CN113557242A - 用于治疗癌症的修饰的il-12 t细胞疗法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供包含肿瘤靶向性和膜锚定性IL‑12的嵌合抗原受体(CAR)样构建体。本申请还提供表达所述CAR样IL‑12构建体的T细胞。此外，本申请还提供治疗癌症的方法，所述方法包括施用表达CAR样IL‑12构建体的T细胞。

Description

用于治疗癌症的修饰的IL-12 T细胞疗法
本申请要求于2019年2月1日提交的美国临时专利申请号62/800,136的利益，该专利申请通过引用完全结合在本文中。
背景
1.技术领域
本发明整体上涉及免疫学和医学领域。更具体地，本发明涉及修饰的IL-12 T细胞疗法及其用于治疗癌症的用途。
2.相关技术描述
自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)输注已成为治疗难治性黑色素瘤患者的重大突破且其引起的反应率高于BRAF靶向疗法或CTLA-4阻断疗法。大部分患者应该经历对TIL转移的反应，这是因为可以自其肿瘤分离TIL。然而，在实践中，反应率仅为约50％，包括10％-15％的完全反应率(Besser等人,2010；Radvanyi等人,2012；Dudley等人,2005)。
TIL疗法中的主要挑战在于TIL在再输注后的肿瘤归巢能力降低以及肿瘤微环境的变化。在最近的临床试验中，输注1.5-2x1011个TIL以确保足够的肿瘤靶向性TIL和成功的肿瘤缓解(Radvanyi等人,2012；Dudley等人,2005)。然而，将如此大量的TIL转移至癌症患者可能引起脱靶不良作用。需要容许将TIL更有效地递送至肿瘤部位且由此需要数量少得多的输注T细胞的方式。
TIL不能到达肿瘤部位的一个原因在于在离体培养期间损失肿瘤归巢特性；因此，新疗法使用已经用识别肿瘤抗原(例如CD19)的受体改造的T细胞，其被称为嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法。CAR-T细胞疗法更特异性地靶向肿瘤细胞且在治疗血液学恶性肿瘤方面已取得重大成功，其中CAR-T细胞靶向血液和骨髓中的肿瘤细胞。然而，CAR-T细胞疗法在实体肿瘤中的功效有限。实体肿瘤细胞因其异质性而缺乏常见抗原。另外，宿主调理作用(host conditioning)通常避免T细胞进入肿瘤间质中。
在使用T细胞疗法(包括CAR-T、TIL和TCR-T(CTL)细胞)治疗实体肿瘤中存在多个挑战，包含逃避抗原或靶特异性T细胞攻击的肿瘤异质性、T细胞渗透至实体肿瘤中、免疫抑制环境使浸润T细胞失活、以及效应T细胞耗竭。因此，对于能够深入渗透到实体肿瘤中的T细胞疗法存在尚未满足的需求。
发明内容
在第一实施方案中，本发明提供编码肿瘤靶向性和膜锚定性白介素12(IL-12)的构建体。IL-12可以包含IL-12α亚基p35和IL-12β亚基p40。
在一些方面中，p35亚基融合至跨膜结构域(TM)(例如EGFR跨膜结构域)。在某些方面中，p35/TM亚基进一步融合至信号传导结构域(SD)。例如，信号传导结构域是CD3ζ、CD28和/或4-1BB信号传导结构域。在特定方面中，信号传导结构域包含CD3ζ和4-1BB信号传导域。在一些方面中，信号传导结构域是4-1BB。
在某些方面中，p40亚基融合至肿瘤靶向性部分。例如，肿瘤靶向性部分是肽、抗体或其片段。在一些方面中，抗体或其片段是选自由以下组成的组：F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv。在特定方面中，抗体或其片段是scFv。在一些方面中，肿瘤靶向性部分是肽。在具体方面中，肿瘤靶向性部分特异性结合细胞表面波形蛋白(CSV)，例如CSV肽。在其他方面中，p40亚基融合至跨膜结构域和/或信号传导结构域且p35亚基融合至肿瘤靶向性部分。包含p35融合亚基(p35/TM/SD)和p40融合体(p40-肿瘤靶向性部分)的异源二聚体在本文中称为嵌合抗原受体(CAR)样IL12(CARL-IL12)。
在一些方面中，构建体是病毒载体。例如，病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。
在另一个实施方案中，提供经改造以表达实施方案的构建体(例如表达肿瘤靶向性和膜锚定性IL-12或CARL-IL12的构建体)的宿主细胞。在一些方面中，宿主细胞是免疫细胞。例如，免疫细胞是肿瘤归巢细胞。在某些方面中，免疫细胞是T细胞。在一些方面中，T细胞是外周血T细胞。在一些方面中，T细胞是CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。在某些方面中，T细胞是自体或同种异体的。在其他方面中，免疫细胞是NK细胞。
本申请进一步提供包含实施方案的IL-12免疫细胞(例如经改造以表达肿瘤靶向性和膜锚定性IL-12或CARL-IL12的免疫细胞)和药物载剂的药物组合物。另一实施方案提供包含有效量的实施方案的IL-12免疫细胞(例如经改造以表达表达膜锚定性IL-12的构建体的免疫细胞)的组合物，其用于治疗受试者中的癌症。
在又一实施方案中，提供治疗受试者中的癌症的方法，其包括给受试者施用有效量的实施方案的IL-12免疫细胞(例如经改造以表达肿瘤靶向性和膜锚定性IL-12或CARL-IL12基因的免疫细胞)。在特定方面中，CARL-IL12锚定至所述免疫细胞的膜。
在一些方面中，所述癌症是胶质母细胞瘤、宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、食道癌、黑色素瘤癌、头颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、肉瘤癌、乳腺癌、肝癌、肾癌或急性骨髓性白血病。
在另外的方面中，所述方法还包括给所述受试者施用至少第二抗癌疗法。在一些方面中，所述第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。在特定方面中，第二抗癌疗法是化学疗法。在一些方面中，化学疗法是环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨喋呤(methotrexate)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、多柔比星(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、顺铂(cisplatin)、吉西他滨(gemcytabine)、白消安(busulfan)或阿糖胞苷(ara-C)。在特定方面中，所述化学疗法是多柔比星。在一些方面中，所述化学疗法在IL-12(例如CARL-IL12)免疫细胞之前施用。在具体方面中，所述化学疗法在IL-12(例如CARL-IL12)免疫细胞之前24-48小时施用。在某些方面中，所述化学疗法在IL-12(例如CARL-IL12)免疫细胞之前15-25小时施用。在一些方面中，施用IL-12(例如CARL-IL12)免疫细胞不诱导内源性IL-12分泌和/或IFNγ释放。在某些方面中，T细胞和/或至少一种另外的治疗剂经静脉内、腹膜内、气管内、肿瘤内、肌内、经内窥镜、病灶内、经皮、皮下、区域性或通过直接注射或灌注施用。在特定方面中，与施用具有野生型IL-12的T细胞相比，施用所述IL-12(例如CARL-IL12)T细胞不诱导IFNγ或诱导较低水平的IFNγ。在一些方面中，在血清样品中测量IFNγ。在具体方面中，T细胞和/或第二抗癌疗法施用多于一次。在一些方面中，所述T细胞渗透至所述受试者内肿瘤的中心或中心附近。
本发明的其他目标、特征和优点将通过下列详细说明而显而易见。然而，应理解，在指示本发明的优选实施方案时，详细说明及具体实例仅以举例说明方式给出，这是由于本领域技术人员由该详细说明能够知晓在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
下列附图形成本说明书的一部分且包含其以进一步阐释本发明的某些方面。参照这些附图中的一个或多个结合本文所示特定实施方案的详细说明来更好地理解本发明。
图1：使用单独CARL-IL12 T细胞疗法(标记为attIL12BBT)或其与多柔比星的组合治疗的小鼠的肿瘤体积。
图2：使用CARL-IL12 T细胞治疗的具有上皮肿瘤的小鼠的肿瘤体积。
图3：在预先多柔比星治疗存在下人类骨肉瘤模型中经CARL-IL12(ATTIL12BB)修饰的T细胞疗法与未修饰T细胞疗法之间的并排比较。向约1000mm3大小的骨肉瘤随机指派不同治疗，如下文所详述。多柔比星(Dox)在T细胞疗法之前2天以1mg/kg的剂量经腹膜内(IP)施用。经由静脉内途径以2.5x10E6/每次施用的剂量来施用T细胞。针对每只荷瘤小鼠进行两此独立的施用。Notx：无治疗；多柔比星：仅多柔比星治疗；CtrlT：仅施用未修饰的T细胞；CtrlT+Dox：使用未修饰的T细胞+多柔比星；ATTIL12T+Dox：使用经肿瘤靶向性和膜锚定性IL12修饰的T细胞+多柔比星；ATTIL12BBT+Dox：经CARL-IL12修饰的T细胞+多柔比星治疗；ttIL12T+Dox：经肿瘤靶向性IL12修饰的T细胞+多柔比星治疗；wtIL12T+Dox：经野生型IL12修饰的T细胞+多柔比星治疗；anIL12T+Dox：经膜锚定性野生型IL12修饰的T细胞+多柔比星治疗。
图4：在人类骨肉瘤模型中CARL-12T(ATTIL12BBT)细胞疗法与其他可能的IL12修饰的T细胞疗法之间的并排比较(参见图3的图例)。
图5：具有源于患者的毛细血管扩张性骨癌(OS)肿瘤的异种移植物的小鼠的肿瘤体积。使用多柔比星、对照T细胞、或T细胞与多柔比星的组合治疗小鼠。T细胞是CAR IL-12T细胞(上图)或具有膜锚定性IL-12的T细胞(下图)。
图6：显示各种IL-12构建体(包括CARL-IL12构建体)的示意图。
图7：显示在细胞膜处的CARL-IL12的示意图。
图8：在第19天在不含细胞因子或抗体的基本培养基中的T细胞存活率。
图9：使用具有肿瘤靶向性部分且无细胞内信号传导组成部分的ATT-IL-12治疗的小鼠的肿瘤体积。
具体实施方式
在某些实施方案中，本发明提供具有膜锚定性和/或肿瘤靶向性IL-12的CAR样构建体。所述构建体可以包含肿瘤靶向性部分(例如肽、抗体或其片段)。示例性肿瘤靶向性部分是细胞表面波形蛋白(CSV)肽或scFv。构建体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。本文进一步提供经改造以表达CARL-IL12载体的细胞，例如免疫细胞、尤其是T细胞。CARL IL-12T细胞可以用于治疗疾病或病症，如实体肿瘤或血液癌症。
具体而言，本发明构建体可以是表达具有细胞内细胞活化/存活结构域的肿瘤靶向性和膜锚定性白介素12(IL-12)的CARL-IL-12构建体(图6、7)。IL-12可以包含与细胞膜靶定结构域融合的IL-12α亚基p35(具有或不具有细胞存活/活化结构域)和与肿瘤靶向肽融合的IL-12β亚基p40。在本发明的研究中，不具有细胞存活/活化结构域的单独肿瘤靶向性部分(ATT-IL-12)展示增加的抗肿瘤功效(图9)。CARL-IL12和ATT-IL构建体二者都导致增加的宿主T细胞增殖。
具体而言，IL-12可以包含p35亚基和p40亚基二者。p40亚基可以融合至肿瘤靶向性部分(例如CSV肽)。p35亚基可以融合至跨膜结构域(例如EGFR)。p35亚基可进一步融合至细胞信号传导结构域(例如4-1BB和CD3ζ)。这两个亚基一起可形成CARL-IL12构建体。构建体可使用p40亚基中的肿瘤靶向肽或scFV直接靶向肿瘤且经由膜锚定性p35-TM-4-1BB或p35-TM(即不具有4-1BB)亚基诱导T细胞增殖。取决于细胞类型，4-1BB可以被其他细胞活化/存活信号传导结构域代替。结果，CARL-IL12可以用于治疗大肿瘤，例如耐药性肉瘤。CARL-IL12通过使T细胞快速靶向肿瘤而可以进一步减少CAR T细胞疗法和IL-12疗法的毒性问题。CARL-IL12疗法可以与化学疗法(如多柔比星)组合施用，并且其可以加强肿瘤特异性TCR-T细胞诱导。CARL-IL12 T细胞疗法还可以减轻细胞因子释放综合征。实际上，本研究展示，与野生型IL-12 T细胞疗法和膜锚定性IL-12 T细胞疗法相比，本发明的CARL-IL12疗法具有优良的抗肿瘤功效。
还提供从受试者的血液分离T细胞、用CARL-IL12修饰、扩增并且施用给受试者的方法。另外，受试者可以使用多柔比星或其他T细胞募集诱导剂进行预先治疗。
I.定义
如本文所用，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于表示没有任何特定组分被有意配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量形式存在。因此，由组合物的任何非预期污染产生的指定组分的总量远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到任何量的特定组分的组合物。
如本文所用，“一个”或“一种”可表示一个(种)或多个(种)。如本文在权利要求中使用的，当与词“包含”结合使用时，词“一个”或“一种”可以表示一个(种)或多于一个(种)。
权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持定义仅指替代方案和“和/或”。如本文所用，“另一个”可表示至少第二个或更多个。术语“约”、“基本上”和“大约”通常表示规定值加减5％。
疾病或病况的“治疗”或处理是指执行方案，其可以包括向患者施用一种或多种药物，以努力减轻疾病的体征或症状。治疗的理想效果包括降低疾病进展的速度、缓解或缓和疾病状态以及减缓或改善预后。减轻可以发生在疾病或病况的体征或症状出现之前，也可以在它们出现之后。因此，“治疗”或“处理”可以包括“预防”或“防止”疾病或不良状况。此外，“治疗”或“处理”不需要完全减轻体征或症状，不需要治愈，并且特别包括对患者仅具有边际影响的方案。
本申请通篇使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指促进或增强受试者在该病况的医学治疗方面的健康的任何方面。这包括但不限于降低疾病的体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可涉及例如减小肿瘤的大小、减小肿瘤的侵袭性、降低癌症的生长速率或预防转移。癌症的治疗也可指延长癌症受试者的生存期。
“受试者”和“患者”指人类或非人类，如灵长类、哺乳动物和脊椎动物。在特定实施方案中，受试者是人类。
短语“药学上或药理学上可接受的”是指是指当对动物(例如人类)视情况而定施用时不产生不良、过敏或其他不期望反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，本领域技术人员将知晓制备包含抗体或其他活性成分的药物组合物。此外，对于动物(例如人类)施用，应理解制备物应满足FDA生物标准办公室要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。
如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括任何和所有水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外媒介物，例如氯化钠、林格氏右旋糖等)、非水性溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯)、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂，例如本领域普通技术人员已知的材料及其组合。根据众所周知的参数来调整药物组合物中各种成分的pH和精确浓度。
术语“膜锚定性IL-12”是指包括跨膜结构域的IL-12蛋白(图6)。术语“膜锚定性肿瘤靶向性IL-12(attIL-12)”是指包含跨膜结构域和肿瘤靶向结构域二者的IL-12蛋白(例如图6)。
多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)具有某一百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“类似性百分比”或“序列类似性”，其是指一个氨基酸可在不损失功能的前提下取代另一氨基酸的程度。可通过使用矩阵(诸如PAM250或BLOSUM62矩阵)来测定所述类似性百分比。
多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一序列具有特定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”或“同源性”意指，在所比较两个序列经比对时，该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。可以使用本领域已知的软件程序(例如CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人,编,1987)Supplement 30,section7.7.18,Table 7.7.1中所述的那些)来测定该比对和同源性或序列同一性百分比。优选地，使用默认参数进行比对。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数的进行。特定而言，优选的程序是BLASTN和BLASTP，且使用下列默认参数：基因代码＝标准；筛选＝无；链＝两条；截止值＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；说明＝50个序列；分类依据＝高评分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。
II.CAR样IL-12(CARL-IL12)T细胞疗法
本发明的某些实施方案涉及具有膜锚定性IL-12的CAR样构建体。在一些方面中，构建体或表达载体是逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、DNA质粒表达载体或AAV表达载体。构建体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。具体而言，IL-12可以包含p35亚基和p40亚基。p40亚基可以融合至肿瘤靶向性部分。p35亚基可以融合至跨膜结构域。p35亚基可进一步融合至细胞信号传导结构域。信号传导结构域可以是CD3ζ、CD28和/或4-1BB信号传导结构域。两种融合亚基一起可以形成CARL-IL12构建体。
构建体可以包括肿瘤靶向性部分(例如肽、抗体或其片段)。肿瘤靶向性部分可以是抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如衍生自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)及可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
示例性肿瘤靶向性部分是细胞表面波形蛋白(CSV)肽或scFv。除通过该CARL-IL12T细胞疗法加上预先化学疗法(例如多柔比星)在肿瘤中诱导的NKG2D配体靶外，第二通用肿瘤特异性靶标是细胞表面波形蛋白(CSV)。在任何类型的高度恶性肿瘤中检测到CSV，并且主要在诸如转移性肿瘤和复发性肿瘤的高度恶性肿瘤上发现。例如，研究已经展示，CSV存在于结肠肿瘤中100％的转移性肿瘤细胞表面和97-98％的耐药性或耐受CAR-T细胞或复发性ALL上。
CARL-IL12构建体可以包含跨膜结构域以使抗体锚定至细胞。本领域已知的任意跨膜结构域可以用于CARL-IL12针对宿主细胞(例如T细胞)的膜锚定表达。示例性的跨膜结构域是EGFR跨膜结构域。在其他实施方案中，跨膜结构域可以包含本领域已知的其他跨膜序列，例如Kozma等人,Nucleic Acids Research 41 Database Issue,D524-D529,2013中公开的跨膜序列。在其他实施方案中，IL-12 p35包含跨膜结构域。具有一个或多个跨膜多肽结构域的跨膜蛋白的公知实例包括整联蛋白家族的成员、CD44、血型糖蛋白、I类和II类MHC糖蛋白、EGF受体、G蛋白偶合受体(GPCR)家族、受体酪案酸激酶(例如胰岛素样生长因子1受体(IGFR)和血小板衍生的生长因子受体(PDGFR))、孔蛋白家族以及其他跨膜蛋白。本发明的某些实施方案涵盖使用跨膜多肽结构域的一部分，例如具有如可以根据标准和公知的方法测定的膜插入特性的截短多肽。
可用于各个实施方案中的膜锚定性IL-12蛋白序列包括野生型IL-12的氨基酸序列以及其类似物和衍生物。类似物和衍生物可以包括(但不限于)由核苷酸序列编码的氨基酸序列内的氨基酸残基的添加或取代，但其可能引起沉默变化，由此产生功能等效的基因产物。氨基酸取代可以基于所涉及残基在以下方面中的类似性来进行：极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；且带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
氨基酸取代可以备选地基于氨基酸的亲疏水指数来进行。每个氨基酸已基于其疏水性和电荷特性来指定亲疏水指数。其为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本领域已理解亲疏水氨基酸指数在赋予蛋白质交互生物功能中的用途(Kyte和Doolittle,J.Mol.Biol.157:105-132,1982)。已知在某些情况下，某些氨基酸可以被取代为具有类似亲疏水指数或评分且仍保留类似生物活性的其他氨基酸。在基于亲疏水指数做出改变时，在某些实施方案中，包括亲疏水指数在±2内的氨基酸，而在其他实施方案中，包括±1内的氨基酸取代，且在其他实施方案中，包括±0.5内的氨基酸取代。
氨基酸取代可以备选地基于亲水性来进行，尤其在由此产生的生物功能蛋白质或肽意欲用于免疫学实施方案中时。在某些实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性所决定)与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物特性相关。已经对这些氨基酸残基指定了下述亲水值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于类似亲水值做出改变时，在某些实施方案中，包含亲水值在±2内的氨基酸取代，在某些实施方案中，包含亲水值在±1内的氨基酸取代，且在某些实施方案中，包含亲水值在±0.5内的氨基酸取代。还可以基于亲水性来鉴别来自一级氨基酸序列的表位。
取代变体通常包含在蛋白质内一个或多个位点处一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可以被设计用于调节多肽的一个或多个性质，有或没有丧失其他功能或性质。取代可以是保守的，也就是说，一个氨基酸被一个相似形状和电荷的氨基酸替换。保守取代在本领域中是众所周知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。备选地，取代可以是非保守的，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守的变化通常涉及将残基取代为化学上不相似的残基，例如用极性或带电的氨基酸取代非极性或不带电的氨基酸，反之亦然。
A.T细胞制备
本文进一步提供经改造以表达CARL-IL12载体的细胞，例如免疫细胞、尤其是T细胞。CARL-IL12 T细胞可以用于治疗疾病或病症(例如实体肿瘤或血液癌症)。
本发明的某些实施方案是关于获得T细胞的起始群体、修饰T细胞，且将经修饰的T细胞作为免疫疗法施用给受试者以靶向癌细胞。具体而言，T细胞表达CARL-IL12。最近二十年，已记载了用于衍生、活化和扩增功能性抗肿瘤效应T细胞的若干基本方式。所述方式包括：自体细胞，例如肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)；使用自体DC、淋巴细胞、人工抗原呈递细胞(APC)或经T细胞配体和活化抗体包被的珠粒或借助捕获靶细胞的膜而分离的细胞离体活化的T细胞；天然表达抗宿主肿瘤T细胞受体(TCR)的同种异体细胞；和经基因再编程或“重新引导”以表达展现出抗体样肿瘤识别能力的肿瘤反应性TCR或嵌合TCR分子(称为“T小体”)的非肿瘤特异性自体或同种异体细胞。所述方式已产生可以用于本文所述方法中的T细胞制备进而免疫的诸多方案。
在一些实施方案中，T细胞的起始群体衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴样器官。在一些方面中，细胞是人类细胞。细胞通常是原代细胞，例如从受试者直接分离的和/或从受试者分离并且冷冻的那些细胞。在一些实施方案中，细胞包含T细胞或其他细胞类型(例如全T细胞群体、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群体)的一个或多个亚组，例如根据以下各项所定义的那些：功能，活化状态，成熟度，分化、扩增、再循环、局部化和/或持久能力的潜力，抗原特异性，抗原受体类型，在特定器官或腔室中的存在，标记物或细胞因子分泌特征和/或分化程度。对于待治疗的受试者而言，细胞可以是同种异体和/或自体的。在一些方面中，例如对于现有技术而言，细胞是多能性的(pluripotent)和/或专能性的(multipotent)，例如干细胞，例如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包含从受试者分离细胞、制备、处理、培养和/或改造细胞(如本文所述)，且在冷冻保存之前或之后将其再引入相同患者中。
T细胞(例如CD4+和/或CD8+ T细胞)的亚型和亚群体是幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(例如干细胞记忆T细胞(TSCM)、中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在的和适应性调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞(例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡性辅助性T细胞)、α/βT细胞及δ/γT细胞。
在一些实施方案中，一种或多种T细胞群体富集或耗尽针对特定标记物(例如表面标记物)阳性的细胞或针对特定标记物阴性的细胞。在一些情形下，所述标记物是在某些T细胞群体(例如非记忆细胞)上不存在或以相对较低含量表达但以相对较高含量存在或表达于某些其他T细胞群体(例如记忆细胞)上的标记物。
在一些实施方案中，通过负向选择在非T细胞(例如B细胞、单核细胞或其他白血细胞)上表达的标记物(例如CD14)从PBMC样品分离T细胞。在一些方面中，使用CD4+或CD8+选择步骤来分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。可以通过正向或负向选择表达或以相对较高程度表达于一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群体上的标记物来将所述CD4+和CD8+群体进一步分选成亚群体。
在一些实施方案中，例如，通过基于与各个亚群体有关的表面抗原进行正向或负向选择来使CD8+ T细胞进一步富集或耗尽幼稚、中央记忆、效应记忆和/或中央记忆干细胞。在一些实施方案中，进行中央记忆T(TCM)细胞的富集以增加功效，例如改良施用后的长期存活、扩增和/或植入(其在一些方面中于所述亚群体中尤其稳健)。参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，T细胞是自体T细胞。在该方法中，从患者获得肿瘤样品并获得单细胞悬液。以任何合适的方式，例如机械地(使用例如gentleMACSTM解离器(MiltenyiBiotec,Auburn,Calif.)解离肿瘤)或酶促地(例如胶原酶或DNA酶)，可以获得单细胞悬液。将肿瘤酶消化物的单细胞悬液在白介素-2(IL-2)中培养。培养细胞直至汇合(例如，约2×106个淋巴细胞)，例如，约5天至约21天，优选约10天至约14天。例如，可以将细胞培养从5天、5.5天或5.8天至21天、21.5天或21.8天，诸如从10天、10.5天或10.8天至14天、14.5天或14.8天。
可以将培养的T细胞合并和快速扩增。快速扩增会提供抗原特异性T细胞的数目在约10天至约14天的时间内至少约50倍(例如，50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更大)的增加。更优选地，快速扩增会提供在约10天至约14天的时间内至少约200倍(例如，200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍或更大)的增加。
可以通过本领域中已知的许多方法中的任一种来完成扩增。例如，在有饲养淋巴细胞和白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激，可以快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激可以包括约30ng/ml的OKT3(一种小鼠单克隆抗-CD3抗体，可从
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Raritan,N.J.获得)。备选地，在有T细胞生长因子(例如诸如300IU/ml IL-2)存在下，通过用一种或更多种癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位或细胞)(其可以任选地从载体表达，诸如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽)在体外刺激外周血单核细胞(PBMC)，可以快速扩增T细胞。通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激，快速扩增在体外诱导的T细胞。备选地，可以例如用经辐射的自体淋巴细胞或者用经辐射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激T细胞。
可以修饰自体T细胞以表达促进自体T细胞的生长和活化的T细胞生长因子。合适的T细胞生长因子包括例如白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12。合适的修饰方法是本领域中已知的。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001；和Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994。在特定方面，经修饰的自体T细胞以高水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列，例如IL-12的编码序列，在本领域中是容易获得的，启动子也是如此，其与T细胞生长因子编码序列的可操作连接会促进高水平表达。
B.T细胞活化
在一些实施方案中，本发明提供活化T细胞以增加NKG2D受体在T细胞(例如CD8+ T细胞)上表达的方法。可使用抗CD3(例如抗CD3珠粒)预处理起始T细胞群体。预处理可以持续约12小时至3天，例如约24小时。然后可将经扩增的T细胞与CD80蛋白(例如CD80-Fc重组蛋白)一起培养以诱导CD28活化且由此诱导NKG2D表达。与CD80一起的培养可以持续约1-6天，例如约1、2、3、4、5或6天、尤其约4天。在一些方面中，可以同时用抗CD3和CD80处理T细胞。
C.经基因改造的T细胞
本发明的T细胞可经基因经改造以表达本发明的CARL IL-12构建体。该构建体可以包含在一些方面中经由接头和/或一个或多个跨膜结构域连接至一种或多种细胞内信号传导组分的细胞外抗原(或配体)结合结构域。此类分子通常模拟或近似经由天然抗原受体的信号、经由该受体与共刺激受体的组合的信号和/或仅经由共刺激受体的信号。
在一些方面中，抗原特异性结合或识别组分融合至p40亚基，所述p40亚基在生理学上在细胞外附接至p35融合亚基以形成异源二聚体，从而变成具有负责细胞内信号传导的p35融合体和负责抗原特异性结合的p40融合亚基的CARL结构。
在一些实施方案中，跨膜结构域是衍生自天然或合成来源。当来源是天然的时，该结构域在一些方面中是衍生自任意膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括衍生自(即至少包含一个或多个跨膜区)以下各项的α、β或ζ链的那些：T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154。备选地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面中，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基(例如亮氨酸和缬氨酸)。在一些方面中，在合成的跨膜结构域的每一末端处将存在苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
CARL-IL12通常包括至少一种细胞内信号传导组分或多个细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，CARL-IL12包括TCR复合物的细胞内组分(例如调介T细胞活化和细胞毒性的TCR CD3+链，例如CD3ζ链)。因此，在一些方面中，抗原结合分子连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR进一步包括一种或多种其他分子(例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面中，CARL-IL12包括CD3ζ(CD3-Q或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
D.递送方法
本领域技术人员熟知经由标准重组技术(例如参见Sambrook等人，2001和Ausubel等人，1996，二者均通过引用并入本文中)来构建用于表达本发明的抗原受体的载体。载体包含(但不限于)质体、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如YAC)，例如逆转录病毒载体(例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒载体(Moloney murineleukemia virus vector，MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒载体(例如衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)、腺病毒(Ad)载体(包括其有复制能力、复制缺陷和无肠形式)、腺相关病毒(AAV)载体、猿病毒40(SV-40)载体、牛乳头瘤病毒载体、埃巴病毒载体(Epstein-Barr virus vector)、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、哈维鼠肉瘤病毒载体(Harvey murinesarcoma virus vector)、鼠乳房瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体(Rous sarcoma virusvector)、细小病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、水疱性口炎病毒载体、马拉巴病毒载体(maraba virus vector)和B组腺病毒enadenotucirev载体(group B adenovirusenadenotucirev vector)。
a.病毒载体
在本发明的某些方面中，可以提供编码CARL的病毒载体。在生成重组病毒载体时，非必需基因通常用异源性(或非天然)蛋白质的基因或编码序列代替。病毒载体是一类利用病毒序列将核酸和可能的蛋白质引入细胞中的表达构建体。某些病毒经由受体介导的胞吞作用感染细胞或进入细胞中且整合至宿主细胞基因体中并稳定且有效地表达病毒基因的能力使得其成为用于将外来核酸转移至细胞(例如哺乳动物细胞)中的有吸引力候选者。可用于递送本发明某些方面的核酸的病毒载体的非限制性实例阐述于下文中。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除常见逆转录病毒基因gag、pol和env外还含有具有调控或结构功能的其他基因。慢病毒载体在本领域内是众所周知的(例如参见美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞且可以用于体内和离体基因转移以及核酸序列表达。例如，能够感染非分裂细胞(其中适宜的宿主细胞经两种或更多种携带包装功能(亦即gag、pol和env以及rev和tat)的载体转染)的重组慢病毒记载于美国专利5,994,136中，该专利通过引用并入本文中。
b.调控元件
可用于本发明的载体中所包含的表达盒尤其含有(在5’至3’方向上)可操作地连接至蛋白质编码序列的真核转录启动子、包含插入序列的剪接信号和转录终止/多腺苷酸化序列。控制真核细胞中的蛋白质编码基因的转录的启动子和增强子是由多种基因元件构成的。细胞机制能够聚集并整合由每一元件传送的调控信息，从而容许不同基因进化出独特的、通常复杂的转录调控模式。本发明情形中所用的启动子包括组成型启动子、可诱导性启动子和组织特异性启动子。
(i)启动子/增强子
本文所提供的表达构建体包含启动子以驱动抗原受体的表达。启动子通常包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。此序列的最佳已知实例是TATA盒，但在一些缺乏TATA盒的启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身可以帮助固定起始位置。其他启动子元件调控转录起始的频率。通常，所述元件位于起始位点上游的30110bp区域中，但多种启动子已展示也含有位于起始位点下游的功能元件。为使编码序列“处于启动子的控制下”，需将转录阅读框的转录起始位点的5’端定位于所选启动子的“下游”(即3’端)。“上游”启动子刺激DNA的转录且促进所编码RNA的表达。
启动子元件之间的间隔通常较灵活，以使得在相对于彼此插入或移动各元件时保留启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可在活性开始下降之前增加至50bp。取决于启动子，似乎各个元件可以协同或独立地发挥活化转录的功能。启动子可以或可以不与“增强子”联合使用，增强子是指参与核酸序列的转录活化的顺式作用调控序列。
启动子可以是与核酸序列天然缔合的启动子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5′非编码序列而获得。这样的启动子可以称为“”内源性的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然缔合的增强子，其位于该序列的下游或上游。备选地，通过使编码核酸区段处于重组或异源性启动子的控制下而获得某些优点，所述重组或异源性启动子是指在其天然环境中通常并不与核酸序列缔合的启动子。重组或异源性增强子还指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。所述启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子和从任意其他病毒或原核细胞或真核细胞分离的启动子或增强子以及非“天然存在的”(即含有不同转录调控区的不同元件和/或改变表达的突变)启动子或增强子。例如，最常用于重组DNA构建中的启动子包括β内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp-)启动子系统。除以合成方式产生启动子和增强子的核酸序列外，可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)联合本文所公开的组合物来产生序列。另外，考虑还可以采用引导非核细胞器(例如线粒体、叶绿体等)内的序列的转录和/或表达的控制序列。
自然地，重要的是采用有效地引导DNA区段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知晓用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的应用(例如参见Sambrook等人，1989，其通过引用并入本文中)。所采用启动子可以为组成型、组织特异性、可诱导型和/或可在适当条件下用于引导所引入的DNA区段的高水平表达，因此这有利于重组蛋白和/或肽的大规模生产。启动子可以是异源性或内源性的。
另外，还可以使用任意启动子/增强子组合(例如，根据真核启动子数据库(Eukaryotic Promoter Data Base)EPDB，通过epd.isb-sib.ch/的万维网)来驱动表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统的应用是另一个可行的实施方案。如果提供适当的细菌聚合酶(作为递送复合物的一部分或作为额外的基因表达构建体)，则真核细胞能够支持来自某些细菌启动子的细胞质转录。
启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子、GADPH启动子、金属硫蛋白启动子；和串联反应元件启动子，例如环状AMP反应元件启动子(cre)、血清反应元件启动子(sre)、佛波醇酯启动子(TPA)和靠近最小TATA盒的反应元件启动子(tre)。还可以使用人生长激素启动子序列(例如记载于Genbank登录号X05244的核苷酸283-341的人生长激素最小启动子)或小鼠乳房肿瘤启动子(可从ATCC目录号ATCC 45007获得)。在某些实施方案中，启动子是CMV IE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β肌动蛋白、MHC I类或MHC II类启动子，然而，可用于驱动治疗基因表达的任意其他启动子适用于本发明实践。
在某些方面中，本发明的方法还涉及增强子序列，即，增加启动子活性且具有顺式作用的潜能、并且不论其定向如何、甚至在相对较长距离(远离靶启动子高达几千个碱基)发挥作用的核酸序列。然而，增强子功能未必限于这样的长距离，这是因为其也可以在给定启动子附近发挥作用。
(ii)起始信号和连接表达
特定起始信号也可以用在本发明中所提供的表达构建体中以有效翻译编码序列。这些信号包括ATG起始密码子或毗邻序列。可能需要提供外源性翻译控制信号(包括ATG起始密码子)。本领域普通技术人员易于确定这一点并且提供所需信号。众所周知，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框“同框”以确保翻译整个插入体。外源性翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过纳入适当的转录增强子元件来增强表达效率。
另外，可以使用某些2A序列元件来在本发明所提供的构建体中产生多个基因连接的表达或共表达。例如，可以使用裂解序列通过连接开放阅读框以形成单一顺反子来共表达基因。示例性的裂解序列是F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A样”序列(例如明脉扁刺蛾(Thoseaasigna)病毒2A；T2A)。
(iii)复制起点
为了在宿主细胞中增殖载体，其可以含有一个或多个复制起点位点(通常称为“ori”)，例如对应于如上文所所述的EBV的oriP或具有类似或升高的编程化功能的经基因改造的oriP的核酸序列，其是在此引发复制的特异性核酸序列。备选地，可以采用如上文所述的其他染色体外复制病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。
c.选择和可筛选标记物
在一些实施方案中，通过在表达载体中包含标记物可以在体外或在体内鉴别含有本发明构建体的细胞。所述标记物将赋予细胞可鉴别的变化，从而允许容易地鉴别含有所述表达载体的细胞。通常，选择标记物是赋予容许选择的性质的标记物。正向选择标记物是其中标记物的存在容许其选择的标记物，而负向选择标记物是其中其存在防止其选择的标记物。正向选择标记物的一个实例是耐药性标记物。
通常，纳入药物选择标记物有助于转化体的克隆和鉴别，例如，赋予新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)、DHFR、GPT、zeocin和组胺醇抗性的基因是有用的选择标记物。除赋予容许基于实施条件来区分转化体的表型的标记物外，还考虑其他类型的标记物，包括可筛选标记物，例如基于比色分析的GFP。备选地，可以利用作为负向选择标记物的可筛选酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。本领域技术人员还知晓如何使用免疫学标记物、可能与FACS分析联合使用。所用的标记物并不视为是重要的，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和可筛选标记物的其他实例是本领域技术人员所熟知的。
d.其他核酸递送方法
除编码抗原受体的核酸的病毒递送外，下文是将重组基因递送至给定宿主细胞的其他方法，并且由此在本发明中加以考虑。
可以使用如本文所述或如本领域普通技术人员已知用于递送核酸以转化细胞的任一适宜方法来将核酸(例如DNA或RNA)引入本发明的免疫细胞中。所述方法包括(但不限于)：例如使用以下方式直接递送DNA：通过离体转染、通过注射(包括显微注射)；通过电穿孔；通过磷酸钙沈淀；通过使用DEAE-葡聚糖且随后使用聚乙二醇；通过直接声波加载；通过脂质体介导的转染和受体介导的转染；通过微粒轰击；通过使用碳化硅纤维搅动；通过土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化；通过干燥/抑制介导的DNA摄入，以及所述方法的任意组合。通过使用诸如这些的技术，可以稳定或瞬时转化细胞器、细胞、组织或生物体。
III.治疗方法
本文进一步提供治疗个体中的癌症或延迟其进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的CARL IL-12 T细胞疗法。考虑用于治疗的癌症的实例包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、宫颈癌、胃肠道癌、淋巴瘤、肺中的赘瘤形成前病灶、结肠癌、黑色素瘤和膀胱癌。
在一些实施方案中，个体患有耐受(已显示耐受)一种或多种抗癌疗法的癌症。在一些实施方案中，对抗癌疗法的耐受性包括癌症复发或难治性癌症。复发可是指在治疗之后于原始位点或新位点再发生癌症。在一些实施方案中，对抗癌疗法的耐受性包括癌症在使用抗癌疗法治疗期间的进展。在一些实施方案中，癌症处于早期或处于晚期。
在一些实施方案中，向受试者施用化学治疗剂与T细胞疗法的组合。例如，化学治疗剂可以为多柔比星(Dox)或环磷酰胺。可以使用化学治疗剂(例如多柔比星或其他T细胞募集诱导剂)预先治疗受试者。预先治疗可以在T细胞疗法之前16-24小时。
在一些实施方案中，T细胞是自体的。然而，如果敲除内源性TCR，细胞可以是同种异体的。在一些实施方案中，T细胞分离自患者本身，从而细胞是自体的。如果T细胞是同种异体的，则需要去除内源性TCR。将细胞以足以控制、减少或消除所治疗疾病的症状和体征的量施用给所关注的受试者。
可以通过本领域技术人员已知的许多方法来测量治疗的有效性。在一个实施方案中，使用白细胞计数(WBC)来测定受试者免疫系统的反应性。WBC测量受试者中的白细胞的数量。使用本领域熟知的方法，使受试者血液样品中的白细胞与其他血液细胞分离并计数。白细胞的正常值为约4,500至约10,000个白细胞/μl。较低数量的白细胞可能指示受试者中的免疫抑制状态。
在另一个实施方案中，可使用T淋巴细胞计数来测定受试者中的免疫抑制。使用本领域熟知的方法，将受试者血液样品中的白细胞与其他血液细胞分离。使用本领域的标准方法(例如免疫荧光或FACS)来区分T淋巴细胞与其他白细胞。T细胞或特定T细胞群体的数量减小可用作免疫抑制的量度。T细胞或特定T细胞群体的数量小于治疗前的T细胞数量(或特定群体中的细胞数量)可用于指示已诱导免疫抑制。
在另外的实施方案中，进行测试以测量T细胞活化、增殖或细胞因子反应(包括对特定抗原的反应)。在一些实例中，可在来自受试者的样品中测量Treg或Breg细胞的数量。在另外的实例中，在来自受试者的样品中测量细胞因子(例如IL-10)。
在其他实例中，为评估炎症，可以测量炎症位点处的中性粒细胞浸润。为评估中性粒细胞浸润，可以测量髓过氧化物酶活性。髓过氧化物酶是存在于多形核白细胞和单核细胞的嗜苯胺蓝颗粒中的血红素蛋白。其催化卤化物离子氧化成各自的次卤酸，所述次卤酸用于通过吞噬细胞进行微生物杀死。因此，组织中的髓过氧化物酶活性降低反映了中性粒细胞浸润的降低，并且可以用作炎症抑制的量度。
在另一个实例中，可以通过测量受试者中的细胞因子水平来分析受试者的有效治疗。通过常规方法测定体液或细胞样品中的细胞因子水平。例如，可使用免疫印迹分析，例如酶联免疫印迹或“ELISPOT”测定。免疫印迹测定是用于在单细胞水平上检测细胞因子分泌的高度敏感性和定量性分析。免疫印迹方法和应用在本领域中已众所周知且记载于例如Czerkinsky等人，1988；Olsson等人，1990；和EP 957359中。标准免疫印迹测定的变化形式在本领域已众所周知且可以用在本发明方法中检测细胞因子产生中的变化(例如参见美国专利号5,939,281和美国专利号6,218,132)。
在一些实施方案中，可以在T细胞疗法之前向受试者施用非清髓性淋巴细胞清除性化学疗法。非清髓性淋巴细胞清除性化学疗法可以是任意适宜的此类疗法，其可以通过任意适宜的途径施用。非清髓性淋巴细胞清除性化学疗法可以包括例如施用环磷酰胺和氟达拉滨(fludarabine)，尤其在癌症是可能转移的黑色素瘤时。施用环磷酰胺和氟达拉滨的一个示例性途径是经静脉内施用。同样地，可以施用任意适宜剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在特定方面中，施用约60mg/kg环磷酰胺两天，然后施用约25mg/m2氟达拉滨5天。
在某些实施方案中，与自体T细胞同时或在自体T细胞之后将促进自体T细胞生长和活化的T细胞生长因子施用给受试者。T细胞生长因子可以是促进自体T细胞的生长和活化的任何合适的生长因子。合适的T细胞生长因子的例子包括白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12，它们可以单独地或以不同组合使用，诸如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或IL-12和IL2。IL-12是优选的T细胞生长因子。
局部、区域性或全身性施用可以是适宜的。对于>4cm的肿瘤而言，施用体积将为约4-10ml(尤其是10ml)，而对于<4cm的肿瘤而言，将使用约1-3ml的体积(尤其是3ml)。以单一剂量递送的多个注射包含约0.1ml至约0.5ml的体积。
B.药物组合物
本发明还提供包含T细胞疗法和药用载剂的药物组合物和制剂。
如本文所述的药物组合物和制剂可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如抗体或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的载剂(Remington's PharmaceuticalSciences，第22版，2012)混合来制备，制成冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载剂进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003253467290000241
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP以及使用方法(包括rHuPH20)记载于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968。一方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
C.另外的疗法
在某些实施方案中，本实施方案的组合物和方法涉及与至少一种另外的疗法组合的CARL-IL12 T细胞群体。另外的疗法可以是放射疗法、手术(例如，肿块切除术(lumpectomy)和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。另外的疗法可以是辅助疗法或新辅助疗法的形式。
T细胞疗法可以在相对于另外的疗法(例如多柔比星)之前、期间、之后或以各种组合施用。施用可以间隔从同时到几分钟到几天到几周不等。在T细胞疗法与另外的治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常会确保在每次递送之间没有很长的时间段，使得这两种化合物仍然能够发挥对患者有利的组合效果。在这种情况下，预期可以在彼此相隔约12至24或72小时内，更具体地，彼此相隔约6-12小时内向患者提供T细胞疗法和抗癌疗法。在某些情况下，如果各个施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7天)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)，可能需要显著延长治疗时间。
T细胞疗法和另外的治疗剂可以通过相同施用途径或通过不同施用途径来施用。在一些实施方案中，经静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内来施用T细胞疗法和/或抗血小板剂。可施用有效量的T细胞疗法和另外的治疗剂以预防或治疗疾病。基于以下因素来确定T细胞疗法和另外的治疗剂的适当剂量：待治疗疾病的类型、疾病的严重程度与病程、个体的临床状况、受试者的临床史和对治疗的反应以及主治医师的判断。
在一些实施方案中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减少治疗副作用的发生和/或严重程度的试剂，例如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ照射。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向PBK/AKT/mTOR通路的疗法、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、细胞凋亡抑制剂和/或化学预防剂。另外的疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。
可以采用多种组合。对于以下实例，T细胞疗法是“A”，并且另外的治疗剂是“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，本发明实施方案的任何化合物或疗法向患者的施用将遵循用于施用这样的化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于联合疗法的毒性的步骤。
1.化学疗法
根据本发明实施方案可以使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”表示使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于意指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物通过其在细胞内的活性模式(例如，其是否影响细胞周期以及在何阶段影响细胞周期)进行分类。备选地，可以基于它的直接交联DNA、嵌入到DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征药剂。
化学治疗剂的实例包括：烷化剂，诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；杜卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺和乌拉莫司汀；硝基脲类，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωI1)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐类，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authrarnycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷和睾内酪；抗肾上腺类，诸如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦辛类，诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇行菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如，紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸类，诸如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂，和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
2.放射疗法
造成DNA损伤并已广泛使用的其它因素包括通常被称为γ射线、X射线的那些和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑了其它形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束照射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV照射。最可能的是，所有这些因素对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持造成宽范围的损害。X射线的剂量范围为从以50-200伦琴的日剂量持续长时间段(3至4周)至2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围宽泛地变化，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。
3.免疫疗法
熟练的技术人员会理解，另外的免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的情形下，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子以靶向并破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0003253467290000281
是这样的一个实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标记物特异性的抗体。所述抗体单独地可以充当治疗的效应物，或者它可以募集其它细胞以实际影响细胞杀死。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且充当靶向剂。备选地，效应物可以是直接地或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的携带表面分子的淋巴细胞。多种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
已经出现抗体-药物缀合物作为癌症治疗剂开发的突破性方案。癌症是世界上死亡的主要原因之一。抗体-药物缀合物(ADC)包含与杀死细胞的药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。该方案将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物组合，从而产生将货物(药物)递送至具有丰富水平抗原的肿瘤细胞的“武装”MAb(Carter等人,2008；Teicher等人,2014；Leal等人,2014)。药物的靶向递送还使其在正常组织中的暴露最小化，从而导致降低的毒性和提高的治疗指数。FDA对两种ADC药物的批准(2011年
Figure BDA0003253467290000282
(本妥昔单抗(Brentuximab)vedotin)和2013年
Figure BDA0003253467290000283
(曲妥珠单抗美坦新或T-DM1))验证了该方案。目前存在超过30种ADC药物候选物处于癌症治疗的临床试验的各个阶段(Leal等人,2014)。随着抗体工程和接头-货物优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合于该方案的新靶标的鉴定和验证(Teicher等人,2009)以及靶向MAb的产生。ADC靶标的两个标准是在肿瘤细胞中上调的/高水平的表达和稳健内化。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须带有一些适合靶向的标记物，即，所述标记物不存在于大多数其它细胞上。存在许多肿瘤标记物，并且这些肿瘤标记物中的任一种可能适合用于在本发明实施方案的情形中的靶向。常见的肿瘤标记物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸基路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，诸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，诸如MIP-1、MCP-1、IL-8，和生长因子，诸如FLT3配体。
目前在研究或在使用中的免疫疗法的例子是免疫佐剂，例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人,1998)；细胞因子疗法，例如，干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人,1998；Davidson等人,1998；Hellstrand等人,1998)；基因疗法，例如，TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人,1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如，抗-CD20、抗-神经节苷脂GM2和抗-p185(Hollander,2012；Hanibuchi等人,1998；美国专利5,824,311)。考虑一种或更多种抗癌疗法可以与本文所述的抗体疗法一起使用。
在一些实施方案中，所述免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点是免疫系统中的调节剂，其调高信号(例如共刺激分子)或调低信号。可通过免疫检查点阻断而靶向的抑制性免疫检查点包括：腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也被称作CD276)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、细胞毒性T-淋巴细胞相关的蛋白4(CTLA-4、也被称作CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活的V结构域Ig阻抑剂(VISTA)。具体地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体，或者特别是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718；Pardoll,Nat Rev Cancer,12(4):252-64,2012；二者通过引用并入本文)。可以使用免疫检查点蛋白的已知抑制剂或其类似物，特别是可以使用嵌合的、人源化的或人形式的抗体。如技术人员将知晓的，替代和/或等同名称可以用于在本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如已知的是，帕姆单抗(lambrolizumab)也以替代和等同名称MK-3475和帕博丽珠单抗(pembrolizumab)为人所知。
在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体的方面，所述PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体的方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体的方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号US8735553、US8354509和US8008449中，它们都通过引用并入本文。用于用在本文提供的方法中的其它PD-1轴拮抗剂是本领域已知的，例如描述于美国专利申请号US20140294898、US2014022021和US20110008369中，它们都通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是抗-PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，所述抗-PD-1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、帕博丽珠单抗(pembrolizumab)和CT-011。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，含有与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗(也被称作MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003253467290000301
)是在WO2006/121168中描述的抗-PD-1抗体。帕博丽珠单抗(也被称作MK-3475、Merck 3475、帕姆单抗、
Figure BDA0003253467290000302
和SCH-900475)是在WO2009/114335中描述的抗-PD-1抗体。CT-011(也被称作hBAT或hBAT-1)是在WO2009/101611中描述的抗-PD-1抗体。AMP-224(也被称作B7-DCIg)是在WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文提供的方法中被靶向的另一种免疫检查点是细胞毒性T-淋巴细胞-相关的蛋白4(CTLA-4)，也被称作CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞表面上并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的一个成员，其在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28类似，并且这两种分子都结合抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中并且可能对其功能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化会导致增加的CTLA-4(B7分子的抑制性受体)表达。
在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是抗-CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
使用本领域众所周知的方法，可以产生适用于本发明方法的抗-人-CTLA-4抗体(或由此衍生出的VH和/或VL结构域)。备选地，可以使用本领域公认的抗-CTLA-4抗体。例如，在以下文献中公开的抗-CTLA-4抗体可以用在本文公开的方法中：US 8,119,129，WO01/14424，WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也被称作曲美木单抗；以前的替西木单抗)，美国专利号6,207,156；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)J Clin Oncology 22(145):摘要号2505(抗体CP-675206)；和Mokyr等人(1998)Cancer Res 58:5301-5304。每篇上述公开物的教导通过引用并入本文。也可以使用与这些本领域公知的抗体中的任一种竞争结合CTLA-4的抗体。例如，在国际专利申请号WO2001014424、WO2000037504和美国专利号US8017114(都通过引用并入本文)中描述了人源化的CTLA-4抗体。
一种示例性的抗-CTLA-4抗体是伊匹木单抗(也被称作10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0003253467290000311
)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，WO 01/14424)。在其它实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的VH区域的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹木单抗的VL区域的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，所述抗体与上述抗体竞争结合CTLA-4上的相同表位和/或结合至CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，所述抗体与上述抗体具有至少约90％可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹木单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的其它分子包括例如在美国专利号US5844905、US5885796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752(都通过引用并入本文)中描述的CTLA-4配体和受体，以及例如在美国专利号US8329867(通过引用并入本文)中描述的免疫粘附素。
4.手术
大约60％的患有癌症的人将经历某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括其中将全部或一部分癌性组织物理去除、切除和/或破坏的切除术，并且可以与其它疗法(例如本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除术表示至少一部分肿瘤的物理去除。除肿瘤切除术之外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电手术和用显微镜控制的手术(Mohs氏手术)。
在切除一部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤之后，可能在体内形成腔。通过灌注、直接注射或向该区域局部施用另外的抗癌疗法，可以实现治疗。可以重复这样的治疗，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复进行。这些治疗也可以具有不同剂量。
5.其它药剂
考虑可以将其它药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的治疗效果。这些其它药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的增量调节的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其它生物药剂。通过提高GAP连接数目实现的细胞间信号传导的增加，会增加对相邻过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其它实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖功效。考虑细胞粘附抑制剂以提高本发明实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的例子是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其它试剂(例如抗体c225)可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗效力。
IV.制品或试剂盒
本文还提供了包含表达CARL IL-12的T细胞的制品或试剂盒。制品或试剂盒还可以包括包装插页，该插页包括使用过继T细胞任选地与另外的治疗剂(例如，多柔比星)联合治疗或延缓个体中癌症进展或增强患有癌症的个体的免疫功能的说明书。本文所述的任何过继T细胞和/或另外的治疗剂可以包括在制品或试剂盒中。在一些实施方案中，过继T细胞和另外的治疗剂处在同一容器或分开的容器中。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、袋和注射器。容器可由多种材料形成，例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(例如不锈钢或哈氏合金)。在一些实施方案中，容器容纳制剂以及容器上或与容器相关联的标签可以表明使用说明。制品或试剂盒还可以包括从商业和用户角度看需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。在一些实施方案中，制品还包括一种或多种另外的试剂(例如，化疗剂和抗肿瘤剂)。一种或多种试剂的合适容器包括例如瓶子、小瓶、袋和注射器。
V.实施例
包括以下实施例来证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，在以下的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中良好地起作用的技术，因而可以视为构成其实践的优选模式。但是，本领域技术人员考虑到本公开内容以后应该理解，可以在所公开的具体实施方案中做出许多改变且仍然获得类似或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1–在CAR样构建体中表达IL-12
使用融合至肿瘤靶向肽CSV的膜结合IL-12来研发嵌合抗原受体样构建体。简言之，将IL12的两个亚基克隆到单一载体中。使p35亚基以处在同一阅读框中的方式与EGFR跨膜结构域和4-1BB编码序列融合，并且使p40亚基与CSV结合肽编码序列融合。将CARL-IL12融合基因包装到慢病毒载体中。
使用具有间质肿瘤的小鼠来测试CARL-IL12疗法。将含有CARL-IL12融合基因的病毒转染至从外周血扩增的T细胞中，并且在施用多柔比星(DOX)之后一天经由尾部静脉施用到荷瘤小鼠中。多柔比星的治疗剂量为1mg/kg，且在不同治疗之前一天或两天施用。其他对照组包括无治疗(Notx)、单独的多柔比星(Dox)、单独的对照T细胞(ctrl-T)和Dox+对照T细胞(Ctrl-T)。CARL-IL12 T细胞疗法标记为attIL12BBT，其中在治疗前一天施用Dox，且每只小鼠实施总共两个治疗。分别在第56天和第68天将250万个T细胞施用到治疗小鼠中；分别在第54天和第67天施用多柔比星(图1)。然后重复该研究，其中分别在第25天和第41天施用多柔比星，而在第27天和第43天施用T细胞(图2)。与对照相比，经CARL-IL12 T细胞治疗的小鼠具有显著的肿瘤体积减小(图2)。
然后将CAR IL-12 T细胞与具有膜锚定性IL-12的T细胞比较(图4)。使用T细胞在第78、93和105天以2.5X106个/小鼠的剂量来治疗小鼠。在第77天和第91天以1mg/kg的剂量施用多柔比星。观察到，与用IL-12T细胞治疗的小鼠相比，用本发明的CAR IL-12 T细胞和多柔比星治疗的小鼠的肿瘤体积更小(图4-5)。
图6显示各种IL-12构建体，包括CARL-IL12构建体以及没有细胞的细胞内信号传导的ATT-IL-12构建体。这两种构建体都增强T细胞增殖(图8)。另外，ATT-IL-12构建体在一些肿瘤模型中导致肿瘤体积减小(图9)。因此，这两种构建体都可以用作治疗剂。
根据本公开内容，无需过多实验可以实现和执行在本文中公开并要求保护的所有方法。虽然已经以优选实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法，但是本领域技术人员显而易见，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文中所述方法以及本文所述方法的步骤或步骤顺序做出改变。更具体地，显而易见，可以用在化学上和生理学上均相关的某些药剂替代本文所述的药剂，并实现相同或类似的结果。本领域技术人员显而易见的是，所有这样的类似的替代和修改均被认为落入由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
就它们提供示例性操作细节或其它细节来补充本文所述的那些而言，下述参考文献具体地通过引用并入本文。
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Claims (46)

1.构建体，所述构建体编码肿瘤靶向性和膜锚定性IL-12。
2.根据权利要求1所述的构建体，其中所述肿瘤靶向性和膜锚定性IL-12包含IL-12p35亚基和IL-12p40亚基。
3.根据权利要求1或2所述的构建体，其中IL-12p35编码DNA以处在同一阅读框的方式融合到跨膜结构域编码DNA。
4.根据权利要求3所述的构建体，其中所述跨膜结构域是EGFR跨膜结构域。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的构建体，其中所述p35亚基连接至信号传导结构域编码序列。
6.根据权利要求5所述的构建体，其中所述信号传导结构域是CD3ζ、CD28和/或4-1BB信号传导结构域。
7.根据权利要求5所述的构建体，其中所述信号传导结构域包含CD3ζ和4-1BB信号传导结构域。
8.根据权利要求5所述的构建体，其中所述信号传导结构域是4-1BB。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的构建体，其中p40亚基编码DNA以处于同一阅读框的方式融合到肿瘤靶向性部分编码DNA。
10.根据权利要求9所述的构建体，其中肿瘤靶向通过肿瘤靶向性部分实现，所述肿瘤靶向性部分包含肽、抗体或其片段。
11.根据权利要求10所述的构建体，其中所述抗体或其片段选自由以下组成的组：F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv。
12.根据权利要求10所述的构建体，其中所述抗体或其片段是scFv。
13.根据权利要求10所述的构建体，其中所述肿瘤靶向性部分包含肽或是肽。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的构建体，其中所述肿瘤靶向性IL-12特异性结合细胞表面波形蛋白(CSV)。
15.根据权利要求13所述的构建体，其中所述肿瘤靶向性部分是CSV肽。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的构建体，其中所述构建体是病毒载体。
17.根据权利要求16所述的构建体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
18.宿主细胞，所述宿主细胞被改造以表达权利要求1-17中任一项所述的构建体。
19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是免疫细胞。
20.根据权利要求19所述的宿主细胞，其中所述免疫细胞是肿瘤归巢细胞。
21.根据权利要求19所述的宿主细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述T细胞是外周血T细胞。
23.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
24.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述T细胞是自体的。
25.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述T细胞是同种异体的。
26.根据权利要求19所述的宿主细胞，其中所述免疫细胞是NK细胞。
27.药物组合物，所述药物组合物包含权利要求18-26中任一项所述的IL-12免疫细胞和药物载剂。
28.组合物，所述组合物包含有效量的权利要求18-26中任一项所述的肿瘤靶向性IL-12免疫细胞，所述组合物用于治疗受试者中的癌症。
29.治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求18-26中任一项所述的免疫细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中肿瘤靶向性IL-12锚定在所述免疫细胞的膜上。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤、宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、食道癌、黑色素瘤癌、头颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、肉瘤癌、乳腺癌、肝癌、肾癌或急性骨髓性白血病。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，所述方法还包括给所述受试者施用至少第二抗癌疗法。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二抗癌疗法是化学疗法。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述化学疗法是环磷酰胺、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、多柔比星、长春新碱、异环磷酰胺、顺铂、吉西他滨、白消安或阿糖胞苷。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述化学疗法是多柔比星。
37.根据权利要求34或36所述的方法，其中所述化学疗法在所述IL-12免疫细胞之前施用。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述化学疗法在所述IL-12免疫细胞之前24-48小时施用。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述化学疗法在所述IL-12免疫细胞之前15-25小时施用。
40.根据权利要求29-38中任一项所述的方法，其中施用所述IL-12免疫细胞不诱导内源性IL-12分泌和/或IFNγ释放。
41.根据权利要求29-38中任一项所述的方法，其中所述方法诱导内源性肿瘤特异性T细胞扩增和肿瘤杀死。
42.根据权利要求58所述的方法，其中T细胞和/或至少一种另外的治疗剂经静脉内、腹膜内、气管内、肿瘤内、肌内、经内窥镜、病灶内、经皮、皮下、区域性或通过直接注射或灌注施用。
43.根据权利要求48所述的方法，其中与施用具有野生型IL-12的T细胞相比，施用所述IL-12T细胞不诱导IFNγ或诱导较低水平的IFNγ。
44.根据权利要求43所述的方法，其中在血清样品中测量所述IFNγ。
45.根据权利要求58所述的方法，其中T细胞和/或第二抗癌疗法施用多于一次。
46.根据权利要求58所述的方法，其中所述T细胞渗透至所述受试者内肿瘤的中心或中心附近。
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