CN110218769A - 用于lamp或rt-lamp的整合一体式多联试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于LAMP或RT‑LAMP的整合一体式多联试纸条，包括试纸条主体，试纸条主体包括上层片、下层片和中层片；上层片与下层片密封固连形成套状构件，套状构件的一端具有开口；中层片安置于套状构件内，中层片朝开口延伸出抽拉柄；中层片与套状构件构成移动副；上层片设有一组加样孔，下层片设有一组反应点；中层片设有一组流通孔、一组试剂孔、一反应区、以及一组染料孔。反应点的材质为FTA滤膜或FTA卡或Whatman No.1滤纸。采用本发明能够直接实现样本核酸的抽提、扩增及显示结果，且能一并实现对多个目标核酸的检测，摆脱对自动仪器的依赖。

Description

用于LAMP或RT-LAMP的整合一体式多联试纸条

技术领域

本发明涉及一种用于LAMP或RT-LAMP的整合一体式多联试纸条，属于核酸检测辅助装置技术领域。

背景技术

据发明人所知，一些相同症候群传染病(如病毒性出血热系列有发热伴出血，病毒疹系列有发热伴出疹等)，它们的主要临床表现相似，早期难以鉴别诊断，最终病因确认有赖于病原检测，尽快筛查并明确诊断对控制疫情至关重要。由于传染病疫情的突发性和快速蔓延性，最好能在现场第一时间展开快速病原检测，因为患者标本或虫媒标本从现场或野外辗转后送至具备条件的实验室，往往距离较远，耗时长，延误救治和防控，并且标本易失活造成假阴性，此外还存在一定的传播隐患。然而，目前针对传染病病原的现场检测手段相对单薄，仍以胶体金试纸条为主，存在灵敏度低、检测谱窄、钩状效应等问题，常致假阴性。

核酸检测是早期、可靠、敏感的方法。然而常规PCR及DNA探针杂交技术因假阳性高等问题不适合临床诊断；实时荧光定量PCR技术灵敏度高，可靠性好，为全封闭反应，但该技术需要价格昂贵的荧光定量PCR仪，并且要保证高特异性往往需要荧光标记探针，检测成本较高，需要注意的是，精密贵重仪器对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，难以在基层卫生部门和防疫机构推广使用，也难以直接用于现场检测。

与上述各检测手段相比，LAMP(环介导等温扩增反应)或RT-LAMP(逆转录环介导等温扩增反应)方法应能更好地在现场进行早期病原学筛查。

LAMP/RT-LAMP方法具有较高特异性和抗干扰能力，只有当引物组与目的片段的6-8个区域都匹配上时才能进行扩增；反应体系稳定可靠，在室温下放置2周后仍然稳定，并且对于样品中原有或污染的无关、干扰片段仍然不敏感，而其他类似技术则无法做到这一点；敏感性较高，扩增快速、高效，1小时内产物量可达约10¹⁰倍，逆转录反应和LAMP扩增可同时进行，扩增效率和检测灵敏度可比普通RT-PCR高10-100倍左右；结果鉴别相对简便，如检测反应管的沉淀浊度就能判断扩增与否，也可在管盖或管底蜡封(高熔点)SYBR荧光染料直接观察反应后的颜色变化即可判断，或直接在反应体系加入不影响扩增效率的羟基萘酚蓝染料(hydroxy naphthol blue,HNB)来大幅度增强显色。总之，LAMP/RT-LAMP方法对于样品处理、操作技术和仪器设备的要求都比较低，更适宜于现场检测、医疗机构(如各类中小医院、社区医院等)、床边检验(Point of care testing,POCT)等场景下使用。

然而，将LAMP/RT-LAMP方法推广应用于以上现场检测等场景同样存在瓶颈问题：一是该方法需抽提核酸，手工操作繁琐，或需要配置价格较昂贵的全自动核酸提取仪，且核酸提取与检测分离易导致污染和假阳性问题；二是该方法需要配制反应体系，整合度不高；三是LAMP/RT-LAMP的相关试剂一般需冷链储存，运输储存不便；四是目前LAMP/RT-LAMP反应还难以实现多重反应，一般只能针对单个病原进行检测，通量不足，难以适应相同症候群(如发热伴出血、传染病四项筛查等)多种病原筛查的需要。因此，亟待研制出能克服上述技术问题的技术手段，以利于LAMP/RT-LAMP方法在现场检测、医院临床诊断中的应用。

经检索发现，申请号CN201610710500.3、申请公布号CN106337085A的中国发明专利申请，公开了一种核酸检测卡及其使用方法，包括封口膜、卡体、试剂孔、核酸扩增试剂、反应孔、核酸收集试纸、配套使用的核酸纯化试剂、冲洗缓冲液、防止溶液挥发的有机相。打开封口膜，将病原体样本加入到封装有核酸收集试纸的反应孔中，经核酸纯化试剂和冲洗缓冲液自动冲洗数次后，将试剂孔内的核酸扩增试剂分别加入每个对应的反应孔，在防止溶液挥发的有机相保护下，进行核酸扩增反应，反应的结果可通过配套使用的光学检测仪进行定性与定量分析。

申请号CN201810583631.9、申请公布号CN108642569A的中国发明专利申请，公开了一种核酸检测芯片，包括：设置在中间位置的样本室单元，其存储加入的核酸样本，并在旋转作用下将核酸样本等分；与样本室单元连通，并通过虹吸现象将核酸样本引入反应室单元的第一虹吸阀；反应室单元，其设置在边缘位置，其将核酸样本与试剂混合并进行核酸反应，反应室单元的反应室还连通有第二虹吸阀；与反应室单元连通的试剂存储导入单元，其内存储有反应试剂，在反应室单元内导入核酸样本后，向反应室单元内导入反应试剂，以使反应试剂与核酸样本反应可以针对各种血液病毒进行检测。

然而，以上两种技术方案都不能脱离价格昂贵的自动仪器，难以适用于目前现场检测等场景的现状。

经检索还发现，专利号CN201410363297.8、授权公告号CN104101706B的中国发明专利，公开了一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法，试纸条包括底板和顺次搭接粘贴在所述底板上的样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中结合物垫为金标-生物素结合物垫和链霉亲和素-金-抗体结合物垫的组合；检测甲流抗原的方法中，将待检样品滴加在所述的试纸条上，若在检测线(1)处显示红色条带，则说明所述待检样品中含有甲流抗原。

申请号CN201710569444.0、申请公布号CN107287351A的中国发明专利申请，提到了一种横向流动试纸条(Lateral flow dipstick，LFD)，其原理是将FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，LFD检测无需特殊的设备，操作者只需将产物和试纸条浸入缓冲液，LFD试纸条上具有控制带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有控制带显色检测带不显色表明检测结果为阴性。

然而，以上两种试纸条技术方案都不能在试纸条上直接进行核酸的洗脱和扩增，仍然无法满足现场检测等场景的需求。

发明内容

本发明目的在于：针对上述现有技术存在的问题，提出一种用于LAMP或RT-LAMP的整合一体式多联试纸条，能够直接实现样本核酸的抽提、扩增及显示结果，且能一并实现对多个目标核酸的检测，摆脱对自动仪器的依赖，适用于现场检测场景，尤其适用于传染病现场防控、医院临床科室、口岸检验检疫。

为了达到以上目的，本发明的技术方案如下：

一种用于LAMP或RT-LAMP的整合一体式多联试纸条，包括试纸条主体，其特征是，所述试纸条主体包括上层片、下层片和中层片；所述上层片与下层片密封固连形成套状构件，所述套状构件的一端具有开口；所述中层片安置于套状构件内，所述中层片朝开口延伸出抽拉柄，所述抽拉柄穿过开口并伸出套状构件；所述中层片与套状构件构成移动副；

所述上层片设有一组加样孔，所述下层片设有一组反应点，所述加样孔与反应点一一对应；所述中层片设有一组流通孔、一组试剂孔、一反应区、以及一组染料孔，所述流通孔、试剂孔、染料孔彼此一一对应，所述流通孔、试剂孔、染料孔分别与加样孔一一对应；

所述加样孔、流通孔分别为开孔，所述试剂孔为预装有扩增反应试剂冻干粉的半密封孔，所述染料孔为预装有染料粉末的半密封孔；所述半密封孔的两端开口分别以透水膜封闭；所述反应区与上层片、下层片分别相贴。

采用该结构，可使试纸条具有多个检测点而成为多联试纸条，使用时可通过抽拉中层片使其流通孔、试剂孔、反应区、染料孔依次位于上层片加样孔下、且位于下层片反应点上，然后实施加样并抽提核酸、加扩增反应试剂、进行恒温扩增反应、显色以判断结果的LAMP或RT-LAMP实验过程，能一并实现对多个目标核酸的检测，并摆脱对自动仪器的依赖，不需要进行额外的核酸抽提操作，尤其适用于现场检测场景。

本发明还可以采用以下优选方案：

优选地，所述反应点的材质为FTA滤膜或FTA卡或Whatman No.1滤纸。

优选地，所述试纸条具有：

中层片在外力抽拉作用下使其流通孔对准加样孔以及反应点，各流通孔分别与对应加样孔、以及对应反应点构成加样腔，经加样孔和流通孔向反应点加入待检样本的加样状态；

在加样状态基础上且在加入待检样本、洗涤并移除废液后，中层片在外力抽拉作用下使其试剂孔对准加样孔以及反应点，各试剂孔分别与对应加样孔、以及对应反应点构成加样腔，经加样孔向试剂孔加入去离子水复溶扩增反应试剂冻干粉以向反应点加入扩增反应试剂的预备状态；

在预备状态基础上且在加入扩增反应试剂后，中层片在外力抽拉作用下使其反应区覆盖所有反应点，上层片与反应区贴合使加样孔朝向中层片的下端开口保持封闭，且下层片与反应区贴合使反应点位于密闭空间内，试纸条主体的加样孔所处区域置于恒温环境中进行反应的扩增反应状态；

在扩增反应状态基础上且在扩增反应完成后，中层片在外力抽拉作用下使其染料孔对准加样孔以及反应点，各染料孔分别与对应加样孔、以及对应反应点构成加样腔，经加样孔向染料孔加入去离子水溶解染料粉末以向反应点加入染料、并使其显色以备判定结果的结果显示状态。

采用该优选方案，可通过更加明确的各个状态在试纸条上顺利实施LAMP或RT-LAMP实验过程。

优选地，所述中层片与套状构件之间的间隙填充有润滑脂，且润滑脂位于流通孔、试剂孔、反应区、染料孔、加样孔、反应点的周围。

优选地，所述上层片、中层片、下层片的材质分别为聚甲基丙烯酸甲酯；所述中层片与套状构件之间的间隙填充有液态硅胶层，所述液态硅胶层与套状构件固连，所述液态硅胶层位于流通孔、试剂孔、反应区、染料孔、加样孔、反应点的周围。

采用以上两优选方案的任意一个均能实现更好地密封效果，更好地确保检测的可靠性，并尽量避免扩增反应可能带来的气溶胶污染。

优选地，所述上层片内设有第一磁力片，所述下层片内设有第二磁力片，所述第一磁力片与第二磁力片以磁力彼此相吸；所述中层片的材质为铁氧体磁性薄膜。

采用该优选方案，可使上层片与下层片能借助磁吸力夹紧中层片，中层片本身的材质可进一步确保夹紧效果，实现更好地密封效果，更好地确保检测的可靠性，并尽量避免扩增反应可能带来的气溶胶污染。

优选地，所述中层片的抽拉柄设有一组抽拉指示线，所述抽拉指示线包括预备状态指示线、扩增反应状态指示线、结果显示状态指示线。当试纸条处于加样状态时，预备状态指示线、扩增反应状态指示线、结果显示状态指示线均位于套状构件的开口以内；当试纸条处于预备状态时，预备状态指示线与套状构件的开口外边缘平齐，扩增反应状态指示线、结果显示状态指示线均位于套状构件的开口以内；当试纸条处于扩增反应状态时，预备状态指示线位于套状构件的开口以外，扩增反应状态指示线与套状构件的开口外边缘平齐，结果显示状态指示线位于套状构件的开口以内；当试纸条处于结果显示状态时，预备状态指示线、扩增反应状态指示线位于套状构件的开口以外，结果显示状态指示线与套状构件的开口外边缘平齐。

采用该优选方案，可通过抽拉指示线来指示试纸条的当前状态，更加易于使用。

优选地，所述中层片的抽拉柄与套状构件的开口尺寸相配，且抽拉柄嵌于开口内。

采用该优选方案，能使试纸条密封性更好，且避免整个中层片被拉出。

优选地，所述反应区靠近下层片的侧面设有液态硅胶层，所述下层片位于反应点周围的部位也设有液态硅胶层；当反应点位于反应区的覆盖区域内时，所述反应区的液态硅胶层与下层片的液态硅胶层相贴合。

采用该优选方案，可使反应点位于反应区覆盖范围时，能够更加有效地将反应点封闭起来，这样在整个试纸条或反应区部位放入恒温环境(如水浴锅、恒温设备等)后，能够使反应点在封闭状态下进行扩增反应，以更好地确保检测的可靠性，并尽量避免扩增反应可能带来的气溶胶污染。

采用本发明后，可直接在试纸条上通过加试剂的方式实现核酸抽提，同时不需要配制整个反应体系，能够直接实现样本核酸的抽提、扩增及显示结果，一并实现对多个目标核酸的检测，摆脱对自动仪器的依赖，适用于现场检测场景。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本发明实施例的主体结构示意图。

图2为本发明实施例的套状构件示意图。

图3为图2的局部放大示意图。

图4为本发明实施例的主视方向示意图。

图5为本发明实施例的中层片示意图。

图6为本发明实施例的下层片示意图。

图7为本发明实施例试纸条处于加样状态时，图4的A-A剖视示意图。

图8为本发明实施例试纸条处于扩增反应状态时，图4的A-A剖视示意图。

具体实施方式

实施例

如图1至图8所示，本实施例用于LAMP或RT-LAMP的整合一体式多联试纸条，包括试纸条主体01，试纸条主体01包括上层片11、下层片13和中层片12；上层片11与下层片13密封固连形成套状构件14，套状构件14的一端具有开口15；中层片12安置于套状构件14内，中层片12朝开口15延伸出抽拉柄16，抽拉柄16穿过开口15并伸出套状构件14；中层片12与套状构件14构成移动副；中层片12的抽拉柄16与套状构件14的开口15尺寸相配，且抽拉柄16嵌于开口15内。

上层片11设有一组加样孔21，下层片13设有一组反应点28(反应点28的材质为FTA滤膜或FTA卡或Whatman No.1滤纸，反应点28直径可设为5mm左右)，加样孔21与反应点28一一对应；中层片12设有一组流通孔23、一组试剂孔25、一反应区24、以及一组染料孔26，流通孔23、试剂孔25、染料孔26彼此一一对应，流通孔23、试剂孔25、染料孔26分别与加样孔21一一对应。

加样孔21、流通孔23分别为开孔，试剂孔25为预装有扩增反应试剂冻干粉的半密封孔，染料孔26为预装有染料粉末的半密封孔；半密封孔的两端开口分别以透水膜封闭；反应区24与上层片11、下层片13分别相贴。

为确保试纸条的密封性，可采用以下两种结构之一(如图7所示)：

(1)中层片12与套状构件14之间的间隙填充有润滑脂41，且润滑脂41位于流通孔23、试剂孔25、反应区24、染料孔26、加样孔21、反应点28的周围。

润滑脂41可采用杜邦的lvp高真空润滑脂41。润滑脂41可在中层片12与套状构件14之间形成润滑膜，并起到封闭作用。

(2)上层片11、中层片12、下层片13的材质分别为聚甲基丙烯酸甲酯；中层片12与套状构件14之间的间隙填充有液态硅胶层42，液态硅胶层42与套状构件14固连，液态硅胶层42位于流通孔23、试剂孔25、反应区24、染料孔26、加样孔21、反应点28的周围。

注：液态硅胶层42是指材质为液态硅胶的固体层，并非液体层。

为进一步确保试纸条的密封性，如图7所示，上层片11内设有第一磁力片43，下层片13内设有第二磁力片44，第一磁力片43与第二磁力片44以磁力彼此相吸；中层片12的材质为铁氧体磁性薄膜。

为进一步确保扩增反应时试纸条反应部位的密封性，如图6、图8所示，反应区24靠近下层片13的侧面设有液态硅胶层45，下层片13位于反应点28周围的部位也设有液态硅胶层46；当反应点28位于反应区24的覆盖区域内时，反应区24的液态硅胶层45与下层片13的液态硅胶层46相贴合。

经试验，本实施例试纸条可满足在65℃下孵育1小时以上的要求。

本实施例纸条具有以下具体状态：

(1)中层片12在外力抽拉作用下使其流通孔23对准加样孔21以及反应点28，各流通孔23分别与对应加样孔21、以及对应反应点28构成加样腔，经加样孔21和流通孔23向反应点28加入待检样本的加样状态。(注：待检样本为血液、细菌培养液等。)

(2)在加样状态基础上且在加入待检样本、洗涤并移除废液后，中层片12在外力抽拉作用下使其试剂孔25对准加样孔21以及反应点28，各试剂孔25分别与对应加样孔21、以及对应反应点28构成加样腔，经加样孔21向试剂孔25加入去离子水复溶扩增反应试剂冻干粉以向反应点28加入扩增反应试剂的预备状态。(注：按正常试验步骤，加入待检样本后等待一段时间，加入FTA提取液、TE缓冲液各冲洗一遍，所有废液均使用移液器吸走即可。扩增反应试剂冻干粉包括LAMP检测试剂和扩增引物。)

(3)在预备状态基础上且在加入扩增反应试剂后，中层片12在外力抽拉作用下使其反应区24覆盖所有反应点28，上层片11与反应区24贴合使加样孔21朝向中层片12的下端开口15保持封闭，且下层片13与反应区24贴合使反应点28位于密闭空间内，试纸条主体01的加样孔21所处区域置于恒温环境中进行反应的扩增反应状态。

(4)在扩增反应状态基础上且在扩增反应完成后，中层片12在外力抽拉作用下使其染料孔26对准加样孔21以及反应点28，各染料孔26分别与对应加样孔21、以及对应反应点28构成加样腔，经加样孔21向染料孔26加入去离子水溶解染料粉末以向反应点28加入染料、并使其显色以备判定结果的结果显示状态。(注：染料粉末为SYBR green粉末。)

如图5所示，中层片12的抽拉柄16设有一组抽拉指示线，抽拉指示线包括预备状态指示线30、扩增反应状态指示线31、结果显示状态指示线32。

当试纸条处于加样状态时，预备状态指示线30、扩增反应状态指示线31、结果显示状态指示线32均位于套状构件14的开口15以内；当试纸条处于预备状态时，预备状态指示线30与套状构件14的开口15外边缘平齐，扩增反应状态指示线31、结果显示状态指示线32均位于套状构件14的开口15以内；当试纸条处于扩增反应状态时，预备状态指示线30位于套状构件14的开口15以外，扩增反应状态指示线31与套状构件14的开口15外边缘平齐，结果显示状态指示线32位于套状构件14的开口15以内；当试纸条处于结果显示状态时，预备状态指示线30、扩增反应状态指示线31位于套状构件14的开口15以外，结果显示状态指示线32与套状构件14的开口15外边缘平齐。

本实施例试纸条在具体使用时，可结合各抽拉指示线，通过抽拉中层片12使其流通孔23、试剂孔25、反应区24、染料孔26依次对准或覆盖上层片11的加样孔21和下层片13的反应点28，并对应实施加入待检样本、加洗脱液进行洗脱抽提核酸、加扩增反应试剂、放于恒温环境中进行恒温扩增反应、加染料显色以判断结果的LAMP或RT-LAMP实验过程，最终实现对多个目标核酸的检测。

其中，在进行恒温扩增反应时可采用水浴锅或小型恒温设备；将试纸条放入恒温环境前，以外力按压，使反应区24的液态硅胶层45与下层片13的液态硅胶层46能更好地贴合；在将试纸条放入恒温环境时，通常将整个试纸条放入，如果条件允许，可以在反应时只将反应区24部位放于恒温环境中进行扩增反应。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于LAMP或RT-LAMP的整合一体式多联试纸条，包括试纸条主体，其特征是，所述试纸条主体包括上层片、下层片和中层片；所述上层片与下层片密封固连形成套状构件，所述套状构件的一端具有开口；所述中层片安置于套状构件内，所述中层片朝开口延伸出抽拉柄，所述抽拉柄穿过开口并伸出套状构件；所述中层片与套状构件构成移动副；

所述上层片设有一组加样孔，所述下层片设有一组反应点，所述加样孔与反应点一一对应；所述中层片设有一组流通孔、一组试剂孔、一反应区、以及一组染料孔，所述流通孔、试剂孔、染料孔彼此一一对应，所述流通孔、试剂孔、染料孔分别与加样孔一一对应；

所述加样孔、流通孔分别为开孔，所述试剂孔为预装有扩增反应试剂冻干粉的半密封孔，所述染料孔为预装有染料粉末的半密封孔；所述半密封孔的两端开口分别以透水膜封闭；所述反应区与上层片、下层片分别相贴。

2.根据权利要求1所述的整合一体式多联试纸条，其特征是，所述反应点的材质为FTA滤膜或FTA卡或Whatman No.1滤纸。

3.根据权利要求1所述的整合一体式多联试纸条，其特征是，所述试纸条具有：

中层片在外力抽拉作用下使其流通孔对准加样孔以及反应点，各流通孔分别与对应加样孔、以及对应反应点构成加样腔，经加样孔和流通孔向反应点加入待检样本的加样状态；

在加样状态基础上且在加入待检样本、洗涤并移除废液后，中层片在外力抽拉作用下使其试剂孔对准加样孔以及反应点，各试剂孔分别与对应加样孔、以及对应反应点构成加样腔，经加样孔向试剂孔加入去离子水复溶扩增反应试剂冻干粉以向反应点加入扩增反应试剂的预备状态；

在预备状态基础上且在加入扩增反应试剂后，中层片在外力抽拉作用下使其反应区覆盖所有反应点，上层片与反应区贴合使加样孔朝向中层片的下端开口保持封闭，且下层片与反应区贴合使反应点位于密闭空间内，试纸条主体的加样孔所处区域置于恒温环境中进行反应的扩增反应状态；

在扩增反应状态基础上且在扩增反应完成后，中层片在外力抽拉作用下使其染料孔对准加样孔以及反应点，各染料孔分别与对应加样孔、以及对应反应点构成加样腔，经加样孔向染料孔加入去离子水溶解染料粉末以向反应点加入染料、并使其显色以备判定结果的结果显示状态。

4.根据权利要求1所述的整合一体式多联试纸条，其特征是，所述中层片与套状构件之间的间隙填充有润滑脂，且润滑脂位于流通孔、试剂孔、反应区、染料孔、加样孔、反应点的周围。

5.根据权利要求1所述的整合一体式多联试纸条，其特征是，所述上层片、中层片、下层片的材质分别为聚甲基丙烯酸甲酯；所述中层片与套状构件之间的间隙填充有液态硅胶层，所述液态硅胶层与套状构件固连，所述液态硅胶层位于流通孔、试剂孔、反应区、染料孔、加样孔、反应点的周围。

6.根据权利要求1所述的整合一体式多联试纸条，其特征是，所述上层片内设有第一磁力片，所述下层片内设有第二磁力片，所述第一磁力片与第二磁力片以磁力彼此相吸；所述中层片的材质为铁氧体磁性薄膜。

7.根据权利要求1所述的整合一体式多联试纸条，其特征是，所述中层片的抽拉柄设有一组抽拉指示线，所述抽拉指示线包括预备状态指示线、扩增反应状态指示线、结果显示状态指示线。

8.根据权利要求7所述的整合一体式多联试纸条，其特征是，当试纸条处于加样状态时，预备状态指示线、扩增反应状态指示线、结果显示状态指示线均位于套状构件的开口以内；当试纸条处于预备状态时，预备状态指示线与套状构件的开口外边缘平齐，扩增反应状态指示线、结果显示状态指示线均位于套状构件的开口以内；当试纸条处于扩增反应状态时，预备状态指示线位于套状构件的开口以外，扩增反应状态指示线与套状构件的开口外边缘平齐，结果显示状态指示线位于套状构件的开口以内；当试纸条处于结果显示状态时，预备状态指示线、扩增反应状态指示线位于套状构件的开口以外，结果显示状态指示线与套状构件的开口外边缘平齐。

9.根据权利要求1至8任一项所述的整合一体式多联试纸条，其特征是，所述中层片的抽拉柄与套状构件的开口尺寸相配，且抽拉柄嵌于开口内。

10.根据权利要求1至8任一项所述的整合一体式多联试纸条，其特征是，所述反应区靠近下层片的侧面设有液态硅胶层，所述下层片位于反应点周围的部位也设有液态硅胶层；当反应点位于反应区的覆盖区域内时，所述反应区的液态硅胶层与下层片的液态硅胶层相贴合。