CN108949950B - 检测人slc11a1基因第543位密码子非保守碱基多态性的引物组、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基多态性的引物组、试剂盒及应用，属于分子诊断和基因诊断领域。引物组选自引物组P1、引物组P2、引物组P3或引物组P4中的一种。引物组在检测SLC11A1第543位密码子非保守碱基G/A多态性中的应用。引物组在制备检测SLC11A1第543位密码子非保守碱基G/A多态性的试剂盒中的应用。试剂盒选自试剂盒P1、P2、P3或P4中的一种。本发明具有以下优点：本发明同时使用四条引物从而提高了检测的特异性；在使用时只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备；具有高特异性；能快速、高效扩增；灵敏度高；鉴定过程简便，通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断和基因诊断领域，为体外诊断试剂，试剂检测对象为人外周血DNA；具体涉及检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基多态性的引物组、试剂盒及应用。
背景技术
结核病是全世界关切的公共健康问题，全球大约有三分之一人口被结核分枝杆菌感染，每年有三百余万人死于结核病。而结核分枝杆菌暴露是发展为结核病的关键环节，宿主因素同样影响着结核分枝杆菌的易感性。流行病学统计结果显示：某些人群存在对结核病较高的易感性。来自动物模型的实验证明：一些与免疫功能相关的基因及其调控基因与小鼠结核分枝杆菌的感染和致病性相关。例如在小鼠对卡介苗(BCG)、胞内分支杆菌(M.intracellulare)、鸟型分支杆菌(M.avium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)的感染受到lsb的单基因控制，该基因位于小鼠1号染色体上。该基因为隐形的小鼠具有对上述细菌感染的抵抗能力，研究发现Lsb基因产物能够激活巨噬细胞的。
人类SLC11A1基因位于2q35，包含15个外显子，编码550个氨基酸，它编码的溶质转运体家族11成员1蛋白，也曾命名为天然抗性相关巨噬细胞蛋白1(NRAMP1)，分布于巨噬细胞的吞噬溶酶体膜上。它通过影响巨噬细胞的活化来调节IL-1β、主要组织相容性复合物(MHC)II类分子、TNF-α、NO释放和抗菌性等功能，现已发现SLC11A1的5’端int4和D543N以及3’UTR多态性与结核病相关，其中INT4和3’UTR的杂合子在结核病患者中表达量显著提高。根据一项最新研究成果，发现第543位密码子的非保守碱基G/A替换(简称为D543N)已被证实与中国肺结核患者易感性具有相关性。因此可以利用这一发现，对SLC11A1基因D543N进行分子分型，从而对结核病易感性进行判断，并将结核病易感人群筛选出来，通过采取针对性的有效预防和提前干预措施，从而避免结核分枝杆菌感染、降低结核病发病率的目的。
目前，多态性位点进行分析的方法主要包括荧光定量PCR、限制性片段长度多态性PCR、扩增组织突变系统PCR、变性高效液相色谱分析等方法。以上方法操作繁琐，依赖复杂的仪器设备，对操作人员要求高，因此不适用于大规模筛查和基层单位开展。虽然测序技术在基因组分型检测方面仍是金标准，但成本较高，且耗时较长。基于PCR的技术需要有变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的反应温度和时间均不相同且有十分精确的要求，甚至需要进行20～40个循环来完成，因此需要依赖相对贵重的PCR温度循环仪进行控制，不利于现场诊断的要求。
发明内容
本发明公开了一种人类SLC11A1基因D543N位点多态性快速检测试剂盒，改善了目前测序技术不易普及推广、PCR反应需要依赖精密仪器的不足。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、不需要依赖昂贵的仪器设备、能够在1小时内对人体血液样本进行检测，并且通过肉眼直接观察结果等优点。利用本发明专利，能够特异性检出SLC11A1基因D543N位点多态性，通过该位点多态性信息，筛选出结核易感人群，通过采取针对性的预防措施，达到降低结核病发病率的目的。
本发明的目的在于公开了检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基多态性的引物组。
本发明第二个目的在于公开了检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基多态性的试剂盒。
本发明第三个目的在于公开了上述引物组和试剂盒的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基多态性的引物组，其中，所述引物组选自引物组P1、引物组P2、引物组P3或引物组P4中的一种；所述引物组P1为：
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所述引物组P2为：
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SLC11A1B3-2:AGCCTGGGCTACAG
SLC11A1FIPA-2:TGCAGCCTCCTTCACTTCTCCCTGGAGCCTTGAGGACATGTTA
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所述引物组P3为：
SLC11A1F3-4:GCCCAGGGGGAATT
SLC11A1B3-4:CAGTGAGCTGAGATCG
SLC11A1FIPA-4:TGCAGCCTCCTTCACTTCTCCCTAATTGGAGCCTTGAGGACATGTTA
SLC11A1FIPG-4:TGCAGCCTCCTTCACTTCTCCCTAATTGGAGCCTTGAGGACATGTTG
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所述引物组P4为：
SLC11A1F3-5：CTCAATGAATCTCAGCTTTC
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SLC11A1FIPA-5：CTATGCCCTTTCCTAAATGCTAGAAGGAAAAGAGGCCCAGGGGGAA
SLC11A1FIPG-5：CTATGCCCTTTCCTAAATGCTGGAAGGAAAAGAGGCCCAGGGGGAA
SLC11A1BIP-5：GCTGCAGGCTGGCATCTAGGAGACTCCATCTCCAAAAAAAGAGA。
上述技术方案所述的引物组在检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基非保守碱基G/A多态性中的应用。
上述技术方案所述的引物组在制备检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基G/A多态性的试剂盒中的应用。
上述技术方案所述的应用，其中，所述应用的具体过程为：
(1)、待检样本DNA的提取；
(2)、按照以下配方配制反应液：反应体系为25μL：1-10mM的SLC11A1FIPA、1-10mM的SLC11A1BIP、0.1-10mM的SLC11A1F3、0.1-10mM的SLC11A1B3、1-10mM的dNTPs、1-10mM的MgSO4、1-10M的甜菜碱、1-5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、加蒸馏水至25μL，温和混匀；
(3)、进行恒温扩增反应：在60-65℃保温0.5至1.5小时进行链置换反应；
(4)、分析判断反应产物结果：在反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，混匀，静置5min，反应产物显现绿色时SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基为A，显橙色时SLC11A1第543位密码子非保守碱基不为A；
(5)、对步骤(4)中反应液呈现橙色的样本，配制反应液：25μL：1-10mM的SLC11A1FIPG、1-10mM的SLC11A1BIP、0.1-10mM的SLC11A1F3、0.1-10mM的SLC11A1B3、1-10mM的dNTPs、1-10mM的MgSO4、1-10M的甜菜碱、1-5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、加蒸馏水至25μL，温和混匀；再次进行60-65℃进行扩增；反应产物显现绿色时SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基为G，显橙色时SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基不为G。
检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基多态性的试剂盒，其中，所述试剂盒选自试剂盒P1、试剂盒P2、试剂盒P3或试剂盒P4中的一种；
所述试剂盒P1包括检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒和检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒；其中：
检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPA-1、1～10mM的SLC11A1BIP-1、0.1～10mM的SLC11A1F3-1、0.1～10mM的SLC11A1B3-1、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPG-1、1～10mM的SLC11A1BIP-1、0.1～10mM的SLC11A1F3-1、0.1～10mM的SLC11A1B3-1、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
所述试剂盒P2包括检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒和检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒；其中：
检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPA-2、1～10mM的SLC11A1BIP-2、0.1～10mM的SLC11A1F3-2、0.1～10mM的SLC11A1B3-2、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPG-2、1～10mM的SLC11A1BIP-2、0.1～10mM的SLC11A1F3-2、0.1～10mM的SLC11A1B3-2、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
所述试剂盒P3包括检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒和检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒；其中：
检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPA-4、1～10mM的SLC11A1BIP-4、0.1～10mM的SLC11A1F3-4、0.1～10mM的SLC11A1B3-4、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPG-4、1～10mM的SLC11A1BIP-4、0.1～10mM的SLC11A1F3-4、0.1～10mM的SLC11A1B3-4、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
所述试剂盒P4包括检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒和检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒；其中：
检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPA-5、1～10mM的SLC11A1BIP-5、0.1～10mM的SLC11A1F3-5、0.1～10mM的SLC11A1B3-5、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPG-5、1～10mM的SLC11A1BIP-5、0.1～10mM的SLC11A1F3-5、0.1～10mM的SLC11A1B3-5、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
所述SLC11A1F3-1序列如SEQ ID NO.1所示，所述SLC11A1B3-1序列如SEQ ID NO.2所示，所述SLC11A1FIPA-1序列如SEQ ID NO.3所示，所述SLC11A1FIPG-1序列如SEQ IDNO.4所示，所述SLC11A1BIP-1序列如SEQ ID NO.5所示；
所述SLC11A1F3-2序列如SEQ ID NO.6所示，所述SLC11A1B3-2序列如SEQ ID NO.7所示，所述SLC11A1FIPA-2序列如SEQ ID NO.8所示，所述SLC11A1FIPG-2序列如SEQ IDNO.9所示，所述SLC11A1BIP-2序列如SEQ ID NO.10所示；
所述SLC11A1F3-4序列如SEQ ID NO.11所示，所述SLC11A1B3-4序列如SEQ IDNO.12所示，所述SLC11A1FIPA-4序列如SEQ ID NO.13所示，所述SLC11A1FIPG-4序列如SEQID NO.14所示，所述SLC11A1BIP-4序列如SEQ ID NO.15所示；
所述SLC11A1F3-5序列如SEQ ID NO.16所示，所述SLC11A1B3-5序列如SEQ IDNO.17所示，所述SLC11A1FIPA-5序列如SEQ ID NO.18所示，所述SLC11A1FIPG-5序列如SEQID NO.19所示，所述SLC11A1BIP-5序列如SEQ ID NO.20所示。
上述技术方案所述的试剂盒在检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基非保守碱基G/A多态性中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明是根据人类SLC11A1基因设计了四条扩增目的基因片段的引物，传统的PCR方法只使用两条引物，相比较之下，本发明同时使用四条引物从而提高了检测的特异性。
2、本发明的引物组及试剂盒在使用时只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备。
3、本发明的引物组及试剂盒具有高特异性：应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，假阳性率为0。
4、本发明的引物组及试剂盒能快速、高效扩增：扩增仅需1小时即可完成，且产率高。
5、本发明的引物组及试剂盒的灵敏度高：对SLC11A1基因的最低检测极限达到10个拷贝以内，标本的检出率达高到99％。
6、本发明的引物组及试剂盒的鉴定过程简便：通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。
7、本发明的引物组及试剂盒用途广，可广泛用于临床常规检测及流行病学调查。
附图说明：
1、图1为反应产物中加入SYBR Green I荧光染料后的显色照片，其中A为对照A；B为待测样品1；C为待测样品2；D为对照G；E为空白对照。
2、图2为反应液配置中的SLC11A1FIPA-1引物换为SLC11A1FIPG-1后，反应产物中加入SYBR Green I荧光染料后的显色照片，其中A为对照A；B为待测样品1；C为待测样品2；D为对照G；E为空白对照。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基多态性的引物组、试剂盒及应用作进一步的说明。
特殊引物的设计：原有恒温扩增的引物设计上条件非常苛刻，本发明运用生物信息平台进行大规模基因组分析，引入对于多态性位点引入简并碱基和基因组分型处理，使引物设计更加完善，在引物设计时，充分考虑了引物二聚体ΔG；3’和5’末端ΔG；错配概率，优化了引物间距和扩增效率，大大提高了扩增反应的特异性和灵敏度。根据SLC11A1基因上的多态性位点所设计的六条引物是扩增进行的关键。此外，本专利提供的引物序列，除了在设计时的优化筛选之外，还通过大量经测序验证过的标准品验证确实有效的引物组。
本发明中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示的引物序列由上海生工公司制备。
本发明是对结核病易感基因SLC11A1进行分型，分为结核易感与结核不易感，并非对结核病进行诊断，因此本发明的血液样本来源于普通人群外周血液样本，可以为结核患者，也可以是健康人。
实施例1：人类结核分支杆菌易感基因SLC11A1第543位密码子非保守碱基多态性的检测：
一、被检样品的预处理：
按照常规方法提取待检血液样本DNA
二、质量控制：
空白对照：用取出DNAase和RNAase的无菌双蒸水作为实际空白对照，(用以判断试剂是否被污染)；
对照A：将经过测序验证过的，在SLC11A1基因D543N位点为A的人类血液样本提取核酸，其产物作为对照A；
对照G：将经过测序验证过的，在SLC11A1基因D543N位点为G的人类血液样本提取核酸，其产物作为对照G；
三、等温扩增反应的准备：
将以下组分混合后63℃保温1h：
1.反应液配置：反应体系为25μL：1.6mM的SLC11A1F3-1和1.6mM的SLC11A1B3-1；0.2mM的SLC11A1FIPA-1；0.2mM的SLC11A1BIP-1；1.6mM的dNTPs；6mM的MgSO4；1M的甜菜碱；2μL待检样本DNA或相应对照(例如阳性对照、阴性对照等)；8U Bst DNA聚合酶；加蒸馏水至25μL。
2.将上述反应液在63℃下保温1h，随后85℃加热2min后终止反应。
四、质控结果的分析与判断：
在反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，混匀，静置5min后观察质控样本结果：
(1)、对照A：反应产物需显现绿色，否则有可能是检测试剂失效(见图1中的A)；
(2)、对照G：反应产物需显现橙色，否则有可能是检测试剂失效(见图1中的D)；
(3)、空白对照必须为橙色，否则有可能是核酸提取或检测试剂已造成污染，出现此种情况，应当需要在清洁检测环境和更换试剂和耗材之后进行重复试验(见图1中的E)。
五、待测样本反应产物结果观察与判断：
质控均为正常工作的条件下，才能对结果进行判断。
在反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，混匀，静置5min，若反应产物显现绿色则说明SLC11A1第543位密码子非保守碱基为A，显橙色则说明SLC11A1第543位密码子不为A。本实施例使用2个未知待测样本(待测样品1和待测样品2)，检测结果如图1所示(其中A为对照A；B为待测样品1；C为待测样品2；D为对照G；E为空白对照)，待测样品1反应液成绿色，说明该样本的SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基为A(见图1中的B)；待测样品2反应液成橙色，说明该样本的SLC11A1基因第543位密码子不为A(见图1中的C)。
六、对多态性位点的进一步判断：
经过以上步骤，若待测样本的反应液为阴性(呈现橙色)可以进一步通过以下反应判断SLC11A1基因D543N位点是否为G：即，将步骤三，反应液配置中的SLC11A1FIPA-1引物换为SLC11A1FIPG-1，其他成分保持不变，在63℃下保温1h，随后85℃加热2min后终止反应。观察对照样品，对照A反应产物需呈现橙色(见图2中的A)，对照G反应产物需呈现绿色(见图2中的D)，空白对照反应产物需呈现橙色(见图2中的E)，否则数据无效。接下来对待测样本反应产物进行观察和判断，具体方法参考步骤五，若反应产物显现绿色则说明SLC11A1第543位密码子非保守碱基为G，显橙色则说明SLC11A1第543位密码子非保守碱基不为G。本实施例使用的2个未知待测样本，检测结果如图2所示(图2中A为对照A；B为待测样品1；C为待测样品2；D为对照G；E为空白对照)：待测样品1反应液成橙色，说明该样本的SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基不为G(见图2中的B)；待测样品2反应液成绿色，说明该样本的SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基为G(见图2中的C)。
实施例2：人类结核分支杆菌易感基因SLC11A1第543位密码子非保守碱基多态性的检测：
本实施例与实施例1相同，区别在于：
1、本实施例中步骤三中反应液配置为：反应体系为25μL：1.6mM的SLC11A1F3-2和1.6mM的SLC11A1B3-2；0.2mM的SLC11A1FIPA-2；0.2mM的SLC11A1BIP-2；1.6mM的dNTPs；6mM的MgSO4；1M的甜菜碱；2μL待检样本DNA或相应对照；8U Bst DNA聚合酶；加蒸馏水至25μL。
2、步骤六中将反应液配置中的SLC11A1FIPA-2引物换为SLC11A1FIPG-2。
实施例3：人类结核分支杆菌易感基因SLC11A1第543位密码子非保守碱基多态性的检测：
本实施例与实施例1相同，区别在于：
1、本实施例中步骤三中反应液配置为：反应体系为25μL：1.6mM的SLC11A1F3-4和1.6mM的SLC11A1B3-4；0.2mM的SLC11A1FIPA-4；0.2mM的SLC11A1BIP-4；1.6mM的dNTPs；6mM的MgSO4；1M的甜菜碱；2μL待检样本DNA或相应对照；8U Bst DNA聚合酶；加蒸馏水至25μL。
2、步骤六中将反应液配置中的SLC11A1FIPA-4引物换为SLC11A1FIPG-4。
实施例4：人类结核分支杆菌易感基因SLC11A1第543位密码子非保守碱基多态性的检测：
本实施例与实施例1相同，区别在于：
1、本实施例中步骤三中反应液配置为：反应体系为25μL：1.6mM的SLC11A1F3-5和1.6mM的SLC11A1B3-5；0.2mM的SLC11A1FIPA-5；0.2mM的SLC11A1BIP-5；1.6mM的dNTPs；6mM的MgSO4；1M的甜菜碱；2μL待检样本DNA或相应对照；8U Bst DNA聚合酶；加蒸馏水至25μL。
2、步骤六中将反应液配置中的SLC11A1FIPA-5引物换为SLC11A1FIPG-5。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第四军医大学
<120> 检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基多态性的引物组、试剂盒及应用
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> SLC11A1F3-1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
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cctatgaagg aaaagagg 18
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<212> DNA
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<222> (1)..(17)
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<210> 19
<211> 46
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<400> 19
ctatgccctt tcctaaatgc tggaaggaaa agaggcccag ggggaa 46
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> SLC11A1BIP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(44)
<400> 20
gctgcaggct ggcatctagg agactccatc tccaaaaaaa gaga 44
Claims (4)
1.检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基多态性的引物组，其特征在于，所述引物组选自引物组P1、引物组P2、引物组P3或引物组P4中的一种；所述引物组P1为：
SLC11A1F3-1:CCTATGAAGGAAAAGAGG
SLC11A1B3-1:AGCCTGGGCTACAGAG
SLC11A1FIPA-1:CTATGCCCTTTCCTAAATGCTACCCAGGGGGAATTGGGATTG
SLC11A1FIPG-1:CTATGCCCTTTCCTAAATGCTGCCCAGGGGGAATTGGGATTG
SLC11A1BIP-1:GCTGCAGGCTGGCATCTAGCGAGACTCCATCTCCAAAAAAAGAGA；
所述引物组P2为：
SLC11A1F3-2:GCCCAGGGGGAATT
SLC11A1B3-2:AGCCTGGGCTACAG
SLC11A1FIPA-2:TGCAGCCTCCTTCACTTCTCCCTGGAGCCTTGAGGACATGTTA
SLC11A1FIPG-2:TGCAGCCTCCTTCACTTCTCCCTGGAGCCTTGAGGACATGTTG
SLC11A1BIP-2:TCTAGCATCTAGGATGCAGCGAGACTCCATCTCCAAAAAAAGAGA；
所述引物组P3为：
SLC11A1F3-4:GCCCAGGGGGAATT
SLC11A1B3-4:CAGTGAGCTGAGATCG
SLC11A1FIPA-4:TGCAGCCTCCTTCACTTCTCCCTAATTGGAGCCTTGAGGACATGTTA
SLC11A1FIPG-4:TGCAGCCTCCTTCACTTCTCCCTAATTGGAGCCTTGAGGACATGTTG
SLC11A1BIP-4:TCTAGCATCTAGGATGCGGCTACAGAGCGAGA；
所述引物组P4为：
SLC11A1F3-5：CTCAATGAATCTCAGCTTTC
SLC11A1B3-5：AGCCTGGGCTACAGAGC
SLC11A1FIPA-5：CTATGCCCTTTCCTAAATGCTAGAAGGAAAAGAGGCCCAGGGGGAA
SLC11A1FIPG-5：CTATGCCCTTTCCTAAATGCTGGAAGGAAAAGAGGCCCAGGGGGAA
SLC11A1BIP-5：GCTGCAGGCTGGCATCTAGGAGACTCCATCTCCAAAAAAAGAGA。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基G/A多态性的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的具体过程为：
(1)、待检样本DNA的提取；
(2)、按照以下配方配制反应液：反应体系为25μL：1-10mM的SLC11A1FIPA、1-10mM的SLC11A1BIP、0.1-10mM的SLC11A1F3、0.1-10mM的SLC11A1B3、1-10mM的dNTPs、1-10mM的MgSO4、1-10M的甜菜碱、1-5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、加蒸馏水至25μL，温和混匀；
(3)、进行恒温扩增反应：在60-65℃保温0.5至1.5小时进行链置换反应；
(4)、分析判断反应产物结果：在反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，混匀，静置5min，反应产物显现绿色时SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基为A，显橙色时SLC11A1第543位密码子非保守碱基不为A；
(5)、对步骤(4)中反应液呈现橙色的样本，配制反应液：25μL：1-10mM的SLC11A1FIPG、1-10mM的SLC11A1BIP、0.1-10mM的SLC11A1F3、0.1-10mM的SLC11A1B3、1-10mM的dNTPs、1-10mM的MgSO4、1-10M的甜菜碱、1-5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、加蒸馏水至25μL，温和混匀；再次进行60-65℃进行扩增；反应产物显现绿色时SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基为G，显橙色时SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基不为G。
4.检测人SLC11A1基因第543位密码子非保守碱基多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒选自试剂盒P1、试剂盒P2、试剂盒P3或试剂盒P4中的一种；
所述试剂盒P1包括检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒和检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒；其中：
检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPA-1、1～10mM的SLC11A1BIP-1、0.1～10mM的SLC11A1F3-1、0.1～10mM的SLC11A1B3-1、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPG-1、1～10mM的SLC11A1BIP-1、0.1～10mM的SLC11A1F3-1、0.1～10mM的SLC11A1B3-1、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
所述试剂盒P2包括检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒和检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒；其中：
检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPA-2、1～10mM的SLC11A1BIP-2、0.1～10mM的SLC11A1F3-2、0.1～10mM的SLC11A1B3-2、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPG-2、1～10mM的SLC11A1BIP-2、0.1～10mM的SLC11A1F3-2、0.1～10mM的SLC11A1B3-2、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
所述试剂盒P3包括检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒和检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒；其中：
检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPA-4、1～10mM的SLC11A1BIP-4、0.1～10mM的SLC11A1F3-4、0.1～10mM的SLC11A1B3-4、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPG-4、1～10mM的SLC11A1BIP-4、0.1～10mM的SLC11A1F3-4、0.1～10mM的SLC11A1B3-4、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
所述试剂盒P4包括检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒和检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒；其中：
检测第543位密码子非保守碱基为A的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPA-5、1～10mM的SLC11A1BIP-5、0.1～10mM的SLC11A1F3-5、0.1～10mM的SLC11A1B3-5、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
检测第543位密码子非保守碱基为G的试剂盒的反应体系为25μL，由以下物质组成：1～10mM的SLC11A1FIPG-5、1～10mM的SLC11A1BIP-5、0.1～10mM的SLC11A1F3-5、0.1～10mM的SLC11A1B3-5、1～10mM的dNTPs、1～10mM的MgSO4、1～10M的甜菜碱、1～5μL待检样本DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、余量为蒸馏水；
所述SLC11A1F3-1序列如SEQ ID NO.1所示，所述SLC11A1B3-1序列如SEQ ID NO.2所示，所述SLC11A1FIPA-1序列如SEQ ID NO.3所示，所述SLC11A1FIPG-1序列如SEQ ID NO.4所示，所述SLC11A1BIP-1序列如SEQ ID NO.5所示；
所述SLC11A1F3-2序列如SEQ ID NO.6所示，所述SLC11A1B3-2序列如SEQ ID NO.7所示，所述SLC11A1FIPA-2序列如SEQ ID NO.8所示，所述SLC11A1FIPG-2序列如SEQ ID NO.9所示，所述SLC11A1BIP-2序列如SEQ ID NO.10所示；
所述SLC11A1F3-4序列如SEQ ID NO.11所示，所述SLC11A1B3-4序列如SEQ ID NO.12所示，所述SLC11A1FIPA-4序列如SEQ ID NO.13所示，所述SLC11A1FIPG-4序列如SEQ IDNO.14所示，所述SLC11A1BIP-4序列如SEQ ID NO.15所示；
所述SLC11A1F3-5序列如SEQ ID NO.16所示，所述SLC11A1B3-5序列如SEQ ID NO.17所示，所述SLC11A1FIPA-5序列如SEQ ID NO.18所示，所述SLC11A1FIPG-5序列如SEQ IDNO.19所示，所述SLC11A1BIP-5序列如SEQ ID NO.20所示。
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| Infection with Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype Strains Is Associated with Polymorphisms in SLC11A1/NRAMP1 in Indonesian Patients with Tuberculosis;Reinout van Crevel等;《The Journal of Infectious Diseases》;20091201;第200卷(第11期);1671-1674 * |
| ＮＲＡＭＰ1基因多态性与中国汉族儿童结核病易感性研究;金婧等;《中国当代儿科杂志》;20090415;第11卷(第4期);283-286 * |
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