a flask is preferable.
  • the composition of the medium used for the preculture and the medium used for the production culture may be the same, or may be changed if necessary.
  • the culture temperature may be appropriately changed within the range in which the FK 1-21 3 6 substance-producing bacterium produces the compounds of the stemphones, but usually 20 to 30 ° C, preferably 27 ° C. It is better to incubate around C.
  • the culture pH is usually 5 to 8, preferably about 7.
  • the culture time varies depending on the culture conditions, but is usually about 4-7 days.
  • the compounds of stenphones thus obtained are present in cultured cells and culture filtrate.
  • the product is extracted with a water-miscible organic solvent such as aceton, the extract is distilled off under reduced pressure with an organic solvent, and then the residue is extracted with a water-immiscible organic solvent such as ethyl acetate.
  • UV absorption spectrum measured in methanol solution is: ima x (Me ⁇ H, ⁇ ): 20 3 nm (1 7 4 4 2), 2 Absorption at 6 5 nm (8 2 8 4) and 3 96 nm (6 7 8)
  • Red external absorption spectrum The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide tablet method is i max 3 4 4 2, 2 9 7 3, 1 7 3 5, 1 6 4 3 , 1 6 0 4 cm "shows a characteristic absorption maximum at 1 etc.
  • Solubility in solvents Soluble in methanol and black form, insoluble in water
  • Proton and carbon nuclear magnetic resonance spectra Hydrogen chemical shift (P Pm) and carbon chemistry measured in a heavy oxygen source with a 30 OMHz nuclear magnetic resonance spectrometer manufactured by Varian.
  • the shift (p pm) is as shown below. ⁇ 0 • 8 9 (3 H), 1.0 2 (3 H), 1 • 1 5 (3 H), 1 • 2 0 (
  • Stenphone D substance has a chemical structure represented by the above formula [I].
  • UV absorption spectrum Measured in methanol solution UV absorption spectrum is ⁇ ma X (Me OH, ⁇ ): 20 4 nm (3 4 4 4 7), 2 9 2 Absorption at nm (4 3 7 0), 3 5 6 nm (4.0 3)
  • Red external absorption spectrum Infrared absorption spectra measured by the brominated power Ryumu tablet method are: Re max 3 4 3 4, 2 9 2 9, 1 7 1 8, 1 6 2 9 cm A characteristic absorption maximum at 1 etc.
  • UV absorption spectrum measured in methanol solution is: ima x (Me OH, ⁇ ): 20 2 nm (3 4 5 0 3), 29 Absorption at 1 nm (3 8 8 9) and 3 60 nm (4 2 2)
  • Red external absorption spectrum Infrared absorption spectra measured by the bromide-powered Rum tablet method are max 34 3 2, 2 9 3 1, 1 727, 1 6 3 3 cm 1 etc. Shows a characteristic absorption maximum
  • Proton and carbon nuclear magnetic resonance spectra Hydrogen chemical shifts (ppm) and carbon chemical shifts measured in a heavy-duty form with a Varian 300 MHz nuclear magnetic resonance spectrometer. (P pm) is as shown below.
  • Stenphone E 1 substance has a chemical structure represented by the above formula [ ⁇ ]. Was decided.
  • UV absorption spectrum measured in methanol solution is: ima x (Me OH, ⁇ ): 20 2 nm (3 3 5 3 3), 2 87 nm (
  • Red external absorption spectrum Infrared absorption spectrum measured by the bromide-powered Rum tablet method is special for max 34 3 4, 2 975, 1 720, 1 6 3 7 cm 1 etc. The maximum absorption
  • Stenphone E 2 substance has a chemical structure represented by the above formula [IV]. It has been determined.
  • UV absorption spectrum measured in methanol solution is ima x (Me OH, ⁇ ): 2 Q 2 nm (1 5: 0; 1 4), 2 Absorption of 7 2 nm (1 1 4 7 8), 4 7 3 nm (2 7 4 8)
  • Red external absorption spectrum Potassium bromide tablet method
  • the infrared absorption spectrum measured is as follows: Les max 3 4 3 4, 2 9 2 7, 1 7 3 3, 1 6 4 8, 1 6 2 1 cm—A characteristic absorption maximum at 1 etc.
  • Stenphone E 3 substance As described above, as a result of detailed examination of various physicochemical properties and spectral data of the Stenphone E 3 substance, the Stenphone E 3 substance has the chemical formula represented by the above formula [V]. Stenphone F substance determined to be structural
  • UV absorption spectrum The ultraviolet absorption spectrum measured in methanol solution is: max (Me ⁇ H, ⁇ ): 2 0 1 nm (1 1 6 6 9), 2 4 4 nm (6 4 2 7), 2 8 8 nm (3 6 0 3), 3 6 1 nm (3 8 7)
  • Red external absorption spectrum Infrared absorption spectra measured by the potassium bromide tablet method are: Re max 3 4 3 8, 2 9 6 7, 1 6 5 8, 1 6 2 9, 1 6 2 3 cm—shows a special absorption maximum at 1 mag
  • ⁇ -ton and carbon nuclear magnetic resonance spectra hydrogen chemical shift (p pm) and carbon measured in a heavy-duty form with a 300 MHz nuclear magnetic resonance spectrometer manufactured by Varian.
  • the chemical shift (ppm) is as shown below.
  • ⁇ c 1 1. 1, 1 3.3, 1 3.4, 2 0.1, 2 1.5, 2 1, 8, 2 3
  • Stenphone F substance has a chemical structure represented by the above formula [VI]. It has been determined.
  • the smearing was performed using a sterile swab (Kawamoto Sangyo Co., Ltd., Japan) according to the US National Committee for Laboratory Standards (NCCLS) method.
  • NCCLS National Committee for Laboratory Standards
  • the antibacterial activity on each culture medium against the test bacteria was expressed in mm as the diameter of the circle of inhibition after 20 hours at 37 ° C by the paper disk method (thin, 6 mm: ADVA NTEC).
  • any of Stenphone D substance, Stenphone E substance, Stenphone E 1 substance, Stenphone E 2 substance, Stenphone E 3 substance and Stenphone F substance in the presence of imipenem, 25 mm, 22 mm, 15 mm, 22 mm, 20 mm, and 20 mm were respectively measured. As a result, the action of enhancing the activity of imipene was confirmed. In the case of Stimphon B substance and Stenfon C substance reported by the present inventors, the inhibition circle was not measured under the same conditions, but in the presence of imipenem, Because the 20 mm and 22 mm inhibition circles were measured, the newly isolated substance was almost equal to or better than the imipene activity. It became clear to have. Cytotoxicity assessment method
  • Agar slope culture medium (glycerol 0.16 (Japan, Kanto Chemical Co.), KH 2 P0 4 0. 0 8% (Japan, Kanto Chemical Co.), KH 2 P 04 0. 0. 0. 0 2% (Japan) , Seki Higashika Gakusha), MgS0 4 ⁇ 7H 2 0 0. 0 2% ( Japan, Wako Pure Chemicals), KC 1 0. 0 2% ( Japan, Kanto Chemical Co., Inc.), NaN0 3 0. 2% (Japan, Wako Pure Chemical Industries), Yeast extract 0.0 2% (Japan, Oriental Yeast), Agar 1.5%
  • the culture solution (4.9 L) was centrifuged to obtain a supernatant and cells.
  • Acetone 2.5 L was added to the cells and stirred for 30 minutes, and the cells were separated by filtration to obtain a cell extract.
  • the aqueous extract obtained by distilling off acetone from the bacterial cell extract under reduced pressure and the above-mentioned supernatant are mixed, the active ingredient is extracted with ethyl acetate (5 L), and the ethyl acetate layer is concentrated to dryness.
  • the active crude material (6.4 g) was obtained.
  • the crude material was roughly purified by a silica gel column (silica gel 60, Merck, 60 g).
  • ⁇ / roform monomethanol (10: 00 (10 Oml ⁇ , 100 : 20 OmL), 50: 1 (30 OmL), 10: 1 (30 OmL), 5; 1 Fractionation was performed by chromatography using each mixed solvent of (300 mL) and 1: 1 (30 OmL)) as a developing solvent.
  • the active fraction (50: 1) was concentrated to dryness to obtain 70 mg of a brown oily substance.
  • the crude material was purified again with a silica gel column (silica gel 60, Merck, 30 g). Black-mouthed form methanol (1 0 0: 0 (50 mL x 2), 1 0 0: 1 (3 0 mL x 5), 5 0: 1 (25 mL 10), 1 0: 1 (3 0 mL x 5 ) And 5: 1 (3 OmL ⁇ 5)) were chromatographed using a mixed solvent as a developing solvent.
  • Preparative HPLC (column: PEGASIL ODS, 200 x 250 mm) 1 7 mg of methanol soluble part of crude material 3 Omg obtained by concentrating the active fraction (10: 1 fraction number 3-4) to dryness , Moving bed: 45% aqueous solution of acetonitrile, flow rate: 6m 1 Zmin, detection: UV 2 10 nm), separating peak of retention time 6 4min and concentrating the fractionated solution under reduced pressure
  • the stenphone D substance was isolated in a yield of 1.2 mg.
  • the active fraction (50: 1 fraction number 7-10) after the second silica gel column was concentrated to dryness to obtain a white powdered Stenphone E substance in a yield of 3 18 mg.
  • 50 mg of Stenphone E substance was mixed with 170 7L of TMS-diazomethane (Nacalai Tesque, Japan), 10% hexane solution and methanol 34 After reacting in 0 ⁇ L solution at 40 ° C for 24 hours, preparative HPLC (column: PEGASIL ODS, 200 x250tnm, moving bed: 70% aqueous solution of acetonitrile, flow rate: SmLZmin, detection: UV 2 1 0 nm).
  • Von E 1 material was isolated in a yield of 1 1.6 mg.
  • 5 Omg of Stenphone E substance was heated in aqueous solution at 60 ° C, and then the concentrated dry solid was dissolved in a small amount of methanol, followed by preparative HPLC. Purification was performed by (column: PEGASIL ODS, 200 ⁇ 25 Omm). The absorption at UV 2 10 nm was monitored at a flow rate of 6 mL / min using isocratic of 70% aqueous acetonitrile as a moving bed. Retention times 1 4 min and 2 1 min peaks were collected, and the fractions were concentrated under reduced pressure to yield the yields of Stenphone E 2 substance and Nmphone E 3 substance, respectively. Released.
  • the culture solution to (0.1 L) was centrifuged to obtain a supernatant and cells.
  • Acetone (2.5 L) was added to the cells and stirred for 30 minutes, and the cells were separated by filtration to obtain a cell extract.
  • the aqueous residue obtained by distilling off the acetone from the bacterial cell extract under reduced pressure and the above-mentioned supernatant were mixed, the active ingredient was extracted with ethyl acetate (0.5 L), and the ethyl acetate layer was concentrated and dried.
  • Solid active crude material (0.5 g) was obtained. This crude material was roughly purified on a silica gel column (silica gel 60, Merck, 2.3 g).
  • Stemphone D substance obtained by culturing a microorganism represented by FK 1-2 1 3 6 strain belonging to the genus Aspergillus having the ability to produce compounds of the novel stenphones of the present invention in a culture medium.
  • Stenphone E substance, Stenphone E 1 substance, Stenphone E 2 substance, Stenphone E 3 substance, or Stenphone F substance are equivalent to or better than the previously reported Stenphone C substance. It is expected to be useful as a lead for concomitant medications for methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infections.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus

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Abstract

本発明はアスペルギルス属に属し、ステンフォンD物質、ステンフォンE物質、ステンフォンE1物質、ステンフォンE2物質、ステンフォンE3物質、ステンフォンF物質よりなる群から選択されるステンフォン類の化合物を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にステンフォン類の化合物を蓄積せしめ、該培養物からステンフォン類の化合物を採取する新規ステンフォン類の化合物である。得られた化合物はイミペネム活性増強作用をするとともに、細胞毒性の低下が認められることから、メチンリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染症の併用薬のリードとして有用である。

Description

明 細 書 新規ステンフォン （stemphone)類の化合物及びその製造法 技術分野
本発明は、 抗菌剤として利用ざれている S—ラクタム抗生物質ィミぺネムと併 用することによりその効果を増強する新^ステンフォン （ s. t e m p .h o rue .) 類の化合物及びその製造法に関する。 背景技術
近年、 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 （M R S A ) は、 院内感染の主な原因菌 として社会的問題となっている。 この病原菌は、 yS—ラクタム抗生物質など種々 の薬剤に対する耐性を有しており、 一般にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 （M R S A ) 感染症の治療には、 現時点ではほとんど耐性化が報告されていないグリコ ぺプチド系のバンコマイシンゃァミノグリコシド系のアルべカシンといった抗生 物質が使用されている。 またこの他に、 S—ラクタム抗生物質同士、 もしくは 一ラクタム抗生物質と他の作用点の異なる抗生物質との併用療法が行われている (長谷川裕美ら、 抗菌薬投与の科学、 2 6 4 — 2 7 3、 1 9 9 8年） 。 従来の技術
バンコマイシンやアルべカシンについてもすでにこれらの薬剤に対する耐性菌 が出現している。 また、 これらの薬剤に いては、 第 8脳神経障害による聴力障 害などの副作用を有することが知られており、 問題となている。 現在までに、 こ のような状況に対処すベく、 —ラクタム^生物質の効力を回復させる作用を有 する物質が報告されている。 例えば、 S Tラクタム抗生物質を含む抗菌剤と組み 合せて使用することで相乗的効果を示す茶エキスま はその活性フラクシヨン （ 特表平 9 - 5 0 9 6 7 7 ) がこれに相当する。 発明の開示 新規ステンフォン類は、 茶エキスまたはその活性フラクションに有する活性成 分であるポリフ ノール化合物とは、 分子式および化学構造が明確に区別される
。 また、 本発明者らは、 糸状菌 F K I— 2 1 3 6株の培養液中より単離したステ ンフォン B物質及びステンフォン C物質と命名した 2種のィミぺネム活性物質を 既に報告している。 とくにステンフォン C物質は、 ィミぺネ厶の M I Cを 1 6 g /m Lから 0 . 0 3 g Zm Lまで 5 1 2倍の活性増強を有しており、 クロキ サシリンゃセファゾリンにおいても、 それぞれ、 5 1 2および 1 6倍の活性増強 が確認されたことから、 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 （MR S A) 感染症の ーラク夕厶抗生物質併用薬への応用が期待-される。
β —ラクタム抗生物質の活性を増強する薬剤は、 /S—ラクタム抗生物質の投与 量を減量させ、 投与期間を短縮させることにより耐性菌出現の頻度を低減させる ことが期待される。 また同時に、 作用の異なる 2つの薬剤を併用することにより 、 8—ラク夕ム抗生物質に対する耐性を克服することも期待される。
本発明の目的はかかる実情において、 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 （MR S A) に対する ^ーラクタム抗生物質の活性増強作用を有する物質を提供すること であり、 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 （MR S A ) 感染症や ^ーラクタム抗生 物質耐性を含む多剤耐性菌を起因とする感染症の新しい治療薬として有用なこと である。
本発明者らは、 以前に土壌から分離した糸状菌 F K 1 - 2 1 3 6株の培養液を 精査したところ、 ステンフォン B物質およびステンフォン C物質とは異なるィ ミ ぺネ厶活性増強物質が産生されていることを見出した。 次いで、 該培養物から 3 種のイミぺネム活性増強物質を分離、 精製した。 このような化学構造を有する物 質は従来まったく知られていないことから、 本物質をそれぞれステンフォン D物 質、 ステンフォン E物質およびステンフォン F物質と称することにした。 また、 ステンフォン E物質については、 誘導体の調製を行った結果、 このような化学構 造を有する物質は従来まったく知られていないことから、 本物質をそれぞれステ ンフォン E 1物質、 ステンフォン E 2物質おょぴステンフォン E 3物質と称する ことにした。
本発明は、 かかる知見に基づいて完成されたものであって、 請求の範囲 1に記 載のように、 下記式 [ I ]
Figure imgf000004_0001
で表されるステンフォン D物質、 下記式 [H]
Figure imgf000004_0002
で表されるステンフォン E物質、 下記式 [H]
Figure imgf000004_0003
で表されるステンフォン E 1物質、 下記式 [ΙΠ
Figure imgf000005_0001
で表されるステンフオン E 2物質、 下記式 [V]
Figure imgf000005_0002
で表されるステンフォン E 3物質、 下記式 [VI]
Figure imgf000005_0003
で表されるステンフォン F物質よりなる群から選択されるステンフォン類の化合 物とするものである。
本発明はまた、 ァスペルギルス属に属し、 請求の範囲 1に記載のス^ンフォン D物質、 ステンフォン E物質、 ステンフォン E l物質、 ステンフォン E 2物質、 ステンフォン E 3物質、 ステンフォン F物質よりなる群から選択されるステンフ ォン類の化合物を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、 培養物中にステ ンフォン類の化合物を蓄積せしめ、 該培養物からステンフォン類の化合物を採取 する新規ステンフォン類の化合物の製造法とするものである。
本発明は、 さらに請求の範囲 2に記載のように、 ァスペルギルス属に属し、 ス テンフォン類の化合物を生産する能力を有する微生物が ァスペルギルス エス ピ一 FK I— 2 1 36 (Aspergillus sp: F I-2136 (NITE BP-83) とするもので ある o
前記の式 [i]、 [n]、 [m]、 [iv]、 [v]および [vr]で表される新 規ステンフォン類の化合物を生産するために使用される菌株としては、 一例とし て、 本発明者等によって沖縛県石垣島の土壌より新たに分離されたァスペルギル ス エスピー FK 1 - 2 1 36 (Aspergillus sp. FKI-2136) 株が挙げられる。 本 菌株の培養性状を示すと以下のとおりである。 形態的特徴
本菌株は、 ッァペック 'イーストエキス寒天培地、 麦芽汁寒天培地、 ショ糖 2 0%入りッァペック 'イーストエキス寒 培地などで良好に生育し、 各寒天培地 での分生子の着生は良好であつた。
ッァぺック 'ィーストエキス寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察する と、 菌糸は無色で隔壁を有していた。 分生子柄は基底菌糸より直生し、 その長さ は、 1 75〜730；/mで基部には逆 T字型の足細胞を生じる。 分生子柄の先端 は、 球形から亜球形に肥大し、 直径 1 5〜60 の頂囊を形成する。 ァスペル ギラは、 複列性で、 メ トレ （.6〜厂 2 X 3〜6 m) とアンプル型のフィアラィ ド （5〜1 0 x 2〜3 ^m) からなる。 ァスペルギラは頂囊のほぼ全体を覆う。 フィアラィ ドの先端からは分生子が形成され、 培養時間の経過とともに連鎖状と なる。 .分生子は、 球形から亜球形、 薄い黄土色、 大きさ 2〜4 zmで表面は粗面 であった。 培養性状
本菌株を各種寒天培地上で、 2 5で、 7.日間培養した場合の肉眼的観察結果を 次表に示す。 培地 培地上の生育状態 コ□ニー表面 コロュ—裏面 可溶性 (コ□ニーの直径） の色調 の色調 色素 ッァペック ■ィ一ストエキス寒天培地
良好 （ 6 0〜 6 5 mm) 白色〜グリーム色 ： 黄色
羊毛状〜ビロード状
しわ状
周辺平滑 麦芽汁寒天培地
良好 （4 0〜4 5mm) クリーム色〜 灰色 なし 羊毛伏〜ビロード状 薄い黄土色
周辺平滑
2 0 %ショ糖ッァペック 'ィーストエキス寒天培地
良好 （ 6 5〜7 0mm) 白色〜クリーム色
羊毛状〜ビロード状
しわ状
周辺平滑 なお、 本菌株はッァペック ·イーストエキス寒天培地で、 5°Cおよび 3 7でで 1 4日間培養したが、 生育しなかった。 生理的性状
1 ) 最適生育条件 本菌株の最適生育条件は pH4〜8、 温度 1 1. 5〜29°Cである。
2) 生育の範囲
本菌株の生育範囲は p H 3〜 1 0、 温度 1 0〜30. 5°Cである。
3) 好気性、 嫌気性の区別 好気性 微生物の国際寄託
上記 FK 1 -21 36株の形態的特徴、：培養 状 よ 理的性状に基づき、 既知菌種との比較を試みた結果、 本菌株はァスペルギルス く Aspergillus)属に属 するー菌株と同定し、 ァスペルギルス■エスピー FK'4— 21 36と命名した。 本菌株は、 ァスペルギルス 'エスピー FK I— 21 36 (Aspergillus sp. FKI- 2136) として、 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約 に基づき、 〒292— 08 1 8日本国千葉県木更津巿かずさ鎌足 2丁目 5番 8号 (2-5-8 Kazusakamatari Kisarazu-shi, Chiba-ken 292-0818 Japan) に所在する 独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター （Incorporated Adm inistrative Agency National Institute of Technology and Evaluation Paten t Microorganisms. Depositary (NPMD)に寄託してある。 受託日は 2005年 3月 3日、 受託番号は N I TE BP- 83である。
本発明で使用される FK I— 2 1 36物質生産菌として (ま、 前述のァスペルギ ルス ·エスピー FK 1 - 21 36菌株が好ましい例として挙げられるが、 菌のー 般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、 一定したものではなく、 自然 的にあるいは通常行われる紫外線照射、 X線照射ま は変異誘導体剤、 例えば N —メチルー N' —二トロー N—ニトロソグァ二ジン、 2—ァミノプリンなどを用 いる人土変異株も含め、 ァスペルギルス 'エスピー （Aspergillus sp.)に属し、 前記の式 [ I ] 、 [I] 、 [IE] 、 [IV] 、 [V] および [VI] で表されるステ ンフォン類の化合物を生産する能力を有する菌株は本発明に含まれる。
本発明を実施するに当たっては、 先ず FK 1 - 21 36物質生産菌を培地に培 養することにより行われる。 上記 テンフォン類の化合物の生産に適 た栄養源 としては、 微生物が同化し得る炭素源、 消化し得る窒素源、 さらに必要に応じて 無機塩、 ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。 上記の同化し得る炭素 源としては、 グルコース、 フラクト一ス、 マルト一ス、 ラク トース、 ガラクトー ス、 デキスト リ ン、 澱粉等の糖類、 大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合 わせて用いられる。
消化し得る窒素源としては、 ペプトン、 酵母エキス、 肉エキス、 大豆粉、 綿実 粉、 コーン 'スティ一プ · リカ一、 麦芽エキス、 カゼィン、 アミノ酸、 尿素、 ァ ンモニゥム塩類、 硝酸塩類が単独または組み合わせて用いられる。 その他必要に 応じてリン酸塩、 マグネシウム塩、 カル^ウム塩、 ナ ゥム塩、 カリウム塩な どの塩類、 鉄塩、 マンガン塩、 銅塩、 コ ルト塩、 亜鉛塩等の重金属塩類ゃビ夕 ミン類、 その他本ステンフォン類化合物の生産に好適なものが適宜添加される。 培養するに当たり、 発泡が激しいときには、 必要に応じて液体パラフィン、 動 物油、 植物油、 シリコン等、 界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。 上記の培 養は、 上記栄養源を含有すれば、 培地は液体でも固体でもよいが、 通常は液体培 地を用い、 培養するのがよい。 少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適 である。 目的物質を大量に工業生産するには、 他の発酵生産物と同様に、 通気攪 拌培養するのが好ましい。
培養を大きなタンクで行う場合は、 生産工程において、 菌の生育遅延を防止す るため、 はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、 次に培養物を大 きなタンクに移して、 そこで生産培養するのが好ましい。 この場合、 前培養に使 用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、 両者とも同一であってもよ いし、 必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、 例えばプロペラやその他機械による攪拌、 ファメーターの回転または振とう、 ポンプ処理、 空気の吹き込み等、 既知の方法 が適宜使用される。 通気用の空気は滅菌したものを使用する。
培養温度は、 本 F K 1 - 2 1 3 6物質生産菌が本ステンフォン類の化合物を生 産する範囲内で適宜変更し得るが、 通常は 2 0〜3 0 °C、 好ましくは 2 7 °C前後 で培養するのがよい。 培養 p Hは通常 5〜8、 好ましくは 7前後で培養するのが よい。 培養時間は培養条件によっても異なるが、 通常は 4〜7日程度である。 こ のようにして得られたステンフォン類の化合物は、 培養菌体および培養濾液に存 在する。 培養物から目的とするステンフォン類の化合物を採取するには、 全培養 物をァセトンなどの水混和性有機溶媒で抽出し、 抽出液を減圧下有機溶媒で留去 後、 続いて残渣を酢酸ェチル等の水不混和性有機溶媒で抽出することによって行 われる。
上記の抽出法に加え、 脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、 例えば吸着 クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグ:ラフィ一、 薄層クロマトグラフィー、 遠心向流分配クロマトグラフィ一、 高速液体クロマトグラフィ一等を適宜組み合 わせ、 あるいは繰り返すことにより、 本 テンフォン:類 化合物を分離、 精製す ることができる。 理化学的性状
本発明のステンフォン類化合物の理化学的性状について説明する。
ステンフォン D物質
( 1 ) 性状 ：黄色粉末
(2) 分子式： C3。H4208
HRFAB-MS (m/z) [M + N a ] + 計算値 5 5 3. 2 7 7 7、 実測値 5 5 3. 2 7 8 8
( 3 ) 分子量： 5 3 0
F AB-MS (m/z) で [M + H] + 5 3 1を観測
(4) 紫外部吸収スぺク トル： メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スぺク トルは、 ；ima x (Me〇H， ε) : 2 0 3 nm ( 1 7 4 4 2) 、 2 6 5 nm ( 8 2 8 4) 、 3 9 6 nm ( 6 7 8 ) の吸収を示す
( 5) 赤外部吸収スぺク トル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺ ク トルは、 i ma x 3 4 4 2、 2 9 7 3、 1 7 3 5、 1 6 4 3、 1 6 0 4 cm"1 等に特徴的な吸収極大を示す
(6) 比旋光度： [ひ] 。 26十 9 3. 0。 （c = 0. 1、 メタノール）
( 7) 溶剤に対する溶解性： メタノールやクロ口ホルムに可溶、 水に不溶
( 8) プロ トン及びカーボン核磁気共鳴スペク トル：重クロ口ホルム中で、 バ リアン社製 3 0 OMHz核磁気共鳴スぺク トロメータで測定した水素の化学シフ ト （P Pm) 及び炭素の化学シフ ト （p pm) は下記に示すとおりである。 δη 0• 8 9 ( 3 H) 、 1. 0 2 ( 3 H) 、 1• 1 5 (3 H) 、 1• 2 0 (
3 H) 、 1 • 2 9 ( 3 H) 、 1. 4 8 ( 1 H) 、 1 6 0 (4 H) 、 1 6 1 (
3 H) 、 1 8 2 ( 2 H) 、 1. 9 4 ( 3 H) 、 2 • 0 0 ( 1 H) 、 2 1 2 (
2 H) 、 2 1 5 ( 1 H) 、 2. 5 0 (:1:H) 、 3 - 3 4 ( 1 H) 、 3 5 8 (
1 H) 、 3 7 0 ( 1 H) 、 3. .9 0 (1Ή) 、 5 1 4 ( 1 H) 、 5 5 5 (
1 H) ヽ 6 • 4 8 ( 1 H) P pm
δ c 1 1 - 6 、 1 2. 8、 1 3 • 1 v;l 6. 1 、 1 •7 ノ1、 2 0 . 9 、 2 1
1、 2 3 • 8 、 2 4 . 9 、 2 6 . 2 、 2 9. 9 、 3 3 • 4、 3 6. 7 、 3 8 .
9、 3 9 . 7 、 6 9 3, 7 1. 8 、 7 5. 9、 7 8 •9 、 8 1. 0 、 8 1 • 6
、 1 1 7 7 、 1 2 5 . 0 、 1 3 2 • 0, 1 3 2 • 4 、 1 4 8. 0、 1 5 2 4
. 1 6 9 9 、 1 8 1 . 3 、 1 8 7 1 p P m
以上のように、 ステンフォン D物質の各種理化学的性状ゃスぺクトルデータを 詳細に検討した結果、 ステンフォン D物質は前記の式 [ I ] で表される化学構造 であることが決定された。 ステンフォン E物質
( 1 ) 性状 ：白色粉末
(2) 分子式： C3。H44〇3
HRFAB-MS (m/z) [M + H] + 計算値 5 4 9. 2 9 8 6、 実 測値 5 4 9,. 2 9 7 7 >
( 3 ) 分子量： 5 4 8
FAB-MS (m/z) で [M + H] + 5 4 9を観測
(4) 紫外部吸収スぺクトル： メタノール溶液中 測定した紫外部吸収スぺク トルは、 λ m a X (M e OH, ε ) ： 2 0 4 n m ( 3 4 4 4 7 ) , 2 9 2 n m ( 4 3 7 0) 、 3 5 6 n m ( 4 .0 3 ) の吸収を示す
(5) 赤外部吸収スぺクトル：臭化力リゥム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺ クトルは、 レ ma x 3 4 3 4、 2 9 2 9、 1 7 1 8、 1 6 2 9 cm 1等に特徴的 な吸収極大を示す
( 6) 比旋光度： [ひ ] ！) 26 + 1 0 0. 8 ° (c = 0. 1、 メタノール） (7) 溶剤に対する溶解性： メタノールやクロ口ホルムに可溶、 水に不溶
( 8) プロトン及びカーボン核磁気共鳴スぺク トル：重クロ口ホルム中で、 バ リアン社製 3 0 OMH z核磁気共鳴スぺク トロメータで測定した水素の化学シフ 卜 （P P m) 及び炭素の化学シフ ト （p pm) は下記に示すとおりである。
6» 0. 9 7 ( 3 H) 、 0. 9 9 ( 3Ή) 、 1. 1 3 ( 3— H) 、 1. 1 8 (
3 Η) 、 1. 2 4 ( 3 H) 、 1. 5 8 ( 1 H) 、 1. 6 0 ( 1 H) 、 1. 6 2 (
3 Η) 、 1. 6 4 ( 3 H) 、. 1. 7 8 (¾H) 、 1. 8 . '( 1 Η) 、 1. 8 8一
1. 9 2 (3 Η) 、 2. 3 2 ( 1 Η) 、 3. 4 4 ( 1 Η) 、 3. 5 8 ( 1 H) 、
3. 7 0 ( 1 Η) 、 4. 1 4 ( 1 Η) 、 ·5. 0 6 ( 1 Η)-： 5. 3 4 ( 1 H) 、
5. 6 3 ( 1 Η) 、 6. 1 8 ( 1 H) p pm
δ c ； 1 0 . 9、 1 2. 9、 1 3. 1、 1 7. 6、 2 1. 2、 2 2 • 1、 2 3
7、 2 5. 1、 2 6. 0、 2 8. 1、 3,3. 8, 3 7. 6、 4 0. 5、 4 6 -
5、 6 3 . 6 、 7 0. 7、 7 2. 0、 7 6. 6、 7 9. 5、 8 0. 4 、 8 3. 1
、 1 0 4 . 6 、 1 1 1. 0、 1 2 5. 8、 1 2 8. 8、 1 3 2. 5、 1 3 6. 5
、 1 3 9 . 7 、 1 4 7. 4、 1 7 1. 4 p pm
以上のように、 ステンフォン E物質の各種理化学的性状やスぺク トルデータを 詳細に検討した結果、 ステンフォン E物質は前記の式 [II] で表される化学構造 であることが決定された。 ステンフォ,ン E 1物質
( 1 ) 性状 ： 白色粉末
(2) 分子式： C31H"09
HRFAB-MS (m/z) [M + H] + 計算値 5 6 3. 3 1 4 2、 実 測値 5 6 3. 3 1 5 3
( 3 ) 分子量： 5 6 2
F AB-MS (m/z) で [M + H] _ 5 6 1を観測
(4) 紫外部吸収スぺク トル： メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スぺク トルは、 ；ima x (Me OH, ε ) : 2 0 2 nm ( 3 4 5 0 3) 、 2 9 1 nm ( 3 8 8 9) 、 3 6 0 nm ( 4 2 2 ) の吸収を示す ( 5 ) 赤外部吸収スぺク トル：臭化力リゥム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺ ク トルは、 ma x 34 3 2、 2 9 3 1、 1 727、 1 6 3 3 c m 1等に特徴的 な吸収極大を示す
(6) 比旋光度： [ひ] 。 2 e+ 9 7. .0° (c = 0. 1、 メタノール）
(7) 溶剤に対する溶解性： メタノールやクロ口ホルムに可溶、 水に不溶
(8) プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペク トル：重クロ口ホルム中で、 バ リアン社製 3 0 0 MHz核磁気共鳴スぺ トロメータで測定した水素の化学シフ ト （p pm) 及び炭素の化学シフ ト （p pm) は下記に示すとおりである。
5„ ： 1. 0 0 (3Η) 、 1 • 0 8 ( 3 Η) 、 1. 1 5 - (3 Η) 、 1. 2 1 (
3H) 、 1. 25 (3Η) 、 1 • 5 0 - 1. 6 0 (2Η) ゝ 1. 6 4 (3 H) 、
1. 6 7 (3 Η) 、 1. 8 0 ( 3 Η)、 1. 8 1 ( 1 Η) . 1. 8 8 - 2. 0 6
(3H) 、 2 . 3 5 ( 1 Η) 、 3 . 4 3 ( 1 Η) 、 3. 6 0 ( 1 Η) 、 3. 74
( 1 H) 、 3 . 8 2 (3Η) 、 4 . 1 2 ( 1 Η) 、 5. 0 6 ( 1 Η) 、 5. 2 1
( 1 H) 、 5 . 4 5 ( 1 Η) 、 5 . 6 7 ( 1 Η) 、 6. 27 ( 1 Η) P pm δ c ： 1 1 . 3 、 1 3. 3 、 1 3. 4、 1 7. 6、 2 1. 4、 22 . 3. 23
9、 2 5. 4、 26. 6、 2 8 . 4、 34. 0 、 3 7. 8、 4 0. 8、 4 6.
9、 5 5. 7 、 6 3. 5、 7 1 • 0、 72. 0、 77. 3、 7 9. 7 、 8 0. 9
> 82. 5、 1 0 1. 2. 1 1 2 . 2、 1 2 5. 6、 1 2 8. 6、 1 3 2. 9、
1 3 7. 9、 1 4 0. 1、 1 5 0 . 3、 1 7 0. 4 ρ p m
以上のよ,うに、 ステンフォン Ε 1物質の各種理化学的性状やスぺク トルデータ を詳細に検討した結果、 ステンフォン E 1物質は前記の式 [ΠΙ] で表される化学 構造であることが決定された。 ステンフォン E 2物質
( 1 ) 性状 ： 白色粉末
(2) 分子式： C3。H4208
HRFAB - MS (m/z) [M + H] 計算値 5 3 1. 2 9 8 0、 実 測値 5 3 1. 2 8 9 6
( 3 ) 分子量： 5 3 0 FAB-MS (m/z) で [M + H] - 5 2 9を観測
(4) 紫外部吸収スぺクトル： メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スぺク トルは、 ；ima x (Me OH， ε) ： 20 2 nm ( 3 3 5 3 3 ) 、 2 8 7 nm (
2 1 7 22 ) の吸収を示す
( 5 ) 赤外部吸収スぺク トル：臭化力リゥム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺ クトルは、 ma x 34 3 4、 2 975、 1 720、 1 6 3 7 c m 1等に特徵的 な吸収極大を示す
(6) 比旋光度： [ひ] 。 26 + 20 0. '5° (c = 0. 1、 メタノール）
(7) 溶剤に対する溶解性： メタノールやクロ口ホルムに可溶、 水に不溶
(8) プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロ πホルム中で、 バ リアン社製 3 0 0 MHz核磁気共鳴スぺクトロメータで測定した水素の化学シフ ト （p pm) 及び炭素の化学シフト （p pm) は下記に示すとおりである。
(5„ 1 0 4 ( 3 Η) 、 1. 1 3 (3 H) 、 1. 1 8 (3 H) 、 1. 22 (
3 H) 、 1 4 2 (3 Η) 、 1. 6 4 (3H) 、 1. 6 7 (3 H) 、 1. 7 0 (
2 H) ヽ 1 8 1 (3 Η) 、 1. 8 2 ( 1 H) 、 1. 9 6 ( 1 H) 、 2. 0 1 (
1 H) 、 2 1 2 ( 1 Η) 、 3. 4 5 ( 1Ή) 、 3. 6 4 ( 1 H) 、 3. 8 6 (
1 H) 4 • 2 8 ( 1 Η) 、 5. 4 1 ( 1 H) 、 5. 6 6 ( 1 H) 、 6. 22 (
1 H) 6 • 6 0 ( 1 Η) ρ p m
δ c • 1 1 . 0 、 1 3. 2 、 1 7 • 6、 2 0. 5、 2 1 . 3 、 2 3 . 8 、 2 4
0、 2 6 , 3 、 2 6 . 6、 27 • 9 、 34. 6 、 3 7 • 1、 44. 3、 6 9
3、 7 1 • 9ヽ 7 4. 5、 7 7. 9 78. 9、 8 2 8 、 1 0 5. 9、 1 0 8
8, 1 1 3 7 、 1 2 5. 7、 1 3 0. 0、ノ 1 32 5 、 1 3 6. 6、 1 3 8
, 3、 1 3 9 5 、 1 4 4. 2、 1 7 0. 9 ρ ρ m
以上のように、 ステンフォン E 2物質の各種理化学的性状やスぺク トルデータ を詳細に検討した結果、 ステンフォン E 2物質は前記の式 [IV] で表される化学 構造であることが決定された。 ステンフォン E 3物質
( 1 ) 性状 ：赤色粉末 (2) 分子式： C3。H4。〇8
HRFAB-MS ( /z) [M + H] + 計算値 5 2 9. 2 7 2 3、 実 測値 5 2 9. 2 7 2 0
(3) 分子量： 5 2 8
FAB-MS (m/z) で [M + H] 一 5 2 9を観測
(4) 紫外部吸収スぺク トル： メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スぺク トルは、 ima x (Me OH, ε) ： 2 Q 2 n m ( 1 5: 0; 1 4 ) 、 2 7 2 nm ( 1 1 4 7 8) 、 4 7 3 nm (2 7 4 8) の吸収を示す
(5) 赤外部吸収スぺク トル：臭化カリウム錠剤法 測定した赤外部吸収スぺ ク トルは、 レ ma x 3 4 3 4、 2 9 2 7、 1 7 3 3、 1 6 4 8、 1 6 2 1 cm— 1 等に特徴的な吸収極大を示す
( 6) 比旋光度： [ひ] D 26+ 7. 1 2° (c = 0. 1、 メタノール）
(7) 溶剤に対する溶解性： メタノールやクロ口ホルムに可溶、 水に不溶
( 8) プロ トン及び力一ボン核磁気共鳴スペク トル：重クロ口ホルム中で、 バ リアン社製 3 0 0 MHz核磁気共鳴スぺク トロメータで測定した水素の化学シフ ト （p pm) 及び炭素の化学シフト （p pm) は下記に示すとおりである。
： 0. 9 8 ( 3 H) 、 1. 0 8 (3H) 、 1 1 0 (3 H)、 1 • 1 5 (
3 H) 、 1. 4 7 ( 3 H) 、 1. 5 2 ( 3 H) 、 1 . 5 6 (3 H)、 1 . 6 4一
1. 8 6 (3 Η) 1. 8 7 (3 H) 、 1. 9 0 ― 2 0 3 (2 H) 、 2 2 0
( 1 H) 3 . 2 7 ( 1 H) 、 3 . 5 5 ( 1 H) 、 3； 7 7 ( 1 H) 、 4 2 2
( 1 H) 、 5 . 1 0 ( 1 H) 、 5 . 4 9 ( 1 H) 、 6 3 4 ( 1 H) 、 6 4 2
( 1 H) Ρ Ρ m
δ c": 1 1 . 5 、 1 3. 2、 1 7. 1、 2 0. 8 、：' 2 1 . K 2 3 • 9 、 2 4
0、 2 6. 3、 2 6. 6, 2 8 . 2 、 3 4. 1 、 3： 6 . 7、 4 4. 8 、 6 9.
1、 7 1 . 8 、 7 3 . 8, 7 7. 2、 7 8. 9、 8 1 .■ 0 、 8 1. 5 、 1 1 1.
5、 1 1 7. 0、 1 2 5. 3、 1 3 1 . 6, 1 3 1 . ' 8 、 1 4 3. 5 、 1 4 9.
0、 1 4 9. 3、 1 7 0. 0、 1 8 0 . 8, 1 8 4 6 P P m
以上のように、 ステンフォン E 3物質の各種理化学的性伏やスぺク トルデータ を詳細に検討した結果、 ステンフォン E 3物質は前記の式 [V] で表される化学 構造であることが決定された ステンフォン F物質
( 1 ) 性状 ：赤色粉末
(2) 分子式： C33H48OI 0
HRFAB-MS (m/z) [M + N a ] + 計算値 6 2 7. 3 1 4 6、 実測値 6 2 7. 3 1 5 1
( 3 ) 分子量： 6 0 4
F AB-MS (m/z) で [M + H] + 6 0 5を観測
(4) 紫外部吸収スペク トル： メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スぺク トルは、 ； m a x (Me〇H, ε) : 2 0 1 nm ( 1 1 6 6 9) , 2 4 4 nm ( 6 4 2 7) 、 2 8 8 nm (3 6 0 3) , 3 6 1 nm (3 8 7) の吸収を示す
(5) 赤外部吸収スぺクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外吸収スぺク トルは、 レ ma x 3 4 3 8、 2 9 6 7、 1 6 5 8、 1 6 2 9、 1 6 2 3 cm— 1等 に特徵的な吸収極大を示す
( 6) 比旋光度： [ひ] 。 26 + 1 4 8. 9 ° (c = 0. 1、 メタノール）
(7) 溶剤に対する溶解性： メタノールやクロ口ホルムに可溶、 水に不溶
(8) プ αトン及びカーボン核磁気共鳴スペク トル：重クロ口ホルム中で、 バ リアン社製 3 0 0 MHz核磁気共鳴スぺク トロメータで測定した水素の化学シフ ト （p pm) 及び炭素の化学シフ ト （p pm) は下記に示すとおりである。
5„ ： 0. 9 5 ( 3 H) 、 0. 9 9 ( 3 H) 、 1. 1 3 ( 3 H) 、 1. 1 8 (
3 H) ヽ 1. 2 8 (3 H) 、 1. 5 8 - 1 6 0 ( 3 H) 、 1. 6 1 (3H) 、
1. 6 3 ( 3 Η) , 1. 8 2 ( 1 H) 、 1. 9 4一 1 9 6 (2 H) 、 1. 9 4
( 3 H) 、 2. 0 6 ( 1 H) 、 2. 3 0 ( 3 H) 、 2 • 5 0 ( 1 H) 、 2. 9 4
( 1 H) 、 3. 0 0 ( 1 H) 、 3. 5 6 ( 1 H) 、 3 • 6 6 ( 1 H) 、 4. 1 1
( 1 H) 、 4. 7 9 ( 1 H) 、 5. 1 4 ( 1 H) 、 5 • 7 0 ( 1 H) 、 6. 0 6
( 1 H) P pm
δ c ： 1 1. 1 、 1 3. 3 、 1 3. 4, 2 0. 1、 2 1 . 5, 2 1 . 8, 2 3
8、 2 5. 2、 2 6. 5、 2 8. 4 、 3 3. 5 、 3 6 2. 3 7. 4. 4 0. 9、 4 6. 4、 4 6. 6、 6 2. 4、 70. 9、 7 1. 9、 72. 1、 7 6. 7 、 8 0. 0、 8 3. 1、 8 3. 5、 1 1 0. 1、 1 24. 1、 1 2 7. 5、 1 3 1. 5、 1 6 2. 0、 1 6 9. 1、 1 6 9. 4、 1 8 7. 5、 2 0 9. 9 p p m 以上のように、 ステンフォン F物質の各種理化学的性状やスぺクトルデータを 詳細に検討した結果、 ステンフォン F物質は前記の式 [VI] で表される化学構造 であることが決定された。 次に、 本発明のステンフォン類化合物の生物学的性状に 4いて詳細に述べる。 ペーパーディスク法によるィミぺネム活性増強作用の評価方法
試験菌として、 臨床分離されたメチシリ ン耐性 Staphyloccocus aureus K24株 を用レヽた o Staphyloccocus aureus は、 Mueller- Hinton broth (2.1 % w/v) (DI FC0) 3 7°C、 20時間培養後、 同培地で 0. 5Mc FARAND (約 108 CFU/mL) 相当 に懸濁し、 MHA培地 （Mueller- Hinton broth 2.1 % (w/v). Agar 1.5 %) およ び同組成の培地にイミぺネム （日本国、 萬有製薬社チェナム筋注用力価 0. 5) を試験菌の生育に影響を与えない濃度、 すなわち最終濃度 1 0 gZmLとなる ように添加した培地に塗沫した。
塗沫は、 米国臨床検査標準化委員会 (National Committee for Laboratory St andard, NCCLS)法に従い、 滅菌綿棒 （日本国、 川本産業社） を用いて行った。 試 験菌に対する各培地上での抗菌活性は、 ペーパーディスク法 （薄手、 6 mm: ADVA NTEC社） にて、 3 7 °Cで 20時間後の阻止円径の直径を単位 mmで表記した。 そ の結果、 1 0 / gディスク条件下にて、 ステンフォン D物質、 ステンフォン E物 質、 ステンフォン E 1物質、 ステンフォン E 2物質、 ステンフォン E 3物質およ びステンフォン F物質いずれも、 それ自身では阻止円が測定されなかったのに対 して、 イミぺネム存在下では、 それぞれ、 25mm、 22 mm. 1 5 mm, 22 mm、 2 0mmおよび 2 0 mmの阻止円が測定され、 ィミぺネ厶活性増強作用が 確認された。 本発明者等のよって以前報告したステンフォン B物質およびステン フオン C物質は同条件下にて、 それ自身では阻止円が測定されなかったのに対し て、 ィミぺネム存在下では、 それぞれ、 20 mmおよび 22 mmの阻止円が測定 されたため、 新たに単離した上記物質はほぼ同等以上のィミぺネ厶活性増強作用 を有していることが明らかとなった。 細胞毒性の評価方法
J u r k a t細胞に対する細胞毒性の評価は、 MTT法 （Mosmaan ら、 J. Immu nol. Methods 、 65巻、 55-63頁、 1983年） に従って行った。 Ju r k a t細胞培 養液を RPM 1— 1 640培地 （日本国、 イワキ社） に 4 X 1 05 c e l l s/ m Lで懸濁して、 96穴マイクロプレート （Corning：社); 0. 05 mLずつま，, く。 その後、 ステンフォン D物質、 ステンフォン E物質、 ステンフォン E 1物質 、 ステンフォン E 2物質、 ステンフォン E 3物質またはステンフォン F物質 （0. 05 mし 、 2 % メタノール ZRPMI- 1640培地） を添加し、 5%炭酸ガスインキュべ —夕一内で 37°C、 4 8時間後、 濃度 5. 5mg/mLとなるように PBSで溶 解した MTT試薬 （SIGMA社） を 0. 0 lmL加え、 37 °C、 4時間反応させた 。 反応後、 0. 09 mLの細胞溶解液 （40 %, N-ジチルホルムアミ ド （日本国、 関東化学社） 、 20%s o d i um d o d e c y l s u l f a t e (日本国 、 和光純薬社） 、 2%酢酸 （日本国、 関東化学社） 、 0. 03%塩酸 （日本国、 関東化学社） となるように精製水に溶液） を加え、 室温で 2時間振とうした後、 550 ηΐΏの吸光度を ELx 808 (BI0-TEK Instruments社） を用いて測定 した。 その結果、 Ju r k a t細胞に対する I C5。値は、 次表に示すとおりであ り、 本発明者等が以前報告したステンフォン C物質 （Ratio: 1.0) と比較して約 4倍から 60倍の毒性の低下を認めた。
ステンフォン類化合物の細胞毒性試験結果
IC5o： Aig/ml Ratio
ステンフォン C物質 0. 4 1. 0
ステンフォン D物質 [ I ] 1. 8 4. 2
ステンフォン E物質 [I] . 3. 6 . 8. 5
ステンフォン E 1物質 [Π] 26. 2 60. 9
ステンフォン E 2物質 [IV] 4. 4 1 0. 3
ステンフォン E 3物質 [V] 2. 6 6. 0 ステンフォン F物質 [VI]
発明を実施するための最良の形態
次に実施例を挙げて本発明を説明するが、 本発明はこれのみに限定されるもの でない。
実施例
寒天斜面培地 （グリセロール 0. 1 6 (日本国、 関東化学社） 、 KH2 P04 0. 0 8 % (日本国、 関東化学社） 、 KH2 P 04 0. 0. 0 2 % (日本国、 関 東化学社） 、 MgS04 · 7H2 0 0. 0 2 % (日本国、 和光純薬社） 、 KC 1 0. 0 2% (日本国、 関東化学社） 、 NaN03 0. 2 % (日本国、 和光純 薬社） 、 酵母エキス 0. 0 2% (日本国、 オリエンタル酵母社） 、 寒天 1. 5 %
(日本国、 清水食品社） 、 pH 6. 0に調製） で培養した FK I - 2 1 3 6株を 、 種培地 （グルコース 2% (和光純薬社） 、 ポリべトン 0. 5 % (和光純薬社） 、 MgS04 - 7H2 0 0. 0 5 % (和光純薬社） 、 酵母エキス 0. 2% (日 本国、 オリエンタル酵母社） 、 KH2 P O4 0. 1 % (関東化学社） 、 寒天
1 % (清水食品社） 、 pH 6. 0に調製） 1 OmLを分注した大試験管に一白金 耳ずつ接種し、 27 °Cで 2日間口一タリ一シヱイカー （ 3 0 0 r p m) で培養し た後、 生産培地 （グルコース 1. 0% (和光純薬社） 、 可溶性スターチ 2. 0 %
(関東化学社） 、 大豆油 2. 0% (和光純薬社） 、 ファーマメディア 1. 0% ( 日本国、 イワキ社） 、 肉エキス 0. 5% (日本国 極東製薬社） 、 MgSC · 7H2 0 0. 1 % (和光純薬社） 、 C a C 03 0. 3 % (関東化学社） 、 トレ ース塩溶液 1. 0 % (F e S04 - 7H2 0 0. \ % (関東化学社） 、 Mn C
12 ■ 4 H2 0 0. 1 % (関東化学社） 、 ZnS04 - 7H2 0 0. 1 % ( 関東化学社） 、 Cu S04 · 5H2 〇 0. 1 (関東化学社） 、 C o C 12 · 6 H2 0 0. 1 % (和光純薬社） 、 寒天 0. 196 (清水食品社） 、 pH 6. 0 に調製） 1 0 OmLを分注した 5 0 OmL容三角フラスコ （ 5 0本） に植菌し、 2 7て、 2 1 0 r pmで 7日間振とう培養した。 うち三角フラスコ 1本は、 さら に 27で、 2 1 0 r pmで 8日間振とう培養した。 三角フラスコ （4 9本） について培養終了後、 培養液 （4. 9 L) を遠心分離 し、 上清と菌体を得た。 菌体にアセトン （2. 5 L) を加え、 3 0分攪拌後菌体 を濾別して菌体抽出液を得た。 菌体抽出液を減圧下でアセトンを留去して得られ た水残查と前述の上清を混合し、 酢酸ェチル （5 L) で活性成分を抽出し、 酢酸 ェチル層を濃縮乾固し活性粗物質 （ 6. 4 g) を得た。 この粗物質をシリカゲル カラム （シリカゲル 6 0、 メルク社、 6 0 g) にて粗精製を行った。 ク π/ロホル ム一メタノール （ 1 0 0 : 0 ( 1 0 Oml^ 、 1 0 0 ; 20 OmL) 、 5 0 : 1 ( 3 0 OmL) , 1 0 : 1 ( 3 0 OmL) 、 5 ; 1 ( 3 00 m L ) 、 1 : 1 (3 0 OmL) ) の各混合溶媒を展開溶媒とするクロマトグラフィ一による分画 を行った。
まず、 活性画分 （5 0 : 1 ) を濃縮乾固することで、 褐色油状物質 70 4 mg を得た。 再度、 この粗物質をシリカゲルカラム （シリカゲル 60、 メルク社、 3 0 g) にて精製を行った。 クロ口ホルム一メタノール （ 1 0 0 : 0 (5 0 mL x 2) 、 1 0 0 : 1 (3 0mL x 5) 、 5 0 : 1 ( 25 mL 1 0 ) , 1 0 : 1 ( 3 0mLx 5) 、 5 : 1 ( 3 OmL x 5) ) の各混合溶媒を展開溶媒とするクロ マトグラフィ一による分画を行った。 活性画分 （ 1 0 ： 1フラクション番号 3 - 4) を濃縮乾固することで得られた粗物質 3 Omgのメタノール可溶部 1 7m g を分取 HPLC (カラム： PEGASIL ODS、 200 x 250 mm、 移動層： 4 5 %ァセ トニトリル水溶液、 流速： 6m 1 Zm i n、 検出： UV 2 1 0 nm) で精製し、 保持時間 6 4m i nのピークを分取して分取液を減圧下濃縮しステンフォン D物 質を収量 1. 2 mgで単離した。
また、 2回目のシリカゲルカラム後の活性画分 （5 0 : 1 フラクション番号 7 - 1 0) を濃縮乾固することで、 白色粉末のステンフォン E物質を収量 3 1 8m gで得た。 ステンフォン E物質のメチル化体を合成するために、 5 0mgのステ ンフォン E物質を 1 7 0〃 Lの TMS—ジァゾメタン （日本国、 ナカライテスク 社） 、 1 0 %へキサン溶液） とメタノール 34 0〃L溶液中で 4 0°C、 24時間 反応させた後、 分取 HPLC (カラム： PEGASIL ODS、 200 x250tnm、 移動層： 7 0 %ァセトニトリル水溶液、 流速： SmLZm i n、 検出： UV 2 1 0 nm) で精製し、 保持時間 2 2m i nのピークを分取して分取液を減圧下濃縮しステン フォン E 1物質を収量 1 1. 6 mgで単離した。 また、 ステンフォン脱水体を調 製するために、 5 Omgのステンフォン E物質を水溶液中で 6 0°Cにて加温した 後、 濃縮乾固物を少量のメタノールに溶解し、 分取 HPLC (カラム ： PEGASIL ODS 、 200 X 2 5 Omm) により精製を行った。 7 0%ァセトニトリル水溶液のァ イソクラティックを移動層とし、 6mL/m i nの流速において、 UV 2 1 0 n mの吸収をモニターした。 保持時間 1 4m i nおよび 2 1 m i nのピ一クを分取 して分取液を減圧下濃縮しステンフォン E 2物質お び ンフォン E 3物質を それぞれ収量 1 2. Omgと 2. 3mgで単離した。
三角フラスコ （ 1本） については培養終了後、 培養液〜（0. 1 L) を遠心分離 し、 上清と菌体を得た。 菌体にアセトン （2. 5 L) を加え、 3 0分攪拌後菌体 を濾別して菌体抽出液を得た。 菌体抽出液を減圧下でァセトンを留去して得られ た水残査と前述の上清を混合し、 酢酸ェチル （0. 5 L) で活性成分を抽出し、 酢酸ェチル層を濃縮乾固し活性粗物質 （0. 5 g) を得た。 この粗物質をシリカ ゲルカラム （シリカゲル 6 0、 メルク社、 2. 3 g) にて粗精製を行った。 クロ 口ホルム一メ夕ノール （ 1 0 0 : 0 ( 1 0mLx 4) 、 1 0 0 : 1 ( 1 0 m L x 2) 、 5 0 : 1 ( 1 0mLx 3) 、 1 0 : 1 ( 1 0 m L x 3 ) . 5 ： 1 ( 1 0m L) 、 1 : 1 ( 1 OmL) ) の各混合溶媒を展開溶媒とするクロマトグラフィー による分画を行った。 活性画分 （5 0 : 1フラクショ ン番号 2 - 3) を濃縮乾固 することで得られた粗物質 1 9. 2mgを分取 HPLC (カラム： PEGASIL 0DS 、 200 X 250mm、 移動層： 5 0 %ァセトニトリル水溶液、 流速： 6mL/m i n 、 検出： UV2 1 0 nm) で精製し、 保持時間 1 8m i nのピークを分取して分 取液を減圧下濃縮しステンフォン F物質を収量 1 0. 3mgで単離した。 産業上の利用分野
本発明の新規ステンフォン類の化合物を生産する能力を有するァスペルギルス 属に属する FK 1 - 2 1 3 6株を代表とする微生物を培地に培養して、 その培養 液中から採取したステンフォン D物質、 ステンフォン E物質、 ステンフォン E 1 物質、 ステンフォン E 2物質、 ステンフォン E 3物質またはステンフォン F物質 のそれぞれの化合物は、 以前報告したステンフォン C物質と同等以上のィミぺネ ム活性増強作用を有するとともに、 細胞毒性の低下が認められることから、 メチ シリン耐性黄色ブドウ球菌 （MRSA) 感染症の併用薬のリードとして有用であ ると期待される。

Claims

1. 下記式 [ I ]
請
の
Figure imgf000023_0001
s- で表されるステンフォン D物質、 下記式 [I]
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000023_0003
で表されるステンフォン E 1物質、 下記式 [IV]
Figure imgf000024_0001
で表されるステンフォン E 2物質、 下記式 [V]
Figure imgf000024_0002
で表されるステンフォン E 3物質、 下記式 [VI]
Figure imgf000024_0003
で表されるステンフォン F物質よりなる群から選択されるステンフォン類の化合 物。
2. ァスペルギルス属に属し、 請求の範囲 1に記載のステンフォン D物質、 ステンフォン E物質、 ステンフォン E 1物質、 ステンフォン E 2物貲、 ステンフ オン E 3物質、 またはステンフォン F物質よりなる群から選択されるステンフォ ン類の化合物を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、 培養物中にステン フォン類の化合物を蓄積せしめ、 該培養物からステンフォン類の化合物を採取す る新規ステンフォン類の化合物の製造法。
3. ァスペルギルス属に属し、 ステンフオシ類の化合物を生産する能力を有 する微生物が、 ァスペルギルス エスピ FK I― 2 -1 -36 (Aspergillus sp. FKI-2136) (NITE BP- 83) である請求項 2記載の製造法。
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