CN116716342A - 一种adcc功能增强的nk细胞的制作方法、nk细胞及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞技术领域，具体涉及一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物。通过至少一种质粒载体将编码后的CD16基因序列导入iPSC并最终分化为NK细胞，所获得的NK细胞具有增强的细胞表型及ADCC效果。

Description

一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及到一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物。
背景技术
NK细胞是一种具有肿瘤细胞杀伤能力的天然免疫细胞类型，在肿瘤免疫细胞治疗领域有着重要的应用。按照来源分类，目前肿瘤免疫细胞治疗领域使用的NK细胞绝大多数是通过在捐献者或者患者身上提取外周血细胞(PBMC)，然后通过体外分离、改造、扩增，获得最后的NK细胞产品。但是在工业界，药企和生物制药公司必须要考虑到产品的生产成本和原材料来源。外周血来源于患者或者捐献者，而NK细胞在外周血中的占比只有5-10％，这很大程度上限制了稳定的供应来源。并且通过PBMC获取的NK细胞其标志物表达及杀伤效果都不是很理想。因此我们引进iPSC细胞，iPSC可以在体外无限增殖并分化为功能性NK细胞，因此iPSC技术为获得大批量质量稳定的免疫细胞提供了有潜力的解决方案。
在实际应用方面，iPSC细胞的获得方法相对简单和稳定，不需要使用卵细胞或者胚胎，这在技术上和伦理上都比其他方法更有优势。iPSC来源的NK细胞的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离。
但是存在一个现实问题，即未经基因修饰的iPSC细胞分化为NK细胞，它们在其细胞表面的CD16表达偏低，无法通过抗体依赖性细胞毒性效应即ADCC机制裂解靶细胞。
发明内容
本申请提供一种CD16高表达、ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物，本方案的优点在于：基于两种质粒系统均可实现将编码后的CD16基因导入到iPSC细胞基因组中。并成功分化为NK细胞，获得CD16-NK细胞系，实现CD16表达稳定，ADCC功能增强，NK细胞纯度高等优点。具体详细说明如下：
为实现上述技术目的，本申请采取的技术方案为：一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，包括如下步骤：
步骤一：通过电转将表达CD16的质粒导入到iPSC中，得到CD16高表达的iPSC细胞株；
步骤二：将上述步骤中得到的CD16高表达的iPSC细胞株分化为NK细胞；
其中，步骤一中能够表达CD16的质粒至少有一种。
进一步改进在于，表达CD16的质粒可以是基于转座子插入系统的Piggybac质粒或是基于同源重组的模板质粒。
进一步改进在于，表达的CD16为具有抗体Fc段高亲和力且不可切割的突变体。
进一步改进在于，CD16基因序列的突变位点为F158V和位点S197P。
进一步改进在于，CD16基因序列为SEQ ID NO:1。
进一步改进在于，表达CD16的基于转座子插入系统的Piggybac质粒需要与PBase质粒共转染，最终获得CD16-PiggyBac质粒。
进一步改进在于，PiggyBac质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记；其中，Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记的序列为SEQ ID NO:3。
进一步改进在于，表达CD16的基于转座子插入系统的PiggyBac质粒，将其命名为CD16-PiggyBac质粒，序列为SEQ ID NO:4。
进一步改进在于，其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒需要与靶向AAVS1位点的CRISPR-sgRNA质粒共转染；表达CD16的基于同源重组的模板质粒，将其命名为AAVS1-CD16-Puc57质粒。
进一步改进在于，其中，靶向AAVS1的sgRNA序列为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
进一步改进在于，其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记，Ef1a启动子之前为AAVS1左侧同源臂序列，PuroR抗性筛选标记之后为AAVS1右侧同源臂序列；其中，Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记序列为SEQ ID NO:3；左、右同源臂序列可设置为两组，组1中的左侧同源臂长度为400bp，右侧同源臂长度为600bp，左侧同源臂序列为SEQ IDNO:11，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:12，；组2中的左侧同源臂长度为500bp，右侧同源臂长度为500bp，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:14，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:15。
进一步改进在于，所述表达CD16的基于同源重组的模板质粒，即AAVS1-CD16-Puc57质粒的序列为SEQ ID NO:13。
进一步改进在于，所述CD16高表达的iPSC细胞株通过抗生素筛选和一次的克隆挑选即可获得，所得的iPSC细胞株中CD16的表达不低于85％。其中，抗生素优选为嘌呤霉素，即puromycin。
本发明还公开一种ADCC功能增强的NK细胞，通过上述步骤获得的NK细胞，其CD16的表达不低于80％。
本发明还公开一种组合物，包括ADCC功能增强的NK细胞，所述ADCC功能增强的NK细胞是通过上述方法制作获得。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明可将编码CD16的基因序列通过PiggyBac质粒系统或同源重组的模板质粒成功导入到iPSC基因组中；通过电转的方式成功获得CD16-iPSC稳定表达的细胞株。
(2)稳定表达的iPSC细胞株能够成功分化为NK细胞，其获得的NK细胞的CD16+表达大于等于80％，且表达稳定；采用本方法的基因修饰及分化，成功构建了CD16-NK细胞系。
(3)基于进一步验证，本方案获得的NK细胞的ADCC杀伤率可达60％以上，是未经基因修饰后分化获得的NK细胞ADCC杀伤率的2.8倍左右；可证实通过本方案最终获得的NK细胞的ADCC功能增强，提高了NK细胞的自然杀伤效果。能够用于制备预防或治疗免疫缺陷、以及治疗肿瘤的药物。
(4)将表达CD16的两种质粒导入到iPSC中后仅通过一次单克隆的挑取即可得到CD16+高表达的CD16-iPSC的细胞株；步骤简单，效果明确。
(5)通过本方案获得的NK细胞，其CD56+表达高，说明本方案获得的NK细胞的纯度较高。
附图说明
图1为CD16-PiggyBac质粒图谱；
图2为靶向AAVS1位点的CD16同源重组模板质粒(AAVS1-CD16-Puc57质粒)图谱；
图3为基于PiggyBac质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株1中CD16流式检测图；
图4为基于PiggyBac质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株2中CD16流式检测图；
图5为基于PiggyBac质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株3中CD16流式检测图；
图6为基于同源重组的模板质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株4中CD16流式检测图；
图7为基于同源重组的模板质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株5中CD16流式检测图；
图8为基于同源重组的模板质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株6中CD16流式检测图；
图9为基于PiggyBac质粒基因修饰后的iPSC细胞株1分化获得NK细胞的CD16流式检测图；
图10为基于PiggyBac质粒基因修饰后的iPSC细胞株2分化获得NK细胞的CD16流式检测图；
图11为基于PiggyBac质粒基因修饰后的iPSC细胞株3分化获得NK细胞的CD16流式检测图；
图12为基于同源重组的模板质粒基因修饰后的iPSC细胞株4分化获得的NK细胞CD16流式检测图；
图13为基于同源重组的模板质粒基因修饰后的iPSC细胞株5分化获得的NK细胞CD16流式检测图；
图14为基于同源重组的模板质粒基因修饰后的iPSC细胞株6分化获得的NK细胞CD16流式检测图；
图15为无基因修饰的iPSC，即对照1，分化NK细胞的CD16流式检测图；
图16为无基因修饰的iPSC，即对照2，分化NK细胞的CD16流式检测图；
图17为基于PiggyBac质粒基因修饰后获得的iPSC最终分化为NK细胞的ADCC杀伤效果图；
图18为基于同源重组的模板质粒基因修饰后获得的iPSC最终分化为NK细胞的ADCC杀伤效果图；
图19为未经基因修饰的iPSC分化为NK细胞的ADCC杀伤效果图；
图20为PBMC中来源的NK细胞的ADCC杀伤效果图；
图21为野生型CD16基于PiggyBac质粒基因修饰后的iPSC最终分化获得NK细胞的CD16流式检测图；
图22为野生型CD16基于同源重组的模板质粒基因修饰后的iPSC最终分化获得NK细胞的CD16流式检测图
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
定义
PBMC：外周血单个核细胞。
APC CD16抗体：APC anti-human CD16 Antibody。
1％FBS的1640培养基：RPMI1640+1％FBS。
10％FBS的1640培养基：RPMI1640+10％FBS。
PBase质粒：pCMV-hyPBase，是现有的转座酶。
Fc受体：是指通过结合到称为Fc区的抗体的一部分而有助于免疫细胞的保护功能的某些细胞(例如天然杀伤细胞)的表面上发现的蛋白质。抗体的Fc区与细胞的Fc受体(FcR)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。
F158V：CD16的基因序列上的158F变为158V；即第158位由苯丙氨酸(F)变成了缬氨酸(V)。
S197P：CD16的基因序列上的197S变为197P；即第197位由丝氨酸(S)变成了脯氨酸(P)。
AAVS1：iPSC基因组中的基因位点。
CD16-NK细胞：经本方法基因修饰后的iPSC细胞株分化为NK细胞。
野生型CD16：现有技术，未通过基因突变。
本文中除了提到的野生型CD16，其余单独提到的CD16是本方案中提到的F158V与S197P突变后的基因序列。
转基因表达
本发明中涉及到的基因编辑的流程包括如下环节：基因选择，设计序列，PiggyBac质粒，同源重组的模板质粒的构建，PiggyBac质粒和同源重组模板载体向细胞内的导入及细胞分化。可以通过本领域技术人员已知的任何机制将目的基因(例如CD16)工程化到表达质粒中。
可以使用本领域已知的任何瞬时转染方法将转基因引入iPSC细胞，包括例如电转染、脂质转染、核转染、或是“基因枪”，本方案中优选使用电转法。
可以使用任何数量的载体表达CD16。在一些实施方式中，可以使用的质粒载体包括PiggyBac转座子插入系统质粒、同源重组的模板质粒。
在一些实施例中，Fc受体是CD16，将CD16的基因序列突变位点为F158V和位点S197P，最终获得CD16的序列参考SEQ ID NO:1。表达CD16的质粒可以基于PiggyBac转座子插入系统的质粒或是同源重组CRISPR的模板质粒。其中，表达CD16同源重组模板载体的选择：是选择获取自Addgene的Puc57载体作为骨架。最终获得CD16-PiggyBac质粒与AAVS1-CD16-Puc57质粒。
PiggyBac质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记；其中，Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记的序列为SEQID NO:3，获得的CD16-PiggyBac质粒序列为SEQ ID NO:4。
其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒需要与靶向AAVS1位点的CRISPR-sgRNA质粒共转染；可以将表达CD16的基于同源重组的模板质粒，将其命名为AAVS1-CD16-Puc57质粒，其质粒图谱为附图2，序列为：SEQ ID NO:13。
具体如下：靶向AAVS1的sgRNA序列为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记，Ef1a启动子之前为AAVS1左侧同源臂序列，PuroR抗性筛选标记之后为AAVS1右侧同源臂序列；其中，Ef1a启动子序列如SEQ ID NO:2(与PiggyBac质粒中用到的Ef1a启动子序列相同)，抗性筛选标记序列为SEQ ID NO:3(与PiggyBac质粒中用到的抗性筛选标记序列相同)；其中，左、右同源臂序列设置为两组，组1中左侧同源臂长度为400bp，右侧同源臂长度为600bp，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:11，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:12，组2中左侧同源臂长度为500bp，右侧同源臂长度为500bp，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:14，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:15。
电转染后进行单克隆挑选，并进行阳性克隆验证，通过流式细胞术检测CD16-iPSC细胞株中CD16+表达。经过基因修饰后的iPSC呈现CD16高水平表达，平均表达在93％±0.46，最低表达为86.29％，最高可达到98.88％。
通过流式细胞术检测NK细胞的CD16+表达。通过对比经本方法基因修饰后的iPSC细胞株分化为NK细胞(CD16-NK细胞)和未经过修饰的iPSC细胞分化获得的NK细胞流式细胞分析显示：与未修饰的iPSC细胞分化的NK细胞相比，经基因修饰后获得的CD16-NK细胞呈现高的多的CD16表达，平均水平达到85％以上，最高表达95.20％。而未经过修饰的iPSC细胞分化获得的NK细胞的CD16+流式检测仅为43.59％与30.13％。
通过流式细胞术检测ADCC的杀伤率。经本方法基因修饰后获得的CD16-NK细胞与未经过修饰的iPSC细胞分化获得的NK细胞、及PBMC来源的NK细胞三者通过流式细胞术数据分析显示：与未经修饰的获得的NK细胞、PBMC中来源的NK细胞相比，通过本案中的基因修饰方法获得的CD16-NK细胞呈现较高的ADCC杀伤率。与PBMC中来源的NK细胞相比，CD16-NK细胞的ADCC杀伤率是它的1.9倍左右；与未修饰的NK细胞相比，CD16-NK细胞的ADCC杀伤率是它的2.8倍左右。
通过流式细胞术检测CD16-NK细胞与未经过修饰的iPSC分化获得的NK细胞的NKG2D+表达，通过本案中的基因修饰方法获得的CD16-NK细胞高表达NKG2D受体，其中最高可达97.04％，而未经修饰的iPSC分化获得的NK细胞的NKG2D+表达仅为59.07％，可达到它的1.7倍左右。进而说明通过本方案产生NK细胞高表达NKG2D受体，具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。
总之，这些结果表明，将编码CD16的序列引入至iPSC基因组能够高表达、且稳定表达形成CD16-iPSC细胞株，建模成功；并且通过仅一次的单克隆挑选可获取CD16高表达iPSC细胞株。并经基因修饰后最终获得的NK细胞CD16表达水平较高，同时也增强了NK细胞的ADCC功能。也需要强调的是，分化的NK细胞有高表达的CD56与NKG2D受体，说明分化的NK细胞纯度高且具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。
也需要说明的是，经基因改造过的iPSC能够继续维持其多能性，以及向其它免疫细胞分化的潜能。
电转及分化
通过电转将CD16导入iPSC，培养基为Stemflex，每天更换培养基，培养6-8天左右，挑克隆并接种于24孔板中，每孔加入300-500ul的Stemflex，继续培养6-8天左右，在培养过程中添加终浓度为0.3-1.5ug/ml的puromycin，进行阳性克隆验证。
将iPSC细胞株分化为NK细胞，包括如下步骤，步骤一：采用人诱导多能干细胞分化形成具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞；步骤二：将具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞经内皮-血液转化，形成具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞；步骤三：将具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞进一步分化为具有CD56+CD3-表达的NK细胞。
步骤一用到的分化培养基I，所述分化培养基I包括细胞因子组合A与细胞因子组合B；所述细胞因子组合A为VEGF，bFGF，Activin-A中的至少两种的组合；所述细胞因子组合B为BMP-4，SCF，IL-3，IL-6，TPO，FLT3L中的至少一种或多种的组合；
分化培养基I的用量VEGF 1-100ng/ml，bFGF 0.25-50ng/ml，Activin-A 0.1-20ng/ml，BMP-4 0.3-60ng/ml，SCF 1-200ng/ml，IL-3 0.1-20ng/ml，IL-6 0.1-20ng/ml，TPO 0.1-100ng/ml，FLT3L 0.1-30ng/ml。
所述培养基分化培养基I还含有基础培养基I；所述基础培养基I为AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV，KBM581中的一种或多种按照任意比例的混合。
步骤二用到的分化培养基II，所述分化培养基II包括细胞因子组合C与细胞因子组合D；所述细胞因子组合C包含SCF、TPO、FLT3L、IL3或IL6中的一种或多种的组合；所述细胞因子组合D包含IL7、IL15、IL12、IL18、IL21中的一种或多种的组合；
分化培养基II的用量为SCF 1-200ng/ml，TPO 1-100ng/ml，FLT3L 1-200ng/ml，IL3 1-200ng/ml，IL6 1-100ng/ml，IL7 1-100ng/ml，IL15 1-100ng/ml，IL12 1-100ng/ml，IL18 1-100ng/ml，IL21 1-100ng/ml。
所述分化培养基II还包括基础培养基II；所述基础培养基II为AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV和KBM581中的一种或多种按照不同比例的混合。
步骤三用到的分化培养基III，所述分化培养基III包括SCF，TPO，FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15，IL21中的一种或多种的组合；
所述分化培养基III中的用量SCF 1-200ng/ml，TPO 1-100ng/ml，FLT3L1-200ng/ml，IL3 1-200ng/ml，IL6 1-100ng/ml，IL7 1-100ng/ml，IL11 1-100ng/ml，IL12 1-100ng/ml，IL18 1-100ng/ml，IL15 1-100ng/ml，IL21 1-100ng/ml。
所述分化培养基III的成份还包括基础培养基III；所述基础培养基III包括AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV和KBM581中的一种或多种按照任意质量比例的混合。
本文中的iPSC分化为NK细胞的具体方法，将我司已经公开的专利文本全部引入此次文本，其中引入文本的公开号为CN113801846A，名称为“一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法”。
可知，通过本方案的基因修饰方法获取的NK细胞，其经过本方案中的基因修饰后最终获取的NK细胞的CD16表达更稳定，核实基因修饰后最终获取的NK细胞中CD16的表达仅导致14％±0.08的下调。
实施例1:目的基因与质粒构建
目的基因为CD16，突变位点是F158V和位点S197P，新获得的CD16为具有抗体Fc段高亲和力且不可切割的突变体，CD16序列表为SEQ ID NO:1，序列如下所示，并突变位点对应的碱基序列已标出下划线：
Atgtggcagctgctcctcccaactgctctgctacttctagtttcagctggcatgcggactgaagatctcccaaaggctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgctcgagaaggacagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcccctgaggacaattccacacagtggtttcacaatgagagcctcatctcaagccaggcctcgagctacttcattgacgctgccacagtcgacgacagtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtgacccggtgcagctagaagtccatatcggctggctgttgctccaggcccctcggtgggtgttcaaggaggaagaccctattcacctgaggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataaggtcacatatttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctgacttctacattccaaaagccacactcaaagacagcggctcctacttctgcagggggcttgttgggagtaaaaatgtgtcttcagagactgtgaacatcaccatcactcaaggtttggcagtgccaaccatctcatcattctttccacctgggtaccaagtctctttctgcttggtgatggtactcctttttgcagtggacacaggactatatttctctgtgaagacaaacattcgaagctcaacaagagactggaaggaccataaatttaaatggagaaaggaccctcaagacaaatga
本发明分别验证了两种质粒载体将CD16导入到iPSC中，分别是基于PiggyBac的质粒和同源重组的模板质粒。
1)CD16-PiggyBac质粒的构建：
表达CD16的PiggyBac质粒需要与PBase质粒共转染。PiggyBac质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记；其中，Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记的序列为SEQ ID NO:3，获取的CD16-PiggyBac质粒序列为SEQ ID NO:4，图谱如附图1。
2)AAVS1-CD16-Puc57质粒的构建：
AAVS1是iPSC基因组中的基因位点。
CD16同源重组模板载体的选择：选择获取自Addgene的pUC57载体作为骨架。
其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒需要与靶向AAVS1位点的CRISPR-sgRNA质粒共转染；将表达CD16的基于同源重组的模板质粒，将其命名为AAVS1-CD16-Puc57质粒，其质粒图谱为附图2，序列为：SEQ ID NO:13。
具体如下：靶向AAVS1的sgRNA序列为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记，Ef1a启动子之前为AAVS1左侧同源臂序列，PuroR抗性筛选标记之后为AAVS1右侧同源臂序列；其中，Ef1a启动子序列与上同为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记序列与上同为SEQ ID NO:3，其中，左、右同源臂序列可设置为两组；组1中左侧同源臂长度为400bp，右侧同源臂长度为600bp，左侧同源臂序列为SEQ IDNO:11，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:12；组2中，左侧同源臂长度为500bp，右侧同源臂长度为500bp，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:14，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:15。见表1-1。
左、右同源臂如下：
组 L左侧同源臂长度/bp R右侧同源臂长度/bp 序列
1 400 600 SEQ ID NO:11与12
2 500 500 SEQ ID NO:14与15
表1-1
基于PiggyBac质粒CD16基于是随机插入至iPSC细胞基因组中；而AAVS1-CD16-Puc57质粒是定点插入至iPSC细胞的AAVS1的基因位点处，靶向AAVS1的sgRNA的插入位点是在CRISPR质粒的BbsI(245)与BbsI(267)之间。
实施例2:电转染及挑克隆
2.1.质粒的配置：CD16-PiggyBac质粒与AAVS1-CD16-Puc57质粒；分别用DEPC水将CD16-PiggyBac质粒、PBase质粒、AAVS1-CD16-Puc57质粒浓度调整为0.5-1.5ug/ul，本方案中优选使用1ug/ul，设计可以是0.6ug/ul、0.7ug/ul、0.8ug/ul、0.9ug/ul、1.0ug/ul、1.1ug/ul、1.2ug/ul、1.3ug/ul、1.4ug/ul或任意两个数字之间的任何范围，包括端点。-20℃存储备用。
2.2.将生长至90％左右汇合率的iPSC取出放于生物安全柜中，吸弃上清，加入TrypLE，放于37℃细胞培养箱中静置孵育；消化细胞，离心并计数。
2.3.细胞计数后，吸取1×106个细胞，低速离心，取出离心管至生物安全柜中，拧开管盖，吸弃上清。其中，低速离心为转速为8000r/min以下，相对离心力为10000×g以下的离心。
2.4.在生物安全柜中取出洁净1.5ml EP管，吸取100μl预先配制好的电转Buffer于EP管中。将上述三种质粒分别吸取1μl-3μl，加入电转缓冲液buffer中。本方案中上述三种质粒优选为2μl，其设计可以是1.1μl、1ul、1.1ul、1.2ul、1.3ul、1.4ul、1.5ul、1.6ul、1.7ul、1.8ul、1.9ul、2ul、2.1ul、2.2ul、2.3ul、2.4ul、2.5ul、2.6ul、2.7ul、2.8ul、2.9ul，或任意两个数字之间的任何范围，包括端点。
2.5.用100μl移液枪吹打8-10次混匀后，将全部液体吸出后加入细胞沉淀中；将电转杯取出并放入电转仪的转染室中进行电转，电转程序为B016。电转结束后取出电转杯放进生物安全柜中。
2.6.取出6孔板放于生物安全柜中，并在其中1孔加入2ml Stemflex培养基,十字交叉混匀，静置培养。
2.7.每天更换2ml Stemflex培养基，培养两天后，将细胞消化、计数，并接种5000个细胞于10cm皿中(预先铺好Matrigel，并加入10ml Stemflex培养基)；同时进行取适量细胞，染APC CD16抗体，进行流式检测，CD16阳性率是37.96％；
2.8.培养7天左右，在层流工作台中进行单克隆的挑取，克隆挑取并接种于孔板(预先铺好Matrigel，每孔加入500ul Stemflex培养基)。继续培养7天左右，培养过程中添加试剂puromycin，终浓度为0.3-1.5ug/ml。本方案中优选为1ug/ml，进行阳性克隆的验证。puromycin的设计可以是0.4ug/ml、0.5ug/ml、0.6ug/ml、0.7ug/ml、0.8ug/ml、0.9ug/ml、1.0ug/ml、1.1ug/ml、1.2ug/ml、1.3ug/ml、1.4ug/ml，或任意两个数字之间的任何范围，包括端点。
实施例3：流式验证
基于本方案中的转座子系统质粒、同源重组的模板质粒分别将CD16电转导入iPSC基因组中获得iPSC细胞株。基于转座子系统质粒基因修饰后获得iPSC细胞株，随机挑取3株克隆进行阳性验证，分别是Clone-1,Clone-2,Clone-3，流式结果分别如附图3-5。
其次，基于同源重组的模板质粒基因修饰后获得iPSC细胞株。随机挑取3株克隆进行阳性验证，分别是Clone-4,Clone-5,Clone-6,流式结果分别如附图6-8。
表1:通过两种质粒基因修饰获得的iPSC细胞株中CD16阳性表达
表1
实施例4：NK细胞分化及其验证
对将上述经过基因修饰后的iPSC、与未经过基因编辑的iPSC在连续培养三代后进行NK分化实验，具体分化操作步骤引入本公司之前申请专利。即将公开号为CN113801846A，专利名称为“一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法”全部引入本次文本。
表2：经过本方案基因修饰后获得的iPSC细胞株分化为NK细胞(实验组)、与未经过基因修饰获得的iPSC分化为NK细胞(设对照组1和对照组2)、电转实验中，经过相同方法将野生型CD16转入到iPSC，分别基于PiggyBac质粒与同源重组的模板质粒将野生型CD16导入iPSC分化为NK细胞，(分别设为对照组3和对照组4)，进行NK细胞表面标志物验证：
表2
基于PiggyBac质粒基因修饰后获得的iPSC分化为NK细胞，CD16+表达流式结果如附图9、附图10与附图11；
基于同源重组的模板质粒，即AAVS1-CD16-Puc57质粒基因修饰后获得的iPSC分化为NK细胞流式结果如图12、图13与图14。
未经过基因修饰获得的iPSC分化为NK细胞，NK细胞CD16+表达流式结果如图15和图16。
经过本方案中相应的电转及实验方法，将野生型CD16转入iPSC分化获得的NK细胞，NK细胞CD16+表达流式结果如图21和图22。
结合表2与附图10-16，图21和22可知，经过基因修饰后的iPSC细胞株分化获得的NK细胞，其CD16阳性表达均达到80％以上，最高值达到95％以上，对照组1和2的NK细胞的CD16阳性表达分别为30.13％与45.59％，对照组3和4的NK细胞的CD16阳性表达分别为22.64％与32.24％。实验组即经本方案改造后的iPSC获得的NK细胞，对照组即未经本方案改造的iPSC获得的NK细胞，实验组CD16的表达量均明显高于对照组。
通过本方案的基因修饰分化得到的NK细胞各标志物的表达较高且稳定，由此说明本实验通过电转化法转入的CD16基因在NK细胞中成功表达，这可能会增强NK细胞的ADCC功能。为了进一步确定ADCC的功能是否增强，本方案进一步进行验证。
实施例5：ADCC验证
5.1.靶细胞悬液配置：取1M靶细胞，靶细胞为Raji，300g，5min离心，去上清；用含1％FBS的1640培养基重悬，得到1M/mL的细胞悬液；
5.2.将靶细胞按每孔50ul加至96孔板内；用10％FBS的1640培养基将抗体(anti-CD20Rituximab单抗)稀释为25ug/ml-40ug/ml，本方案中优先使用30ug/ml。抗体的设计可以是26ug/ml、27ug/ml、28ug/ml、29ug/ml、30ug/ml、31ug/ml、32ug/ml、33ug/ml、34ug/ml、35ug/ml、36ug/ml、37ug/ml、38ug/ml、39ug/ml，或任意两个数字之间的任何范围，包括端点。
按照每孔50ul加入对应孔内，轻轻吹打几次混匀；放入37度培养箱中孵育30min。
5.3.效应细胞悬液配制：收集效应细胞，400g，5min离心，去上清，使用10％FBS的1640培养基重悬并计数；将效应细胞按每孔100ul加至96孔，靶细胞按每孔100ul加至与效应细胞共孵育的孔。其中，效应细胞分别为：经过本方案基因修饰后iPSC分化的NK细胞、无基因修饰的iPSC分化的NK细胞、PBMC扩增的NK细胞。
5.4.孵育、检测，混匀转移至对应EP管。每个样品均加入终浓度为5nM的SYTOX染色液，混匀，4℃避光孵育15min，上机检测。
表3：通过本方案基因修饰iPSC获得的NK细胞、无基因修饰获得NK细胞、及其PBMC扩增来源的NK细胞的ADCC验证：
表3
通过本方案基因修饰后获得的iPSC分化为NK细胞、无基因修饰的iPSC分化为NK、以及从PBMC中来源的NK细胞，分别获得ADCC进行杀伤效果的比较，实验结果分别如图17-20。
通过表3与附图17-20可知，基于本方案基因修饰最终获得的CD16-NK细胞的ADCC杀伤能力明显优于无基因修饰iPSC分化的NK细胞和PBMC来源的NK细胞的ADCC能力。因此可以证明通过本方案基因修饰后获得的NK细胞，其抗体依赖性细胞毒性作用显著增强。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
Ⅰ、通过电转将表达CD16的质粒导入到iPSC中，得到CD16高表达的iPSC细胞株；
Ⅱ、将步骤Ⅰ中得到的CD16高表达的iPSC细胞株分化为NK细胞；
其中，能够表达CD16的质粒是基于同源重组的模板质粒；
CD16的基因序列突变位点为F158V和位点S197P，突变后的碱基序列分别是gtt和cca；
基于同源重组的模板质粒需要与靶向AAVS1位点的CRISPR-sgRNA共转染。
2.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，靶向AAVS1位点的sgRNA序列为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
3.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，同源重组的模板质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a
启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记， Ef1a启动子之前为AAVS1左侧同源臂，PuroR抗性筛选标记之后为AAVS1右侧同源臂；同源臂序列设置两组，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:11，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:12；或是左侧同源臂序列为SEQ ID NO:14，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:15；Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记的序列为SEQ ID NO:3。
4.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，表达CD16的基于同源重组模板质粒的序列为SEQ ID NO:13。
5.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，表达的CD16 为具有抗体Fc 段高亲和力且不可切割的突变体。
6.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，CD16的基因序列为SEQ ID NO:1。
7.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，所述CD16高表达的iPSC细胞株通过抗生素筛选和一次的克隆挑选获得，iPSC细胞株中CD16的表达不低于85%。
8.一种ADCC功能增强的NK细胞，其特征在于，该NK细胞是通过权利要求1-7任一项所述方法获得，通过所述方法最终获得的NK细胞的CD16的表达不低于80%。
9.一种组合物，其特征在于，包含ADCC增强型的NK细胞，所述ADCC增强型的NK细胞是通过权利要求1-7任一项方法获得。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP7008294B2 (ja) * 2017-06-13 2022-02-10 大日本印刷株式会社 腸オルガノイド及びその作製方法
JP2021519061A (ja) * 2018-03-29 2021-08-10 フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド 操作された免疫エフェクター細胞およびその使用
CA3106324C (en) * 2018-08-01 2024-04-02 Nantkwest, Inc. A quadricistronic system comprising a homing receptor or a cytokine, and chimeric antigen receptor for stable genetic modification of cellular immunotherapies
WO2021039965A1 (ja) * 2019-08-29 2021-03-04 学校法人慶應義塾 パルブアルブミン陽性神経細胞の製造方法、細胞、及び分化誘導剤
EP4237089A1 (en) * 2020-10-27 2023-09-06 The Regents of the University of California Natural killer cells with enhanced activity

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