CN114480684A - 一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的是一种猪肺炎支原体nfo‑RPA检测试剂盒及其制备方法，通过生物信息学分析筛选出Mhp的P36基因保守序列，从Mhp基因组中扩增出P36基因并连接到pUC57质粒中构建P36阳性质粒，根据P36基因序列分别设计nfo‑RPA酶扩增引物Mhp‑specific‑Forward、Mhp‑specific‑Reverse和探针Mhp‑specific‑Probe，将引物和探针与nfo‑RPA酶混合建立反应体系，具有反应重复性好，检测特异性高，反应结果快，检测结果与荧光定量PCR检测结果符合率为93.75%，适用于临床快检等技术特点。

Description

一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒及其制备方法，更具体一点说，涉及一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒及其制备方法，属于生物基因工程领域。
背景技术
猪肺炎支原体 (Mycoplasma hyopneumonia, Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine, MPS)又称“猪气喘病”或“猪地方性肺炎(porcineenzootic pneumonia, PEP)”的主要病原体。该病具有高发病率和低死亡率的特点，临床症状主要表现为慢性干咳、发热以及食欲不振等。猪肺炎支原体的感染会抑制宿主免疫系统，极易引发继发性感染，常见的继发性感染病原体包括猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus2, PCV2)，猪繁殖和呼吸道综合病毒(Porcine Reproductive and Respiratory SyndromeVirus, PRRSV)、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)等，多种病原体之间的相互作用，严重恶化了单一病原体感染的症状，继而引起呼吸系统疾病综合症 (Porcine RespiratoryDisease Complex, PRDC)，给全球养猪业造成巨大的经济损失。
如何快速有效地检测Mhp的感染对猪场有效防控该病具有极其重要的意义。病原分离是鉴定Mhp感染的金标准，但其不能作为临床检测应用。随着PCR技术的不断发展，如实时荧光定量PCR技术、套式PCR技术、基因芯片、环介导等温扩增技术等在疾病诊断方面被逐步建立起来，但这些技术均因设备依赖性高或检测特异性低等难以满足临床快速且经济的检测需求。Piepenburg等于2006年报道了一种重组酶聚合酶（Recombinase polymeraseamplification, RPA）扩增技术[1]，可在常温恒温条件下快速进行核酸的扩增。nfo-RPA是在反应体系中添加了nfo酶（大肠埃希菌核酸内切酶Ⅳ）。通过特异性地引物和探针，使nfo-RPA的扩增产物同时携带FAM和Biotin标记，结合侧流层析试纸条，扩增产物通过抗原抗抗体结合的作用在试纸条上显色，无需依赖特殊设备即可实现临床上快速、特异且可视化的检测。
发明内容
本发明目的在于提供具有检测特异性高、重复性好、反应结果可以快速通过胶体金试纸条呈现，可应用于临床快检等技术特点的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒，包括用于nfo-RPA酶扩增的引物Mhp-specific-Forward和Mhp-specific-Reverse，与P36基因特异性结合的探针Mhp-specific-Probe，P36阳性质粒，试纸条。
优选的，所述P36阳性质粒序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述Mhp-specific-Forward序列为CCCTTGTAATTATATCAACAGGATTAGCAAC；所述Mhp-specific-Reverse序列为[Biotin] TGCCTTTTCCGATTAGTGTCTCCCGTTATG；所述Mhp-specific-Probe序列为[FAM]GGTCTTCCCGCTGTAATTACAATAAAATCAGCAT[THF]CTTTTAGATCTTTATA[SpC]。
本发明一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
步骤一：猪肺炎支原体的培养；
步骤二：P36阳性质粒的制备：通过生物信息学分析筛选出Mhp的P36基因保守序列，从Mhp基因组中扩增出P36基因并连接到pUC57质粒中构建P36阳性质粒；
步骤三：Mhp nfo-RPA反应体系的建立：以P36保守序列为模板，分别设计P36-Forward和P36-Reverse两条引物从Mhp基因组中扩增出P36基因序列，根据P36基因的序列分别设计用于nfo-RPA酶扩增的引物Mhp-specific-Forward和Mhp-specific-Reverse，以及与P36基因特异性结合的探针Mhp-specific-Probe，将引物、探针、nfo-RPA酶混合建立反应体系，获得Mhp nfo-RPA反应体系。
优选的，还包括Mhp nfo-RPA反应体系及条件优化，其包括如下步骤：
选取稀释浓度为2×108 copies/μL的P36质粒模板，分别设置多个时间梯度进行nfo-RPA扩增反应，待反应结束后，取出反应管置于冰上结束反应，并在胶体金试纸条中观察结果，验筛可见清晰的扩增条带对应的最佳反应时间；
在上述筛选出最佳反应时间的基础上，进一步设置多个温度梯度进行nfo-RPA扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果，确定最佳反应温度。
优选的，还包括Mhp nfo-RPA反应体系灵敏度验证，其包括如下步骤：
以P36阳性质粒标准品2×109 copies/μL为初始浓度，按10倍梯度稀释，在最佳反应时间和最佳反应温度条件下分别以稀释浓度为2×109 copies/μL、2×108 copies/μL、2×107 copies/μL、2×106 copies/μL、2×105copies/μL、2×104 copies/μL、2×103copies/μL、2×102 copies/μL、2×101 copies/μL、2×100 copies/μL的P36阳性质粒为模板，ddH2O为阴性对照进行nfo-RPA扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果。
优选的，还包括Mhp nfo-RPA反应体系特异性鉴定，其包括：分别以Mhp168株、猪圆环病毒2型、猪繁殖和呼吸道综合病毒、猪流行性腹泻病毒、非洲猪瘟病毒及伪狂犬病毒的基因组为模板，ddH2O为阴性对照，在最佳反应时间和反应温度条件下进行nfo-RPA反应，并在胶体金试纸条中观察结果；
还包括Mhp nfo-RPA反应体系重复性验证，其包括组间重复、组内重复，其中，组间重复：以2×107 copies/μL、2×106 copies/μL、2×105 copies/μL 3个不同浓度的P36质粒在同一条件下进行3次重复检测；组内重复：以2×107 copies/μL、2×106 copies/μL、2×105 copies/μL 3个不同浓度的P36质粒在同一次实验中做3次重复。
优选的，猪肺炎支原体的培养步骤为：用改良Friis培养基溶解实验室鉴定冻存的Mhp或Mhp活疫苗，并以10 %的比例加入到10 mL的改良Friis培养基中培养进行培养，用双蒸水煮裂解法提取Mhp株的基因组；
改良Friis培养基由1.5 g脑心浸液粉，1.6 g PPLO肉汤粉，9 mL酵母浸液，12.5mL Hank’s液，50 mL猪血清，5 mL 0.25%酚红，50 mg/mL Amp混合，定容至500 mL，调节pH为7.4后制备而得。
优选的，步骤二具体为：在NCBI数据库中查找Mhp P36基因的序列，通过生物信息学比对确定P36基因的保守序列，以P36保守序列为模板，分别设计P36-Forward和P36-Reverse两条引物从Mhp基因组中扩增出P36基因序列，根据P36基因的序列分别设计用于nfo-RPA酶扩增的引物Mhp-specific-Forward和Mhp-specific-Reverse，以及与P36基因特异性结合的探针Mhp-specific-Probe；利用分子生物学方法将扩增的P36基因进行双酶切后连接到pUC57载体中，转入Escherichia coli TG1感受态菌中扩增，筛选鉴定后获得的重组载体命名为P36阳性质粒。
优选的，步骤三具体为：在nfo-RPA干粉管中分别加入29.4 μL Buffer A、2 μLMhp-specific-Forward、2 μL Mhp-specific-Reverse、0.6 μL Mhp-specific-Probe、共13.5 μL的ddH2O和P36阳性质粒，2.5 μL 的Buffer B，在最佳反应温度条件等待最佳反应时间过后，取反应产物40 μL清洁回收后进行琼脂糖凝胶电泳，其余10 μL产物稀释20倍后，取50 μL滴加到胶体金试纸条加样孔中，观察胶体金试纸条的检测结果，ddH2O为阴性对照。
有益效果：引物、探针、nfo-RPA酶混合建立反应体系形成检测试剂盒，该反应体系仅需在39 ℃反应14 min，检测下限为2×101 copies/μL的质粒浓度，检测特异性高，重复性好，反应结果5 min内即可通过胶体金试纸条呈现，且检测结果与荧光定量PCR检测结果符合率为93.75%，可应用于临床快检。
附图说明
图1 是本发明P36阳性质粒示意图。
图2 是本发明Mhp nfo-RPA反应体系的建立图。
图3 是本发明Mhp nfo-RPA反应时间图。
图4 是本发明Mhp nfo-RPA反应温度图。
图5是本发明Mhp nfo-RPA反应灵敏度测定图。
图6是本发明Mhp nfo-RPA反应重复性测定图。
图7是本发明Mhp nfo-RPA反应特异性测定图。
具体实施方式
以下结合说明书附图1-7所示，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
本发明以Mhp的P36基因序列为模板，设计扩增引物Mhp-specific-Forward和Mhp-specific-Reverse从Mhp基因组中扩增P36基因片段，以该基因片段序列为靶标设计DNA探针Mhp-specific-Probe。将引物和探针与nfo-RPA酶混合建立反应体系，该反应体系仅需在39 ℃反应14 min，检测下限为2×101 copies/μL的质粒浓度，检测特异性高，重复性好，反应结果5 min内即可通过胶体金试纸条呈现，且检测结果与荧光定量PCR检测结果符合率为93.75%。说明通过此方法构建的猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒可应用于临床快检。
本发明一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法包括如下步骤：
一、猪肺炎支原体的培养
用改良Friis培养基溶解实验室鉴定冻存的Mhp或Mhp活疫苗，并以10 %的比例加入到10 mL的改良Friis培养基中培养进行培养。用双蒸水煮裂解法提取Mhp株的基因组。
二、 P36阳性质粒的制备
在NCBI数据库中查找Mhp P36基因的序列，通过生物信息学比对确定P36基因的保守序列。以P36保守序列为模板，分别设计P36-Forward和P36-Reverse两条引物从Mhp基因组中扩增出P36基因序列。根据P36基因的序列分别设计用于nfo-RPA酶扩增的引物Mhp-specific-Forward和Mhp-specific-Reverse，以及与P36基因特异性结合的探针Mhp-specific-Probe。P36基因扩增所需引物序列及片段插入载体中的位点如图1所示。
利用分子生物学方法将扩增的P36基因进行双酶切后连接到pUC57载体中，转入Escherichia coli TG1感受态菌中扩增，筛选鉴定后获得的重组载体命名为P36阳性质粒。P36基因的片段序列如SEQ ID NO.1所示，构建的P36阳性质粒载体示意图分别如图2所示。
三、 Mhp nfo-RPA反应体系的建立
在nfo-RPA干粉管（nfo-RPA试剂盒购于潍坊安普未来生物技术有限公司，属于一种具体选择，对于型号、生产公司本发明不作限定）中分别加入29.4 μL Buffer A、2 μLMhp-specific-Forward（10 μM）、2 μL Mhp-specific-Reverse（10 μM）、0.6 μL Mhp-specific-Probe（10 μM）、共13.5 μL的ddH2O和P36阳性质粒，2.5 μL 的Buffer B，在39 ℃反应14 min后，取反应产物40 μL清洁回收后进行琼脂糖凝胶电泳。其余10 μL产物稀释20倍后，取50 μL滴加到胶体金试纸条（胶体金试纸条购置于潍坊安普未来生物技术有限公司，属于一种具体选择，对于型号、生产公司本发明不作限定）加样孔中，观察胶体金试纸条的检测结果。ddH2O为阴性对照，结果如图2所示。
四、 Mhp nfo-RPA反应体系及条件优化
选取稀释浓度为2×108 copies/μL的P36质粒模板，在根据试剂盒推荐的温度（试剂盒上都有标识），分别设置时间梯度7 min、8 min、9 min、10 min、11 min、12 min、13min、14 min进行nfo-RPA扩增反应，待反应结束后，取出反应管置于冰上结束反应，并在胶体金试纸条中观察结果，如图3所示，由图可见，反应时间为14 min时可见清晰的扩增条带。
在上述实验筛选出反应时间为14 min的基础上，进一步设置温度梯度34 ℃、35℃、36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃进行nfo-RPA扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果，如图4所示，结合临床上实际使用的便利性，最终确定39 ℃为最佳反应温度。
五、 Mhp nfo-RPA反应体系灵敏度验证
以P36阳性质粒标准品2×109 copies/μL为初始浓度，按10倍梯度稀释（109至100），在反应时间为14 min，反应温度为39 ℃的反应条件下分别以稀释浓度为2×109copies/μL、2×108 copies/μL、2×107 copies/μL、2×106 copies/μL、2×105copies/μL、2×104 copies/μL、2×103 copies/μL、2×102 copies/μL、2×101 copies/μL、2×100copies/μL的P36阳性质粒为模板，ddH2O为阴性对照进行nfo-RPA扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果，如图5所示。
六、 Mhp nfo-RPA反应体系特异性鉴定
分别以Mhp168株、猪圆环病毒2型、猪繁殖和呼吸道综合病毒、猪流行性腹泻病毒、非洲猪瘟病毒及伪狂犬病毒的基因组为模板，ddH2O为阴性对照，在反应时间14 min，反应温度39 ℃进行nfo-RPA反应，并在胶体金试纸条中观察结果，如图6所示。
七、 Mhp nfo-RPA反应体系重复性验证
组间重复：以2×107 copies/μL、2×106 copies/μL、2×105 copies/μL 3个不同浓度的P36质粒在同一条件下进行3次重复检测。
组内重复：以2×107 copies/μL、2×106 copies/μL、2×105 copies/μL 3个不同浓度的P36质粒在同一次实验中做3次重复。结果如图7所示
八、 Mhp nfo-RPA反应体系用于临床样本检测
采集猪场鼻拭子样品80份，提取猪鼻拭子基因组并进行nfo-RPA扩增反应，同时利用荧光定量PCR进行样品检测，将Mhp nfo-RPA扩增反应结果与荧光定量PCR检测结果进行比较，结果如下表所示。
Mhp nfo-RPA与qPCR检测结果对比结果
Figure 969311DEST_PATH_IMAGE002
结果表明Mhp nfo-RPA反应与qPCR反应检测结果符合率为93.75%。
综上所述，通过生物信息学分析筛选出Mhp的P36基因保守序列，从Mhp基因组中扩增出P36基因并连接到pUC57质粒中构建P36阳性质粒。根据P36基因序列分别设计nfo-RPA酶扩增引物Mhp-specific-Forward、Mhp-specific-Reverse和探针Mhp-specific-Probe。将引物和探针与nfo-RPA酶混合建立反应体系，该反应体系仅需在39 ℃反应14 min，最低检测下限为2×101 copies/μL的质粒浓度，该反应重复性好，检测特异性高，反应结果在5min内即可通过胶体金试纸条呈现，且检测结果与荧光定量PCR检测结果符合率为93.75%。说明通过此方法构建的猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒适用于临床快检。
本发明所提及试剂和培养基配方：
改良Friis培养基：1.5 g脑心浸液粉，1.6 g PPLO肉汤粉，9 mL酵母浸液，12.5 mLHank’s液，50 mL猪血清，5 mL 0.25%酚红，50 mg/mL Amp，定容至500 mL，调节pH为7.4；
本发明所提及引物如下表所示
引物序列
Figure 292976DEST_PATH_IMAGE004
注：表中Biotin表示生物素，FAM表示荧光报告基团，THF表示四氢呋喃，SpC表示荧光淬灭基团
SEQ ID NO.1 P36
CCAAGCTTCCTGAACCGAATTAGGCGATACTTTTGCTCTTTTTGCGATTGCAAATTGAAGCCTTGCTGTATCTAAAACAGTTCCACTACCGATAACTTTTTGATCGGAAAATCCAGATGCATCCCGGTAAGCCCTTGTAATTATATCAACAGGATTAGCAACAATAATACTTATTCCACTAAAGCCACTTTCTTTGACTTTTAGTGCAATTTCCCGGATAATTCGGATGTTATCAGCTACTAATTCAAGCCGAGTTTCACCCGGTTTTTGTGGTCTTCCCGCTGTAATTACAATAAAATCAGCATCTTTTAGATCTTTATATTCATAACGGGAGACACTAATCGGAAAAGGCAGGTACCC
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司
浙江理工大学
<120> 一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法
<141> 2022-01-27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1

Claims (10)

1.一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒，其特征在于：包括用于nfo-RPA酶扩增的引物Mhp-specific-Forward和Mhp-specific-Reverse，与P36基因特异性结合的探针Mhp-specific-Probe，P36阳性质粒，试纸条。
2.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒，其特征在于：所述P36阳性质粒序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒，其特征在于：所述Mhp-specific-Forward序列为CCCTTGTAATTATATCAACAGGATTAGCAAC；所述Mhp-specific-Reverse序列为[Biotin] TGCCTTTTCCGATTAGTGTCTCCCGTTATG；所述Mhp-specific-Probe序列为[FAM]GGTCTTCCCGCTGTAATTACAATAAAATCAGCAT[THF]CTTTTAGATCTTTATA[SpC]。
4.一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：
步骤一：猪肺炎支原体的培养；
步骤二：P36阳性质粒的制备：通过生物信息学分析筛选出Mhp的P36基因保守序列，从Mhp基因组中扩增出P36基因并连接到pUC57质粒中构建P36阳性质粒；
步骤三：Mhp nfo-RPA反应体系的建立：以P36保守序列为模板，分别设计P36-Forward和P36-Reverse两条引物从Mhp基因组中扩增出P36基因序列，根据P36基因的序列分别设计用于nfo-RPA酶扩增的引物Mhp-specific-Forward和Mhp-specific-Reverse，以及与P36基因特异性结合的探针Mhp-specific-Probe，将引物、探针、nfo-RPA酶混合建立反应体系，获得Mhp nfo-RPA反应体系。
5.根据权利要求4所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：还包括Mhp nfo-RPA反应体系及条件优化，其包括如下步骤：
选取稀释浓度为2×108 copies/μL的P36质粒模板，分别设置多个时间梯度进行nfo-RPA扩增反应，待反应结束后，取出反应管置于冰上结束反应，并在胶体金试纸条中观察结果，验筛可见清晰的扩增条带对应的最佳反应时间；
在上述筛选出最佳反应时间的基础上，进一步设置多个温度梯度进行nfo-RPA扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果，确定最佳反应温度。
6.根据权利要求5所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：还包括Mhp nfo-RPA反应体系灵敏度验证，其包括如下步骤：
以P36阳性质粒标准品2×109 copies/μL为初始浓度，按10倍梯度稀释，在最佳反应时间和最佳反应温度条件下分别以稀释浓度为2×109 copies/μL、2×108 copies/μL、2×107 copies/μL、2×106 copies/μL、2×105copies/μL、2×104 copies/μL、2×103 copies/μL、2×102 copies/μL、2×101 copies/μL、2×100 copies/μL的P36阳性质粒为模板，ddH2O为阴性对照进行nfo-RPA扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果。
7.根据权利要求5或6所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：还包括Mhp nfo-RPA反应体系特异性鉴定，其包括：分别以Mhp168株、猪圆环病毒2型、猪繁殖和呼吸道综合病毒、猪流行性腹泻病毒、非洲猪瘟病毒及伪狂犬病毒的基因组为模板，ddH2O为阴性对照，在最佳反应时间和反应温度条件下进行nfo-RPA反应，并在胶体金试纸条中观察结果；
还包括Mhp nfo-RPA反应体系重复性验证，其包括组间重复、组内重复，其中，组间重复：以2×107 copies/μL、2×106 copies/μL、2×105 copies/μL 3个不同浓度的P36质粒在同一条件下进行3次重复检测；组内重复：以2×107 copies/μL、2×106 copies/μL、2×105 copies/μL 3个不同浓度的P36质粒在同一次实验中做3次重复。
8.根据权利要求4所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：猪肺炎支原体的培养步骤为：用改良Friis培养基溶解实验室鉴定冻存的Mhp或Mhp活疫苗，并以10 %的比例加入到10 mL的改良Friis培养基中培养进行培养，用双蒸水煮裂解法提取Mhp株的基因组；
改良Friis培养基由1.5 g脑心浸液粉，1.6 g PPLO肉汤粉，9 mL酵母浸液，12.5 mLHank’s液，50 mL猪血清，5 mL 0.25%酚红，50 mg/mL Amp混合，定容至500 mL，调节pH为7.4后制备而得。
9.根据权利要求4所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤二具体为：在NCBI数据库中查找Mhp P36基因的序列，通过生物信息学比对确定P36基因的保守序列，以P36保守序列为模板，分别设计P36-Forward和P36-Reverse两条引物从Mhp基因组中扩增出P36基因序列，根据P36基因的序列分别设计用于nfo-RPA酶扩增的引物Mhp-specific-Forward和Mhp-specific-Reverse，以及与P36基因特异性结合的探针Mhp-specific-Probe；利用分子生物学方法将扩增的P36基因进行双酶切后连接到pUC57载体中，转入Escherichia coli TG1感受态菌中扩增，筛选鉴定后获得的重组载体命名为P36阳性质粒。
10.根据权利要求5或6或8所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤三具体为：在nfo-RPA干粉管中分别加入29.4 μL Buffer A、2 μL Mhp-specific-Forward、2 μL Mhp-specific-Reverse、0.6 μL Mhp-specific-Probe、共13.5 μL的ddH2O和P36阳性质粒，2.5 μL 的Buffer B，在最佳反应温度条件等待最佳反应时间过后，取反应产物40 μL清洁回收后进行琼脂糖凝胶电泳，其余10 μL产物稀释20倍后，取50 μL滴加到胶体金试纸条加样孔中，观察胶体金试纸条的检测结果，ddH2O为阴性对照。
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