CN116837035A - 一种碱基编辑自然杀伤细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种编辑编码TIGIT蛋白的多核苷酸的方法、碱基编辑NK细胞、制备方法和应用。使编码TIGIT的多核苷酸与碱基编辑系统接触，以对所述C或A脱氨基；所述系统包括：(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸，所述融合蛋白自N端至C端依次包括第一nCas9片段、脱氨酶片段、第二nCas9片段；(b)引导核苷酸序列或其编码多核苷酸。该碱基编辑NK细胞通过安全高效的碱基编辑技术敲除NK细胞的TIGIT基因。本发明所述的碱基编辑NK细胞在体内、体外具有高效的杀伤肿瘤细胞的作用，可望开发成为一种安全而有效的抗癌药物，具有广阔的临床应用前景和开发价值。

Description

一种碱基编辑自然杀伤细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术技术，具体涉及一种碱基编辑自然杀伤细胞及其制备方法和在杀伤肿瘤细胞中的应用。
背景技术
2020年诺贝尔化学奖授予埃马纽埃尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)、詹妮弗·杜德纳(Jennifer A.Doudna)，因她们开发了一种基因组编辑的方法。基因编辑技术已在癌症和基因缺陷疾病的治疗中得到了广泛的应用，该技术在癌症免疫治疗中的应用是目前最具前景的应用方向之一。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对T细胞、NK细胞等效应细胞进行基因编辑，敲除T细胞和NK细胞中PD-1、TIGIT等免疫检查点基因，从而制备能够抵抗免疫抑制微环境的“超级”免疫细胞。然而，由于多项临床试验中披露了T细胞免疫治疗的不良反应，包括细胞因子风暴和移植物抗宿主病等，T细胞癌症免疫治疗在安全性方面不被业界看好。因此，越来越多的研究者把目光投向了一种更为安全的疗法，即NK细胞癌症免疫疗法。NK细胞免疫疗法在多项临床试验中均展现了良好的有效性和安全性，是一种极具潜力的抗癌新手段。
由于人类机体NK细胞含量少，仅占外周血单个核细胞(PBMC)的5％-15％，数目难以满足临床治疗的需求，NK细胞需要经过大规模体外扩增才能达到输注癌症患者所需要的细胞数目。目前，NK细胞来源主要有4种：1)健康捐献者来源的PBMC；2)脐带血(CB)；3)胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)；4)NK-92细胞系。其中，NK-92细胞系是一种来源于人类恶性非霍奇金淋巴瘤(Malignant Non Hodgkins Lymphoma)的癌细胞，用于临床治疗存在巨大的风险。ESC或iPSC来源的NK细胞由体外细胞因子刺激分化而来，由于未经过机体正常微环境的驯化，表型与人类机体成熟NK细胞存在差异，例如iPSC来源的NK细胞低表达CD16分子，并且不表达KIR分子。因此，PBMC和CB成为了NK细胞癌症免疫治疗的主要细胞来源。
在过去的很多年中，PBMC来源的NK细胞难以进行遗传操作，很大程度上限制了NK细胞癌症免疫治疗的发展。随着分子生物学技术的发展，CRISPR/Cas9和电穿孔转染技术开始被应用到NK细胞的遗传操作中。从此，困扰癌症免疫学家多年的世界性难题得以解决。
然而，尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术实现了对NK细胞的高效遗传操作，但CRISPR/Cas9技术仍然存在一些安全性的顾虑。CRISPR/Cas9基因编辑技术基于Cas9蛋白对DNA双链进行切割，断裂的DNA双链在修复时可引入插入或缺失突变，从而对靶基因进行敲除。然而研究表明，这种以DNA双链断裂(DSB)为基础的遗传操作存在重大缺陷，可能导致百万碱基级别的染色体缺失，对人类细胞基因组造成全局性破坏。另外，双链断裂可引起p53诱导的细胞凋亡，阳性编辑的细胞更倾向于富集p53突变的细胞，这种编辑的细胞注射到体内无疑增加了癌变风险。因此，利用更安全的基因编辑工具应用于NK细胞癌症免疫治疗是当下亟需解决的问题。
碱基编辑技术是在CRISPR/Cas技术上融入了脱氨酶，通过对碱基脱氨在原位实现碱基编辑的目的。此种编辑方式不需要引入DNA双链断裂，理论上更加安全。目前使用最广的是胞嘧啶碱基编辑与腺嘌呤碱基编辑，分别可以实现C到T的转换或者A到G的转换。碱基编辑技术的提出迅速成为基因编辑领域炙手可热的工具。胞嘧啶碱基编辑可以作用于表达基因的CDS区，通过靶向CAA、CAG、CGA或TGG，产生终止密码子达到敲除基因的目的。除此之外，胞嘧啶碱基编辑与腺嘌呤碱基编辑均可以通过靶向起始密码子ATG，通过将ATG突变为ATA、GTG或者ACG达到敲除基因的目的。但是，目前采用碱基编辑技术编辑NK细胞仍存在效率不高或易脱靶等问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种利用碱基编辑系统对NK细胞中TIGIT基因进行编辑的方法，达到沉默TIGIT表达的效果。本发明所使用的碱基编辑系统是将脱氨酶嵌合到Cas9蛋白中间。研究表明，所述碱基编辑系统在DNA与RNA水平的脱靶与野生型细胞相比无明显差异，表明了该方法对于细胞治疗产品的安全性。通过该方法获得的经过基因编辑的NK细胞可以作为药物及时有效地应用于临床免疫治疗，可以为建立碱基编辑技术联合过继免疫在肿瘤及病毒感染性疾病(例如HIV/AIDS)的治疗提供新的选择，还可以为新的有效基因靶点的研究提供支持，同时为相关疾病治疗的研究奠定坚实的技术基础。
本发明的目的之一是提供一种编辑编码TIGIT蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括使编码TIGIT的多核苷酸与碱基编辑系统接触，以对所述多核苷酸的靶C碱基或靶A碱基脱氨基；所述碱基编辑系统包括：
(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸，所述融合蛋白自N端至C端依次包括第一nCas9片段、脱氨酶片段、第二nCas9片段；所述第一nCas9片段的氨基酸序列如SEQ IDNO.43所示；所述第二nCas9片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示；
(b)引导核苷酸序列或其编码多核苷酸，其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述多核苷酸中的靶C碱基和/或靶A碱基。
本发明的另一目的是提供一种碱基编辑系统，其为如上所述方法中所述的碱基编辑系统。
本发明的另一目的是提供一种NK细胞，其包含碱基突变的TIGIT基因；优选地，所述碱基突变是指C至T的转化、或A至G的转化；所述C至T的转化生成提前终止密码子或使得起始密码子突变，所述A至G的转化使得起始密码子突变。
本发明的另一目的是提供一种组合物，其包含如上所述方法中所述的碱基编辑系统或如上任一项所述的NK细胞；优选地，其进一步包含药学上可接受的载体。
本发明的另一目的是试剂盒，其包含如上所述的组合物。
本发明的另一目的是提供根据如上所述方法中所述的碱基编辑系统或如上任一项所述的NK细胞或如上所述的组合物的用途，所述用途选自以下至少任一项：
1)制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物；
2)制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物；
3)制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；
4)制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。
本发明的另一目的是提供一种预防和/或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的碱基编辑系统、NK细胞或组合物；所述病症选自以下至少任一项：自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病。
本发明中，所述组合物可以与其他药物联用。
与现有技术相比，本发明具有如下显著有益效果：
本发明的研究结果显示：利用修饰的sgRNA和碱基编辑蛋白，以电穿孔转染的方式将sgRNA/BE蛋白复合物(RNP)导入经体外扩增的原代NK细胞，可以高效敲除TIGIT基因。同时利用碱基编辑敲除TIGIT的NK细胞(TIGIT-NK细胞)，其在DNA与RNA水平均没有检测到明显脱靶。利用本发明所述方法制备的基因编辑NK细胞，可解除CD155+肿瘤细胞对NK细胞的免疫抑制作用。本发明制备的TIGIT-NK细胞相对于野生型NK细胞在体内、体外实验中均展现出更强的抗肿瘤活性，具有明显的应用前景和临床应用价值。
附图说明
图1显示了体外转录与合成sgRNA相对应的编辑效率。
图2流式细胞术检测不同RNP质量比对编辑效率的影响。
图3不同类型NK细胞抗肿瘤活性的比较。
图4不同类型NK细胞治疗后肿瘤体积变化。
图5不同类型NK细胞治疗后肿瘤质量变化。
图6全基因组测序分析碱基编辑NK的DNA脱靶。
图7全转录组测序分析碱基编辑NK的RNA脱靶。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明提供了一种编辑编码TIGIT蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括使编码TIGIT的多核苷酸与碱基编辑系统接触，以对所述多核苷酸的靶C碱基或靶A碱基脱氨基；所述碱基编辑系统包括：
(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸，所述融合蛋白自N端至C端依次包括第一nCas9片段、脱氨酶片段、第二nCas9片段；所述第一nCas9片段的氨基酸序列如SEQ IDNO.43所示；所述第二nCas9片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示；
(b)引导核苷酸序列或其编码多核苷酸，其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述多核苷酸中的靶C碱基和/或靶A碱基。
本发明所述方法中，所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA，可以是单链的或是双链的；DNA可以是编码链或非编码链。
本发明所述方法中，可以直接讲所述融合蛋白或其变体可以直接递送至待编辑对象如体外体系或宿主细胞中；或以信使RNA(mRNA)分子的形式递送，其在递送进入宿主细胞之后被翻译成所述融合蛋白或其变体；或以表达载体的形式递送，所述表达载体包含编码一个或多个基因以表达融合蛋白或其变体的脱氧核糖核酸(DNA)序列。
本发明所述方法中，在一些实施方式中，可以直接将所述融合蛋白或其变体递送至待编辑对象如体外体系或宿主细胞中。
本发明所述方法中，在一些实施方式中，也可以将所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸递送至待编辑对象如体外体系或宿主细胞中，然后翻译成所述融合蛋白或其变体。其中所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式；DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的，DNA可以是编码链或非编码链；RNA形式例如是信使RNA(mRNA)。在一些优选实施方式中，所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸可以以表达载体的形式递送，所述表达载体上包含编码一个或多个拷贝的编码融合蛋白或其变体的多核苷酸。
本发明所述方法中，在一些实施方式中，可以直接将所述引导核苷酸序列递送至待编辑对象如体外体系或宿主细胞中。
本发明所述方法中，在一些实施方式中，也可以将所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸递送至待编辑对象如体外体系或宿主细胞中，然后翻译成所述引导核苷酸序列。其中所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸可以是DNA形式；DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的，DNA可以是编码链或非编码链。在一些优选实施方式中，所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸可以以表达载体的形式递送，所述表达载体上包含编码一个或多个拷贝的编码引导核苷酸序列的多核苷酸。
本发明所述方法中，编码所述融合蛋白或其变体的多核苷酸包括：只编码融合蛋白或其变体的编码序列；融合蛋白或其变体的编码序列和各种附加编码序列；融合蛋白或其变体的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。编码所述引导核苷酸序列的多核苷酸包括：只编码引导核苷酸序列的编码序列；引导核苷酸序列的编码序列和各种附加编码序列；引导核苷酸序列的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。在一些实施方式中，本发明所述方法中，所述碱基编辑系统可以是包含一个或多个载体；所述一个或多个载体包含(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至所述融合蛋白或其变体的编码序列；以及(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至所述引导核苷酸序列的编码序列；所述(i)和(ii)位于相同或不同载体上。在一些实施方式中，所述碱基编辑系统包含(i)融合蛋白或其变体，以及(ii)包含所述引导核苷酸序列的编码序列的载体。
所述第一调控元件可以调控所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸的转录。所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸可以是一个或多个，所述第一调控元件可以是一个或多个。所述第二调控元件可以调控所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸的转录。所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸可以是一个或多个，所述第二调控元件可以是一个或多个。
本发明所述方法中，所述融合蛋白的变体为所述融合蛋白的片段、衍生物和类似物，其可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。根据本发明的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在一些实施方式中，所述融合蛋白的变体是指与所述融合蛋白的氨基酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性，且具有所述融合蛋白相同或相似功能的蛋白。上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性；具体地可为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。上述90％或90％以上同一性，可为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。所述相似功能是指保留原蛋白的75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高的功能。
本发明所述方法中，所述脱氨酶选自胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。
其中，所述胞嘧啶脱氨酶选自下组：APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、激活诱导的脱氨酶(AID)和pmCDA1。优选地，所述胞嘧啶脱氨酶为APOBEC3A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示。
其中，所述腺嘌呤脱氨酶选自野生型tadA、突变型tadA，或者两者组成的复合物wtTadA–TadA*；优选为两者组成的复合物wtTadA–TadA*，其氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示。
本发明所述方法中，所述引导核苷酸序列的靶向序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.9至少任一所示。当所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶时，所述碱基编辑系统为胞嘧啶碱基编辑系统，优选地，当所述胞嘧啶脱氨酶为APOBEC3A时，所述引导核苷酸序列的靶向序列如SEQ ID NO.1-8至少任一所示(其中SEQ ID NO.8用于对起始密码子编辑)；在一些实施方式中，当所述胞嘧啶脱氨酶为APOBEC3A时，所述引导核苷酸序列为合成序列，如SEQ IDNO.12-19至少任一所示，优选地，在所述SEQ ID NO.12-19的3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，即在SEQ ID NO.12-19的3′端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，在SEQID NO.12-19的5′端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰(其中SEQ ID NO.19或其修饰型用于对起始密码子编辑)。当所述脱氨酶为腺嘌呤脱氨酶时，所述碱基编辑系统为腺嘌呤碱基编辑系统，优选地，当所述腺嘌呤脱氨酶为ectadA时，所述引导核苷酸序列的靶向序列如SEQID NO.9所示；在一些实施方式中，当所述腺嘌呤脱氨酶为ectadA时，所述引导核苷酸序列为合成序列，如SEQ ID NO.20所示，优选地，在所述SEQ ID NO.20的3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，即在SEQ ID NO.20的3′端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，在SEQ ID NO.20的5′端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰。其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.12或修饰的SEQ ID NO.12靶向相同序列，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.13或修饰的SEQ IDNO.13靶向相同序列，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.14或修饰的SEQ ID NO.14靶向相同序列，……依次类推，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.20或修饰的SEQ ID NO.20靶向相同序列。编辑器蛋白与靶点和不同序列sgRNA的对应关系如下表所示：
本发明所述方法中，所述引导核苷酸序列与融合蛋白的质量比为1:(2～20)；可以是1:(2～4)、1:(2～6)、1:(2～8)、1:(2～10)、1:(2～12)、1:(2～14)、1:(2～16)、1:(2～18)、1:(2～20)、(4～6)、1:(4～8)、1:(4～10)、1:(4～12)、1:(4～14)、1:(4～16)、1:(4～18)、1:(4～20)、1:(8～10)、1:(8～12)、1:(8～14)、1:(8～16)、1:(8～18)、1:(8～20)、1:(10～12)、1:(10～14)、1:(10～16)、1:(10～18)、1:(10～20)、1:(12～14)、1:(14～16)、1:(16～18)、1:(18～20)；优选地，为1:(2～8)；进一步优选地，为1:6。
本发明所述方法中，所述编码TIGIT蛋白的多核苷酸与(a)、(b)分别接触，或与(a)和(b)形成的RNP复合物接触。
本发明所述方法中，对于所述融合蛋白，在一些实施方式中，所述第一nCas9片段与所述脱氨酶通过链接肽链接；优选地，所述链接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示。在一些实施方式中，所述第二nCas9片段与所述脱氨酶通过链接肽链接；优选地，所述链接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示。在一些实施方式中，所述融合蛋白的两端还包含核定位信号；优选地，所述核定位信号的氨基酸序列如SEQ IDNO.46所示。在一些实施方式中，当所述核酸酶为胞嘧啶核酸酶时，所述融合蛋白还包含两个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)片段；优选地，所述两个UGI片段的氨基酸序列如SEQ IDNO.47所示；进一步优选地，所述两个UGI片段通过GS肽段与所述第二nCas9片段的C端融合，所述GS肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.48所示。
在一些优选实施方式中，所述融合蛋白结构为NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[链接肽]-[胞嘧啶脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[UGI肽段]-[UGI肽段]-[核定位信号]-COOH；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。
在另一些优选实施方式中，所述融合蛋白结构为NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[链接肽]-[腺嘌呤脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[核定位信号]-COOH；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
本发明所述方法中，在一些优选实施方式中，当所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQID No.10所示时，所述引导核苷酸序列的靶向序列如SEQ ID NO.1-8至少任一所示；在一些优选实施方式中，当所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示时，所述引导核苷酸序列为合成序列，如SEQ ID NO.12-19至少任一所示，优选地，在所述SEQ ID NO.12-19的3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，即在SEQ ID NO.12-19的3′端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，在SEQ ID NO.12-19的5′端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰。在一些优选实施方式中，当所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示时，所述引导核苷酸序列的靶向序列如SEQ ID NO.9所示。在一些优选实施方式中，当所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示时，所述引导核苷酸序列为合成序列，如SEQ ID NO.20所示，优选地，在所述SEQ ID NO.20的3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，即在SEQ ID NO.20的3′端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，在SEQ ID NO.20的5′端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰。
本发明所述方法中，所述编码TIGIT蛋白的多核苷酸包含编码链和互补链；所述编码TIGIT蛋白的多核苷酸包含编码区和非编码区。所述脱氨基导致所述编码TIGIT蛋白的多核苷酸中C至T转化或A至G转化。在一些实施方式中，所述C至T转化和/或A至G转化发生在所述编码TIGIT的多核苷酸的编码序列中。在一些实施方式中，所述C至T转化和/或A至G转化导致所述TIGIT蛋白中的突变；所述TIGIT蛋白中的所述突变是功能丧失突变或非编码突变；优选地，所述功能丧失突变在所述TIGIT编码序列中引入提前终止密码子，其导致截短的或非功能性的TIGIT蛋白，或所述非编码突变是通过使所述TIGIT编码序列的起始密码子ATG突变，其导致消除TIGIT表达。在一些实施方式中，将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变引入到所述编码TIGIT的多核苷酸中。
在一些实施方式中，所述提前终止密码子是TAA，TAG，TGA或者TGA。例如，所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CAA至TAA转化生成；所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CAG至TAG转化生成；所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CGA至TGA转化生成；所述提前终止密码子经由所述互补链上的第三个C的脱氨基从TGG至TGA转化生成；所述起始密码子突变经由所述互补链上的第三个C的脱氨基从ATG至ATA转化生成；所述起始密码子突变经由所述互补链上的第二个A的脱氨基从ATG至ACG转化生成；所述起始密码子突变经由所述编码链上的第一个A的脱氨基从ATG至GTG转化生成。
本发明所述方法适用的基因编辑的对象没有特别的限制，可以在体外或体内实施。
在一些实施方式中，所述方法在培养的细胞中实施，可以在体细胞或生殖细胞，可以是动物细胞或人细胞；进一步优选地，所述细胞为自然杀伤细胞即NK细胞；进一步优选地，所述NK细胞选自来自外周血细胞的原代NK细胞(优选来自PBMC的原代NK细胞)、脐带血来源NK细胞、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(ips)或诱导多能干细胞(ips)诱导的NK细胞。
可以使用基因递送载剂递送本文所述的多核苷酸至细胞或组织。本文所用“基因递送”、“基因转移”、“转导”等，其指代将外源性多核苷酸导入宿主细胞，如载体介导的基因转移(通过，例如，病毒感染/转染，或各种其他基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物)以及协助“裸”多核苷酸递送的技术(如电穿孔，“基因枪”递送以及用于导入多核苷酸的各种其他技术)。导入的多核苷酸可以稳定地或瞬时地维持在宿主细胞中。稳定维持通常需要导入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或者纳入到宿主细胞的复制子，诸如染色体外复制子(例如，质粒)或核或线粒体染色体。许多“载体”已知能够介导基因向哺乳动物细胞的转移，如本领域已知和本文所述。在一些优选实施方式中，本发明所述方法通过电穿孔、病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化中的一种或多种方法将所述碱基编辑系统转入所述细胞中；更优选地，所述转染方法选自电穿孔方法；更进一步优选地，所述电穿孔方法选择的程序为LONZA电转仪的CM158或者Maxcyte的NK5程序。
本发明所述方法在体内实施，可以作用于体细胞或生殖细胞，优选地，所述方法在哺乳动物中实施；进一步优选地，所述哺乳动物是啮齿动物；更进一步优选地，所述哺乳动物是人。进一步优选地，所述方法靶向哺乳动物的NK细胞，所述NK细胞选自来自外周血细胞优选PBMC的原代NK细胞、脐带血来源NK细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或诱导多能干细胞诱导的NK细胞。
本发明还提供了一种碱基编辑系统，其为如上任一项所述方法中所述的碱基编辑系统。
本发明还提供了一种NK细胞，其包含碱基突变的TIGIT基因。优选地，所述碱基突变是指C至T的转化、或A至G的转化；所述C至T的转化生成提前终止密码子或使得起始密码子突变，所述A至G的转化使得起始密码子突变。所述C至T的转化发生CDS区中的CAA、CAG、CGA、TGG；优选地，所述提前终止密码子为TAA，TAG，TGA或者TGA；所述C至T的转化发生起始密码子ATG，所述起始密码子突变为ATA；所述A至G的转化发生起始密码子ATG，所述起始密码子突变为ACG或GTG。在另一优选时候方式中，所述NK细胞，其根据所述的方法制备得到。
本发明还提供了一种组合物，其包含如上任一项所述方法中所述的碱基编辑系统或NK细胞。在一些优选实施方式，其进一步包含药学上可接受的载体。所述可接受的载体例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含如上所述的组合物。
本发明还提供了一种根据如上所述方法中所述的碱基编辑系统或如上所述的NK细胞或如上所述的组合物的用途，所述用途选自以下至少任一项：
1)制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物；
2)制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物；
3)制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；
4)制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。
本发明还提供了一种预防和/或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上所述方法中所述的碱基编辑系统或如上所述的NK细胞或如上所述的组合物；所述病症选自以下至少任一项：自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病等。
其中，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎中的一种或多种。
其中，所述肿瘤选自淋巴瘤、血液瘤或实体瘤；优选地，选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤肿瘤细胞中的一种或多种。
其中，所述病毒选自流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、或埃可病毒中的一种或几种。
其中，所述细菌选自大肠杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌以及短双歧杆菌中的一种或几种。
本发明中，所述的碱基编辑系统或如上所述的NK细胞或如上所述的组合物还可以与其他药物联用。在一些实施方式中，未编辑的NK细胞来自于有需要的受试者。在一些实施方式中，所述方法进一步包括，向有需要的受试者施用一种或多种细胞因子，例如包括但不限于是IL-2和/或IL-15等。与天然NK细胞相比，经碱基编辑的NK细胞对细胞因子刺激更加敏感并表现出改善的扩增、抗肿瘤功能和抗病毒功能等。
本发明所提供的组合物或用途中，所述碱基编辑系统或NK细胞可以是单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合，构成联合制剂。所述其他活性组分可以是其他各种可以用于治疗自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病的药物。组合物中活性组分的含量通常为安全有效量，所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的，例如，所述活性成分的施用量通常依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的所述碱基编辑系统或NK细胞的施用量通常可以为1～1000mg/kg/day、20～200mg/kg/day、1～3mg/kg/day、3～5mg/kg/day、5～10mg/kg/day、10～20mg/kg/day、20～30mg/kg/day、30～40mg/kg/day、40～60mg/kg/day、60～80mg/kg/day、80～100mg/kg/day、100～150mg/kg/day、150～200mg/kg/day、200～300mg/kg/day、300～500mg/kg/day、或500～1000mg/kg/day。
如本文所用，所述药物组合物的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉雾剂等。
本发明所述方法和应用中，当所述活性成分与其他治疗剂联用时，所述活性成分与其他治疗剂共同给予。“共同给予”表示在同一制剂中或在两种不同制剂中经由相同或不同途径同时给予，或通过相同或不同途径顺次给予。“顺次”给予表示在两种或多种不同化合物的给药之间具有以秒、分钟、小时或天计的时间差异。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
如本文所用，同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
如本文所用，“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思；即“包括但不限于”的意思。
如本文所用，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。
如本文所用，“治疗性”和“预防性”应理解为其最宽的意义。术语“治疗性”不一定暗示哺乳动物接受治疗直至完全恢复。类似地，“预防性”不一定表示对象最终不会感染疾病病症。因此，治疗和预防包括缓解具体病症的症状或防止或降低具体病症产生的风险。术语“预防”可理解为降低具体病症发作的严重程度。治疗也可降低已有病症的严重程度或急性发作的频率。
如本文所用，进行治疗性或预防性治疗的对象或个体优选哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、牲畜(如绵羊、牛、马、驴、猪)、宠物(如狗、猫)、实验室试验动物(如小鼠、家兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)或被捕获的野生动物(如狐狸、鹿)。所述对象优选灵长类。所述对象最优选人。
如本文所用，术语“核酸”和“核酸组分”可互换使用，其指具有核碱基和酸性部分的化合物，例如核苷、核苷酸或核苷酸的聚合物。在一些实施方式中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方式中，“核酸”是指包含三个或更多个单个核苷酸残基的寡核苷酸链。本文中所用术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用以指核苷酸的聚合物(例如，一串至少三个核苷酸)。在一些实施方式中，“核酸”包括RNA以及单链和/或双链DNA。核酸可以是天然产生的或是非天然产生的分子。
如本文所用，术语“表达”指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样品内mRNA或蛋白质的量予以确定。
术语“调节元件”包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。调节元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可指导在感兴趣的组织表达，例如肌肉、神经元、骨、皮肤等。在一些实施例中，一个载体包含一个或多个pol III启动子、pol II启动子、pol I启动子、或其组合。pol III启动子包括但不限于U6和H1启动子。pol II启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子等。
如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用并以其最广泛的含义使用，是指两个或更多个亚基的氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一方面中，亚基可以通过其他键连接，例如，酯、醚等。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。已知蛋白质和肽具有C-末端和N-末端，所述C-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合羧基的末端，所述N-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合氨基的末端。本文所用术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸，以及D和L光学异构体，氨基酸类似物和肽模拟物。术语“融合”在蛋白质或多肽上下文中是指两个或更多个蛋白质或多肽(或其结构域)末端之间形成融合蛋白的连接。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
实施例1：碱基编辑NK细胞的制备
1.原代NK细胞的扩增和培养
1)从液氮中取出冻存的人外周血单个核细胞(PBMC)，于37℃水浴迅速融化。
2)在一个新的15mL离心管中加入4mL含有10％FBS的RPMI-1640完全培养液，将1mLPBMC悬液转移至15mL离心管中。
3)室温250×g离心5min。
4)弃去上清液，使用1mL RPMI-1640培养液重悬细胞。
5)在一个新的75mL细胞培养瓶中加入19mL RPMI-1640培养液，将上述细胞悬液转移至培养瓶中。
6)向培养瓶中加入人重组IL-2蛋白，终浓度200U/mL。
7)将培养瓶置于37℃5％CO2培养箱中，培养过夜后，将培养瓶中的PBMC进行细胞计数。
8)从液氮取出冻存的辐照EK562工程细胞，并于37℃水浴迅速融化。
9)在一个新的15mL离心管中加入4mL RPMI-1640完全培养液，将EK562细胞悬液转移至15mL离心管中。
10)室温250×g离心5min。
11)弃去上清液，使用1mL RPMI-1640培养液重悬细胞并进行细胞计数。
12)按PBMC：EK562＝1：1的效靶比向培养瓶中加入EK562细胞。
13)将细胞置于37℃5％CO2培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1×106个/mL范围内，根据培养液体积加入IL-2，终浓度100U/mL。
14)培养至第7天时，将培养瓶中细胞进行计数，并按照PBMC：EK562＝1：1的效靶比向培养瓶中再次加入EK562细胞。
15)将细胞置于37℃5％CO2培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1×106个/mL范围内，根据培养液体积加入IL-2，终浓度100U/mL。
16)培养至第14天后，培养瓶中NK细胞的纯度可达到95％以上。
2.sgRNA的制备
通过对TIGIT基因的CDS区分析，本发明选取了可能突变成终止密码子的靶序列(SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.59)。相应的sgRNA可以通过体外转录或者公司合成方式获得。两者均能实现编辑，相比于体外转录，合成的sgRNA可以对sgRNA末端进行修饰，有助于提高编辑效率。体外转录的sgRNA序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9所示，合成sgRNA序列如SEQID NO.12-SEQ ID NO.20所示，其中，每条序列在3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰。
其中，SEQ ID NO.1和修饰的SEQ ID NO.12编号为TIGIT-1，SEQ ID NO.2和修饰的SEQ ID NO.13编号为TIGIT-2，SEQ ID NO.3和修饰的SEQ ID NO.14编号为TIGIT-3，SEQ IDNO.4和修饰的SEQ ID NO.15编号为TIGIT-4，SEQ ID NO.5和修饰的SEQ ID NO.16编号为TIGIT-5，SEQ ID NO.6和修饰的SEQ ID NO.17编号为TIGIT-6，SEQ ID NO.7和修饰的SEQID NO.18编号为TIGIT-7，SEQ ID NO.8和修饰的SEQ ID NO.19编号为TIGIT-8，SEQ IDNO.9和修饰的SEQ ID NO.20编号为TIGIT-9。SEQ ID NO.1～9为体外转录获得，SEQ IDNO.12～20为合成方式获得。
以下将简要说明体外转录的步骤。
1)退火，将每条sgRNA加上TAGG内切酶粘性末端上游序列(SEQ ID NO.21-SEQ IDNO.29)和加上AAAC内切酶粘性末端的下游序列(SEQ ID NO.30-SEQ ID NO.38)后，一起通过程序(95℃，5min；95℃-85℃(以2℃/s速度降温)；85℃-25℃(以-0.1℃/s速度降温)；维持在4℃)退火，得到退火产物即oligo片段。
2)线性化，将载体pUC57-sgRNA expression vector(Addgene#51132)经过BsaI(NEB：R0539L)线性化。线性化体系：pUC57-sgRNA expression vector 2μg；buffer(NEB：R0539L)5μL；BsaI 1μL；ddH2O补齐到50μL。
3)连接，将退火产物连接到经过BsaI线性化的pUC57-sgRNA expression vector载体上。连接体系：T4连接buffer(NEB：M0202L)1μL，线性化载体20ng，退火的oligo片段(10μM)5μL，T4连接酶(NEB：M0202L)0.5μL，ddH2O补齐到10μL，16℃连接1小时。连接的载体通过转化，挑菌，鉴定。对阳性克隆摇菌提取质粒(Axygene：AP-MN-P-250G)并测定浓度。
4)PCR扩增，用引物sgRNA-F(SEQ ID NO.39：TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG)和sgRNA-R(SEQ ID NO.40：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC)将含有T7启动子的sgRNA序列利用PCR扩增，凝胶电泳鉴定条带后用RNA-SECURE(Thermo，#AM7005)65℃处理15分钟，然后将扩增产物回收(Axygene：AP-PCR-250G)并测定浓度。
5)体外转录，利用T7转录试剂盒(Thermo，#AM1354)将sgRNA的DNA体外转录为RNA，凝胶电泳鉴定后用RNA回收试剂盒(Thermo，#AM1908)将sgRNA回收，测浓度。
3.碱基编辑蛋白(BE蛋白)的制备和纯化
1)密码子优化。将所使用的胞嘧啶碱基编辑蛋白与腺嘌呤碱基编辑蛋白进行大肠杆菌密码子优化，由金斯瑞公司合成序列，并构建入Pet28a表达质粒骨架中。优化后序列如下：胞嘧啶碱基编辑蛋白DNA序列：SEQ ID NO.41；腺嘌呤碱基编辑蛋白DNA序列：SEQ IDNO.42。
2)质粒转化。将质粒分别转化BL21感受态，涂板，挑单克隆进行摇菌表达，准备2L培基在37℃，220rpm的摇床摇菌，待菌液OD值在0.6-0.8之间加IPTG 2mL(2M浓度)，诱导培养24小时后收菌。
3)收菌。将菌液高速离心：4000rpm 30min，弃上清。
4)破菌。用Buffer A将离心后的菌体吹散后，加入蛋白酶抑制剂，用高压破碎机将大肠杆菌破碎。高速离心后取上清。Buffer A配方：25mM Tris pH＝8.0，500mM NaCl，10％(v/v)Glycerol，0.22μM滤器过滤。
5)过柱。将破碎后的上清用0.45μM滤膜过滤，然后加入BufferA润洗后的钴离子亲和层析柱(Clontech，635504)对带His标签的Cas9蛋白吸附。
6)去杂质。用40ml添加有5mM咪唑的Buffer A 过柱子，以去除亲和力较低的杂质。
7)洗脱。用30ml添加有500mM咪唑的bufferA过柱子，置换出目的蛋白。
8)浓缩。Western blot鉴定后将洗脱下来的目的蛋白加入到蛋白浓缩柱中，3900rpm，20min。
9)浓缩后的蛋白进行离子交换层析(Ion exchange chromatography(IEC))，以除去与蛋白结合的核酸。然后再次浓缩，分别得到氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的胞嘧啶碱基编辑蛋白(CBE蛋白)，以及氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的腺嘌呤碱基编辑蛋白(ABE蛋白)，测定浓度，分装，冻存备用。
4.电穿孔转染NK细胞
1)RNP混合，根据比例将步骤2制备的sgRNA分别与步骤3制备的BE蛋白以1：4的质量比混合，用枪头轻轻吹打混匀。
2)准备NK细胞。用PBS将步骤1制备的NK细胞洗一遍并离心。
3)电穿孔转染。
a)一个可选的实施方案是，采用Lonza 4D电转仪进行电穿孔转染，用电转液将NK细胞和RNP重悬混匀后，加入电转杯中，从候选的135个电转程序中选择合适的电转程序进行电转。电转后用枪头吸出液体放入提前预热的培养基中培养，培养9天后进行流式检测或者测序分析，从而获得编辑效率相关的数据。
b)一个可选实施方案是，采用Maxcyte电转仪进行电穿孔转染，用电转液将细胞和RNP重悬混匀后，加入电转杯中，从候选的5个电转程序中选择合适的电转程序进行电转。电转后用枪头吸出液体放入提前预热的培养基中培养，培养9天后进行流式检测或者测序分析，从而获得编辑效率相关的数据。
实施例2：电转程序的优化
目前对于Cas9蛋白已经有比较成熟的电转方案，但是碱基编辑蛋白相比于Cas9要大约50kDa，因此所适用的电转程序也不同。本实施例中选取编号为TIGIT-1的sgRNA进行电转条件优化，以进一步提高碱基编辑效率。具体序列为TIGIT-1：SEQ ID NO.1。
1)从液氮中取出冻存的人外周血单个核细胞(PBMC)，于37℃水浴迅速融化。
2)在一个新的15mL离心管中加入4mL含有10％FBS的RPMI-1640完全培养液，将1mLPBMC悬液转移至15mL离心管中。
3)室温250×g离心5min。
4)弃去上清液，使用1mL RPMI-1640培养液重悬细胞。
5)在一个新的75mL细胞培养瓶中加入19mL RPMI-1640培养液，将上述细胞悬液转移至培养瓶中。
6)向培养瓶中加入人重组IL-2蛋白，终浓度200U/mL。
7)将培养瓶置于37℃5％CO2培养箱中，培养过夜后，将培养瓶中的PBMC进行细胞计数。
8)从液氮取出冻存的辐照EK562工程细胞，并于37℃水浴迅速融化。
9)在一个新的15mL离心管中加入4mL RPMI-1640完全培养液，将EK562细胞悬液转移至15mL离心管中。
10)室温250×g离心5min。
11)弃去上清液，使用1mL RPMI-1640培养液重悬细胞并进行细胞计数。
12)按PBMC：EK562＝1：1的效靶比向培养瓶中加入EK562细胞。
13)将细胞置于37℃5％CO2培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1×106个/mL范围内，根据培养液体积加入IL-2，终浓度100U/mL。
14)培养至第7天时，将培养瓶中细胞进行计数，并按照PBMC：EK562＝1：1的效靶比向培养瓶中再次加入EK562细胞。
15)将细胞置于37℃5％CO2培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1×106个/mL范围内，根据培养液体积加入IL-2，终浓度100U/mL。
16)培养至14天，培养瓶中NK细胞的纯度可达到95％以上。
17)收集上述体外扩增的原代NK细胞，室温250×g离心5min。
18)弃上清，采用1×PBS缓冲液重悬细胞，室温250×g离心5min。
19)弃上清，采用电转仪配套电转缓冲液重悬NK细胞。
20)RNP混合，根据比例将实施例1步骤3制备的CBE蛋白和实施例1步骤2制备的sgRNA以4:1的质量比混匀。
21)将RNP混合液加入上述准备好的NK细胞悬液中，于电转仪进行电转。
22)采用Lonza电转仪进行电穿孔转染，Lonza能够查到的电转程序有135个(表1)。本实施例的目的是确定细胞活率与电转效率的最优组合。本发明将利用这135个电转程序分别对相同的RNP电转。
23)电转后培养9天检测编辑效率和细胞增殖情况。表2显示对Lonza135种电转程序所对应的编辑效率，表3对应的培养9天以后，细胞的增殖比例。结合表2和表3，发现CM158和CM189两种电转程序其编辑效率和细胞增殖倍数均能维持较高水平，且CM158电转程序的综合效果相对更好。
同样方法，本发明针对Maxcyte电转仪的电转程序的编辑效率进行了测定，其中NK1、NK2、NK3、NK4、NK5五种电转程序分别对应的编辑效率分别是12.4％、29.4％、32.1％、10.2％和43.5％；对应的细胞增殖倍数分别是189、234、390、255和310。综合比较NK5电转程序在编辑效率和细胞增殖两个维度获得较为理想结果。
表1 Lonza仪器所用电转程序
表2不同Lonza电转程序对应的编辑效率
2.0％ 3.5％ 6.3％ 3.4％ 5.3％ 21.0％ 20.0％ 12.0％ 6.0％
0.0％ 0.0％ 3.0％ 5.0％ 2.1％ 4.0％ 8.0％ 4.6％ 2.4％
2.0％ 1.8％ 5.0％ 12.0％ 53.4％ 68.0％ 74.0％ 54.0％ 57.0％
1.3％ 2.4％ 3.4％ 5.3％ 12.0％ 34.0％ 43.0％ 12.0％ 34.0％
4.3％ 5.7％ 6.9％ 3.4％ 2.1％ 2.0％ 1.8％ 2.6％ 3.2％
5.7％ 6.8％ 23.0％ 16.0％ 25.0％ 32.0％ 44.0％ 46.0％ 21.0％
4.8％ 9.0％ 11.0％ 15.0％ 12.0％ 23.0％ 32.0％ 22.0％ 10.0％
9.0％ 23.0％ 0.0％ 0.0％ 23.0％ 32.0％ 43.0％ 23.0％ 34.0％
11.0％ 22.0％ 0.0％ 0.0％ 34.0％ 43.0％ 50.0％ 45.0％ 37.0％
3.5％ 7.0％ 9.0％ 4.6％ 11.0％ 17.0％ 14.0％ 12.0％ 22.0％
0.0％ 1.2％ 3.4％ 6.0％ 8.0％ 11.0％ 19.0％ 22.0％ 11.0％
3.5％ 2.0％ 3.0％ 4.0％ 23.0％ 11.0％ 34.0％ 43.0％ 22.0％
2.5％ 2.0％ 22.0％ 34.0％ 12.0％ 43.0％ 23.0％ 44.0％ 23.0％
0.0％ 8.0％ 3.0％ 12.0％ 32.0％ 43.0％ 43.0％ 45.0％ 50.0％
1.3％ 2.4％ 2.3％ 11.0％ 14.0％ 11.0％ 8.0％ 3.0％ 2.0％
其中，表2中的行和列分别与表1对应。
表3不同Lonza电转程序对应的细胞增殖倍数
186 203 244 189 265 230 186 68 97
154 205 231 322 385 216 193 58 54
234 203 264 326 385 287 164 99 88
265 215 236 235 338 195 68 46 66
244 216 276 275 329 96 109 89 77
276 236 287 246 257 245 135 145 97
246 243 235 321 236 233 190 122 87
275 275 283 237 321 290 200 186 97
298 233 245 385 235 239 122 14 86
286 262 264 312 286 291 102 143 46
259 215 245 268 236 245 168 87 136
239 297 244 365 346 234 196 122 43
234 233 239 231 286 179 230 168 68
330 264 265 196 233 185 203 122 13
320 236 198 254 258 235 235 231 246
其中，表3中的行和列分别与表1对应。
实施例3：高效sgRNA的筛选
利用胞嘧啶碱基编辑工具敲除TIGIT基因，所选用的sgRNA需要针对CAA、CAG、CGA或者TGG三联体密码子，突变成终止密码子，又或者作用于起始密码子ATG，突变成ATA。通过分析发现有7个sgRNA(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7)可以突变成终止密码子，一个sgRNA(SEQID NO.8)可以突变起始密码子。利用腺嘌呤碱基编辑工具可以将起始密码子ATG突变成GTG(SEQ ID NO.9)。
本实施例对这9组sgRNA(TIGIT-1～9)分析其相对应的编辑效率，即同时分析体外转录获得的sgRNA(SEQ ID NO.1～9)与公司合成的sgRNA(3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的SEQ ID NO.12～20)的编辑效率。
利用lonza的CM158电转程序对相应的RNP电转，其中，sgRNA与编辑蛋白的质量比为1:4。电转完培养9天进行编辑效率分析。图1显示不同sgRNA对应的编辑效率。相比体外转录的SEQ ID NO.1～9所示的sgRNA，采用合成方法合成的3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的SEQ ID NO.12～20所示的sgRNA的编辑效率均显著提高，其中至少一方面原因是由于采用合成方法合成的sgRNA进行了修饰，其能够延长sgRNA在细胞内的存在时间。
通过对9组sgRNA(TIGIT-1～9)分析，发现不同sgRNA的编辑效率也存在较大差异，其中，3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的SEQ ID NO.12所示的TIGIT-1位点的编辑效率最高，编辑效率达到了78％。3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的SEQ ID NO.19～20所示的TIGIT-8和TIGIT-9作用于起始密码子的sgRNA，也可以实现较为高效的敲除TIGIT。
实施例4：RNP比例的优化
根据实施例2和3对电转程序及sgRNA优化的结果，选定Lonza电转仪CM158程序为优选电转程序，所用的高效sgRNA为3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的SEQID NO.12所示的TIGIT-1。在此基础上进一步对sgRNA与碱基编辑蛋白的比例进行优化，以进一步提高碱基编辑效率。
1)收集实施例1步骤1经体外扩增的原代NK细胞，室温250×g离心5min。
2)弃上清，采用1×PBS缓冲液重悬细胞，室温250×g离心5min。
3)弃上清，采用电转仪配套电转缓冲液重悬NK细胞。
4)RNP混合，根据比例将实施例1步骤2制备的sgRNA和实施例1步骤3制备的CBE蛋白以1:2、1:4、1:6、1:8的质量比混匀。
5)将RNP混合液加入准备好的NK细胞悬液中，于电转仪进行电转。
6)采用Lonza电转仪进行电穿孔转染，电转程序设置为CM158。
7)电转后用枪头吸出液体放入提前预热的培养基中培养，培养9天后进行流式检测。由图2所示，当sgRNA与蛋白质量比为1:6时，编辑效率达到了最高的92.7％。
实施例5：碱基编辑NK细胞抗肿瘤活性评价
1.生物发光法检测NK细胞体外杀伤活性
1)收集肿瘤细胞和NK细胞进行计数，向96孔板中加入肿瘤细胞，10000个/孔，终体积50μL。
2)收集野生型NK细胞(NK-WT)、Cas9基因编辑的NK细胞(NK-Cas9)(构建步骤详见专利文献CN 202011056575.7，利用Cas9+sgRNA-2编辑获得的NK细胞，其中sgRNA-2的序列对应CN 202011056575.7的SEQ NO ID.2)和实施例4中sgRNA与蛋白质量比为1:6时获得的经CBE碱基编辑的NK细胞(NK-CBE)，计数后分别按NK细胞：肿瘤细胞＝1:1的个数比例，向96孔板中加入50μLNK细胞。
3)每组做三个重复孔，另设立肿瘤细胞单独培养以及NK细胞单独培养的对照孔。
4)培养24h后，每孔加入100μL 生物发光检测试剂(购自Promega公司)。
5)室温震荡1min后，静置10min，随后与酶标仪检测生物发光强度。
6)按以下公式计算NK细胞杀伤活力：
MeanMix：NK细胞与肿瘤细胞共培养组的平均发光强度；
MeanNK：NK细胞单独培养组的平均发光强度；
MeanTumor：肿瘤细胞单独培养组的平均发光强度。
如图3和表4所示，野生型、Cas9基因编辑和CBE碱基编辑的NK细胞与肿瘤细胞共培养24小时后，通过生物发光法检测NK细胞对靶细胞的杀伤百分比，结果显示Cas9基因编辑和CBE碱基编辑的NK细胞相对于野生型NK细胞均具有更强的抗肿瘤活性。
表4野生型、Cas9基因编辑和CBE碱基编辑NK细胞抗肿瘤活性的比较
E:T是指效应细胞(effector)与靶细胞(target)的数量比值，此处效应细胞即为NK细胞。
2.基因编辑NK细胞抗肿瘤活性的体内检测
1)选取T、B和NK细胞均缺失的重症联合免疫缺陷(SCID-bg)小鼠作为荷瘤小鼠，订购小鼠均为雄性，5周龄，小鼠饲养于SPF级动物饲养室，适应性饲养一周后向其背部接种肿瘤细胞。
2)消化并收集H1975肺癌细胞，使用无血清RPMI-1640培养液重悬细胞。
3)将H1975细胞悬液浓度调整至3×107个/mL。
4)取6周龄雄性SCID-Bg小鼠称重，置于呼吸麻醉机进行异氟烷麻醉。
5)使用剃毛器将小鼠背部右侧靠近肩胛骨处毛发剃去，皮下注射上述细胞悬液100μL。
6)接种3天后，小鼠按体重随机分为4组，每组4只，分别接受野生型NK细胞(NK-WT)、Cas9基因编辑的NK细胞(NK-Cas9)和实施例4中sgRNA与蛋白质量比为1:6时经CBE碱基编辑的NK细胞(NK-CBE)过继免疫治疗，空白对照组(Control)仅注射RPMI-1640培养液。NK细胞经尾静脉注射给予，每只小鼠注射1×107个NK细胞，每周注射1次，共治疗3次，从接种肿瘤细胞后的第3天开始第一次NK细胞注射治疗。从接种肿瘤细胞后的第3天开始测量小鼠瘤块大小，每2天测量一次，同时记录小鼠体重。
如图4、图5和表5所示，经基因编辑(NK-Cas9)或CBE碱基编辑(NK-CBE)治疗后，肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长受到明显抑制，经过3次NK细胞过继免疫治疗，基因编辑(NK-Cas9)或CBE碱基编辑(NK-CBE)组肿瘤体积较野生型(NK-WT)治疗组明显缩小，肿瘤重量明显降低，表明碱基编辑的NK细胞和基因编辑的NK细胞在体内均具有更强的抗肿瘤效应。
表5荷瘤小鼠肿瘤体积
实施例6：碱基编辑NK细胞安全性评价
1.利用全基因组测序分析DNA脱靶
利用上述优化的lonza的CM158电转程序，采用3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的SEQ ID NO.12所示的TIGIT-1sgRNA电转NK细胞，其中，sgRNA与编辑蛋白的质量比为1:4，电转完培养14天后收集编辑后的NK细胞，同时收集未编辑的野生型NK细胞。利用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取NK细胞基因组DNA，送北京安诺优达进行全基因组测序，测序深度在25-30x。测序的原始数据通过BWA v0.7.16比对到人的参考基因组上(GRCh38/hg38)。SNP位点通过GATK HaplotypeCaller软件进行分析，根据潜在的脱靶位点计算脱靶效率。
图6显示，通过与参考基因组与野生型NK细胞去除相关的SNP，利用碱基编辑处理后的NK细胞没有发现DNA脱靶。
2.利用转录组分析RNA脱靶
利用上述优化的lonza的CM158电转程序，利用3′端和5′端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的SEQ ID NO.12所示的TIGIT-1sgRNA电转NK细胞，其中，sgRNA与编辑蛋白的质量比为1:4，电转完培养14天后收集编辑后的NK细胞，同时收集未编辑的野生型NK细胞。利用天根RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(DP451)提取编辑NK与未编辑NK细胞总RNA，送北京安诺优化进行RNA测序(Illumina HiSeq X 10)。每个样品的读取深度约为2000万。通过STAR软件(版本2.5.1)将读段映射到人参考基因组(hg38)，使用来自GENCODEv30版的注释。删除重复后，通过GATK HaplotypeCaller(版本4.1.2)识别变体，并用QD(质量按深度)过滤，所有变体均通过bam-readcount进行验证并量化，参数为-q 20-b 30。具体结果如图7所示，利用碱基编辑系统敲除TIGIT基因的NK细胞，在全转录组水平没有检测明显的脱靶。
综上所述可见，本发明所述的碱基编辑NK细胞在体内、体外相比普通NK细胞均具有更强的抗肿瘤活性，且碱基编辑的NK细胞相对于基因编辑的NK细胞具有更好的安全性，因此本发明所述的碱基编辑NK细胞有望开发成为安全有效的抗肿瘤生物制剂，具有明显的应用前景和临床应用价值。
SEQ ID NO.1
SEQ ID NO.2
SEQ ID NO.3
SEQ ID NO.4
SEQ ID NO.5
SEQ ID NO.6
SEQ ID NO.7
SEQ ID NO.8
SEQ ID NO.9
SEQ ID NO.10
SEQ ID NO.11
SEQ ID NO.12
SEQ ID NO.13
SEQ ID NO.14
SEQ ID NO.15
SEQ ID NO.16
SEQ ID NO.17
SEQ ID NO.18
SEQ ID NO.19
SEQ ID NO.20
SEQ ID NO.21
SEQ ID NO.22
SEQ ID NO.23
SEQ ID NO.24
SEQ ID NO.25
SEQ ID NO.26
SEQ ID NO.27
SEQ ID NO.28
SEQ ID NO.29
SEQ ID NO.30
SEQ ID NO.31
SEQ ID NO.32
SEQ ID NO.33
SEQ ID NO.34
SEQ ID NO.35
SEQ ID NO.36
SEQ ID NO.37
SEQ ID NO.38
SEQ ID NO.39
SEQ ID NO.40
SEQ ID NO.41
/>
/>
/>
SEQ ID NO.42
/>
/>
/>
SEQ ID NO.43
SEQ ID NO.44
SEQ ID NO.45
SEQ ID NO.46
SEQ ID NO.47
SEQ ID NO.48
SEQ ID NO.49
SEQ ID NO.50
SEQ ID NO.51
SEQ ID NO.52
SEQ ID NO.53
SEQ ID NO.54
SEQ ID NO.55
SEQ ID NO.56
SEQ ID NO.57
SEQ ID NO.58
/>
SEQ ID NO.59
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海贝斯昂科生物科技有限公司
<120> 一种碱基编辑自然杀伤细胞及其制备方法和应用
<160> 59
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcgcaugcu ucugcccaga gggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 2
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggagcagcag gaccagcuuc uggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 3
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaucgagugg ccccaggucc cggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 4
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agguuccaga uuccauugcu uggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 5
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cugggcccag gggcugaggc aggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 6
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggcaggcuc cccucgccuc aggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 7
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacaagugac ccaggucaac uggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 8
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccaggucaac ugggagcagc aggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 9
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcgcaugcu ucugcccaga gggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 10
<211> 1818
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Val Ser Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly
20 25 30
Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro
35 40 45
Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys
50 55 60
Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu
65 70 75 80
Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys
85 90 95
Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys
100 105 110
Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu
115 120 125
Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp
130 135 140
Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys
145 150 155 160
Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu
165 170 175
Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly
180 185 190
Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu
195 200 205
Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser
210 215 220
Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg
225 230 235 240
Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly
245 250 255
Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe
260 265 270
Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys
275 280 285
Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp
290 295 300
Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile
305 310 315 320
Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro
325 330 335
Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu
340 345 350
Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys
355 360 365
Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp
370 375 380
Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu
385 390 395 400
Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu
405 410 415
Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His
420 425 430
Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp
435 440 445
Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu
450 455 460
Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser
465 470 475 480
Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp
485 490 495
Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile
500 505 510
Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu
515 520 525
Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu
530 535 540
Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu
545 550 555 560
Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn
565 570 575
Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile
580 585 590
Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn
595 600 605
Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys
610 615 620
Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val
625 630 635 640
Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys
690 695 700
Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp
705 710 715 720
Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln
725 730 735
Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala
740 745 750
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770 775 780
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Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu
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1220 1225 1230
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1365 1370 1375
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1620 1625 1630
Gly Lys Gln Leu Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu
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1765 1770 1775
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1780 1785 1790
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<210> 11
<211> 1821
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys
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Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu
65 70 75 80
Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys
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Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys
100 105 110
Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu
115 120 125
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130 135 140
Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys
145 150 155 160
Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu
165 170 175
Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly
180 185 190
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195 200 205
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Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg
225 230 235 240
Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile
305 310 315 320
Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro
325 330 335
Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp
435 440 445
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885 890 895
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930 935 940
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945 950 955 960
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980 985 990
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1265 1270 1275 1280
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Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1300 1305 1310
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1445 1450 1455
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1460 1465 1470
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1475 1480 1485
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile
1490 1495 1500
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1505 1510 1515 1520
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1525 1530 1535
Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile
1540 1545 1550
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1555 1560 1565
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1570 1575 1580
Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile
1585 1590 1595 1600
Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala
1605 1610 1615
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1620 1625 1630
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1635 1640 1645
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1650 1655 1660
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1665 1670 1675 1680
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1685 1690 1695
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1700 1705 1710
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1745 1750 1755 1760
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1765 1770 1775
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1780 1785 1790
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<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcgcaugcu ucugcccaga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 13
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggagcagcag gaccagcuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 14
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaucgagugg ccccaggucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 15
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agguuccaga uuccauugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 16
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cugggcccag gggcugaggc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 17
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aggcaggcuc cccucgccuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 18
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cacaagugac ccaggucaac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 19
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccaggucaac ugggagcagc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 20
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agcgcaugcu ucugcccaga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
taggagcgca tgcttctgcc caga 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
taggggagca gcaggaccag cttc 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tagggatcga gtggccccag gtcc 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
taggaggttc cagattccat tgct 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
taggctgggc ccaggggctg aggc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
taggaggcag gctcccctcg cctc 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
taggcacaag tgacccaggt caac 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
taggccaggt caactgggag cagc 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
taggagcgca tgcttctgcc caga 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaactctggg cagaagcatg cgct 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aaacgaagct ggtcctgctg ctcc 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aaacggacct ggggccactc gatc 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aaacagcaat ggaatctgga acct 24
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aaacgcctca gcccctgggc ccag 24
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aaacgaggcg aggggagcct gcct 24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aaaccacaag tgacccaggt caac 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aaacccaggt caactgggag cagc 24
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aaactctggg cagaagcatg cgct 24
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tctcgcgcgt ttcggtgatg acgg 24
<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt c 31
<210> 41
<211> 5454
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
atgaaaagga cagctgatgg atcagaattt gagtcaccga agaaaaagcg caaggtcagc 60
agcgacaaaa agtactcgat tggcctggcg attggtacga attctgtcgg ttgggcggtc 120
atcacggatg agtacaaggt cccgagcaag aaattcaaag tgctgggtaa tacagatcgt 180
cacagcatca aaaaaaactt aattggtgca ctgctgttcg atagcggtga aaccgcggaa 240
gctacccgcc tgaagcgtac cgcgcgtcgt cgttacaccc gtcgcaagaa ccgcatttgt 300
tatctgcaag aaatattcag caacgaaatg gcaaaggttg acgacagctt ttttcatcgt 360
ctggaggagt ccttccttgt ggaagaggac aaaaagcacg aacgtcatcc gatctttggt 420
aacattgtcg acgaagtggc atatcacgaa aagtacccga ccatctatca tctgagaaag 480
aagttggttg acagcacgga taaggcagat ctgcgtctga tttacttggc tctggcgcac 540
atgattaagt ttcgtggtca ttttctgatc gagggtgatc tgaatccgga taacagtgac 600
gttgacaagc ttttcattca gcttgtgcag acctacaacc agttgttcga ggaaaacccg 660
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cgtttggaga acctgatcgc tcagttgcca ggtgagaaga agaatggctt gttcggcaac 780
ctcatcgcgc tgtcactggg tctgacgccg aatttcaaat caaacttcga tttagcggag 840
gatgcgaaac tgcagctgtc caaagatacc tatgatgatg accttgataa tctcctggcc 900
caaattggcg accagtatgc agatttgttc cttgccgcca agaacctctc tgacgcgatc 960
ctgctgtctg atatcctgcg cgtgaatacc gaaataacca aagcccctct ctctgcgagc 1020
atgattaaac gttacgacga gcatcaccaa gatctgacac tgctcaaggc cttggtgcgt 1080
cagcagctac cggagaagta taaagagatc tttttcgacc aaagcaagaa cggctacgcg 1140
ggttatatcg atggcggcgc atctcaagaa gagttttata agttcatcaa gccgatcctc 1200
gagaaaatgg acggcaccga ggaactactg gtcaaactga accgagagga tttattacgt 1260
aagcaacgta cctttgataa cggctcgatt ccgcatcaga ttcacctggg cgagctgcac 1320
gccattttgc gccgtcagga ggatttctat ccgtttctta aagacaaccg tgaaaaaatc 1380
gaaaaaatct tgacttttcg tatcccttat tacgtgggtc cgctggcccg tggcaatagc 1440
cgcttcgcgt ggatgacccg taaatccgaa gaaaccatca ccccgtggaa ctttgaagaa 1500
gtggttgaca aaggagcgtc agcgcaatcc tttatcgagc gtatgaccaa cttcgataag 1560
aacctgccta atgaaaaggt gctcccgaag cacagcttat tgtacgaata ctttaccgtt 1620
tataatgaac tgacgaaagt gaaatacgtt accgagggta tgcgtaagcc ggctttttta 1680
tccggcgagc agaagaaggc gattgttgac ttgctgttta aaaccaaccg taaagtgacc 1740
gtgaaacaat taaaggagga ctatttcaaa aaaattgagt gctttgactc tgttgagatc 1800
tccggggtgg aagatcgctt taacgcgagc cttggcacct atcatgatct gctgaaaatc 1860
atcaaggaca aagatttttt ggataacgag gagaatgaag acattctgga ggacattgta 1920
ctgaccctga cgctgttcga agatcgtgaa atgatagaag agcgtctcaa aacctatgca 1980
catctgtttg acgacaaggt tatgaaacag ttgaagcgtc ggcgctacac cggctggggt 2040
cgcctgtctc gtaaattgat caatggcatt cgcgacaagc agagcggcaa gacgatcctg 2100
gacttcctga aatccgacgg tttcgcgaat cgtaatttta tgcagttgat ccacgacgac 2160
agcctgacct ttaaagaaga tatccaaaaa gctcaggtta gcggccaggg tgactctctt 2220
cacgagcaca ttgcaaatct ggccggcagc ccggcaatta aaaaaggtat cttgcaaacc 2280
gttaaagtgg tagacgagct ggtgaaggtg atgggtaggc acaagccgga aaacatcgtg 2340
atcgaaatgg ctcgtgaaaa tcaaaccacc cagaaaggcc agaagaactc tcgtgagcgc 2400
atgaaacgta ttgaagaagg tatcaaggag ttgggcagcc aaattttgaa ggagcacccg 2460
gttgaaaaca cccagctgca aaacgagaaa ctgtacttgt actatctgca aaacggtaga 2520
gatatgtatg ttgatcaaga gctcgacatc aaccgtttga gtgactatga cgttgaccac 2580
atcgttccgc aatcgttcct gaaagacgac tccatcgata acaaagtctt aacccgtagc 2640
gataaaaacc gcggcaagag cgataacgtg ccgtccgaag aagtcgtcaa gaaaatgaag 2700
aactattggc gtcagctgct gaatgcgaag ctgataaccc agcgaaagtt cgacaatctg 2760
accaaggcgg agcgtggcgg cctgtcggaa ttggacaaag cgggcttcat caaacgccaa 2820
ctggtcgaaa cccgtcagat caccaaacac gttgcccaga tcctggattc ccgtatgaat 2880
accaagtacg atgagaatga taagctcatt cgtgaagtta aagtgattac gctgaaatct 2940
aaactggtga gcgacttccg taaggatttt cagttctata aagttcgcga gatcaacaat 3000
tatcaccatg cccacgatgc ctacttgaac gcggtggtag gtacggccct gatcaagaag 3060
tacccgaagc ttgagtcgga gttcgtgtac ggcgattaca aagtttatga cgttcgcaaa 3120
atgattgcta agagcgagca agaaatcggc aaggcgaccg cgaagtattt tttctactct 3180
aacatcatga actttttcaa gtctggctcg gaaactccgg gtaccagtga gtcggcgact 3240
cccgaatcgg ggtctatgga agcaagtccg gcttcaggac cgcgtcacct gatggacccg 3300
catatcttca cctctaactt caataacggt atcggccgtc acaagaccta cctgtgctac 3360
gaggtcgaac gtctggataa cggaaccagc gtaaagatgg accagcaccg cggcttcctg 3420
cataatcagg cgaagaacct gctgtgtggt ttctacggtc gtcacgcaga attgcgtttt 3480
ctggaccttg taccgagcct ccaattggac ccggcgcaaa tctatcgtgt gacctggttc 3540
ataagctgga gcccttgttt tagctggggc tgcgcaggcg aagttcgcgc atttctgcag 3600
gagaacacgc atgttcgtct gagaatcttc gccgcgcgta tctttgacta tgacccgctg 3660
tacaaagagg ctcttcagat gctgcgtgat gcgggcgcgc aagtgagcat catgacatac 3720
gacgaattca agcactgctg ggacaccttc gtggatcatc aaggttgccc gtttcagccg 3780
tgggacggtc tggacgaaca tagccaggcg ttgagcggac gtctccgtgc tattctgcaa 3840
aaccagggta atagcggctc cgaatcgggt agcggtagtg aaactccggg tacatcggag 3900
agcgcaaccc cggaatctga aacgaacggt gaaacaggtg agatcgtttg ggataagggc 3960
agagattttg ctaccgttcg taaagtctta agcatgccgc aggttaatat tgtgaaaaaa 4020
accgaggtgc agaccggcgg ttttagcaaa gagagcattc tgccaaagcg taatagcgac 4080
aaactgattg cacgtaagaa ggactgggac ccgaagaaat acggcggttt tgattcacca 4140
accgttgcgt acagcgtatt ggtggttgct aaagtggaga agggcaagag caagaaattg 4200
aaaagcgtta aagagctgct gggcatcacg attatggaaa gaagcagctt cgagaagaat 4260
ccgatcgact tcctggaggc caaaggttat aaagaggtaa aaaaggattt gatcattaag 4320
ttgccaaaat attctctatt cgaattggaa aacggtcgca aacgcatgct ggcgtctgcg 4380
ggcgaactgc aaaaaggtaa cgagctggcg ctgccaagca agtacgtcaa ctttttgtac 4440
ttggcgagtc attatgaaaa gctgaaaggt agcccggagg acaacgagca aaaacaactg 4500
ttcgttgaac agcataaaca ctatctggac gaaatcattg agcagatcag cgagtttagc 4560
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cgtgataaac cgattcgtga acaagcagag aacatcatcc atttgttcac cctaacgaac 4680
ctgggtgcgc cggcggcatt taaatacttc gatacgacca ttgatcggaa gcgttacact 4740
agcaccaagg aagttctgga cgctaccctc atccaccaga gcatcacggg cctgtacgag 4800
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tccattctga tgctgccgga agaagtggaa gaggttattg gcaacaagcc ggaaagcgat 4980
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tgggcactgg ttattcaaga cagtaacggc gaaaataaga ttaagatgct gtctggtggt 5400
tccaaaagga cagccgatgg ctccgaattc gaaccaaaaa aaaagagaaa ggtt 5454
<210> 42
<211> 5463
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
atgaaaagga cagctgatgg atcagaattt gaaagcccga aaaagaagcg caaagtgagc 60
tcggacaaga aatacagcat cgggctggcg attggtacca acagcgtggg ttgggcagtt 120
attaccgatg aatacaaagt gccgagcaaa aagttcaaag ttttgggcaa taccgatcgg 180
cacagcatta agaagaacct gattggcgct ttactcttcg attccggtga gacggccgag 240
gctacccgtc tcaagcgtac cgctcgtcgt cgctataccc gtcgtaagaa ccgtatttgt 300
tatttgcagg agatctttag caatgaaatg gcgaaggtgg acgactcctt ctttcaccgc 360
ctggaagagt ccttccttgt cgaggaagat aaaaagcacg aacgtcaccc gatctttggt 420
aacattgtcg acgaagtggc ctatcatgag aaatacccga ccatttatca tctgcgtaag 480
aagctagtgg acagcaccga taaagcagat ctgcgtttga tctatcttgc gctggcacac 540
atgattaagt ttcgtggtca ttttctgatt gagggcgacc tgaatcctga taatagcgac 600
gttgacaaac tcttcatcca gctggttcag acgtataacc agttgttcga ggaaaacccg 660
attaacgcga gcggtgttga tgcgaaagcg attctgagtg cccgtctgag caaaagccga 720
cgcctggaga acctgatcgc gcaactgccg ggtgaaaaga agaacggtct gttcggcaat 780
ctgatcgcgc tgtctctggg tctgacgccg aacttcaagt ctaacttcga tctcgcggaa 840
gacgccaaat tacagctgtc caaggacacc tacgacgatg atctggacaa cctgttggcg 900
cagattggcg accaatatgc tgacctgttt ctggctgcga aaaacctgtc cgacgccatc 960
ttgctgagcg acattttgag agtgaacacc gagatcacca aagcgcctct gtctgcaagc 1020
atgatcaagc gttatgatga gcatcaccaa gatttgactt tgctcaaggc tttggttcgt 1080
cagcagttgc cggagaaata taaggaaatc tttttcgatc aaagtaaaaa tggttatgca 1140
ggctacattg atggtggtgc gagccaagaa gaattttaca agtttatcaa accgattctg 1200
gagaagatgg acggtactga agagctgctg gttaaattga accgagaaga tctactacgt 1260
aagcaacgta cgttcgacaa cggctccatc ccgcatcaga tccacctggg tgagctgcac 1320
gctatcctgc gtcggcaaga ggatttttac ccgtttctga aggataatcg tgaaaagatt 1380
gaaaagattt tgacgtttcg tattccgtat tacgtgggtc cgctggcgcg gggcaactcg 1440
cgtttcgcct ggatgaccag aaagtctgaa gaaacgatca caccgtggaa cttcgaggaa 1500
gtagtggata aaggtgccag cgcccaaagc tttatcgagc gtatgaccaa cttcgacaag 1560
aacctgccaa atgaaaaagt gttgccaaaa catagcctgt tatatgaata cttcaccgtt 1620
tataacgagt taaccaaagt caagtacgtg accgagggta tgcggaagcc agcgtttcta 1680
tcaggagagc aaaagaaggc gattgtcgac ctgttattca aaaccaaccg caaagtcacc 1740
gttaagcaac ttaaagaaga ttacttcaag aagatcgaat gttttgacag cgtcgagatc 1800
agcggtgttg aagaccgctt taatgccagc ctgggtacct atcatgactt gttgaaaatc 1860
attaaggata aggactttct ggataatgag gagaacgagg atatcctgga ggacatcgtt 1920
ttgaccttaa ctctgttcga ggaccgtgaa atgatcgagg aacgactgaa gacgtacgcg 1980
catctgttcg acgacaaagt tatgaaacaa cttaagcgtc gccgttacac cggttggggt 2040
cgcttgtctc gcaaactgat aaacggcatc cgtgacaaac agtccggaaa aacgatccta 2100
gatttcctga agagcgacgg cttcgcgaat cgtaacttta tgcagttgat ccacgacgac 2160
tcgttgacct ttaaagaaga tatccagaag gcacaggtta gcggacaggg tgattcgctg 2220
cacgagcaca ttgcgaactt ggctggttcg ccggcgatca agaagggtat tttacaaacc 2280
gtgaaagtgg tggatgagtt ggtcaaagtg atgggtcgtc acaaaccgga aaacattgtc 2340
atcgaaatgg cgcgcgaaaa ccaaacgacc cagaagggtc aaaaaaactc tcgtgagcgc 2400
atgaaacgta tcgaagaggg cattaaagaa ttaggctctc agattctgaa agagcacccg 2460
gtggaaaaca cccagttaca gaatgagaaa ctttacctgt actatctgca gaatggtcgt 2520
gatatgtatg ttgatcagga actggacatt aaccgtctgt ccgattacga cgtggaccat 2580
attgttccgc aaagctttct gaaggacgat tcaatcgaca acaaagtcct gacacgtagc 2640
gacaagaatc gtggtaagag cgataatgtt ccgagcgagg aagtggttaa aaagatgaaa 2700
aactactggc gtcaactgtt gaatgcaaaa ctgatcaccc agaggaaatt cgacaacctg 2760
acgaaggcgg aacgtggtgg cttgtcagag ttggataagg ctggcttcat caagcgccaa 2820
ttggtcgaga ctcgtcaaat taccaaacat gttgcccaaa ttctggactc ccgtatgaac 2880
acgaaatacg acgagaacga taagctcatc cgtgaggtta aagtcattac gctgaaaagt 2940
aagctggtta gtgacttccg caaggacttc cagttttaca aagttaggga gatcaacaac 3000
tatcatcacg cacacgatgc gtatcttaat gccgttgttg gcaccgcact gattaaaaaa 3060
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aatatcatga attttttcaa gtccgggggt agcagtggtg gcagctccgg ttctgagacc 3240
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gagggttgga atagacctat cggccgtcat gaccctacgg cgcacgctga gattatggcc 3480
ctgcgtcagg gtggcctggt gatgcagaac taccgcctga tcgatgcgac actctacgtt 3540
accttggaac cgtgcgtcat gtgtgccggt gcaatgattc acagccgtat cggtcgtgtt 3600
gtatttggcg cgcgtgatgc gaagaccggt gccgcaggca gcctgatgga tgttctgcat 3660
catcccggta tgaatcaccg tgtggaaatc actgagggta tcctcgcgga tgagtgcgct 3720
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cagagctcga ccgactccgg cggatccagc ggtggttctt cgggctccga gaccccgggc 3840
accagcgagt ccgcaacccc ggaatcttcc ggaggctcga gcggtggcag cagcgaagtg 3900
gaatttagcc acgagtactg gatgagacac gccttgaccc tagcaaagcg cgcacgagat 3960
gagagagaag ttccggttgg agccgtgctt gttctgaaca accgcgtaat tggtgagggt 4020
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caaggcggtc tggtgatgca aaactatcgt ctgattgacg cgaccctgta tgtgaccttt 4140
gagccgtgcg ttatgtgcgc tggcgcgatg atccactctc gtattggtcg cgtagtgttc 4200
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ggcatgaatc atcgtgtcga aatcaccgaa ggcattctgg ccgacgagtg cgcagcgctg 4320
ctgtgctatt tcttccgtat gccgcgtcaa gtgttcaacg cacagaaaaa agcgcagagc 4380
tccaccgata gcggtggttc tagcggtggt tcctcgggct ccgaaacccc gggtacaagc 4440
gagagcgcga ccccggagag ctctggtggc agttccggtg gatcagagac gaatggagag 4500
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atggaacgtt cctcttttga aaaaaacccg attgacttcc tggaagcaaa aggctacaaa 4860
gaagtcaaaa aagacctgat tatcaagctg ccgaagtaca gcctcttcga actggagaac 4920
ggccggaagc gtatgctggc gtctgcgggt gaactgcaaa aaggtaatga actcgcgctg 4980
ccgtcaaaat acgttaattt cctgtatctt gcctcccatt acgaaaaact gaaaggcagc 5040
ccggaagata atgagcaaaa acagctgttc gtggagcagc ataaacacta tttggacgaa 5100
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accaccatag atcgtaaacg ctacacctcc actaaagaag ttttggacgc gactctcatc 5340
caccagagca tcacgggctt gtacgaaact cgtattgacc tgtcccagct cggcggtgat 5400
agcggcggat caaaacgtac cgctgatggc tctgagttcg aaccaaaaaa aaagcgcaag 5460
gtt 5463
<210> 43
<211> 1037
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys
1 5 10 15
Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser
20 25 30
Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr
35 40 45
Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg
50 55 60
Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met
65 70 75 80
Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu
85 90 95
Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile
100 105 110
Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu
115 120 125
Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile
130 135 140
Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile
145 150 155 160
Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile
165 170 175
Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn
180 185 190
Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys
195 200 205
Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys
210 215 220
Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro
225 230 235 240
Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu
245 250 255
Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile
260 265 270
Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp
275 280 285
Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys
290 295 300
Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln
305 310 315 320
Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys
325 330 335
Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr
340 345 350
Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro
355 360 365
Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn
370 375 380
Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile
385 390 395 400
Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln
405 410 415
Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys
420 425 430
Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly
435 440 445
Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr
450 455 460
Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser
465 470 475 480
Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys
485 490 495
Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn
500 505 510
Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala
515 520 525
Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys
530 535 540
Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys
545 550 555 560
Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg
565 570 575
Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys
580 585 590
Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp
595 600 605
Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu
610 615 620
Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln
625 630 635 640
Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu
645 650 655
Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe
660 665 670
Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His
675 680 685
Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser
690 695 700
Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser
705 710 715 720
Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu
725 730 735
Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu
740 745 750
Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg
755 760 765
Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln
770 775 780
Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys
785 790 795 800
Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln
805 810 815
Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val
820 825 830
Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr
835 840 845
Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu
850 855 860
Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys
865 870 875 880
Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly
885 890 895
Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val
900 905 910
Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg
915 920 925
Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys
930 935 940
Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe
945 950 955 960
Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp
965 970 975
Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro
980 985 990
Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val
995 1000 1005
Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala
1010 1015 1020
Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys
1025 1030 1035
<210> 44
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp
1 5 10 15
Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val
20 25 30
Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu
35 40 45
Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp
50 55 60
Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
65 70 75 80
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser
85 90 95
Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu
100 105 110
Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys
115 120 125
Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu
130 135 140
Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly
145 150 155 160
Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala
165 170 175
Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys
180 185 190
Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu
195 200 205
Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu
210 215 220
Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg
225 230 235 240
Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly
245 250 255
Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg
260 265 270
Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser
275 280 285
Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly
290 295 300
Asp
305
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Met Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Val
<210> 47
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val
1 5 10 15
Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile
20 25 30
Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu
35 40 45
Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr
50 55 60
Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Lys Met Leu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Leu
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val Ile Gln Glu
100 105 110
Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile Gly Asn Lys
115 120 125
Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu Ser Thr Asp
130 135 140
Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Trp
145 150 155 160
Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile Lys Met Leu
165 170 175
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His
1 5 10 15
Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr
20 25 30
Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met
35 40 45
Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys
50 55 60
Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro
65 70 75 80
Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile
85 90 95
Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala
100 105 110
Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg
115 120 125
Ile Phe Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg
130 135 140
Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His
145 150 155 160
Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp
165 170 175
Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala
180 185 190
Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn
195
<210> 50
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile
35 40 45
Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly
165 170 175
Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly
180 185 190
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp
195 200 205
Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu
210 215 220
Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu
225 230 235 240
Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu
245 250 255
Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu
260 265 270
Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala
275 280 285
Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr
305 310 315 320
Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp
325 330 335
Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val
340 345 350
Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp
355 360
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
agcgcatgct tctgcccaga ggg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ggagcagcag gaccagcttc tgg 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gatcgagtgg ccccaggtcc cgg 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aggttccaga ttccattgct tgg 23
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ctgggcccag gggctgaggc agg 23
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
aggcaggctc ccctcgcctc agg 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cacaagtgac ccaggtcaac tgg 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ccaggtcaac tgggagcagc agg 23
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
agcgcatgct tctgcccaga ggg 23

Claims (23)

1.一种编辑编码TIGIT蛋白的多核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括使编码TIGIT的多核苷酸与碱基编辑系统接触，以对所述多核苷酸的靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基；所述碱基编辑系统包括：
(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸，所述融合蛋白自N端至C端依次包括第一nCas9片段、脱氨酶片段、第二nCas9片段；所述第一nCas9片段的氨基酸序列如SEQ IDNO.43所示；所述第二nCas9片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示；
(b)引导核苷酸序列或其编码多核苷酸，其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述多核苷酸中的靶C碱基和/或靶A碱基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)所述碱基编辑系统包含一个或多个载体；所述一个或多个载体包含(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸；以及(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸；
所述(i)和(ii)位于相同或不同载体上。
2)所述碱基编辑系统包含(i)融合蛋白或其变体，以及(ii)包含所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸的载体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)所述脱氨基导致所述编码TIGIT蛋白的多核苷酸中C至T转化或A至G转化；
2)所述融合蛋白的变体是指与所述融合蛋白的氨基酸序列具有90％以上序列同一性，且具有所述融合蛋白相同或相似功能的蛋白；
3)所述脱氨酶选自胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶；
优选地，所述胞嘧啶脱氨酶选自下组：APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、激活诱导的脱氨酶(AID)和pmCDA1；和/或，所述腺嘌呤脱氨酶为wtTadA–TadA*；
4)所述引导核苷酸序列如SEQ ID NO.1-9、12-20至少任一所示；优选地，在所述引导核苷酸序列的3'端和5'端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰；
5)所述引导核苷酸序列与融合蛋白的质量比为1:(2～20)；优选地，为1:(2～8)；
6)所述编码TIGIT蛋白的多核苷酸与(a)、(b)分别接触，或与(a)和(b)形成的RNP复合物接触。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)当所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶时，所述碱基编辑系统为胞嘧啶碱基编辑系统，所述引导核苷酸序列如SEQ ID NO.1-8、12-19至少任一所示；优选地，所述胞嘧啶脱氨酶为APOBEC3A；
2)当所述脱氨酶为腺嘌呤脱氨酶时，所述碱基编辑系统为腺嘌呤碱基编辑系统，所述引导核苷酸序列如SEQ ID NO.9或20所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)所述第一nCas9片段与所述脱氨酶通过链接肽链接；优选地，所述链接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示；
2)所述第二nCas9片段与所述脱氨酶通过链接肽链接；优选地，所述链接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示；
3)所述融合蛋白的两端还包含核定位信号；优选地，所述核定位信号的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示；
4)当所述核酸酶为胞嘧啶核酸酶时，所述融合蛋白还包含两个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)片段；优选地，所述两个UGI片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示；进一步优选地，所述两个UGI片段通过GS肽段与所述第二nCas9片段的C端融合，所述两个GS肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)所述融合蛋白结构为NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[链接肽]-[胞嘧啶脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[UGI肽段]-[UGI肽段]-[核定位信号]-COOH；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；
2)所述融合蛋白结构为NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[链接肽]-[腺嘌呤脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[核定位信号]-COOH；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；
3)当所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示时，所述引导核苷酸序列如SEQID NO.1-8、12-19至少任一所示；
4)当所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示时，所述引导核苷酸序列如SEQID NO.9或20所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)如SEQ ID No.10所示的融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
2)如SEQ ID No.11所示的融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)所述编码TIGIT蛋白的多核苷酸包含编码链和互补链；
2)所述编码TIGIT蛋白的多核苷酸包含编码区和非编码区；
3)所述C至T转化和/或A至G转化发生在所述编码TIGIT的多核苷酸的编码序列中；
4)所述C至T转化和/或A至G转化导致所述TIGIT蛋白中的突变；所述TIGIT蛋白中的突变是功能丧失突变或非编码突变；优选地，所述功能丧失突变在所述TIGIT编码序列中引入提前终止密码子，其导致截短的或非功能性的TIGIT蛋白，或所述非编码突变是通过使所述TIGIT编码序列的起始密码子突变，其导致消除TIGIT表达；
5)将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变引入到所述编码TIGIT的多核苷酸中。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)所述提前终止密码子是TAA，TAG，TGA或者TGA；
2)所述起始密码子为ATG。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CAA至TAA转化生成；
2)所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CAG至TAG转化生成；
3)所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CGA至TGA转化生成；
4)所述提前终止密码子经由所述互补链上的第三个C的脱氨基从TGG至TGA转化生成；
5)所述起始密码子突变经由所述互补链上的第三个C的脱氨基从ATG至ATA转化生成；
6)所述起始密码子突变经由所述互补链上的第二个A的脱氨基从ATG至ACG转化生成；
7)所述起始密码子突变经由所述编码链上的第一个A的脱氨基从ATG至GTG转化生成。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)所述方法在体外实施；优选地，所述方法在培养的细胞中实施；进一步优选地，所述细胞为自然杀伤细胞即NK细胞；进一步优选地，所述NK细胞选自来自外周血细胞优选PBMC的原代NK细胞、脐带血来源NK细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或诱导多能干细胞诱导的NK细胞；
2)所述方法在体内实施；优选地，所述方法在哺乳动物中实施；进一步优选地，所述哺乳动物是啮齿动物；更进一步优选地，所述哺乳动物是人；更进一步优选地，所述方法靶向哺乳动物的NK细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，通过电穿孔、病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化中的一种或多种方法将所述碱基编辑系统转入所述细胞中；优选地，所述转染方法选自电穿孔方法；进一步优选地，所述电穿孔方法选择的程序为LONZA电转仪的CM158或者Maxcyte的NK5程序。
13.一种碱基编辑系统，其特征在于，其为权利要求1～12任一项所述方法中所述的任一碱基编辑系统。
14.一种NK细胞，其特征在于，其包含碱基突变的TIGIT基因。
15.如权利要求14所述的NK细胞，其特征在于，所述碱基突变是指C至T的转化、或A至G的转化；所述C至T的转化生成提前终止密码子或使得起始密码子突变，所述A至G的转化使得起始密码子突变。
16.根据权利要求15所述的NK细胞，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)所述C至T的转化发生CDS区中的CAA、CAG、CGA、TGG；优选地，所述提前终止密码子为TAA，TAG，TGA或者TGA；
2)所述C至T的转化发生起始密码子ATG，所述起始密码子突变为ATA；
3)所述A至G的转化发生起始密码子ATG，所述起始密码子突变为ACG或GTG。
17.根据权利要求14～16任一项所述的NK细胞，其特征在于，其根据权利要求11或12所述的方法制备得到。
18.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求13所述的碱基编辑系统或如权利要求14～17任一项所述的NK细胞；优选地，其进一步包含药学上可接受的载体。
19.一种试剂盒，其包含权利要求18所述的组合物。
20.根据权利要求13所述的碱基编辑系统或权利要求14～17任一项所述的NK细胞或权利要求18所述的组合物的用途，所述用途选自以下至少任一项：
1)制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物；
2)制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物；
3)制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；
4)制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。
21.一种预防和/或病症的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求13所述的碱基编辑系统或权利要求14～17任一项所述的NK细胞或权利要求18所述的组合物；所述病症选自以下至少任一项：自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病。
22.根据权利要求20所述的应用或如权利要求21所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：
1)所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎中的一种或多种；
2)所述肿瘤选自淋巴瘤、血液瘤或实体瘤；优选地，选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤肿瘤细胞中的一种或多种；
3)所述病毒选自流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、或埃可病毒中的一种或几种；
4)所述细菌选自大肠杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌以及短双歧杆菌中的一种或几种。
23.根据权利要求20所述的应用或如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的碱基编辑系统或如上所述的NK细胞或如上所述的组合物与其他药物联用。
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