KR20230003580A - 항-cd79b 항체 및 키메라 항원 수용체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

항-cd79b 항체 및 키메라 항원 수용체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20230003580A
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Abstract

본원에서는 CD79b 항체 및 CD79b-특이적 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공된다. 본원에서는 추가로 CD79b-특이적 CAR을 발현하는 면역 세포 및 상기 CD79b-특이적 CAR 면역 세포를 투여함에 의해 암을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

항-CD79B 항체 및 키메라 항원 수용체 및 이의 사용 방법
본 출원은 2020년 4월 30일자로 출원된 미국 가출원 제63/018,266호의 우선권을 주장하며, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
1. 분야
본원의 개시내용은 일반적으로 면역학, 세포 생물학, 분자 생물학 및 의약 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 적어도 CD79b 키메라 항원 수용체 및 이의 사용 방법을 포함하는, CD79b 항체 및 관련 조성물에 관한 것이다.
2. 관련 분야의 기재
키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 표적화 CD19는 B 세포 악성종양에서 매우 효과적이다. 최근에, 2개의 항-CD19 CAR T-세포 치료요법 제품은 재발 또는 난치성 B 세포 급성 림프아구성 백혈병 (ALL) 및/또는 대형 B 세포 림프종에 대해 US FDA에 의해 승인되었다. 중추적 시험에서, 1년 이상 지속되는 지속적 차도는 이들 환자의 ~40-50%에서 관찰되었다. 그러나, 재발 또는 진행이 ~50- 60%에서 일어나고 내성의 주요 원인은 CD19 항원 상실때문인 것으로 보인다. 따라서, 이들 환자에서 결과를 추가로 개선시키기 위해서는 신규 표적에 대한 CAR T 세포 치료요법의 개발이 긴급히 요구되고 있다.
발명의 개요
본원의 개시내용은 특정 항체와 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 항체는 임의의 종류의 면역치료요법에 및 CD79b의 표적화가 치료학적인 임의의 의학적 응용을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 단리된 모노클로날 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 CD79b에 특이적으로 결합하고, 하기를 포함한다:
(I):
(a) 서열번호 1을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 2를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 3을 포함하는 제3 VH CDR;
(d) 서열번호 4를 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 5를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 6을 포함하는 제3 VL CDR;
(II):
(a) 서열번호 11을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 12를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 13을 포함하는 제3 VH CDR;
(d) 서열번호 14를 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 15를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 16을 포함하는 제3 VL CDR; 또는
(III):
(a) 서열번호 21을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 22를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 23을 포함하는 제3 VH CDR;
(d) 서열번호 24를 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 25를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 26을 포함하는 제3 VL CDR;
일부 양상에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 2를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 3을 포함하는 제3 VH CDR;
(d) 서열번호 4를 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 5를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 6을 포함하는 제3 VL CDR.
추가의 양상에서, 항체는 서열번호 7의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 9의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열번호 7의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 9의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 11을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 12를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 13을 포함하는 제3 VH CDR;
(a) 서열번호 14을 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 15를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 16을 포함하는 제3 VL CDR.
추가의 양상에서, 항체는 서열번호 17의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 19의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열번호 17의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 19의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 21을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 22를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 23을 포함하는 제3 VH CDR;
(d) 서열번호 24를 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 25를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 26을 포함하는 제3 VL CDR.
추가의 양상에서, 항체는 서열번호 27의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 29의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열번호 27의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 29의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 항체는 재조합체이다. 일부 양상에서, 항체는 IgG, IgM, IgA 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 양상에서, 항체는 Fab', F(ab')2, F(ab')3, 1가 scFv, 2가 scFv, 또는 단일 도메인 항체이다. 일부 양상에서, 항체는 사람, 사람화된 항체 또는 탈면역화된 항체이다. 일부 양상에서, 항체는 이미지화제, 화학치료학적 제제, 독소 또는 방사성핵종에 접합된다.
다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 본원 개시내용의 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.
여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원 개시내용의 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 클론 T26의 VH 도메인의 CDR 1-3 (서열번호 1, 2, 및 3) 및 클론 T26의 VL 도메인의 CDR 1-3(서열번호 4, 5, 및 6)을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공한다.
다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 클론 5B의 VH 도메인의 CDR 1-3 (서열번호 11, 12, 및 13) 및 클론 5B의 VL 도메인의 CDR 1-3(서열번호 14, 15, 및 16)을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공한다.
여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 클론 28B의 VH 도메인의 CDR 1-3 (서열번호 21, 22, 및 23) 및 클론 28B의 VL 도메인의 CDR 1-3(서열번호 24, 25, 및 26)을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공한다.
여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원 개시내용의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원 개시내용의 항체 또는 본원 개시내용의 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자(들)을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 양상에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 효모 세포, 세균 세포, 섬모 세포 또는 곤충 세포이다.
여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원 개시내용의 유효량의 항체를 대상체에게 투여함을 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 상기 암은 B 세포 악성종양이다. 일부 양상에서, 상기 항체는 약제학적으로 허용되는 조성물 중에 있다. 일부 양상에서, 항체는 전신 투여된다. 일부 양상에서, 항체는 정맥내, 피내, 종양내, 근육내, 복막내, 피하 또는 국소적으로 투여된다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 적어도 제2 항암 치료요법을 대상체에게 투여함을 포함한다. 추가의 양상에서, 제2 항암 치료요법은 수술 치료요법, 화학치료요법, 방사선 치료요법, 냉동치료요법, 호르몬 치료요법, 면역치료요법 또는 사이토카인 치료요법이다. 일부 양상에서, 제2 항암 치료요법은 입양 T-세포 치료요법을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 하기를 포함하는 항원 결합 도메인을 갖는 가공된 CD79b CAR 또는 TCR을 제공한다:
(I):
(a) 서열번호 1을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 2를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 3을 포함하는 제3 VH CDR;
(d) 서열번호 4를 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 5를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 6을 포함하는 제3 VL CDR;
(II):
(a) 서열번호 11을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 12를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 13을 포함하는 제3 VH CDR;
(d) 서열번호 14를 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 15를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 16을 포함하는 제3 VL CDR; 또는
(III):
(a) 서열번호 21을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 22를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 23을 포함하는 제3 VH CDR;
(d) 서열번호 24를 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 25를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 26을 포함하는 제3 VL CDR.
일부 양상에서, 항원 결합 도메인은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 2를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 3을 포함하는 제3 VH CDR;
(d) 서열번호 4를 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 5를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 6을 포함하는 제3 VL CDR.
추가의 양상에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 7의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 9의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 7의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 9의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 11을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 12를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 13을 포함하는 제3 VH CDR;
(d) 서열번호 14를 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 15를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 16을 포함하는 제3 VL CDR.
추가의 양상에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 17의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 19의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 17의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 19의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 항원 결합 도메인은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 21을 포함하는 제1 VH CDR;
(b) 서열번호 22를 포함하는 제2 VH CDR;
(c) 서열번호 23을 포함하는 제3 VH CDR;
(d) 서열번호 24를 포함하는 제1 VL CDR;
(e) 서열번호 25를 포함하는 제2 VL CDR; 및
(f) 서열번호 26을 포함하는 제3 VL CDR.
추가의 양상에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 27의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 29의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 27의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 29의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, CAR은 하나 이상의 신호전달 도메인 CD3ξ, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, 또는 이의 조합물을 포함한다. 일부 양상에서, CAR은 CD3ζ 및 CD28 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, CAR은 CD3ζ 및 4-1BB 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, CAR은 CD3ζ 및 OX-40 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, CAR 또는 TCR은 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 추가의 양상에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 양상에서, 항원 결합 도메인은 링커에 의해 VL 도메인에 연결된 VH 도메인을 포함한다. 추가의 양상에서, 링커는 링커 1 (서열번호 44 또는 45), 링커 2 (서열번호 46 또는 47), 링커 3 (서열번호 48 또는 49), 또는 링커 4 (서열번호 50 또는 51)이다. 일부 양상에서, CAR은 VL-링커1-VH; VL-링커2-VH; VL-링커3-VH; VL-링커4-VH; VH-링커1-VL; VH-링커2-VL; VH-링커3-VL; 또는 VH-링커4-VL을 포함한다. 일부 양상에서, CAR 또는 TCR은 힌지를 포함한다. 추가의 양상에서, 힌지는 CD8 힌지 1 (서열번호 52 또는 53), CD8 힌지 2 (서열번호 54 또는 55), CD8 힌지 3 (서열번호 56 또는 57), CD28 힌지 (서열번호 58 또는 59), IgG4 힌지 (서열번호 60 또는 61), IgG4 CH2 (서열번호 62 또는 63), IgG4 CH2CH3 (서열번호 64 또는 65), 또는 IgG4 CH1CH2CH3 (서열번호 66 또는 67)이다. 일부 양상에서, CAR은 막관통 도메인을 포함한다. 추가의 양상에서, 막관통 도메인은 CD8 TM1 (서열번호 68 또는 69), CD8 TM2 (서열번호 70 또는 71), 또는 CD28 TM (서열번호 72 또는 73)이다.
일부 양상에서, 방법은 추가로 형질도입 마커 및/또는 안전성 스위치를 포함한다. 추가의 양상에서, 형질도입 마커는 증진된 녹색 형광 단백질(eGFP)이다. 여전히 추가의 양상에서, eGFP는 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양상에서, 형질도입 마커 및/또는 안전성 스위치는 절단된 상피 성장 인자 (EGFR)이다. 추가의 양상에서, EGFR은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양상에서, 형질도입 마커 및/또는 안전성 스위치는 절단 펩타이드에 의해 CAR에 연결된다. 추가의 양상에서, 절단 펩타이드는 2A 펩타이드이다. 여전히 추가의 양상에서, 2A 폴리펩타이드는 T2A 펩타이드이다. 여전히 추가의 양상에서, T2A 펩타이드는 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양상에서, CAR은 제2 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 추가의 양상에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, 또는 CD22 항원 결합 도메인이다.
다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원 개시내용의 CAR 또는 TCR을 암호화하는 발현 벡터를 제공한다.
여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 CD79b CAR 또는 CD79b TCR을 발현하도록 가공된 숙주 세포를 제공한다. 일부 양상에서, 세포는 본원 개시내용의 CAR을 발현하도록 가공된다. 일부 양상에서, 숙주 세포는 면역 세포이다. 추가의 양상에서, 면역 세포는 T 세포이다. 여전히 추가의 양상에서, T 세포는 1차 사람 T 세포 또는 TIL이다. 다른 양상에서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 양상에서, 1차 사람 T 세포는 건강한 공여자로부터 수득된다. 일부 양상에서, T 세포는 자가 세포이다. 일부 양상에서, T 세포는 동종이계이다. 일부 양상에서, 세포는 CRISPR 또는 트랜스포사제 시스템을 사용하여 가공된다.
여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 CD79b 표적화된 T 세포 및 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 CD79b 표적화된 T 세포는 본원 개시내용의 CAR 또는 TCR을 발현하도록 가공된다.
다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 대상체에서 암의 치료를 위해 유효량의 CD79b 표적화된 T 세포를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 CD79b 표적화된 T 세포는 본원 개시내용의 CAR 또는 TCR을 발현하도록 가공된다.
여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 대상체에서 암의 치료를 위해 유효량의 CD79b 표적화된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 CD79b 표적화된 T 세포는 본원 개시내용의 CAR 또는 TCR을 발현하도록 가공된다.
다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 유효량의 CD79b 표적화된 T 세포를 대상체에게 투여함을 포함하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 여기서, 상기 CD79b 표적화된 T 세포는 본원 개시내용의 CAR 또는 TCR을 발현하도록 가공된다. 추가의 양상에서, 암은 B 세포 악성종양이다. 여전히 추가의 양상에서, B 세포 악성종양은 B 세포 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 미만성, 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 변연부 림프종, 림프형질세포 림프종, 버킷 림프종 또는 만성 림프구 백혈병이다. 일부 양상에서, 대상체에는 이전에 CD19 CAR 치료요법이 투여된 적이 있다. 일부 양상에서, 대상체는 CD19 CAR 치료요법에 내성이다. 추가의 양상에서, 대상체는 CD19 항원이 상실되어 있다. 여전히 추가의 양상에서, 대상체는 CD19-음성 종양이 재발되었다. 일부 양상에서, CD79b 표적화된 T 세포는 정맥내, 피내, 종양내, 근육내, 복막내, 피하 또는 국소적으로 투여된다. 일부 양상에서, CD79b 표적화된 T 세포는 정맥내 투여된다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 적어도 제2 항암 치료요법을 대상체에게 투여함을 포함한다. 추가의 양상에서, 제2 항암 치료요법은 수술 치료요법, 화학치료요법, 방사선 치료요법, 냉동치료요법, 호르몬 치료요법, 면역치료요법 또는 사이토킨 치료요법이다. 일부 양상에서, 암은 CD79b-발현 암이다.
특정 양상에서, CAR은 제2 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, 또는 CD22 항원 결합 도메인이다.
또 다른 구현예에서, 본원의 구현예의 CD79b CAR을 암호화하는 발현 벡터가 제공된다.
본원에서는 추가로 CD79b CAR, 예를 들어, 본원 구현예의 CD79b를 발현하도록 가공된 숙주 세포가 제공된다. 일부 양상에서, 숙주 세포는 면역 세포, 예를 들어, T 세포이다. 일부 양상에서, T 세포는 1차 사람 T 세포이다. 특정 양상에서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 양상에서, 1차 사람 T 세포는 건강한 공여자로부터 수득된다. 상기 T 세포는 자가 또는 동종 이계일 수 있다.
또한, 본원에서는 CD79b CAR T 세포, 예를 들어, 본원 구현예의 CAR T 세포, 및 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 본원에서는 추가로 유효량의 CD79b CAR T 세포, 예를 들어, CAR T 세포를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하기 위한 조성물이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 CD79b CAR T 세포, 예를 들어, 본원 구현예의 CAR T 세포를 포함하는, 대상체에서 암의 치료를 위한 조성물의 용도가 제공된다.
추가의 구현예에서, 유효량의 CD79b CAR T 세포, 예를 들어, 본원 구현예의 CAR T 세포를 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 일부 양상에서, 상기 암은 B 세포 악성 종양, 예를 들어, B 세포 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 미만성, 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 변연부 림프종, 림프질세포 림프종, 버킷 림프종 또는 만성 림프구 백혈병이다. 특정 양상에서, 암은 CD79b-발현 암이다.
일부 양상에서, 대상체에는 이전에 CD19 CAR 치료요법이 투여된 적이 있다. 특정 양상에서, 대상체는 예를 들어, CD19 항원 상실로 인해 CD19 CAR 치료요법에 내성이다. 특정 양상에서, 대상체는 CD19-음성 종양이 재발되었다.
특정 양상에서, CD79b CAR T 세포는 정맥내, 피내, 종양내, 근육내, 복막내, 피하 또는 국소적으로 투여된다. 추가의 양상에서, 상기 방법은 추가로 적어도 제2 항암 치료요법을 대상체에게 투여함을 포함한다. 일부 양상에서, 제2 항암 치료요법은 수술 치료요법, 화학치료요법, 방사선 치료요법, 냉동치료요법, 호르몬 치료요법, 면역치료요법 또는 사이토카인 치료요법이다.
본 발명의 다른 목적, 특성 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 구현예를 제시하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 개념과 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업계의 숙련자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것임을 알아야 한다.
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1a-1d: (도 1a) 세포주에서 CD79b 발현. (도 1b) 사람 조직에서 CD79b 발현. (도 1c) 백혈병에서 CD79b 발현. (도 1d) 림프종에서 CD79b 발현.
도 2a-2d: (도 2a) CD79b가 형질도입된 세포의 유동 세포측정 분석. (도 2b) CD79b 모노클로날 항체의 결합 친화성. (도 2c) CD79b 모노클로날 항체의 특징 분석. (도 2d) 림프종 세포주의 클론 14 염색.
도 3a-3d: (도 3a) CD79b CAR에 대한 작제물의 도식. (도 3b) CD79b CAR 및 CD19 CAR의 유동 세포측정 분석. (도 3c) 대조군으로서 형질도입되지 않은 T 세포와 함께 CD79b CAR 및 CD19 CAR의 퍼센트 세포독성. (도 (3d) 대조군으로서 형질도입되지 않은 T 세포와 함께 CD79b CAR 및 CD19 CAR의 유동 세포측정.
도 4a-4d: (도 4a) CD79b CAR 및 CD19 엑손 2Δ 스플라이스 변이체와 동시 배양된 T 세포. (도 4b) 4일동안 항온처리된, 5:1의 이펙터:표적 비율에서 CAR의 효율의 유동 세포측정 분석. (도 4c) CD79b CAR과 함께 Daudi 세포의 절대 세포수. (도 4d) CD79b CAR을 사용한 CD19 녹다운 세포의 절대 세포수.
도 5a-5c: (도 5a) 임상전 연구의 도식. (도 5b) 연구 동안에 마우스의 생발광 이미지. (도 5c) 연구 동안에 마우스의 퍼센트 생존률.
도 6a-6e: (도 6a) 특정 구현예의 CD79b CAR 작제물. (도 6b-6c) 그래프 및 히스토그램은 항-CD79b CAR T 세포가 Daudi 림프종 세포에 대해 시험관내 세포독성을 나타냄을 보여준다. (도 6d-6e) 그래프 및 이미지화는 항-CD79b CAR T 세포가 Daudi 림프종 이종이식편에 대해 생체내 효능을 나타냄을 보여준다.
도 7: 항-CD79b 항체(클론 5b 및 28b)의 사람 CD79b로의 결합
도 8a-8b: (도 8a) 본원의 구현예에서 사용된 항-CD79b CAR의 도메인 맵. (도 8b) EF1α 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터 (pLVEG)에서 CAR 작제물의 맵.
도 9a-9d: (도 9a) NEAT 리포터 세포에서 CAR의 형질도입. (도 9b) 항체 또는 Daudi 버킷(Burkitt) 세포와 동시 배양된 형질도입된 NFAT 리포터 세포에서 루시퍼라제 활성. (도 9c-9d) SUDHL6과 동시 배양된 형질도입된 NFAT 리포터 세포에서 루시퍼라제 활성.
도 10a-10b: (도 10a) T 세포에서 CAR의 대표적인 형질도입 효율. (도 10b) CAR을 발현하거나 발현하지 않은 T 세포에서 CD3ζ 및 ERK1/2의 인산화.
도 11a-11b: (도 11a-11b) CAR을 발현하거나 발현하지 않는 T 세포의 증식.
도 12: CAR을 발현하거나 발현하지 않는 T 세포의 사이토카인 발현.
도 13a-13b: (도 13a-13b) 림프종 세포에 응답하여 CAR을 발현하거나 발현하지 않는 T 세포의 탈과립화.
도 14a-14b: (도 14a) 림프종 세포에 대한 CAR을 발현하거나 발현하지 않는 T 세포의 세포독성 활성. (도 14b) CAR T 세포에 의한 SUDHL6 세포의 용해.
도 15a-15b: (도 15a) CAR을 발현하거나 발현하지 않은 T 세포로 처리된 마우스에서 종양 부하의 생발광 이미지화. (도 15b) CAR을 발현하거나 발현하지 않는 세포로 처리된 마우스 암 모델에서의 생존 확률.
CD79b는 범 B 세포 계통 마커이고 B 세포 수용체 복합체의 중요한 성분이다. CD79b는 정상 B 세포 및 B 세포 악성 종양에서 광범위하게 발현되고, 이의 발현은 일반적으로 CD19-특이적 CAR T 세포 치료요법 후 재발하는 CD19 음성 종양에 보유된다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 CD79b 모노클로날 항체, 및 예를 들어, CD79b-CAR T 세포에 대한 CD79b-특이적 CAR을 제공한다.
본원의 연구는 시험관내 및 생체내 모델에서 본 CD79b-특이적 CAR T 세포 생성물의 효능을 입증하였다. 3개의 뮤린 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술에 의해 사람 CD79b에 대해 개발되었고 이것은 이들이 재조합 사람 CD79b에 특이적으로 결합하고, 고친화성을 갖고(1.44-17.8 nM의 Kd 범위), 다중 림프종 세포주를 염색하는 것으로 입증되었다. 이어서, CD79b 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝하였고 렌티바이러스 작제물은 CD3ζ및 CD28/4-1BB 동시 자극 도메인을 갖는 항-CD79b CAR에 대해 개발되었다. 항-CD79b CAR 작제물은 70% 초과의 형질도입 효율로 렌티바이러스를 사용하여 건강한 공여자로부터의 1차 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 형질도입될 수 있는 것으로 입증되었다.
형질도입되지 않은 T 세포가 아닌 항-CD79b CAR T 세포는 유의적 세포독성 활성을 입증하였고 이는 Daudi 버킷 림프종 및 Mino 맨틀 세포 림프종 세포주에 대해 항-CD19 CAR T 세포를 제어하는 것에 상응하는 것으로 관찰되었다. 보다 중요하게, 항-CD19 CAR T 세포는 아니지만 항-CD79b는 CD19-CD79b+ 림프종 세포를 용해시켰다. 또한 CD4+ 및 CD8+ 항-CD79b CAR T 세포가 림프종 세포와 동시 배양되는 경우 이들 둘다에서 유의적인 탈과립화가 관찰되었다. 항-CD79b CAR T 세포의 효능은 또한 NSG 마우스에서 Mino 림프종 모델에 대해 생체내 조사하였다. 루시퍼라제-표지된 Mino 맨틀 세포 림프종 세포는 2x106 종양 세포/마우스로 NSG 마우스에 IV 주사하였다. 18일 후, 마우스에는 꼬리 정맥을 통해 10x106 T 세포/마우스로 형질도입되지 않은 1차 T 세포, 항-CD19 CAR T 세포 또는 항-CD79b CAR T 세포로 처리하였다. 생발광 이미지화를 사용하여 종양 부하를 평가하였다. 결과는 형질감염되지 않은 T 세포로 처리된 마우스에서 진행성 종양 성장을 보여주었다. 반면 항-CD19- 및 항-CD79b CAR T 세포로 처리된 마우스에서, 종양 성장은 억제되었고 생존률은 개선되었다. 따라서, 이들 결과는 B 세포 악성종양을 갖는 환자에서 상기 신규 항-CD29b CAR T 세포 치료요법의 효능을 보여주었고 이는 CD19-특이적 CAR T-세포 치료요법 후 CD19 상실로 인한 내성을 극복하기 위한 신규 전략일 수 있다.
일부 양상에서, 본 발명의 항-CD79b CAR 작제물은 렌티바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 벡터는 T 세포와 같은 면역 세포에 형질도입될 수 있다. 작제물은 CD28, CD3ζ, 및/또는 4-1BB 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 작제물은 eGFP 또는 절단된 EGFR 도메인과 같은 형질도입 마커를 포함할 수 있다. 형질도입 마커는 2A 펩타이드와 같은 절단 펩타이드에 의해 CAR에 연결될 수 있다.
추가로 본원에서는 본원에 제공된 T 세포와 같은 CD79b-특이적 CAR 면역 세포를 투여함에 의해 암을 치료하는 방법이 제공된다. 암은 B 세포 악성종양, 예를 들어, CD79b를 발현하는 B 세포 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 미만성 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 변연부 림프종, 림프질세포 림프종, 버킷 림프종 또는 만성 림프구 백혈병일 수 있다. 본 발명의 치료요법을 사용하여 항-CD19-CAR T 세포 치료요법 후 CD19 음성 종양이 재발된, B 세포 악성종양을 갖는 대상체를 치료할 수 있다.
II. 정의
본원에서 사용된 바와 같이, 특정 성분과 관련하여 "필수적으로 부재"라는 용어는 특정 성분의 어떠한 것도 의도적으로 조성물 내로 제형화하여 넣지 않았고/않았거나 해당 특정 성분이 오염물로서만 존재하거나 미량으로만 존재하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 야기된 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01%이다. 표준 분석 방법으로 특정 성분의 양이 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본원 명세서에서, 단수형 관사("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구항에서, 단수형 관사 ("a" 또는 "an")는 "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용되는 경우 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 "또 다른" 이라는 말은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 용어 “약”, “실질적으로” 및 “대략적으로”는 일반적으로 기재된 값의 + 또는 - 5%를 의미한다.
질환 또는 병태의 “치료하는" 또는 치료는 질환의 징후 또는 증상을 완화시키는 노력에서 하나 이상의 약물을 환자에게 투여함을 포함할 수 있는 프로토콜을 실행함을 언급한다. 바람직할 수 있는 치료 효과는 질환 진행율의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 완화는 이들의 출현 후 뿐만 아니라 질환 또는 병태의 징후 또는 증상 출현 전에 일어날 수 있다. 따라서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 목적하지 않을 수 있는 병태를 “예방하는” 또는 이의 “예방”을 포함할 수 있다. 추가로, "치료하는" 또는 "치료"는 징후 또는 증상의 완전한 완화를 요구하지 않고, 치유를 요구하지 않으며 구체적으로 환자에 대해 단지 미진한 효과를 갖는 프로토콜을 포함한다.
본원 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 이득" 또는 "치료학적 유효량"은 상기 병태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 웰빙을 촉진시키거나 증진시키는 어떠한 것을 언급한다. 이것은 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도에서의 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 암의 치료는 예를 들어, 종양 크기에서의 감소, 종양 공격성에서의 감소, 암 성장율에서의 감소 또는 전이의 예방을 포함할 수 있다. 암의 치료는 또한 암을 갖는 대상체의 생존을 지연시키는 것을 언급할 수 있다.
“대상체" 및 "환자"는 사람 또는 비-사람, 예를 들어, 영장류, 포유동물 및 척추동물을 언급한다. 특정 구현예에서, 대상체는 사람이다.
용어 "약제학적 또는 약제학적으로 허용되는"은 동물, 예를 들어, 적절하게 사람에게 투여되는 경우 역반응, 알레르기 반응 또는 다른 원치않는 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 언급한다. 항체 또는 추가의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 제조는 본원 개시내용의 측면에서 당업자에게 공지되어 있다. 더욱이, 동물 (예를 들어, 사람) 투여에 대해, 제조는 생물학적 표준의 FDA 사무국에 의해 요구되는 바와 같이 멸균성, 발열성, 일반적인 안정성 및 순도 표준을 충족해야만 하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은, "약제학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지된 바와 같이, 임의의 및 모든 수성 용매(예를 들어, 물, 알콜/수용액, 식염수 용액, 비경구 비히클, 예를 들어, 염화나트륨, 링거 덱스트로스 등), 비-수성 용매(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸올레에이트), 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항세균 또는 항진균 제제, 항-산화물, 킬레이팅 제제 및 불활성 가스), 등장성 제제, 흡수 지연제, 염, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향제, 염료, 유체 및 영양물 보충제, 상기 유사 물질 및 이의 조합물을 포함한다. 약제학적 조성물 중 다양한 성분들의 pH 및 정확한 농도는 널리 공지된 파라미터에 따라 조정된다.
III. CD79b 항체
특정 구현예에서, CD79b의 적어도 일부에 결합하고 적어도 신호전달을 포함하는 임의의 종류의 Cd79b 활성을 억제하는 항체 또는 이의 단편은 고려된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 “항체”는 항원 결합 활성을 보유하는 항체 CDR 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 뿐만 아니라 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, 및 유전학적으로 변형된 IgG와 같은, 임의의 면역학적 결합제를 광범위하게 언급하는 것으로 의도된다. 항체는 키메라 항체, 친화성 성숙화된 항체, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 사람화된 항체, 사람 항체 또는 항원-결합 항체 단편 또는 천연 또는 합성 리간드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 특정 경우에, 항-CD79b 항체는 모노클로날 항체 또는 사람화된 항체이다.
따라서, 공지된 수단에 의해 그리고 본원에 기재된 바와 같이, Cd79b, 이의 각각의 에피토프 중 하나 이상 또는 이전의 임의의 접합체에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 항체 단편 및 결합 도메인 및 CDR (이전의 임의의 가공된 형태를 포함하는)이 생성될 수 있고, 상기 항원 또는 에피토프는 천연 공급원으로부터 단리되든, 합성 유도체이든 또는 천연 화합물의 변이체이든 상관 없다.
본원의 구현예를 위해 적합한 항체 단편의 예는 제한 없이 다음을 포함한다: (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 “Fd” 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 “Fv” 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 “dAb” 단편; (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (vii) 단일쇄 Fv 분자(“scFv”)로서, VH 도메인 및 VL 도메인이 펩타이드 링커에 의해 연결되어 2개의 도메인이 연합하도록 하여 결합 도메인을 형성하는 단일쇄 Fv 분자(“scFv”); (viii) 이특이적 단일쇄 Fv 이량체(미국 특허 제5,091,513호 참조); 및 (ix) 유전자 융합에 의해 작제된 디아바디, 다가 또는 다중 특이적 단편(미국 특허 출원 공개 제20050214860호). Fv, scFv, 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디설피드 연결의 도입에 의해 안정화될 수 있다. CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디가 제조될 수 있다.
항체 유사 결합 펩티도모사체는 또한 구현예에 고려된다. 문헌(참조: Liu et al. (2003))은 “항체 유사 결합 펩티도모사체” (ABiP)이고 이는 삭감된 항체로서 작용하고 덜 번거로운 합성 방법 뿐만 아니라 보다 긴 혈청 반감기의 특정 이점을 갖는 펩타이드이다.
동물은 CD79b 세포외 도메인 (ECD) 단백질과 같은 항원으로 접종되어 C D79b에 특이적인 항체를 생성할 수 있다. 흔히, 항원은 면역 반응을 증진시키기 위해 또 다른 분자에 결합되거나 접합된다. 본원에 사용된 바와 같은, 접합체는 동물에서 면역 반응을 유발하기 위해 사용되는 항원에 결합된 임의의 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 비-단백질성 물질이다. 항원 접종에 반응하여 동물에서 생성된 항체는 다양한 개별 항체 생성 B 림프구로부터 제조된 다양한 비-동일성 분자 (폴리클로날 항체)를 포함한다. 폴리클로날 항체는 항체 종의 혼합 집단이고 이의 각각은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프를 인지할 수 있다. 동물에서 폴리클로날 항체 생성을 위한 올바른 조건을 고려하면, 동물의 혈청에서 항체 대부분은 동물이 면역화된 항원성 화합물 상의 총체적 에피토프를 인지할 것이다. 상기 특이성은 추가로 목적하는 항원 또는 에피토프를 인지하는 항체만을 선택하기 위한 친화성 정제에 의해 증진된다.
모노클로날 항체는 단일 종의 항체이고, 여기서, 모든 항체 분자는 모든 항체 생성 세포가 단일 B-림프구 세포주로부터 유래되기 때문에 동일한 에피토프를 인지한다. 모노클로날 항체 (MAb)를 생성하기 위한 방법은 일반적으로 폴리클로날 항체를 제조하기 위한 것들과 동일한 라인을 따라 개시한다. 일부 구현예에서, 마우스 및 래트와 같은 설치류는 모노클로날 항체를 생성하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 토끼, 양, 또는 개구리 세포는 모노클로날 항체를 생성하는데 사용된다. 래트의 사용은 널리 공지되어 있고 특정 이점을 제공할 수 있다. 마우스(예를 들어, BALB/c 마우스)는 통상적으로 사용되고 일반적으로 높은 퍼센트의 안정한 융합을 제공한다.
하이브리도마 기술은 CD79b 항원으로 이전에 면역화된 마우스 기원의 단일 B 림프구와 불멸의 골수종 세포 (일반적으로, 마우스 골수종)의 융합을 포함한다. 상기 기술은 무제한의 생성을 위해 단일 항체-생성 세포를 증식시키는 방법을 제공하여, 동일한 항원 또는 에피토프 특이성 (모노클로날 항체)을 갖는 비제한적 양의 구조적으로 동일한 항체가 생성될 수 있다.
혈장 B 세포 (CD45+CD5-CD19+)는 면역화된 토끼의 새롭게 제조된 토끼 말초 혈액 단핵 세포로부터 단리될 수 있고 추가로 CD79b 결합 세포에 대해 선택될 수 있다. 항체 생성 B 세포의 집적 후, 총 RNA는 단리될 수 있고, cDNA가 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 둘다로부터 항체 가변 영역의 DNA 서열은 증폭될 수 있고, 파아지 디스플레이 Fab 발현 벡터로 작제될 수 있고 이. 콜리(E. Coli)를 형질전환시킬 수 있다. CD79b 특이적 결합 Fab는 다중 라운드의 집적 패닝을 통해 선택될 수 있고 서열분석될 수 있다. 선택된 CD79b 결합 히트는 사람 배아 신장 (HEK293) 세포 (Invitrogen)에서 포유동물 발현 벡터 시스템을 사용하여 토끼 및 토끼/사람 키메라 형태로 전장 IgG로서 발현될 수 있고 신속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) 분리 유닛과 함께 단백질 G 수지를 사용하여 정제될 수 있다.
하나의 구현예에서, 항체는 키메라 항체, 예를 들어, 이종성 비-사람, 사람 또는 사람화된 서열 (예를 들어, 골격 및/또는 불변 도메인 서열)에 이식된 비-사람 공여자 기원의 항원 결합 서열을 포함하는 항체이다. 사람 기원의 유사 도메인을 갖는 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄 불변 도메인을 대체하여 외래 항체의 가변 영역이 온전한 상태로 잔류시키는 방법이 개발되었다. 또한, “완전한 사람” 모노클로날 항체는 사람 면역글로불린 유전자에 대해 유전자전이된 마우스에서 생성된다. 설치류, 예를 들어, 마우스 및 사람 아미노산 서열 둘다를 갖는 항체 가변 도메인을 재조합적으로 작제함에 의해 모노클로날 항체의 가변 도메인을 보다 사람 형태로 전환시키는 방법이 개발되었다. “사람화된” 모노클로날 항체에서, 초가변 CDR만이 마우스 모노클로날 항체로부터 유래하고, 골격 및 불변 영역은 사람 아미노산 서열로부터 유래한다(문헌참조: 미국 특허 제5,091,513호 및 제6,881,557호). 설치류의 특징인 항체에서의 아미노산 서열을 사람 항체의 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산 서열로 대체하는 것은 치료학적 사용 동안에 면역 부작용의 가능성을 감소시킬 것으로 사료된다. 하이브리도마 또는 항체를 생성하는 다른 세포는 또한 유전학적 돌연변이 또는 다른 변화에 적용될 수 있고 이것은 하이브리도마에 의해 생성된 항체의 결합 특이성을 변경할 수 있거나 변경하지 않을 수 있다.
사람화된, 키메라 및 완전한 사람을 포함하는 다양한 유형의 모노클로날 항체를 생성하기 위한 방법 뿐만 아나리 다양한 동물 종에서 폴리클로날 항체를 생성하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 고도로 예측가능하다. 예를 들어, 하기 미국 특허 및 특허 출원은 상기 방법의 가능한 기재를 제공한다: 미국 특허 출원 제2004/0126828호 및 제2002/0172677호; 및 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,196,265호; 제4,275,149호; 제4,277,437호; 제366,241호; 제4,469,797호; 제,472,509호; 제4,606,855호; 제4,703,003호; 제4,742,159호; 제4,767,720호; 제4,816,567호; 제4,867,973호; 제4,938,948호; 제4,946,778호; 제5,021,236호; 제5,164,296호; 제5,196,066호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,420,253호; 제5,565,332호; 제5,571,698호; 제5,627,052호; 제5,656,434호; 제5,770,376호; 제5,789,208호; 제5,821,337호; 제5,844,091호; 제5,858,657호; 제5,861,155호; 제5,871,907호; 제5,969,108호; 제6,054,297호; 제6,165,464호; 제6,365,157호; 제6,406,867호; 제6,709,659호; 제6,709,873호; 제6,753,407호; 제6,814,965호; 제6,849,259호; 제6,861,572호; 제6,875,434호; 및 제6,891,024호. 본원이나 상기 문헌에 인용된 모든 특허, 특허 출원 공개 공보 및 다른 공보는 본원에서 참조로 인용된다.
항체는 조류 및 포유동물을 포함하는, 임의의 동물 공급원으로부터 제조될 수 있다. 바람직하게, 항체는 양, 뮤린 (예를 들어, 마우스 및 래트), 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말 또는 닭이다. 추가로, 보다 새로운 기술은 사람 조합 항체 라이브러리로부터 사람 항체의 개발 및 스크리닝을 가능하게 한다. 예를 들어, 박테리오파아지 항체 발현 기술은 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,946,546호에 기재된 바와 같은 동물 면역화의 부재하에 특이적 항체가 생성되도록 한다.
CD79b에 대한 항체는 동물 종, 모노클로날 세포주 또는 기타 항체 공급원에 관계없이 CD79b의 효과를 중화하거나 대응하는 능력을 가질 것으로 완전히 예상된다. 특정 동물 종은 이들이 항체의 “Fc” 부분을 통한 보체계의 활성화로 인해 알레르기 반응을 유발할 가능성이 보다 높을 수 있기 때문에 치료학적 항체를 생성하기 위해 덜 바람직할 수 있다. 그러나, 전체 항체는 효소적으로 “Fc” (보체 결합) 단편으로 및 결합 도메인 또는 CDR을 갖는 항체 단편으로 분해될 수 있다. Fc 부분의 제거는 항원 항체 단편이 목적하지 않은 면역학적 반응을 유발할 가능성을 감소시키고, 따라서 Fc가 없는 항체는 예방학적 또는 치료학적 치료를 위해 바람직할 수 있다. 상기된 바와 같이, 항체는 또한 다른 종에서 생성되거나 다른 종 기원의 서열을 갖는 항체를 동물에게 투여하여 비롯되는 면역학적 부작용을 감소시키거나 제거하기 위해, 키메라 또는 부분적으로 또는 완전한 사람이도록 작제될 수 있다.
치환 변이체는 전형적으로 단백질 내 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 교환을 함유하고 다른 기능 또는 성질의 상실 또는 상실 없이 폴리펩타이드의 하나 이상의 성질을 조절하도록 디자인될 수 있다. 치환은 보존적일수 있고, 즉, 하나의 아미노산은 유사한 형태 또는 전하 중 하나로 대체된다. 보존적 치환은 당업계에 널리 공지되어 있고 예를 들어, 하기의 변화를 포함한다: 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 라이신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파르테이트로; 글라이신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 라이신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로. 또한, 치환은 비-보존적이어서 폴리펩타이드의 기능 또는 활성이 영향받을 수 있다. 비-보존적 변화는 전형적으로 하나의 잔기가 화학적으로 유사하지 않은 잔기로의 치환, 예를 들어, 극성 또는 하전된 아미노산의 비극성 또는 하전되지 않은 아미노산으로의 치환 및 그 반대의 치환을 포함한다.
단백질은 재조합체일 수 있거나 시험관내 합성될 수 있다. 또한, 비-재조합 또는 재조합 단백질은 세균으로부터 단리될 수 있다. 또한 상기 변이체를 함유하는 세균이 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 결과적으로, 단백질은 단리될 필요가 없다.
조성물에서 ml 당 약 0.001 mg 내지 약 10 mg의 총 폴리펩타이드, 펩타이드 및/또는 단백질이 있는 것으로 고려된다. 따라서, 조성물 내 단백질의 농도는 약, 적어도 약 또는 최대 약 0.001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 mg/ml 이상(또는 여기에서 유래될 수 있는 임의의 범위)일 수 있다. 이중에서, 약, 적어도 약, 또는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%는 CD79b에 결합하는 항체일 수 있다.
항체 또는 바람직하게 항체의 면역학적 부분은 화학적으로 다른 단백질에 접합되거나 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 본원 명세서 및 첨부된 청구항의 목적을 위해, 모든 상기 융합된 단백질은 항체 또는 항체의 면역학적 부분의 정의에 포함된다.
구현예는 CD79b에 대한 항체 및 항체 유사 분자, 적어도 하나의 제제와 연결되어 항체 접합체 또는 페이로드를 형성하는 폴리펩타이드 및 펩타이드를 제공한다. 진단학적 또는 치료학적 제제로서 항체 분자의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 하나의 목적하는 분자 또는 모이어티에 연결하거나 공유 결합시키거나 이와 복합체를 형성시키는 것이 통상적이다. 상기 분자 또는 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 이펙터 분자는 목적하는 활성, 예를 들어, 세포독성 활성을 갖는 분자를 포함한다. 항체에 부착된 이펙터 분자의 비제한적인 예는 독소, 치료학적 효소, 항생제, 방사능-표짇된 뉴클레오타이드 등을 포함한다. 대조적으로, 리포터 분자는 검정을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로서 정의된다. 항체에 접합된 리포터 분자의 비제한적인 예는 효소, 방사성표지, 합텐, 형광성 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 발광 분자, 광친화성 분자, 착색된 입자 또는 리간드, 예를 들어, 비오틴을 포함한다.
여러 방법은 항체의 이의 접합체 모이어티로의 부착 또는 접합을 위해 당업계에 공지되어 있다. 일부 접착 방법은 예를 들어, 유기 킬레이팅제, 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물 (DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 항체에 접착된 테트라클로로-3-6-디페닐글리코우릴-3을 사용하는 금속 킬레이트 착물의 용도를 포함한다. 모노클로날 항체는 또한 글루타르알데하이드 또는 페리오데이트와 같은 커플링제의 존재하에 효소와 반응될 수 있다. 플루오레세인 마커와의 접합체는 이들 커플링제의 존재하에 제조되거나 이소티오시아네이트와 반응시킴에 의해 제조된다.
IV. 세포 치료요법
본원 개시내용의 특정 구현예는 암 세포를 표적화하기 위한 면역치료요법으로서 세포를 수득하고 이를 대상체에게 투여하는 것에 관한 것이다. 세포는 본원에 포함된 항체 조성물을 전달할 수 있지만 그 자체는 면역 세포일 수도 있고 아닐 수도 있다. 특정 구현예에서, 세포는 면역 세포이다. 세포의 예는 T 세포(αβ T 세포 또는 γδ T 세포를 포함하는), 천연 킬러 (NK) 세포, 비변형 NKT (iNKT) 세포, B 세포, 대식세포, 임의의 종류의 줄기 세포 (MSC 또는 유도된 만능 줄기 세포를 포함하는) 또는 수지상 세포를 포함한다.
기능성 항-종양 이펙터 T 세포의 유도화, 활성화 및 확장을 위한 여러 기본 접근법은 지난 20년 동안 보고되었다. 이들은 다음을 포함한다: 자가유래 세포, 예를 들어, 종양-침윤 림프구 (TIL); 자가유래 DC를 사용하여 생체외 활성화된 T 세포, 림프구, 인공 항원-제공 세포 (APC) 또는 T 세포 리간드 및 활성화 항체로 코팅된 비드, 또는 표적세포막을 포획함에 의해 단리된 세포; 항-숙주 종양T 세포 수용체 (TCR)를 천연적으로 발현하는 동종이계 세포; 및 "T-몸체"로서 공지된 항체 유사 종양 인지 능력을 나타내는 종양-반응성 TCR 또는 키메라 TCR 분자를 발현하도록 유전학적으로 재프로그래밍되거나 “재지시된” 비-종양-특이적 자가유래 또는 동종이계 세포. 이들 접근법은 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있는 T 세포 제조 및 면역화를 위한 수많은 프로토콜을 생성하였다.
A. T 세포 제조
일부 구현예에서, T 세포는 혈액, 골수, 림프, 또는 림프성 기관으로부터 유래한다. 일부 양상에서, 세포는 사람 세포이다. 세포는 전형적으로 1차 세포, 예를 들어, 대상체로 부터 직접 단리되고/되거나 대상체로부터 단리되어 동결된 것들이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포 또는 다른 세포 유형의 하나 이상의 서브세트, 예를 들어, 전체 T 세포 집단, CD4+　세포, CD8+　세포, 및 이의 서브집단, 예를 들어, 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화를 위한 잠재력, 확장, 재순환, 위치화 및/또는 지속성 능력, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 격실내에서의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화 정도에 의해 한정된 것들을 포함한다. 치료될 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가일 수 있다. 일부 양상에서, 예를 들어, 상용 기술에 대해, 세포들은 만능 및/또는 다능성 세포, 예를 들어, 줄기 세포, 예를 들어, 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 세포를 단리하고, 이들을 제조하고, 가공하고, 배양하고/하거나 조작하고 이들을 냉동보존 전 또는 후에 동일한 환자에게 재도입함을 포함한다.
T 세포 (예를 들어, CD4+　및/또는 CD8+　T 세포)의 서브유형 및 서브집단 중에는 순수 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 메모리 T 세포 및 이의 서브타입, 예를 들어, 줄기 세포 메모리 T (TSCM), 중추 메모리 T (TCM), 이펙터 메모리 T (TEM), 또는 최종적으로 분화된 이펙터 메모리 T(TTEMRA) 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막 연합 불변 T (MAIT) 세포, 천연적으로 존재하고 적응성 조절 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들어, TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 난포 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 구현예에서, T 세포 집단의 하나 이상은 특이적 마커, 예를 들어, 표면 마커에 대해 양성이거나 특이적 마커에 대해 음성인 세포에 대해 집적되거나 고갈된다. 일부 경우에, 상기 마커는 T 세포의 특정 집단 (예를 들어, 비-메모리 세포)상에 부재이거나 비교적 보다 낮은 수준으로 발현되는 것들 및 존재하거나 T 세포의 특정 다른 집단 (예를 들어, 메모리 세포) 상에 존재하거나 비교적 보다 높은 수준으로 발현되는 것들이다. 하나의 구현예에서, 세포(예를 들어, CD8+ 세포 또는 CD3+ 세포)는 CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127, 및/또는 CD62L에 대해 양성이거나 높은 표면 수준을 발현하는 (즉, 이에 대해 양성으로 선택된) 세포에 대해 집적되고/되거나 CD45RA에 대해 양성이거나 높은 표면 수준을 발현하는 (예를 들어, 이에 대해 음성으로 선택된) 세포가 고갈된다. 일부 구현예에서, 세포는 CD122, CD95, CD25, CD27, 및/또는 IL7-Ra (Cd127)에 대해 양성이거나 높은 표면 수준을 발현하는 세포에 대해 집적되거나 세포가 고갈된다. 일부 예에서, CD8+ T 세포는 CD45RO에 대해 양성 (또는 CD45RA에 대해 음성) 및 CD62L에 대해 양성인 세포에 대해 집적된다.
일부 구현예에서, T 세포는 비-T 세포, 예를 들어, B 세포, 단핵구, 또는 다른 백혈구 세포 상에서 발현되는 마커, 예를 들어 CD 14의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 양상에서, CD4+　또는 CD8+　선택 단계는 CD4+　헬퍼 및 CD8+세포독성 T 세포를 분리하기 위해 사용된다. 상기 CD4+　및 CD8+　집단은 추가로 하나 이상의 순수, 메모리 및/또는 이펙터 T 세포 서브집단상에서 발현되거나 비교적 보다 높은 정도로 발현되는 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 서브집단으로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 추가로 예를 들어, 각각의 서브집단과 관련된 표면 항원을 기준으로 양성 또는 음성 선택에 의해 순수, 중추 기억, 이펙터 기억 및/또는 중추 기억 줄기 세포에 대해 집적되거나 이들이 고갈된다. 일부 구현예에서, 중추 기억 T (TCM) 세포에 대한 집적은 효능을 증가시키기 위해, 예를 들어, 일부 양상에서 특히 상기 서브집단에서 강력한, 투여 후 장기 생존, 확장 및/또는 생착을 개선시키기 위해 수행된다. 일부 구현예에서, TCM- 집적된 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 조합은 추가로 효능을 증진시킨다.
일부 구현예에서, T 세포는 자가유래 T 세포이다. 상기 방법에서, 종양 샘플은 환자로부터 수득하였고, 단일 세포 현탁액을 수득한다. 단일 세포 현탁액은 임의의 적합한 방식, 예를 들어, 기계적으로(예를 들어, gentleMACS™ 분해기를 사용하여 종양을 분해시키는, Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.) 또는 효소적으로(예를 들어, 콜라게나제 또는 DNase) 수득될 수 있다. 종양 효소 분해물의 단일-세포 현탁액을 인터류킨-2 (IL-2)에서 배양한다. 세포는 컨플루언스할때까지(예를 들어, 약 2×106 림프구), 예를 들어, 약 5 내지 21일, 바람직하게 약 10 내지 약 14일까지 배양한다. 예를 들어, 세포는 5일, 5.5일, 또는 5.8일로부터 21일, 21.5일, 또는 21.8일까지, 에를 들어, 10일, 10.5일, 또는 10.8일로부터 14일, 14.5일, 또는 14.8일까지 배양할 수 있다.
배양된 T 세포를 풀링하고 신속하게 확장시킬 수 있다. 신속한 확장은 약 10 내지 약 14일, 바람직하게 14일의 기간 동안 적어도 약 50배 (예를 들어, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 또는 100-배 이상)의 항원-특이적 T-세포 수의 증가를 제공한다. 보다 바람직하게, 신속한 확장은 약 10 내지 약 14일, 바람직하게 약 14일의 기간 동안 적어도 약 200-배 (예를 들어, 200-, 300-, 400-, 500-, 600-, 700-, 800-, 900- 이상)의 증가를 제공한다.
확장은 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 다수의 방법에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 피더 림프구 및 인터류킨-2 (IL-2) 또는 인터류킨-15 (IL-15)의 존재하에 바람직하게는 IL-2의 존재하에 비-특이적 T-세포 수용체 자극을 사용하여 신속하게 확장될 수 있다. 비-특이적 T-세포 수용체 자극은 약 30 ng/ml 용량의 OKT3, 마우스 모노클로날 항-CD3 항체(Ortho-McNeil®, Raritan, N.J.로부터 가용함)를 포함한다. 대안적으로, T 세포는 임의로 벡터로 부터 발현될 수 있는, 암의 하나 이상의 항원 (이의 항원성 부분, 예를 들어, 에피토프(들) 또는 세포), 예를 들어, 사람 백혈구 항원 A2 (HLA-A2) 결합 펩타이드를 사용하여, T-세포 성장 인자, 예를 들어, 300 IU/ml IL-2 또는 IL-15, 바람직하게는 IL-2의 존재하에 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 시험관내 자극에 의해 신속하게 확장될 수 있다. 시험관내 유도된 T-세포는 HLA-A2-발현 항원-제공 세포 상에 펄싱된 암의 동일한 항원(들)을 사용한 재-자극에 의해 신속하게 확장될 수 있다. 대안으로, T-세포는 예를 들어, 조사된 자가유래 림프구로 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2로 재자극될 수 있다.
자가유래 T 세포를 변형시켜 자가유래 T 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 T 세포 성장 인자를 발현시킬 수 있다. 적합한 T 세포 성장 인자들은 예를 들어, 인터류킨 (IL)-2, IL-7, IL-15, 및 IL-12를 포함한다. 변형을 위한 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994)을 참조한다. 특정 양상에서, 변형된 자가유래 T 세포는 고수준으로 T 세포 성장 인자를 발현한다. IL-12의 서열과 같은 T 세포 성장 인자 암호화 서열은 당업계에서 용이하게 가용하고, T 세포 성장 인자 암호화 서열로 작동가능하게 연결된 프로모터는 고수준의 발현을 촉진시킨다.
B. 유전학적으로 가공된 항원 수용체
세포는 가공된 TCR 및/또는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 가공된 항원 수용체를 발현하도록 유전학적으로 가공될 수 있다. 예를 들어, 자가유래 T-세포는 암 항원, 예를 들어, CD79b에 대해 항원 특이성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)을 발현하도록 변형된다. 적합한 TCR은 예를 들어, 흑색종 항원, 예를 들어, gp100 또는 MART-1에 대해 항원 특이성을 갖는 것들을 포함한다. 변형을 위한 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 문헌(Sambrook and Ausubel)을 참조한다. 예를 들어, T 세포는 문헌(참조: Heemskerk et al. Hum Gene Ther. 19:496-510 (2008) and Johnson et al. Blood 114:535-46 (2009))에 기재된 형질도입 기술을 사용하여 암 항원에 대한 항원 특이성을 갖는 TCR을 발현하도록 형질도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 T 세포는 하나 이상의 항원 수용체를 암호화하는 유전학적 가공을 통해 도입된 하나 이상의 핵산, 및 상기 핵산의 유전학적으로 가공된 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 즉, 통상적으로 가공된 세포 및/또는 상기 세포가 유래되는 유기체에서 발견되지 않는, 또 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것과 같이 세포로부터 수득된 세포 또는 샘플 중에 존재하지 않는 이종성이다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연적으로 존재하지 않는, 예를 들어, 천연에서 발견되지 않는 핵산(예를 들어, 키메라)이다.
일부 구현예에서, CAR은 CD79b에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인지 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 세포 표면 상에서 발현되는 단백질이다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR-유사 CAR이고 상기 항원은 가공된 펩타이드 항원, 예를 들어, TCR과 같이 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자와 관련하여 세포 표면 상에서 인지되는 세포내 단백질의 펩타이드 항원이다.
CAR 및 재조합 TCR을 포함하는 예시적 항원 수용체, 및 수용체를 가공하고 세포에 도입하기 위한 방법은 예를 들어, 문헌(참조: 국제 특허 출원 공개 공보 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 출원 공개 공보 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 제6,451,995호, 제7,446,190호, 제8,252,592호, 제8,339,645호, 제8,398,282호, 제7,446,179호, 제6,410,319호, 제7,070,995호, 제7,265,209호, 제7,354,762호, 제7,446,191호, 제8,324,353호, 및 제8,479,118호, 및 유럽 특허 출원 EP2537416)에 기재된 것들, 및/또는 문헌(참조: Sadelain et al., 2013; Davila et al. 2013; Turtle et al., 2012; Wu et al., 2012)에 기재된 것들을 포함한다. 일부 양상에서, 유전학적으로 가공된 항원 수용체는 미국 특허 제7,446,190호에 기재된 바와 같은 CAR, 및 국제 특허 출원 공개 공보 WO/2014055668 Al에 기재된 것들을 포함한다.
1. 키메라 항원 수용체
일부 구현예에서, CAR은 다음을 포함한다: a) 세포내 신호전달 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인.
일부 구현예에서, 가공된 항원 수용체는 활성화 또는 자극 CAR, 동시 자극 CAR (문헌참조: WO2014/055668), 및/또는 억제 CAR (iCAR, 문헌(Fedorov et al., 2013)을 참조한다)을 포함하는 CAR을 포함한다. CAR은 일반적으로 일부 양상에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호전달 성분에 연결된 세포외 항원 (또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 상기 분자는 전형적으로 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공동 자극 수용체와 조합된 상기 수용체를 통한 신호 및/또는 단독의 공동 자극 수용체를 통한 신호를 모방하거나 근접한다.
본원의 개시내용의 특정 구현예는 세포내 신호전달 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 신호전달 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 면역원성을 감소시키기 위해 사람화된 CAR (hCAR)을 포함하는 항원-특이적 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 핵산의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, CAR은 하나 이상의 항원 간의 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인지할 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 영역은 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역, 모노클로날 항체의 가변 영역 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 특이성은 수용체에 결합하는 펩타이드 (예를 들어, 사이토카인)로부터 유래한다.
사람 CAR 핵산은 사람 환자에 대한 세포성 면역치료요법을 증진시키기 위해 사용되는 사람 유전자들일 수 있는 것으로 고려된다. 특이적 구현예에서, 본원의 개시내용은 전장 CAR cDNA 또는 암호화 영역을 포함한다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제7,109,304호에 기재된 것들과 같은 특정 사람 모노클로날 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 또한 사람 항원-특이적 항체의 임의의 수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 보다 구체적인 구현예에서, 상기 단편은 사람 세포에서 발현을 위한 사람 코돈 용법을 위해 최적호된 서열에 의해 암호화된 항원-특이적 scFv이다.
정렬은 다량체성, 예를 들어, 디아바디 또는 다량체일 수 있다. 다량체는 경쇄 및 중쇄의 가변부의 가교 결합쌍에 의해 디아바디로 형성될 가능성이 높다. 작제물의 힌지 부분은 전체적으로 결실되고, 제1 시스테인이 유지되고, 세린 보다는 프롤린 치환, 제1 시스테인까지 절단된 다중 대안물을 가질 수 있다. Fc 부분은 결실될 수 있다. 안정하고/하거나 이량체화하는 임의의 단백질은 상기 목적에 작용할 수 있다. Fc 도메인, 예를 들어, 사람 면역글로불린으로부터의 CH2 또는 CH3 도메인 중 단지 하나를 사용할 수 있다. 또한, 이량체화를 개선시키기 위해 변형된 사람 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있다. 또한 단지 면역글로불린의 힌지 부분을 사용할 수 있다. 또한 CD8알파 부분을 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR 핵산은 막관통 도메인 및 변형된 CD28 세포내 신호전달 도메인과 같은, 다른 동시자극 수용체를 암호화하는 서열을 포함한다. 다른 동시자극 수용체는 하나 이상의 CD28, CD27, OX-40 (CD134), 및 4-1BB (CD137)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 입양 치료요법에 의해 표적화될 특정 세포 유형에서 발현되는 항원, 예를 들어, 암 마커 및/또는 약화된 반응을 유도하기 위해 의도된 항원, 예를 들어, 정상 또는 비-환부 세포 유형 상에 발현되는 항원과 같은 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR이 작제된다. 따라서, CAR은 전형적으로 세포외 부분에서, 하나 이상의 항원 결합 분자, 예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인, 또는 이의 일부, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인, 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 모노클로날 항체 (mAb)의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)로부터 유래된 단일쇄 항체 단편 (scFv)와 같은 항에 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들을 포함한다.
키메라 수용체를 암호화하는 개방 판독 프레임의 서열은 게놈 DNA 공급원, cDNA 공급원으로부터 수득될 수 있거나 합성되거나 (예를 들어, PCR을 통해) 이의 조합일 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 의존하여, 인트론이 mRNA를 안정화시키는것으로 밝혀짐에 따라 cDNA 또는 이의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 추가로, mRNA를 안정화시키기 위해 내인성 또는 외인성 비-암호화 영역을 사용하는 것이 유리할 수 있다.
키메라 작제물은 누출된 DNA로서 또는 적합한 벡터에서 면역 세포로 도입될 수 있는 것으로 고려된다. 세포를, 누출된 DNA를 사용하는 전기천공에 의해 안정하게 형질감염시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,410,319호를 참조한다. 누출된 DNA는 일반적으로 발현을 위한 적당한 배향에서 플라스미드 발현 벡터 내 함유된, 키메라 수용체를 암호화하는 DNA를 언급한다.
대안적으로, 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 키메라 작제물을 마우스 세포에 도입할 수 있다. 본원의 개시내용의 방법에 따라 사용하기 위해 적합한 벡터는 면역 세포에서 비-복제성이다. 바이러스를 기반으로 하는 다수의 벡터가 공지되어 있고, 여기서, 세포에 유지되는 바이러스의 카피수는 세포의 생존율을 유지하기에 충분히 낮고, 예를 들어, HIV, SV40, EBV, HSV, 또는 BPV를 기반으로 하는 벡터가 있다.
일부 양상에서, 항원-특이적 결합, 또는 인지 성분은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 천연적으로 CAR 내 도메인 중 하나와 연합된 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인으로의 도메인의 결합을 회피하도록 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 천연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래한다. 공급원이 천연인 경우, 일부 양상에서 도메인은 임의의 막 결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래한다. 막관통 영역은 T-세포 수용체, CD28, CD3 제타, CD3 엡실론, CD3 검마 및 CD3 델타의 알파, 베타 또는 제타 쇄로부터 유래된 것들 (즉, 이의 적어도 막관통 영역(들)을 포함하는)을 포함한다. 대안적으로, 일부 구현예에서 막관통 도메인은 합성이다. 일부 양상에서, 합성 막관통 도메인은 주로 소수성 잔기들, 예를 들어, 류신 및 발린을 포함한다. 일부 양상에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 CAR 작제물은 경쇄-링커-중쇄-힌지-막관통 도메인-신호전달 도메인을 포함한다. 링커는 링커 1 (서열번호 44 또는 45), 링커 2 (서열번호 46 또는 47), 링커 3 (서열번호 48 또는 49), 또는 링커 4 (서열번호 50 또는 51)를 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있거나 필수적으로 이루어질 수 있다. 힌지는 CD8 힌지 1 (서열번호 52 또는 53), CD8 힌지 2 (서열번호 54 또는 55), CD8 힌지 3 (서열번호 56 또는 57), CD28 힌지 (서열번호 58 또는 59), IgG4 힌지 (서열번호 60 또는 61), IgG4 CH2 (서열번호 62 또는 63), IgG4 CH2CH3 (서열번호 64 또는 65), 또는 IgG4 CH1CH2CH3 (서열번호 66 또는 67)을 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있거나 필수적으로 이루어질 수 있다. 막관통 도메인은 CD8 TM1 (서열번호 68 또는 69), CD8 TM2 (서열번호 70 또는 71), CD28 TM (서열번호 72 또는 73) 또는 CD8 TM (서열번호 87)을 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있거나 필수저으로 이루어질 수 있다. 특정 경우에, CD8 TM이 사용되고 이는 이의 C-말단과 같이 LYC 및/또는 NHRN (연속으로 포함하는)의 아미노산 서열이 없다. 신호전달 도메인은 CD28 (서열번호 74 또는 75), 4-1BB(서열번호 76 또는 77), OX-40 (서열번호 78 또는 79), 및/또는 CD3 세포내 (서열번호 80 또는 81)를 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있거나 필수적으로 이루어 질수 있다. CAR 작제물은 GFP (서열번호 82 또는 83), T2A (서열번호 84 또는 85), 및/또는 EGFR (서열번호 40 또는 41)을 추가로 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있거나 필수적으로 이루어질 수 있다. 예시적인 중쇄(HC), 링커, 및 경쇄 (LC) 조합은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: LC-링커1-HC; LC-링커2-HC; LC-링커3-HC; LC-링커4-HC; HC-링커1-LC; HC-링커2-LC; HC-링커3-LC; 또는 HC-링커4-LC.
2. T 세포 수용체 (TCR)
일부 구현예에서, 유전학적으로 가공된 수용체는 재조합 TCR 및/또는 천연적으로 존재하는 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. “T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 및 β 쇄 (또한 각각 TCRα 및 TCRβ로서 공지된) 또는 가변 γ 및 δ 쇄 (또한 각각 TCRγ 및 TCRδ로서 공지된)를 함유하고 MHC 수용체에 결합된 항원 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 언급한다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태이다.
전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만 이들을 발현하는 T 세포는 고유의 해부하적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포의 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면상에서 발견되고, 여기서, 이것은 일반적으로 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인지하는데 관여한다. 일부 구현예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Janeway et al, 1997) 예를 들어, 일부 양상에서, TCR의 각각의 쇄는 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C-말단에 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달을 매개하는데 관여하는 CD3 복합체의 영구적 단백질과 연관된다. 달리 기재되지 않는 경우, 용어 "TCR"은 이의 기능성 TCR 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야만 한다. 상기 용어는 또한 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 포함하는, 온전하거나 전장의 TCR를 포괄한다.
따라서, 본원의 목적을 위해, TCR에 대한 언급은 임의의 TCR 또는 MHC 분자, 즉, MHC-펩타이드 복합체에 결합된 특이적 항원 펩타이드에 결합하는 TCR의 항원-결합 부분과 같은 기능성 단편을 포함한다. 상호교환적으로 사용될 수 있는 TCR의 "항원 결합 부분" 또는 항원 결합 단편" 은 TCR의 구조적 도메인의 일부를 함유하지만 완전한 TCR이 결합하는 항원(예를 들어, MHC-펩타이드 복합체)에 결합하는 분자를 언급한다. 일부 경우에, 항원 결합 부분은 TCR의 가변 도메인, 예를 들어, 특정 MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 것에 대한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 a 쇄 및 가변 β 쇄와 같은 TCR의 가변 도메인을 함유하고, 여기서, 각각의 쇄는 3개의 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 쇄의 가변 도메인은 연합하여 TCR 분자의 결합 부위를 형성함에 의해 항원 인지를 부여하고 펩타이드 특이성을 결정하는, 면역글로불린과 유사한 루프 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 형성한다. 전형적으로, 면역글로불린과 같이, CDR은 프레임워크 영역 (FR)에 의해 분리된다(문헌참조: 예를 들어, Jores et al., 1990; Chothia et al., 1988; Lefranc et al., 2003). 일부 구현예에서, CDR3은 가공된 항원을 인지하기 위해 관여하는 주요 CDR이지만, 알파 쇄의 CDR1은 또한 항원성 펩타이드의 N-말단부와 상호작용하는 것으로 나타난 반면 베타 쇄의 CDR1은 펩타이드의 C-말단부와 상호작용한다. CDR2는 MHC 분자를 인지하는 것으로 사료된다. 일부 구현예에서, β-쇄의 가변 영역은 추가로 초가변 (HV4) 영역을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 쇄는 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 면역글로불린과 같이, TCR 쇄(예를 들어, a-쇄, β-쇄)의 세포외 부분은 N-말단에서 2개의 면역글로불린 도메인, 가변 도메인 (예를 들어, Va 또는 Vp; 전형적으로 캐뱃 넘버링을 기준으로 아미노산 1 내지 116: Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.), 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인(예를 들어, a-쇄 불변 도메인 또는 Ca, 전형적으로 캐뱃을 기준으로 아미노산 117 내지 259, β-쇄 불변 도메인 또는 Cp, 전형적으로 캐뱃을 기준으로 아미노산 117 내지 295)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 쇄에 의해 형성되는 TCR의 세포외 부분은 CDR을 함유하는, 2개의 막-근접 불변 도메인 및 2개의 막-원위 가변 도메인을 함유한다. TCR 도메인의 불변 도메인은 짧은 연결 서열을 함유하고, 여기서, 시스테인 잔기는 디설파이드 결합을 형성하고 이는2개의 쇄 사이를 연결한다. 일부 구현예에서, TCR은 α 및 β 쇄 각각에서 추가의 시스테인 잔기를 가져 TCR은 불변 도메인에서 2개의 디설파이드 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 쇄는 막관통 도메인을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양으로 하전되어 있다. 일부 경우에서, TCR 쇄는 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에, 상기 구조는 TCR이 CD3과 같은 다른 분자와 연합할 수 있게 한다. 예를 들어, 막관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정시키고 CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 영구 서브유닛과 연합할 수 있다.
일반적으로, CD3은 포유동물 및 ζ-쇄에서 3개의 고유 쇄(γ, δ, 및 ε)를 가질 수 있는 다중-단백질 복합체이다. 예를 들어, 포유동물에서, 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄 및 CD3ζ 쇄의 동종이량체를 함유할 수 있다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄는 단일 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 고도의 관련 세포 표면 단백질이다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄의 막관통 영역은 음으로 하전되어 있고, 이는 이들 쇄가 양으로 하전된 T 세포 수용체 쇄와 연합하도록 하는 특징이다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄의 세포내 꼬리 각각은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 공지된 단일의 보존된 모티프를 함유하는 반면 각각의 CD3ζ 쇄는 3개를 갖는다. 일반적으로, ITAM은 TCR 복합체의 신호전달 능력에 관여한다. 이들 악세사리 분자는 음으로 하전된 막관통 영역을 갖고 TCR로부터 세포로 신호를 전파하는 역할을 수행한다. CD3- 및 ζ-쇄는 TCR과 함께 T 세포 수용체 복합체로서 공지된 것을 형성한다.
일부 구현예에서, TCR은 2개의 쇄 α 및 β (또는 임의로 γ 및 δ)의 이종이량체일 수 있거나 이것은 단일쇄 TCR 작제물일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 예를 들어, 디설파이드 결합 또는 다설파이드 결합들에 의해 연결된 2개의 별개의 쇄 (α 및 β 쇄 또는 γ 및 δ 쇄)를 함유하는 이종이량체이다. 일부 구현예에서, 표적 항원 (예를 들어, 암 항원)에 대한 TCR을 동정하고 세포에 도입한다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 예를 들어, 공용의 TCR DNA 서열의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 (PCR)에 의해 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 생물학적 공급원으로부터, 예를 들어, T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포), T 세포 하이브리도마 또는 다른 대중에게 가용한 공급원과 같은 세포로부터 수득된다. 일부 구현예에서, T 세포는 생체내 단리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 고친화성 T 세포 클론은 환자로부터 단리될 수 있고 TCR이 단리된다. 일부 구현예에서, T 세포는 배양된 T 세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 사람 면역계 유전자 (예를 들어, 사람 백혈구 항원 시스템 또는 HLA)로 가공된 유전자전이 마우스에서 생성되었다. 일부 구현예에서, 파아지 디스플레이는 표적 항원에 대한 TCR을 단리하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원-결합 부분은 합성적으로 TCR의 서열 지식으로부터 합성적으로 생성될 수 있다.
C. 전달 방법
당업자는 본원 개시내용의 임의의 항원 수용체의 발현을 위한 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하기 위한 장비를 잘 갖추고 있다(문헌참조: 예를 들어, Sambrook et al., 2001 and Ausubel et al., 1996, 이 둘다는 본원에 참조로 인용된다). 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파아지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체(예를 들어, YAC), 예를 들어, 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 벡터 (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등으로부터 유래된), 렌티바이러스 벡터(예를 들어, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등으로부터 유래된), 복제 컴피턴트, 이의 복제 결핍 및 거트부재 (gutless) 형태를 포함하는 아데노바이러스(Ad) 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40 (SV-40) 벡터, 소 파필로마 바이러스 벡터, 엡슈타인-바르 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 하베이 뮤린 육종 바이러스 벡터, 뮤린 유방 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터, 폴리오 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 마라바 바이러스 벡터 및 그룹 B 아데노바이러스 에나데노투시레브 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
1. 바이러스 벡터
항원 수용체를 암호화하는 바이러스 벡터는 본원 개시내용의 특정 양상에서 제공될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터를 생성하는데 있어서, 비-피루 유전자는 전형적으로 이종성 (또는 비-고유) 단백질에 대한 유전자 또는 암호화 서열로 대체된다. 바이러스 벡터는 일종의 발현 작제물이고 이는 핵산 및 능히 단백질을 세포로 도입하기 위해 바이러스 서열을 사용한다. 특정 바이러스가 세포를 감염시키거나 수용체-매개된 세포내이입을 통해 세포에 진입하고 숙주 세포 게놈에 통합하고 안정하게 및 효율적으로 바이러스 유전자를 발현시키는 능력은 이들이 외래 핵산의 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)로의 전달을 위해 매력적인 후보물이 되게 한다. 본원의 개시내용의 특정 양상의 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 하기에 기재되어 있다.
렌티바이러스는 통상의 레트로바이러스 유전자 gag, pol, 및 env외에 , 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자들을 함유하는 복합 레트로바이러스이다. 렌티바이러스 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,013,516호 및 제5,994,136호).
재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 핵산 서열의 발현 둘다를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-분열 세포-여기서, 적합한 숙주 세포는 팩키징 기능, 즉, gag, pol 및 env, 및 rev 및 tat를 함유하는 2개 이상의 벡터로 형질감염된다―를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스는 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,994,136호에 기재되어 있다.
2. 조절 요소들
본원의 개시내용에 유용한 벡터에 포함된 발현 카세트는 특히 (5'-에서-3' 방향으로) 단백질 암호화 서열에 작동적으로 연결된 진핵 전사 프로모터, 삽입 서열을 포함하는 스플라이스 신호, 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다. 진핵 세포에서 단백질 암호화 유전자의 전사를 제어하는 프로모터 및 인핸서는 다중 유전학적 요소들로 구성된다. 세포 기구는 각각의 요소에 의해 전달되는 조절 정보를 수집하고 통합할 수 있어 상이한 유전자들이 전사 조절의 별개의 흔한 복합 패턴으로 전개되도록 한다. 본원 개시내용과 관련하여 사용되는 프로모터는 항시성, 유도성 및 조직-특이적 프로모터를 포함한다.
a. 프로모터/인핸서
본원에 제공된 발현 작제물은 항원 수용체의 발현을 구동시키기 위해 프로모터를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위를 위치시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이의 최상의 공지된 예는 TATA 박스이지만, 예를 들어, 포유동물 종결 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 레이트 유전자에 대한 프로모터와 같이 TATA 박스가 부재인 일부 프로모터에서, 개시 부위 자체 위에 위치한 구분된 요소는 개시 위치를 고정시키는 것을 도와준다. 추가의 프로모터 요소들은 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 30-30110　bp 업스트림 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터는 또한 개시 부위의 다운스트림에 기능성 요소들을 함유하는 것으로 나타났다. 암호화 서열을 프로모터“의 제어하에” 있도록 하기 위해, 하나는 선택된 프로모터의 “다운스트림”(즉, 3')에 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단에 위치한다. “업스트림” 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진시킨다.
프로모터 요소들 사이의 공간은 흔히 가요성이어서 프로모터 기능은 요소들이 서로 상대적으로 역위되거나 이동되는 경우 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소들 간의 공간은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50bp 이격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 의존하여, 이것은 개별 요소들이 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있음을 나타낸다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용 조절 서열을 언급하는 “인핸서”와 연계하여 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는 암호화 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5* 비-암호화 서열을 단리시킴에 의해 수득될 수 있는 바와 같이 핵산 서열과 천연적으로 연합된 것일 수 있다. 상기 프로모터는 “내인성”으로서 언급될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 상기 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한, 핵산 서열과 천연적으로 연관된 것일 수 있다. 대안적으로, 특정 이점은 정상적으로 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 연합되지 않은 프로모터 프로모터를 언급하는, 재조합 또는 이종성 프로모터의 제어하에 암호화 핵산 분절을 위치시킴에 의해 획득될 수 있다. 재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 이의 천연 환경에서 핵산 성려과 정상적으로 연합되지 않은 인핸서를 언급한다. 상기 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 바이러스, 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 “천연적으로 존재”하지 않는, 즉, 발현을 변화시키는 상이한 전사 조절 영역, 및/또는 돌연변이의 상이한 요소들을 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제물에서 대부분 통상적으로 사용되는 프로모터는 β-락타마제 (페니실리나제), 락토스 및 트립토판 (trp) 프로모터 시스템을 포함한다. 합성적으로 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 생성하는 것에 추가로, 서열은 본원에 기재된 조성물과 연계하여 PCR™을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 추가로, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열이 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
천연적으로, 기관(organelle), 세포 유형, 기관(organ), 또는 발현을 위해 선택된 유기체 내에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요하다. 분자 생물학적 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 사용을 알고 있다(문헌참조: 예를 들어, Sambrook et　al. 1989, 본원에 참조로 인용됨). 사용되는 프로모터는 항상성, 조직-특이적, 유도성일 수 있고/있거나 도입된 DNA 분절의 고수준의 발현을 지시하기 위해 적당한 조건하에서 유용할 수 있고, 예를 들어, 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생성에 유리하다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
추가로 임의의 프로모터/인핸서 조합(예를 들어, epd.isb-sib.ch/의 월드 와이드 웹을 통해, 진핵 세포 프로모터 데이터 베이스 EPDB 당)은 또한 발현을 구동시키기 위해 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 구현예이다. 진핵 세포는 적당한 세균 폴리머라제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전학적 발현 작제물의 일부로서 제공된 경우 특정 세균 프로모터로부터의 세포질 전사를 지지할 수 있다.
프로모터의 비제한적인 예는 어얼리 또는 레이트 바이러스 프로모터, 예를 들어, SV40 어얼리 또는 레이트 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 이메디에이트 어얼리 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 어얼리 프로모터; 진핵 세포 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터, GADPH 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터; 및 연결된(concatenated) 반응 요소 프로모터들, 예를 들어, 사이클릭 AMP 반응 요소 프로모터들 (cre), 혈청 반응 요소 프로모터 (sre), 포르볼 (phorbol) 에스테르 프로모터 (TPA) 및 최소 TATA 박스 부근의 반응 요소 프로모터들 (tre)를 포함한다. 또한 사람 성장 호르몬 프로모터 서열(예를 들어, Genbank에 기재된 사람 성장 호르몬 최소 프로모터, 승인 번호 X05244, 뉴클레오타이드 283-341) 또는 마우스 유방 종양 프로모터(ATCC, Cat. No. ATCC 45007로부터 가용한)를 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 CMV IE, 덱틴-1, 덱틴-2, 사람 CD11c, F4/80, SM22, RSV, SV40, Ad MLP, 베타-액틴, MHC 부류 I 또는 MHC 부류 II 프로모터이지만 치료학적 유전자의 발현을 구동시키기 위해 유용한 임의의 다른 프로모터는 본원 개시내용의 수행에 적용될 수 있다.
특정 양상에서, 본 개시내용의 방법은 또한 인핸서 서열, 즉, 프로모터의 활성을 증가시키고 시스로 작용하고 이들의 배향과 무관하에 심지어 보다 상대적으로 긴 거리 (표적 프로모터로부터 수킬로베이스까지 이격되어 있는)에서 작용할 잠재력을 갖는 핵산 서열에 관한 것이다. 그러나, 인핸서 기능은 이들이 또한 소정의 프로모터에 근접하여 기능할 수 있으므로 필수적으로 상기 긴 거리에 제한되지 않는다.
b. 개시 신호 및 연계된 발현
특정 개시 신호는 또한 암호화 서열의 효율적인 해독을 위해 본원의 개시내용에 제공된 발현 작제물에 사용될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. 외인성 해독 제어 신호는 ATG 개시 코돈을 포함하고 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자는 이를 용이하게 결정할 수 있고 필요한 신호를 제공할 수 있다. 개시 코돈은 전체 삽입체의 해독을 보장하기 위해 목적하는 암호화 서열의 판독 프레임과 “인 프레임”으로 있어야 한다는 것은 널리 공지되어 있다. 외인성 해독 제어 신호 및 개시 코돈은 천연이거나 합성일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 인핸서 요소들의 내포에 의해 증진될 수 있다.
특정 구현예에서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소들을 사용하여 다중유전자, 또는 폴리시스트론, 메시지를 생성한다. IRES 요소들은 5 메틸화된 캡 의존성 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 우회할 수 있고 내부 부위에서 해독을 개시할 수 있다. 피코나바이러스 패밀리의 2개의 구성원 (소아마비 및 뇌척수심근염)으로부터의 IRES 요소들은 개시되어 있고, 또한 포유동물 메시지로부터의 IRES가 기재되어 있다. IRES 요소들은 이종성 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 다중 개방 판독 프레임은 함께 전사될 수 있고 각각은 IRES에 의해 분리되어 있고 폴리시스트론 메시지를 생성한다. IRES 요소에 의해, 각각의 개방 판독 프레임은 효율적인 해독을 위해 리보솜에 접근할 수 있다. 다중 유전자는 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현될 수 있다.
추가로, 특정 2A 서열 요소들을 사용하여 본원의 개시내용에 제공된 작제물 내 유전자들의 연결되거나 동시 발현을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 절단 서열을 사용하여 단일 시스트론을 형성하기 위해 개방 판독 프레임들을 연결시킴에 의해 유전자들을 공동 발현시킬 수 있다. 예시적 절단 서열은 F2A (구제역 질환 바이러스 2A) 또는 “2A-유사” 서열(예를 들어, 토세아 아시그나 바이러스 2A; T2A)이다.
3. 복제 오리진
숙주 세포 내 벡터를 증가시키기 위해, 하나 이상의 복제 오리진 부위 (흔히 “ori”로 칭함), 예를 들어, 상기된 바와 같이 EBV의 oriP 또는 프로그래밍에서 유사하거나 상승된 기능을 갖고, 유전학적으로 가공된 oriP에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기된 바와 같이 다른 염색체외 복제 바이러스의 복제 오리진 또는 자발적으로 복제하는 서열 (ARS)가 사용될 수 있다.
4. 선택 및 스크리닝 가능한 마커
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터 내 마커를 포함시킴에 의해 시험관내 또는 생체내에서 동정될 수 있다. 상기 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 동정을 가능하게 하는 세포에 동정가능한 변화를 부여한다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 가능하게 하는 성질을 부여하는 마커이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 이의 선택을 가능하게 하는 마커이고 음성 선택 마커는 이의 존재가 이의 선택을 차단시키는 마커이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
일반적으로, 약물 선택 마커의 내포는 형질전환체의 클로닝 및 동정을 원조하고, 예를 들어, 네오마이신, 푸로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택 마커이다. 조건의 수행을 기반으로 하는 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커에 추가로, 스크리닝가능한 마커, 예를 들어, 이의 기반이 비색 분석인 GFP를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 고려된다. 대안적으로, 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 음성 선택 마커로서 스크리닝가능한 효소가 사용될 수 있다. 당업자는 또한 능히 FACS 분석과 연계된 면역학적 마커를 사용하는 방법을 알고 있다. 사용되는 마커는 이것이 유전자 생성물을 암호화하는 핵산과 공동 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 사료되지 않는다. 선택 및 스크리닝 가능한 마커의 추가의 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
5. 다른 핵산 전달 방법
항원 수용체를 암호화하는 핵산의 바이러스 전달에 추가로, 하기에는 소정의 숙주 세포로의 추가의 재조합 유전자 전달 방법이 있고 따라서 본원 개시내용에서 고려된다.
현재 개시내용과 함께 DNA 또는 RNA와 같은 핵산의 면역 세포로의 도입은 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이 세포의 형질전환을 위한 핵산 전달을 위해 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 생체외 형질감염, 미세 주사를 포함하는 주사에 의해; 전기천공에 의해; 인산칼슘 침전에 의해; DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 사용함에 의해; 직접적인 소닉 로딩에 의해; 리포좀 매개된 형질감염 및 수용체-매개된 형질감염에 의해; 미립자가속 충격에 의해; 탄화규소 섬유와 함께 교반에 의해; 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환에 의해; 건조/억제-매개된 DNA 취득 및 상기 방법의 임의의 조합에 의해서와 같이 DNA의 직접적인 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 기관(들), 세포(들), 조직 (들) 또는 유기체(들)은 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
V. 치료 방법
본원 구현예의 특정 양상은 CD79b-양성 세포의 사멸이 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상을 개선하는 것을 포함하는, CD79b 신호전달과 관련된 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다. CD79b의 신호전달은 임의의 적합한 조성물에 의해 감소되어 암 세포 증식을 예방할 수 있다. 특정 경우에, 상기 물질은 항-CD79b 항체 또는 항-CD79b CAR-발현 세포이다.
일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원 개시내용의 적어도 CAR T 세포를 포함하는, 항체를 포함하는 유효량의 조성물을 투여함을 포함하는 면역치료요법을 위한 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 의학적 질환 또는 장애는 면역 반응을 유발하는 CAR-발현 세포 집단의 투여에 의해 치료된다. 본원 개시내용의 특정 구현예에서, 암은 면역 반응을 유발하는 CAR 면역 세포 집단의 투여에 의해 치료된다. 본원에 제공된 것은 유효량의 항원 특이적 세포 치료요법을 개체에게 투여함을 포함하는 개체 내 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 방법이다. 본 발명의 방법은 예로서 면역 장애, 고형 암, 및 혈액학적 암의 치료를 위해 적용될 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 B 세포 악성 종양, 예를 들어, B 세포 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 미만성, 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 변연부 림프종, 림프질세포 림프종, 버킷 림프종 및 만성 림프구 백혈병이다.
본 발명의 치료 방법이 유용한 종양은 임의의 악성 세포 유형, 예를 들어, 고형 종양 또는 혈액학적 종양에서 발견되는 것들을 포함한다. 예시적인 고형 종양은 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선 및 유방으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기관의 종양을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 혈액학적 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등을 포함한다. 본원에 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 추가의 예는 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는), 복막, 위장 또는 위암(위장암 및 위장 기질 암을 포함하는), 췌장암, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 음경암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암 및 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상기 암은 구체적으로 하기의 조직학적 유형을 가질 수 있지만 이들에 제한되지 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 스핀들 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평 세포 암종; 림프구상피 암종; 기저 세포 암종; 섬모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관 암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선낭 암종; 선종폴립 내 선암종; 가족성 폴립증 콜리 선암종; 고형 암종; 악성 카시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 색소형성 암종; 호산성 암종; 호산소성 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화 암종; 부신피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 암종 (skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지 선암종; 귀지 선암종(ceruminous adenocarcinoma); 점막상피 암종; 낭선암종; 유두 낭선암종; 유두 장액성 낭선암종(papillary serous cystadenocarcinoma); 점소양 낭선암종; 점소양 선암종; 시그넷 환 세포 암종(signet ring cell carcinoma); 침윤 도관 암종(infiltrating duct carcinoma); 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방 파게트 질환(paget's disease, mammary); 소포 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평 상피화생; 악성 흉선종thymoma; 악성 난소 기질 종양(ovarian stromal tumor, malignant); 악성 포막종(thecoma, malignant); 악성 과립막 세포 종양(granulosa cell tumor, malignant); 악성 암성모세포종; 세르톨리 세포 암종(sertoli cell carcinoma); 악성 라이디히 세포 종양(leydig cell tumor, malignant); 악성 지질 세포 종양; 악성 부신결정종(paraganglioma, malignant); 악성 유선외 부신결정종(extra-mammary paraganglioma, malignant); 크롬친화세포종(pheochromocytoma); 사구체혈관육종(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 흑색점 악성 흑색종(lentigo malignant melanoma); 선단 흑자성 흑색종(acral lentiginous melanomas); 결절성 흑색종; 거대 색소성모반에서 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색모반(blue nevus, malignant); 육종; 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종(myxosarcoma); 지방육종; 평활근육종(leiomyosarcoma); 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러관 혼합 종양; 신아세포종(nephroblastoma); 간아세포종(hepatoblastoma); 암육종; 악성 중간엽종; 악성 브레너 종양 (brenner tumor, malignant); 악성 엽상 종양(phyllodes tumor, malignant); 활액 육종; 악성 중피종(mesothelioma, malignant); 미분화배세포종(dysgerminoma); 배아 암종(embryonal carcinoma); 악성 기형종(teratoma, malignant); 악성 난소갑상선종(struma ovarii, malignant); 융모암종; 악성 중신종(mesonephroma, malignant); 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종(hemangiopericytoma, malignant); 림프관 육종; 골육종; 피질주위 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 간엽성 연골육종(mesenchymal chondrosarcoma); 골의 거대 세포 종양; 어윙 육종(ewing's sarcoma); 악성 치원성 종양(odontogenic tumor, malignant); 에나멜아세포 치원서육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 에나멜아세포종(ameloblastoma, malignant); 사기질모세포섬유육종; 악성 송과체부종양; 척색종; 악성 신경교종; 뇌실막세포종(ependymoma); 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지교모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경외배엽종양; 소뇌 육종; 신경절아세포종(ganglioneuroblastoma); 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 뇌수막종(meningioma, malignant); 신경섬유육종(neurofibrosarcoma); 악성 신경초종(neurilemmoma, malignant); 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨(hodgkin's); 파라육아종(paragranuloma); 소림프구 악성 림프종(malignant lymphoma, small lymphocytic); 대형 세포 확산 악성 림프종(malignant lymphoma, large cell, diffuse); 여포성 악성 림프종(malignant lymphoma, follicular); 균상식육종(mycosis fungoides); 다른 특정 비-호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL); 소림프구(SL) NHL; 중간 등급/여포 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소 비-절단된 세포 NHL; 벌크 질환 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia); 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프구 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병)(erythroleukemia); 림프구육종 세포 백혈병; 골수백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구 백혈병; 골수 육종; 모발 세포 백혈병; 만성 림프구 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 급성 골수 백혈병 (AML); 및 만성 골수아구성 백혈병.
특정 구현예는 백혈병의 치료 방법에 관한 것이다. 백혈병은 혈액암 또는 골수 암이고 혈액 세포, 일반적으로 백혈구 세포 (백혈구)의 비정상적 증식 (증식에 의한 생성)을 특징으로 한다. 이것은 혈액학적 신생물로 불리우는, 광범위한 그룹의 질환의 일부이다. 백혈병은 광범위한 질환을 포괄하는 광범위한 용어이다. 백혈병은 임상적으로 및 병리학적으로 이의 급성 및 만성 형태로 나누어진다.
본원 개시내용의 방법의 일부 구현예에서, 개체 내 활성화된 CD4 및/또는 CD8 T 세포는 γ-IFN 생성 CD4 및/또는 CD8 T 세포 및/또는 조합물의 투여 전과 상대적으로 증진된 세포용해 활성을 특징으로 한다. γ-IFN은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 측정될 수 있고, 예를 들어, 세포 고정, 투과화를 포함하는 세포내 사이토카인 염색(ICS), 및 γ-IFN에 대한 항체를 사용한 염색을 포함한다. 세포용해 활성은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해, 예를 들어, 혼합 이펙터 및 표적 세포를 사용한 세포 사멸 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에게 T 세포 치료요법 전에 비골수절제성 림프구고갈 화학치료요법이 투여될 수 있다. 비골수절제성 림프구고갈 화학치료요법은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있는, 임의의 적합한 상기 치료요법일 수 있다. 비골수절제성 림프구고갈 화학치료요법은 예를 들어, 특히 암이 전이성일 수 있는 흑색종인 경우 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 예시적 경로는 정맥내이다. 또한, 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 특정 양상에서, 약 60 mg/kg의 사이클로포스파미드가 2일 동안 투여되고 이후 약 25 mg/m2의 플루다라빈은 5일동안 투여된다.
특정 구현예에서, 자가유래 T 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 T 세포 성장 인자는 자가유래 T 세포와 동시에 또는 자가유래 T 세포에 후속적으로 대상체에 투여된다. T 세포 성장 인자는 자가유래의 T 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 임의의 적합한 성장 인자일 수 있다. 적합한 T 세포 성장 인자의 예는 인터류킨 (IL)-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-12를 포함하고, 이는 단독으로 또는 다양한 조합으로, 예를 들어, IL-2와 IL-7, IL-2와 IL-15, IL-7과 IL-15, IL-2, IL-7와 IL-15, IL-12와 IL-7, IL-12와 IL-15, 또는 IL-12와 IL-2로 사용될 수 있다. IL-12는 특정 T-세포 성장 인자이다.
치료학적 유효량의 면역 세포는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내, 복막내, 근육내, 흉골하 또는 관절내 주사 또는 주입을 포함하는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
종양내 주사 또는 종양 혈관계로의 주사는 구체적으로 별개의 고형의 접근가능한 종양을 위해 고려된다. 국소, 국부 또는 전신 투여가 또한 적절할 수 있다. >4 cm의 종양에 대해, 투여될 용적은 약 4-10 ml (특히 10 ml)이고, <4 cm의 종양에 대해, 약 1 - 3ml의 용적(특히 3 ml)이 사용된다. 단일 용량으로서 전달된 다중 주사는 약 0.1 내지 약 0.5 ml 용적을 포함한다.
T 세포 집단은 상기 질환에 맞는 치료 용법, 예를 들어, 질환 상태를 개선하기 위해 1일 내지 수일에 걸쳐 단일 용량 또는 수회 용량 또는 질환 진행을 억제하고 질환 재발을 예방하기 위해 연장된 기간 동안 주기적 용량으로 투여될 수 있다. 제형 중에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 중증도에 의존하고 임상의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야만 한다. T 세포의 치료학적 유효량은 치료받는 대상체, 환부의 중증도 및 유형 및 투여 방식에 의존한다. 일부 구현예에서, 사람 대상체의 치료에 사용될 수 있는 용량은 적어도 3.8×104, 적어도 3.8×105, 적어도 3.8×106, 적어도 3.8×107, 적어도 3.8×108, 적어도 3.8×109, 또는 적어도 3.8×1010 T 세포/m2의 범위이다. 특정 구현예에서, 사람 대상체의 치료에 사용되는 용량은 약 3.8×109 내지 약 3.8×1010 T 세포/m2의 범위이다. 추가의 구현예에서, T 세포의 치료학적 유효량은 체중 kg 당 약 5×106 세포 내지 체중 kg 당 약 7.5×108 세포, 예를 들어, 체중 kg 당 약 2×107 세포 내지 약 5×108 세포, 또는 체중 kg 당 약 5×107 세포 내지 약 2×108 세포로 다양할 수 있다. T 세포의 정확한 양은 대상체의 연령, 체중, 성별 및 생리학적 병태를 기준으로 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
본원 개시내용의 특정 구현예에서, 유효량의 Cd79b CAR-발현 면역 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 암을 갖는 개체에게 전달된다. 상기 세포는 이어서 암 세포를 공격하는 개체의 면역계를 증진시킨다. 일부 경우에, 상기 개체에는 하나 이상의 용량의 면역 세포가 제공된다. 개체에게 2 이상의 용량의 면역 세포가 제공되는 경우에, 투여 사이의 지속 기간은 개체내 증식을 위한 시간을 허용하기 위해 충분해야만 하고 특정 구현예에서, 투여 사이의 지속 기간은 l, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상이다.
특정 구현예에서, CD79b CAR을 발현하도록 가공된 세포는 개체에서 암 세포와 관련된 적어도 하나의 증상을 개선하는 치료학적 유효량(103 내지 1010 범위)으로 개체에게 제공된다. 치료학적 유효량은 103 내지 1010, 103 내지 109, 103 내지 108, 103 내지 107, 103 내지 106, 103 내지 105, 103 내지 104, 104 내지 1010, 104 내지 109, 104 내지 108, 104 내지 107, 104 내지 106, 104 내지 105, 105 내지 1010, 105 내지 109, 105 내지 108, 105 내지 107, 105 내지 106, 106 내지 1010, 106 내지 109, 106 내지 108, 106 내지 107, 107 내지 1010, 107 내지 109, 107 내지 108, 108 내지 1010, 108 내지 109, 또는 109 내지 1010 세포일 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서 특정 암을 갖는 개체는 CD79b CAR을 발현하는 치료학적 유효량의 세포를 1회 또는 수회 제공된다.
A. 약제학적 조성물
또한, 본원에서는 CAR-발현 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형이 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로, 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분 (예를 들어, 항체 또는 폴리펩타이드)을 혼합함에 의해 제조할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012). 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅 제제, 예를 들어, EDTA; 슈가, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 역이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn- 단백질 착물); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 조직 사이의 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성 -활성 하이알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 사람 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. 하나의 양상에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 조합된다.
B. 조합 치료요법
특정 구현예에서, 본 구현예의 조성물 및 방법은 적어도 하나의 추가의 치료요법과 조합된 T 세포 집단을 포함한다. 추가의 치료요법은 방사선 치료요법, 수술 (예를 들어, 종괴절제술 및 유방절제술), 화학치료요법, 유전자 치료요법, DNA 치료요법, 바이러스 치료요법, RNA 치료요법, 면역치료요법, 골수 이식, 나노치료요법, 모노클로날 항체 치료요법, 또는 이전의 치료 조합일 수 있다. 추가의 치료요법은 보조제 또는 신규보조제 치료요법 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 소분자 효소 억제제 또는 항-전이성 제제의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 부작용 제한 제제 (예를 들어, 항오심 제제 등과 같은 치료의 부작용의 발병 및/또는 중증도를 감소시키는 것으로 의도된 제제)의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 수술이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법과 수술의 조합이다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 치료요법은 감마 방사선 조사이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 PBK/AKT/mTOR 경로, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 아폽토시스 억제제, 및/또는 화학예방제를 표적화하는 치료요법이다. 추가의 치료요법은 당업계에 공지된 하나 이상의 화학치료학적 제제일 수 있다.
면역 세포 치료요법은 면역 관문 치료요법과 같은 추가의 암 치료요법과 관련하여, 치료요법 전, 치료요법 동안에, 치료요법 후 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시 내지 수분 내지 수일 내지 수주 범위의 간격일 수 있다. 면역 세포 치료요법이 추가의 치료학적 제제와는 별도로 환자에게 제공되는 구현예에서, 당업자는 일반적으로 각각의 전달 시간 사이에 충분한 시기가 만료되지 않도록 보장하여 2개의 화합물은 여전히 환자에 대한 유리한 조합 효과를 발휘할 수 있다. 상기 경우에, 당업자는 환자에게 항체 치료요법 및 항암 치료요법이 서로 약 12 내지 24 또는 72 h 내에, 보다 특히 서로 약 6-12 h 내에 항체 치료요법 및 항암 치료요법이 제공될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 각각의 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과하는 경우, 치료를 위한 시기를 유의적으로 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
다양한 조합이 사용될 수 있다. 하기 예시에 대해, 면역 세포 치료요법은 “A”이고 항암 치료요법은 “B”이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
본 구현예의 임의의 화합물 또는 치료요법의 환자로의 투여는 경우에 따라 제제의 독성을 고려하여 상기 화합물의 투여를 위한 일반 프로토콜에 따른다. 따라서, 일부 구현예에서, 조합 치료요법에 기인할 수 있는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.
1. 화학치료요법
광범위한 화학치료학적 제제는 본 발명의 구현예에 따라 사용될 수 있다. 화학치료학적 제제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드,트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함하는); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함하는); 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신 (합성 유사체 , KW-2189 및 CB1-TM1을 포함하는); 엘레우트레오빈; 판크라티스타틴; 사코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감몰 및 칼리케아미신 오메가I1); 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트; 에스퍼라미신; 및 네오카지노스타틴 발색단 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라르니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모프폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함하는), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 항대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 및 테스톨락톤; 항-부신제(anti-adrenal), 예를 들어, 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 이오니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK폴리사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2”-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (“Ara-C”); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 플라티늄 배위 착물, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예를 들어, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 겜시타비엔, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라티늄, 및 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 상기 임의의 유도체를 포함한다.
2. 방사선 치료요법
DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되어온 다른 인자들은 통상적으로 γ-선, X-선, 및/또는 방사성 동위원소의 종양 세포의 직접적인 전달로서 공지된 것을 포함한다. DNA 손상 인자의 다른 형태가 또한 고려되고, 예를 들어, 마이크로파, 양성자 빔 조사, 및 UV-조사가 있다. 모든 이들 인자들은 DNA에 대해, DNA의 전구체에 대해, DNA의 복제 및 복구에 대해 및 염색체의 어셈블리 및 유지에 대해 광범위한 손상에 영향을 미칠 가능성이 높다. X-선에 대한 용량 범위는 장기간 (3 내지 4주) 동안 하루 50 내지 200 뢴트겐로부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 용량의 범위이다. 방사성 동위원소에 대한 용량 범위는 매우 다양하고 동위원소의 반감기, 방출된 방사선 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다.
3. 면역치료요법
당업자는 면역치료요법이 구현예의 방법과 조합하거나 연계하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료와 관련하여, 면역치료제는 일반적으로 암 세포를 표적화하고 파괴하기 위한 면역 이펙터 세포 및 분자에 의존한다. 리툭시맙 (RITUXAN®)은 그러한 예이다. 면역 이펙터는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상에 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 단독의 항체는 치료요법의 이펙터로서 작용할 수 있거나 이것은 실제로 세포 사멸에 영향을 미치는 다른 세포를 동원할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학치료제, 방사성핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소) 등에 접합될 수 있고 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 이펙터는 직접적으로 또는 간접적으로 종양 세포 표적과 상호작용하는 표면 분자를 함유하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
항체-약물 접합체 (ADC)는 세포-사멸 약물에 공유적으로 연결된 모노클로날 항체 (Mab)를 포함하고 조합 치료요법에 사용될 수 있다. 상기 접근법은 이들의 항원 표적에 대한 고특이성의 Mab와 상당히 강력한 세포독성 약물을 조합하여 농축된 수준의 항원과 함께 페이로드 (약물)를 종양 세포에 전달하는 “무장된(armed)” Mab를 유도한다. 약물의 표적화된 전달은 또한 정상 조직에서 이의 노출을 최소화하여 감소된 독성 및 개선된 치료학적 지수를 유도한다. 예시적인 ADC 약물은 ADCETRIS® (브렌툭시맙 베도틴) 및 KADCYLA® (트라스투주맙 엠탄신 또는 T-DM1)을 포함한다.
면역치료요법의 하나의 양상에서, 종양 세포는 표적화에 순응할 수 있는, 즉 대다수의 다른 세포 상에 존재하지 않는 일부 마커를 함유해야만 한다. 많은 종양 마커가 존재하고 임의의 이들 마커는 본 발명의 구현예와 관련하여 표적화를 위해 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커는 CD20, 암배아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원(Sialyl Lewis Antigen), MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B, erb b2 및 p155를 포함한다. 면역치료요법의 대안적 양상은 항암 효과를 면역 자극 효과와 조합하는 것이다. 면역 자극 분자는 또한 다음을 포함한다: 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모킨, 예를 들어, MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들어, FLT3 리간드.
면역치료요법의 예는 면역 애쥬번트(예를 들어, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물); 사이토카인 치료요법, 예를 들어, 인터페론 α, β 및 γ, IL-1, GM-CSF, 및 TNF; 유전자 치료요법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2, 및 p53; 및 모노클로날 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오시드 GM2, 및 항-p185를 포함한다. 하나 이상의 항암 치료요법은 본원에 기재된 항체 치료요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
일부 구현예에서, 면역치료요법은 면역 관문 억제제일 수 있다. 면역 관문은 신호 (동시-자극 분자)를 상향시시키거나 신호를 하향시킨다. 면역 관문 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제 면역 관문은 아데노신 A2A 수용체 (A2AR), B7-H3 (또한 CD276로서 공지된), B 및 T 림프구 약화인자 (BTLA), 세포독성 T-림프구-연합 단백질 4 (CTLA-4, 또한 CD152로서 공지된), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), 킬러-세포 면역글로불린 (KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG3), 프로그래밍된 사멸 1 (PD-1), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 서프레서(VISTA)를 포함한다. 특히, 면역 관문 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적화한다.
면역 관문 억제제는 소분자, 재조합 형태의 리간드 또는 수용체와 같은 약물일 수 있거나, 특히 항체, 예를 들어, 사람 항체이다. 면역 관문 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제가 사용될 수 있고 특히 키메라화된, 사람화된 또는 사람 형태의 항체가 사용될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 대안적 및/또는 균등한 명칭이 본원 개시내용에 언급된 특정 항체에 대해 사용될 수 있다. 상기 대안적 및/또는 균등한 명칭은 본원 개시내용과 관련하여 상호교환될 수 있다. 예를 들어, 람브롤리주맙은 대안적 및 균등한 명칭인 MK-3475 및 펨브롤리주맙으로 공지되어 있다.
일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 이의 리간드 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 PDL1의 이의 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 구현예에서, PDL2 결합 길항제는 PDL2의 이의 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체 (예를 들어, 사람 항체, 사람화된 항체 또는 키메라 항체)이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 CT-011로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 면역어드헤신　(예를 들어,　불변 영역 (예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역어드헤신)이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, 및 OPDIVO®로서 공지된 니볼루맙은 사용될 수 있는 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA®, 및 SCH-900475로서 또한 공지된 펨브롤리주맙은 예시적인 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로서 또한 공지된 CT-011은 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로서 또한 공지된 AMP-224는 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다.
본원에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 관문은 CD152로서 공지된 세포독성 T-림프구-연합된 단백질 4 (CTLA-4)이다. 사람 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 승인 번호 L15006을 갖는다. CTLA-4는 T 세포의 표면 상에서 발견되고 항원-제공 세포의 표면 상에 CD80 또는 CD86에 결합하는 경우 “오프” 스위치로서 작용한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면상에서 발현되고 억제 신호를 T 세포에 전송하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. CTLA4는 T-세포 공동 자극 단백질 CD28과 유사하고 2개의 분자는 각각 항원-제공 세포 상에서 B7-1 및 B7-2으로 불리우는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA4는 억제 신호를 T 세포에 전송하는 반면 CD28은 자극 신호를 전송한다. 세포내 CTLA4는 또한 조절 T 세포에서 발견되고 이들의 기능을 위해 중요할 수 있다. T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자에 대한 억제 수용체인, CTLA-4의 증가된 발현을 유도한다.
일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 사람 항체, 사람화된 항체, 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드이다.
본 발명의 방법에 사용하기 위해 적합한 항-사람-CTLA-4 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 당업계에서 인지된 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(또한 10D1, MDX- 010, MDX- 101, 및 Yervoy®로서 공지된) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체이다. 다른 구현예에서, 상기 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 CTLA-4상의 동일한 항체에 결합하는 것에 경쟁하고/하거나 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 90%의 가변 영역 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 가변 영역 동일성)을 갖는다.
4. 수술
암을 갖는 사람의 대략 60%는 동일한 유형의 수술을 진행하고 이는 예방적, 진단학적 또는 단계 결정, 치유적 및 일시적인 수술을 포함한다. 치유적 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거되고, 절제되고/되거나 파괴된 절제술을 포함하고 본 발명의 구현예의 치료, 화학치료요법, 방사성 치료요법, 호르몬 치료요법, 유전자 치료요법 및/또는 대안적 치료요법과 같은 다른 치료요법과 연계하여 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 언급한다. 종양 절제술에 추가로, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경적으로 제어된 수술(모흐 수술(Mohs’ surgery))을 포함한다.
암성 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제 시, 공동이 신체에 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접적인 주사 또는 추가의 항암 치료요법을 사용한 영역의 국소 적용에 의해 성취될 수 있다. 상기 치료는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주 마다, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 용량일 수 있다.
5. 다른 제제
다른 제제는 치료의 치료학적 효능을 개선시키기 위해 본 구현예의 특정 양상과 조합하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이들 추가의 제제는 세포 표면 수용체 및 GAP 접속부의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포증식 억제 및 분화제, 세포 접착의 억제제, 과증식성 세포의 아폽토시스 유도제에 대한 민감성을 증가시키는 제제 또는 다른 생물학적 제제를 포함한다. GAP 접속부의 수를 상승시킴에 의한 세포내 신호전달의 증가는 이웃하는 과증식성 세포 집단에 대한 항-과증식성 효과를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 세포증식억제 또는 분화제는 치료의 항-과증식성 효능을 개선시키기 위해 본 구현예의 특정 양상과 조합하여 사용될 수 있다. 세포 접착의 억제제는 본 구현예의 효능을 개선시키는 것으로 고려된다. 세포 접착 억제제의 예는 병소 접착 키나제 (FAK) 억제제 및 로바스타틴이다.
VI. 제품 또는 키트
면역 세포, 항체, 시약, 완충액 또는 이의 조합을 포함하는 제품 또는 키트가 또한 본원에 제공된다. 제품 또는 키트는 추가로 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키거나 암을 갖는 개체의 면역 기능을 증진시키기 위해 면역 세포를 사용하기 위한 지침서를 포함하는 팩키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 항원-특이적 면역 세포는 제품 또는 키트에 포함될 수 있다. 적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 시린지를 포함한다. 컨테이너는 다양한 재료, 예를 들어, 유리, 플라스틱 (예를 들어, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀), 또는 금속 합금 (예를 들어, 스테인레스강 또는 하스텔로이)으로부터 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 컨테이너는 제형 및 이의 위에 또는 연합된 표지를 보유하고, 상기 컨테이너는 사용 지침을 지적할 수 있다. 제품 또는 키트는 추가로 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘, 시린지 및 팩키지 삽입물을 사용 지침서와 함께 포함하는, 상업적 및 사용자 견지에서 요구될 수 있는 다른 물질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제품은 추가로 하나 이상의 또 다른 제제 (예를 들어, 화학치료학적 제제 및 항-신생물제)를 포함한다. 하나 이상의 제제를 위해 적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 시린지를 포함한다.
VII. 특정 구현예에서 사용되는 서열
클론 T26 VH 영역:
뉴클레오타이드 서열
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACCAGGCCTTGAGTGGATCGGAGCAATTGATCCTTCAGATAGTTATACTGGCTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTACAAGAAGCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (357 nt) (서열번호 8)
아미노산 서열
EVQLQESGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGPGLEWIGAIDPSDSYTGYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCTRSYYGNSWFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 7)
(119 aa)
T26 VH CDR1: GYTFTSYW (서열번호 1)
T26 VH CDR2: IDPSDSYT (서열번호 2)
T26 VH CDR3: NSWFAYWGQGTLV (서열번호 3)
클론 T26 VL 영역:
뉴클레오타이드 서열 ACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATAAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGAATCCCAGCCAGGTTTAGTGCCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGTTGCAGCCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAGGTTGGAAATAAAAC ( 330 nt) (서열번호 10)
아미노산 서열
IVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYINWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSASGSGTDFTLNIHPVEEEDVAAYYCQQSNEDPFTFGSGTRLEIK (110 aa) (서열번호 9)
T26 VL CDR1: QSVDYDGDSY (서열번호 4)
T26 VL CDR2: AAS (서열번호 5)
T26 VL CDR3: QQSNEDPFT (서열번호 6)
클론 5B VH 영역:
뉴클레오타이드 서열
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGCAATTGATCCTTCAGATAGTTATACTGGCTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTACAAGAAGCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGATTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (357 nt) (서열번호 18)
아미노산 서열
EVQLQESGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIDPSDSYTGYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCTRSYYGNSWFDYWGQGTLVTVSA (119aa) (서열번호 17)
5B VH CDR1: GYTFTSYW (서열번호 11)
5B VH CDR2: IDPSDSYT (서열번호 12)
5B VH CDR3: NSWFDYWGQGTLV (서열번호 13)
클론 5B VL 영역:
뉴클레오타이드 서열
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGAAGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGAATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTAATGAGGACCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAAATAAAA (333 nt) (서열번호 20)
아미노산 서열
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYEGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYHCQQSNEDPFTFGGGTKLEIK (111 aa) (서열번호 19)
5B VL CDR1: QSVDYEGDSY (서열번호 14)
5B VL CDR2: AAS (서열번호 15)
5B VL CDR3: QQSNEDPFT (서열번호 16)
클론 28B VH 영역:
뉴클레오타이드 서열
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGCAATTGATCCTTCAGATAGTTATACTGGCTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTACAAGAAGCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (357 nt) (서열번호 28)
아미노산 서열
EVQLQESGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIDPSDSYTGYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCTRSYYGNSWFAYWGQGTLVTVSA (119 aa) (서열번호 27)
28B VH CDR1: GYTFTSYW (서열번호 21)
28B VH CDR2: DPSDSYT (서열번호 22)
28B VH CDR3: SWFAYWGQGTLV (서열번호 23)
클론 28B VL 영역:
뉴클레오타이드 서열
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATTTATGTTGCATCCAATCTAGAATCTGGAATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAC (333 nt) (서열번호 30)
아미노산 서열
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYVASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIN (111 aa) (서열번호 29)
28B VL CDR1: QSVDYDGDSY (서열번호 24)
28B VL CDR2: VAS (서열번호 25)
28B VL CDR3: QQSNEDPFT (서열번호 26)
서열번호 40
절단된 사람 EGFR
CGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTAGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGCGAAGG
서열번호 41
EGFRIII-IV
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRR
서열번호 42
CD8리더
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
서열번호 43
CD8리더
MALPVTALLLPLALLLHAARP
서열번호 44
링커1
GGTGGCGGAGGTTCT
서열번호 45
링커1
GGGGS
서열번호 46
링커2
GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC
서열번호 47
링커2
GGGGSGGGGS
서열번호 48
링커3
GGAGGAGGTGGTAGTGGTGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGAGGAAGT
서열번호 49
링커3
GGGGSGGGGSGGGGS
서열번호 50
링커4
GGAGGAGGTGGTAGTGGTGGAGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC
서열번호 51
링커4
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호 52
CD8 힌지 1
ACAACTACTCCAGCACCACGACCACCAACACCTGCTCCAACTATCGCATCTCAACCACTTTCTCTACGTCCAGAAGCATGCCGACCAGCTGCAGGAGGTGCAGTTCATACGAGAGGTCTAGATTTCGCATGTGAT
서열번호 53
CD8 힌지 1
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
서열번호 54
CD8 힌지 2
AAGCCCACAACTACTCCAGCACCACGACCACCAACACCTGCTCCAACTATCGCATCTCAACCACTTTCTCTACGTCCAGAAGCATGCCGACCAGCTGCAGGAGGTGCAGTTCATACGAGAGGTCTAGATTTCGCATGTGAT
서열번호 55
CD8 힌지 2
KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
서열번호 56
CD8 힌지 3
TTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACAACTACTCCAGCACCACGACCACCAACACCTGCTCCAACTATCGCATCTCAACCACTTTCTCTACGTCCAGAAGCATGCCGACCAGCTGCAGGAGGTGCAGTTCATACGAGAGGTCTAGATTTCGCATGTGAT
서열번호 57
CD8 힌지 3
FSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
서열번호 58
CD28 힌지
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGG
서열번호 59
CD28 힌지
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKG
서열번호 60
IgG4 힌지
GAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCA
서열번호 61
IgG4 힌지
ESKYGPPCPSCP
서열번호 62
IgG4 CH2
GAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCCAAAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG
서열번호 63
IgG4 CH2
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG
서열번호 64
IgG4 CH2CH3
GAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCCAAAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
서열번호 65
IgG4 CH2CH3
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 66
IgG4 CH1CH2CH3
GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCCAAAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
서열번호 67
IgG4 CH1CH2CH3
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 68
CD8 TM 1
ATCTACATCTGGGCACCATTGGCTGGGACTTGTGGTGTCCTTCTCCTATCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
서열번호 69
CD8 TM 1
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
서열번호 70
CD8 TM 2
ATCTACATCTGGGCACCATTGGCTGGGACTTGTGGTGTCCTTCTCCTATCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAAC
서열번호 71
CD8 TM 2
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN
서열번호 72
CD28 TM
AAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTC
서열번호 73
CD28 TM
KHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF
서열번호 74
CD28
AGAAGTAAAAGAAGTAGGCTACTTCATAGTGATTACATGAATATGACTCCTCGACGACCTGGTCCCACCCGTAAGCATTATCAGCCCTATGCACCACCACGAGATTTCGCAGCCTATCGCTCC
서열번호 75
CD28
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
서열번호 76
4-1BB
AAACGAGGTAGAAAAAAACTTCTTTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGATGTAGTTGTCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
서열번호 77
4-1BB
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
서열번호 78
OX-40
AGGCGCGACCAGCGGCTGCCACCTGATGCACACAAGCCACCAGGAGGAGGCTCTTTCCGGACCCCAATCCAGGAGGAGCAGGCAGACGCACACAGCACACTGGCCAAGATC
서열번호 79
OX-40
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
서열번호 80
CD 세포내
AGAGTTAAATTTAGCAGAAGTGCAGATGCTCCTGCGTATAAACAGGGTCAAAACCAACTATATAATGAACTAAATCTAGGACGAAGAGAAGAATATGATGTTTTAGATAAAAGACGTGGTCGAGATCCTGAAATGGGAGGAAAACCTAGAAGAAAAAATCCTCAAGAAGGCCTATATAATGAACTACAAAAAGATAAGATGGCAGAAGCTTATAGTGAAATTGGAATGAAAGGAGAACGTCGTAGAGGTAAAGGTCATGATGGTCTTTATCAAGGTCTTAGTACAGCAACAAAAGATACATATGATGCACTTCATATGCAAGCACTTCCACCTCGT
서열번호 81
CD 세포내
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
서열번호 82
증진된 GFP
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
서열번호 83
증진된 GFP
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
서열번호 84
T2A
GAGGGCAGAGGCAGTCTGCTGACATGCGGTGACGTGGAAGAGAATCCCGGCCCT
서열번호 85
T2A
EGRGSLLTCGDVEENPGP
서열번호 86
CD8α TM (뉴클레오타이드 서열)
ATCTACATCTGGGCACCATTGGCTGGGACTTGTGGTGTCCTTCTCCTATCACTGGTTATCACC
서열번호 87
CD8α TM (아미노산 서열)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
VIII. 실시예
하기 실시예들은 본 개시 내용의 특정 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 구현예에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1 - CD79b 항체 및 CAR의 개발
CD79b 발현은 B 세포 계통으로 제한된다: 실시간 PCR을 사용하여, Mino, Daudi, HBC-1, Jeko, SUDHL6, SUDHL4, 및 U2932을 포함하는 광범위한 B 세포 림프종 세포주에서 발현되지만 Jurkat 및 J76 T-세포 림프종/백혈병 세포주에서 발현되지 않는 것으로 밝혀졌다(도 1a). CD79b가 정상 조직 상에서 발현되는지를 결정하기 위해, 20개 정상 사람 조직 총 RNA를 함유하는 FirstChoice 사람 총 RNA 조사 패널은 제조원(Applied Biosystems)으로부터 수득하였다. 총 RNA는 사람 편도선 샘플 기원의 B 및 T 세포로부터 추출하고 각각 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. CD79b 전사체는 비장 및 림프절과 같은 림프성 조직에만 존재하지만 모든 비림프성 정상 조직에는 부재인 것으로 밝혀졌다(도 1b).
공개적으로 가용한 유전자 발현 데이터세트(Oncomine)를 사용하여, CD79b는 ALL 및 만성 림프구 백혈병(도 1c) 및 다중 B 세포 림프종 서브타입, 예를 들어, 버킷 림프종, 미만성 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종 및 맨틀 세포 림프종(도 1d)에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 각각의 종양 유형에 대한 샘플의 수는 괄호안에 나타낸다.
사람 CD79b에 대한 다중 모노클로날 항체의 생성 및 항체의 중쇄 및 경쇄 서열의 동정: 항-사람 CD79b 모노클로날 항체는 마우스를 사람 CD79b-발현 마우스 섬유아세포 L 세포로 면역화시킴에 의한 하이브리도마 기술에 의해 생성되었다(도 2a). ELISA에 의해, 3개의 클론은 재조합 사람 CD79b 단백질에 대한 높은 결합능으로 동정되었다(도 2b). 이들 3개의 모노클로날 항체의 친화성은 추가로 Octet 검정에 의해 결정하였고, 각각 Kd 값이 각각 1.44, 17.8 및 2.0 nM인 3개의 클론, 14 (IgG1), 16A (IgG2) 및 45 (IgG2)는 추가의 개발을 위해 선택되었다(도 2c). 모노클로날 항체 클론 #14에는 형광단을 접합시키고 제조원(BD Biosciences)으로부터의 상업적 항-CD79b 항체에 상응하게 B 세포 림프종 세포주를 염색하는 것으로 나타났다(도 2d). 모노클로날 항체의 하이브리도마의 총 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다. 5’-RACE PCR (cDNA 말단의 신속한 증폭)을 사용하여 중쇄 및 경쇄에 대한 V-유전자를 클로닝하였다. 단백질 서열은 DNA 서열에 의해 예측하였다. 하이브리도마 배양 상등액을 정제하고 중쇄 및 경쇄 단백질 서열은 질량 분광측정기(제조원: MD Anderson Proteomics Core Facility)으로부터 확인하였다.
항-CD79b CAR T 세포의 생성: 가변 영역의 단일쇄 단편 (scFv)의 특이적 서열을 사용하여, 항-CD79b CAR의 여러 작제물을 생성하였다. 형질도입된 T 세포에서 CAR 발현을 검출하기 위해, CAR-증진된 녹색 형광성 단백질(eGFP) 융합 작제물 또는 절단된 사람 상피 성장 인자 수용체 (huEGFRt)를 사용하였다(도 3a). 후자는 또한 안전성 스위치로서 작용하여 중증 독성의 경우에 CAR T 세포를 제거할 수 있다. CD3-제타 (CD3z) 쇄를 혼입하여 T 세포의 활성화에 대한 신호 1을 제공하고 동시자극 도메인 CD28 또는 4-1BB를 혼입하여 신호 2를 제공하였다(도 3a).
이들 작제물은 렌티바이러스 벡터 pHR_SFFV에 클로닝하고, 이어서 이를 사용하여 1차 건강한 공여자 T 세포를 형질도입하였다. 클론 45-CD79b-CD28-CAR을 사용하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 eGFP 발현에 의해 결정된 바와 같이 대표적인 형질도입 효율 (>70%)은 도 3b에 나타낸다. 항-CD19-CAR T 세포는 대조군으로서 사용하였다.
CellTrace Far Red로 표지된 Daudi 세포에 대한 CAR T 세포의 세포독성 활성은 지정된 이펙터:표적 (E:T) 비율에서 16시간 유동 세포측정 검정에서 Aqua 염색에 의해 결정하였다(도 3c). 20:1의 E:T 비율에서 다양한 배양 조건에 대한 퍼센트 죽은 세포를 사용한 대표적인 도트 플롯 (상부 우측 사분면)은 도 3d에 나타낸다. 상기 데이터는 항-CD19-CAR T 세포 및 항-CD79b-CAR T 세포 둘다가 형질도입되지 않은 대조군 T 세포와 비교하여 Daudi 버킷 림프종 세포에 고도로 세포독성임을 보여준다.
항-CD79b CAR T 세포는 CD19 + 및 CD19 - 림프종 세포 둘다에 대해 세포독성이다: CD19 음성 (CD19-) 림프종 세포에 대한 항-CD79b CAR T 세포의 효능을 결정하기 위해, 탈과립화 및 세포독성 검정은 CD19가 부재인 미만성 대형 B 세포 림프종 세포주인 SUDHL6을 사용하여 수행하였다. 첫번째로, CD19은 CRISPR-Cas9 (CD19KOSUDHL6)에 의해 녹아웃시키고 이들 림프종 세포에는 항 CD19 CAR 작제물에서 사용된 항-CD19 항체 클론에 대한 결합 부위인 엑손 2 부재 CD19 스플라이스 변이체 스플라이스 변이체 (CD19Dex2)를 형질도입하였다.
형질도입되지 않은 1차 T 세포 (Ctrl T), 클론-14-CD79b-CD28 CAR, 14-CD79b-4-1BB CAR, 및 FMC63-CD19-CD28 CAR은 5:1의 E:T 비율로 Daudi 또는 상기 SUDHL6 세포 (CD19KOSUDHL6-CD19Dex2)와 동시 배양하였다. T 세포는 CellTrace Far Red로 표지시키고 표적 세포에는 CellTrace Violet을 표지시켰다. 2시간 후, 골지 억제제 및 탈과립화 마커(CD107a/b)는 배양물에 첨가하여 T 세포의 탈과립화를 결정하였다. 종양 세포에 대한 세포독성 활성은 동시 배양 4일 후 결정하였다. 대조군 T 세포가 아닌 14-CD79b-CD28 및 14-CD79b-4-1BB CAR T 세포는 세포주 둘다에 대해 현저히 증가된 탈과립화 및 세포독성 활성(도 4a 및 b)을 보여주었다. 대조적으로, FMC63-CD19-CD28 CAR은 CD19KOSUDHL6- CD19Dex2 종양 세포가 아닌 CD19+ Daudi에 세포독성이다.
유동 세포측정에 대한 CountBright 절대 계수 비드를 사용하여, 생존 종양 세포의 절대수는 또한 4-일 동시 배양 후 결정하였다(도 4c). 상기 결과는 생존 종양 세포의 관찰된 퍼센트와 일치하였다(도 4b). 표적 세포 및 이펙터 T 세포의 대표적인 도트 플롯을 나타낸다(도 4a 및 b). 상기 실험은 유사한 결과와 함께 적어도 3회 반복하였다.
항-CD79b CAR T 세포는 림프종 이종이식편에 대한 생체내 효능을 나타낸다: 항-CD79b CAR T 세포의 효능을 생체내 시험하기 위해, 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 발현하는 Mino 맨틀 세포 림프종 세포주는 2 x 106 종양 세포/마우스에서 NSG 마우스에 IV 주사하였다. 18일 후, 마우스에는 10 x 106 CAR+ T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포/미우스로 꼬리 정맥 주사를 통해 형질도입되지 않은 1차 T 세포, 항-CD19-CD28 CAR T 세포, 또는 클론 45 항-CD79b-CD28 CAR T 세포로 처리하였다. 생발광 이미지화를 사용하여 종양 부하를 평가하였다(도 5a). 결과는 형질감염되지 않은 T 세포로 처리된 마우스에서 진행성 종양 성장을 보여주었다. 대조적으로, 양호한 종양 대조군 및 현저히 개선된 생존률(p<0.05)은 항-CD19- 및 항-CD79b CAR T 세포 둘다로 처리된 마우스에서 관찰되었다(도 5b 및 5c). 시험관내 결과는 각각의 개별 실험에 대해 적어도 3회 입증되었고 생체내 결과는 2회 입증되었다. 따라서, 항-CD79b CAR 치료요법은 CD19 발현 존재 또는 부재인 B 세포 악성종양의 치료를 위해 사용될 수 있다.
실시예 2 - 추가의 CD79b 항체 및 CAR의 개발
새로운 항-CD79b 항체 클론을 사용한 항-CD79b CAR T 세포의 생성: 추가의 항체 클론 (T26, 5B 및 28B)으로부터의 가변 영역의 단일쇄 단편 (scFv)의 특이적 서열을 사용하여, 항-CD79b CAR의 여러 작제물을 생성하였다. 형질도입된 T 세포에서 CAR 발현을 검출하기 위해, CAR-증진된 녹색 형광성 단백질(eGFP) 융합 작제물 또는 절단된 사람 상피 성장 인자 수용체 (huEGFRt)를 사용하였다(도 6a). 후자는 또한 안전성 스위치로서 작용하여 중증 독성의 경우에 CAR T 세포를 제거할 수 있다. CD3-제타 (CD3z) 쇄를 혼입하여 T 세포의 활성화에 대한 신호 1을 제공하고 동시자극 도메인 CD28 또는 4-1BB 또는 OX-40을 혼입하여 신호 2를 제공하였다(도 6a).
항-CD79b CAR T 세포는 Daudi 림프종 세포에 대해 시험관내 세포독성을 나타낸다. 상기 CAR 작제물(T26 및 28B)을 렌티바이러스 벡터 pLVEG 내로 클로닝한 다음, 이를 사용하여 1차 건강한 공여자 T 세포를 형질도입하여 항-CD79b-CAR T 세포를 생성하였다. 항-CD19-CAR T 세포는 대조군으로서 사용하였다. Daudi 세포(CellTrace Violet으로 표지됨)에 대한 CAR T 세포(CellTrace Far Red로 표지됨)의 세포독성 활성은 1일 및 4일 동안 공동 배양한 후 지적된 이펙터:표적(E:T) 비율에서 유동 세포측정 검정에 의해 결정되었다(도 6b). 대표적인 도트 플롯은 도 6c에 나타낸다. 상기 데이터는 항-CD19-CAR T 세포 및 항-CD79b-CAR T 세포 둘다가 Daudi 버킷 림프종 세포에 고도로 세포독성임을 보여준다.
항-CD79b CAR T 세포는 Daudi 림프종 이종이식편에 대한 생체내 효능을 나타낸다: 항-CD79b CAR T 세포(클론 T26)의 효능을 생체내 시험하기 위해, 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 발현하는 Daudi 버킷 림프종 세포주는 2 x 104 종양 세포/마우스에서 NSG 마우스에 IV 주사하였다. 10일 후, 마우스는 처리되지 않거나 3 x 106 CAR+ T 세포/마우스로 꼬리 정맥 주사를 통해 항-CD19-CAR CAR T 세포, 또는 클론 T26 항-CD79b-CD28 CAR T 세포로 처리하였다. 생발광 이미지화를 사용하여 종양 부하를 평가하였다(도 6d). 결과는 처리되지 않은 마우스에서 점진적인 종양 성장을 보여주었다. 대조적으로, 양호한 종양 대조군 및 현저히 개선된 생존률(p<0.01)은 항-CD19- 및 항-CD79b CAR T 세포 둘다로 처리된 마우스에서 관찰되었다(도 6e). 이들 결과는 항-CD79b CAR T 세포가 생체내 강한 항-종양 활성을 가짐을 입증한다.
실시예 3 - CD79b 항체 및 CAR의 추가의 개발 및 연구
항-CD79b 항체의 사람 CD79b로의 결합 하이브리도마 상등액으로부터 단리된 전장 항-CD79b 모노클로날 항체(클론 5B 및 28B)를 사용하여 ELISA에 의해 마우스 섬유아세포 L 세포 상에서 발현된 사람 CD79b에 대한 결합을 시험하였다(도 7).
CAR 작제물의 생성: 클론 28B의 VH 및 VL로부터 유래된 가변 영역의 단일쇄 단편(scFv)의 특정 서열을 사용하여(도 7에 나타냄), 항-CD79b CAR의 여러 작제물을 CD8α 또는 CD28 힌지/막관통 도메인을 사용하여 생성하였다. 형질도입된 T 세포에서 CAR 발현을 검출하기 위해, CAR-증진된 녹색 형광성 단백질(eGFP) 융합 작제물 또는 절단된 사람 상피 성장 인자 수용체 (huEGFRt)를 사용하였다(도 8a). 항-CD19 CAR 작제물은 대조군으로서 사용하였다. 후자는 또한 안전성 스위치로서 작용하여 중증 독성의 경우에 CAR T 세포를 제거할 수 있다. CD3-제타 (CD3ζ) 쇄를 혼입하여 T 세포의 활성화에 대한 신호 1을 제공하고 동시자극 도메인 CD28 또는 4-1BB 또는 OX40을 혼입하여 신호 2를 제공하였다(도 8a). 이들 작제물을 EF1α 프로모터를 갖는 렌티바이러스 벡터 pLVEG 내로 클로닝하고(도 8b), 이어서 T 세포를 형질도입하는 데 사용하고 하기에 기재된 다양한 시험관내 및 생체내 검정에서 시험하였다.
항-CD79b CAR는 특이적으로 사람 CD79b를 인지한다: 항-CD79b CAR의 신호전달 능력을 결정하기 위해, CAR(클론 28B는 CD79b CAR에 대해 사용되었다)은 렌티바이러스를 사용하여 Jurkat-Lucia™ NFAT 리포터 세포에 형질도입하였다(도 9a). 상기 세포주에서 분비된 코엘렌테라진 활용 루시퍼라제를 암호화하는 루시아 유전자는 NFAT 컨센서스 전사 반응 요소의 6개 카피물에 융합된 ISG54 최소 프로모터에 의해 구동된다. 24시간 동안 항-CD3/항-CD28 항체 또는 Daudi 버킷 림프종 세포와 함께 형질도입된 Jurkat 세포의 배양은 처리되지 않은 세포와 비교하여 강력한 루시퍼라제 활성을 유도하였다(도 9b). CAR 분자에 의한 CD79b 인지의 특이성을 확립하기 위해 CRISPR/Cas9를 사용하여 CD19 및 CD79b를 발현하는 확산 거대 B 세포 림프종 세포주인 SUDHL6의 동종 형태를 생성하였다: 모체 또는 야생형(WT), CD19 녹아웃 (CD19KO), CD79bKO, 및 CD19/CD79b 이중 KO (CD19KO CD79bKO) (도 9C). CAR-형질도입된 Jurkat-Lucia™ NFAT 리포터 세포와 SUDHL6 동종 세포주를 공동 배양한 결과 CD79b CAR이 모체 세포와 CD19KO 세포 둘다를 인지하지만 CD79bKO 또는 CD19KOCD79bKO 세포에서는 반응성이 상당히 감소함을 보여주었다. 대조적으로, CD19 CAR은 모체 및 CD79bKO 세포 둘다를 인지했지만 CD19KO 또는 CD19KOCD79bKO 세포는 인지하지 못했다(도 9d).
CAR의 1차 사람 T 세포로의 형질도입: 상기된 CAR 작제물을 사용한 eGFP 발현 및/또는 재조합 사람 CD79b-Fc 단백질 염색에 의해 결정된 바와 같이 대표적인 형질도입 효율(도 8a)은 도 10a에 나타낸다. 항-CD19-CAR T 세포는 대조군으로서 사용하였다. 항-CD79b CAR T 세포는 처리되지 않았거나 항-CD3/CD28 항체 또는 재조합 사람 CD79b-Fc 단백질로 자극하였다. 15분 후, CD3ζ 및 ERK1/2의 인산화를 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 결과는 강성 신호전달의 부재를 시사하는 CAR+ 및 CAR-T 세포 간의 기준선 인산화에 유의적인 차이가 없음을 보여준다. 항-CD3/CD28 항체를 사용한 자극은 CAR+에서 CD3ζ의 인산화를 유도했지만 CAR-T 세포에서는 그렇지 않았다. 대조적으로, 재조합 사람 CD79b-Fc 단백질을 사용한 자극은 CAR+에서 CD3ζ 및 ERK1/2의 인산화를 유도했지만 CAR-T 세포에서는 유도하지 않았으며, 이는 CAR이 CD79b 단백질의 인지에 반응하여 1차 T 세포에서 신호전달을 유도할 수 있음을 시사한다(도 10b).
항-CD79b CAR T 세포의 증식 활성: 건강한 공여자 T 세포로부터 상기 CAR 작제물(도 8a)을 사용하여 생성된 항-CD79b CAR T 세포를 CellTrace Far Red로 표지하고 1:1의 이펙터:표적(E:T) 비율에서 CD79b-발현 Daudi 버킷 림프종 종양 세포와 공동 배양하였다. 4일 후, CAR T 세포의 증식을 유동 세포측정에 의한 염료 희석법으로 평가하였다. 결과는 CD4+ 및 CD8+ 항-CD79b CAR T 세포 둘다가 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 Daudi 종양 세포에 반응하여 유의적으로 증식한다는 것을 보여준다. 항-CD79b CAR T 세포의 증식은 항-CD19 CAR T 세포와 유사하였다(도 11a 및 11b).
항-CD79b CAR T 세포에 의한 사이토카인 생성: 건강한 공여자 T 세포로부터 상기 CAR 작제물(도 8a)을 사용하여 생성된 항-CD79b CAR T 세포를 1:1의 E:T 비율에서 Daudi 버킷 림프종 종양 세포와 동시 배양하였다. 24시간 후, 상등액 중의 사이토카인 수준을 다중 사이토카인 분석으로 평가하였다. 상기 결과는 항-CD79b CAR T 세포가 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 Daudi 종양 세포에 반응하여 상당한 양의 IL-2, GM-CSF, IFN-γ 및 IL-17A를 생성한다는 것을 보여준다. 항-CD79b CAR T 세포에 의한 사이토카인 생성은 항-CD19 CAR T 세포와 유사하였다(도 12).
항-CD79b CAR T 세포는 림프종 세포에 반응하여 탈과립화한다. 건강한 공여자 T 세포로부터 상기 CAR 작제물(도 8a)을 사용하여 생성된 항-CD79b CAR T 세포를 1:1의 E:T 비율에서 Daudi 버킷 림프종 종양 세포와 동시 배양하였다. 6시간 후, CD107 a/b에 대한 염색 후 유동측정에 의해 탈과립화를 평가하였다. 결과는 CD4+ 및 CD8+ 항-CD79b CAR T 세포 둘다가 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 Daudi 종양 세포에 반응하여 유의적으로 탈과립화함을 보여준다. 항-CD79b CAR T 세포에 의한 탈과립화는 항-CD19 CAR T 세포와 유사하였다. 탈과립화는 CD28 힌지/막관통 도메인을 함유하는 항-CD79b CAR T 세포와 비교하여 CD8α 힌지/막관통 도메인을 함유하는 항-CD79b CAR T 세포에서 수치적으로 우수하였다(도 13a 및 13b).
항-CD79b CAR T 세포는 림프종 세포에 세포독성이다. 건강한 공여자 T 세포로부터 상기 CAR 작제물(도 8a)을 사용하여 생성되고 CellTrace Far Red로 표지된 항-CD79b CAR T 세포를 1:1의 E:T 비율에서 CellTrace Violet으로 표지된 Daudi 버킷 림프종 종양 세포 또는 SUDHL6 동종동계의 세포주 (모체, CD19KO, Cd79bKO 및 CD19/CD79b 이중 KO)와 동시 배양하였다. 4일 후, 잔류 생존 종양 세포의 절대 수를 결정하고 용해 퍼센트를 계산함으로써 유동 세포측정에 의해 세포독성을 평가하였다. 결과는 항-CD79b CAR T 세포가 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 Daudi 종양 세포의 유의적인 세포독성을 유도함을 보여준다. 항-CD79b CAR T 세포에 의한 세포독성 활성은 항-CD19 CAR T 세포와 유사하였다. 세포독성 활성은 CD28 힌지/막관통 도메인을 함유하는 항-CD79b CAR T 세포와 비교하여 CD8α 힌지/막관통 도메인을 함유하는 항-CD79b CAR T 세포에서 우수하였다(도 14a). 추가로, 항-CD79b CAR T 세포는 모 세포 및 CD19KO SUDHL6 세포 둘 다의 유의한 용해를 유도하였지만 용해는 CD79bKO 또는 CD19KOCD79bKO 세포에서 유의적으로 감소되었다. 대조적으로, 항-CD19 CAR T 세포는 모 세포 및 CD19KO 세포 둘 다의 유의적인 용해를 유도하였지만 용해는 CD19KO 또는 CD19KOCD79bKO 세포에서 유의적으로 감소되었다(도 14b).
항-CD79b CAR T 세포는 생체내 항종양 효과를 나타낸다: 항-CD79b CAR T 세포의 효능을 생체내 조사하기 위해, 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 발현하는 Daudi 버킷 림프종 세포주는 2 x 104 종양 세포/마우스로 NSG 마우스에 IV 주사하였다. 11일 후, 마우스에는 꼬리 정맥 주사를 통해 5 x 106 CAR+ T 세포/마우스로 형질도입되지 않거나 상기 CAR 작제물을 사용하여 생성된 (도 8a) 항-CD19-CAR T 세포 또는 항-CD79b CAR T 세포로 처리하였다. 생발광 이미지화를 사용하여 종양 부하를 평가하였다(도 15a). 결과는 형질감염되지 않은 T 세포로 처리된 마우스에서 신속한 종양 성장을 보여주었다. 대조적으로, 양호한 종양 대조군 및 현저히 개선된 생존률은 항-CD19-CAR 및 항-CD79b CAR T 세포 둘다로 처리된 마우스에서 관찰되었다. 종양 제어 및 생존은 CD8 힌지/막관통 도메인을 함유하는 항-CD79b CAR T 세포와 비교하여 CD8α 힌지/막관통 도메인을 함유하는 항-CD79b CAR T 세포에서 더 우수하였고, 최고의 생존률은 CD8α 힌지/막관통 도메인 또는 OX40 동시자극 도메인을 함유하는 항-CD79b CAR T 세포에서 관찰되었다(도 15b).
본원에 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 고려하여 과도한 실험없이 만들어 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌들은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 상세하게 포함된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
SEQUENCE LISTING <110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> ANTI-CD79B ANTIBODIES AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND METHODS OF USE THEREOF <130> MDAC.P1290WO-1001165215 <140> PCT/US2021/070497 <141> 2021-04-30 <150> 63/018,266 <151> 2020-04-30 <160> 87 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Asn Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr 1 5 <210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Tyr Tyr Gly Asn Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 28 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggagca attgatcctt cagatagtta tactggctac 180 aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240 atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtac aagaagctac 300 tatggtaact cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 29 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105 110 <210> 30 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 30 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatttatg ttgcatccaa tctagaatct 180 ggaatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggacccattc 300 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aac 333 <210> 31 <400> 31 000 <210> 32 <400> 32 000 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <400> 35 000 <210> 36 <400> 36 000 <210> 37 <400> 37 000 <210> 38 <400> 38 000 <210> 39 <400> 39 000 <210> 40 <211> 1011 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60 acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120 gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tagatccaca ggaactggat 180 attctgaaaa 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sapiens <400> 41 Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile 20 25 30 Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe 35 40 45 Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr 50 55 60 Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn 65 70 75 80 Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg 85 90 95 Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile 100 105 110 Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val 115 120 125 Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp 130 135 140 Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn 145 150 155 160 Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu 165 170 175 Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser 180 185 190 Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu 195 200 205 Leu 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Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 50 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 ggaggaggtg gtagtggtgg aggaggaagt ggtggcggag gttctggagg tggaggttcc 60 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 52 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 acaactactc cagcaccacg accaccaaca cctgctccaa ctatcgcatc tcaaccactt 60 tctctacgtc cagaagcatg ccgaccagct gcaggaggtg cagttcatac gagaggtcta 120 gatttcgcat gtgat 135 <210> 53 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 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caactggtac 180 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttccaaagc 240 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctcaccg tggacaagag caggtggcag 600 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 687 <210> 65 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 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60 accctttact gc 72 <210> 69 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 70 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 atctacatct gggcaccatt ggctgggact tgtggtgtcc ttctcctatc actggttatc 60 accctttact gcaaccacag gaac 84 <210> 71 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn 20 25 <210> 72 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 72 aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg 60 gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 120 <210> 73 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe 1 5 10 15 Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu 20 25 30 Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 35 40 <210> 74 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 74 agaagtaaaa gaagtaggct acttcatagt gattacatga atatgactcc tcgacgacct 60 ggtcccaccc gtaagcatta tcagccctat gcaccaccac gagatttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 75 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 75 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 76 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 76 aaacgaggta gaaaaaaact tctttatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg atgtagttgt cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 77 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 78 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 78 aggcgcgacc agcggctgcc acctgatgca cacaagccac caggaggagg ctctttccgg 60 accccaatcc aggaggagca ggcagacgca cacagcacac tggccaagat c 111 <210> 79 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 79 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 20 25 30 Thr Leu Ala Lys Ile 35 <210> 80 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 80 agagttaaat ttagcagaag tgcagatgct cctgcgtata aacagggtca aaaccaacta 60 tataatgaac taaatctagg acgaagagaa gaatatgatg ttttagataa aagacgtggt 120 cgagatcctg aaatgggagg aaaacctaga agaaaaaatc ctcaagaagg cctatataat 180 gaactacaaa aagataagat ggcagaagct tatagtgaaa ttggaatgaa aggagaacgt 240 cgtagaggta aaggtcatga tggtctttat caaggtctta gtacagcaac aaaagataca 300 tatgatgcac ttcatatgca agcacttcca cctcgt 336 <210> 81 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Glu Leu Gln Lys Asp 50 55 60 Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg 65 70 75 80 Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr 85 90 95 Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 82 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 82 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717 <210> 83 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 83 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 84 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 gagggcagag gcagtctgct gacatgcggt gacgtggaag agaatcccgg ccct 54 <210> 85 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 86 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 atctacatct gggcaccatt ggctgggact tgtggtgtcc ttctcctatc actggttatc 60 acc 63 <210> 87 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20

Claims (92)

  1. 단리된 모노클로날 항체로서, 상기 항체가 CD79b에 특이적으로 결합하고 하기를 포함하는, 단리된 모노클로날 항체:
    (I):
    (a) 서열번호 1을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 2를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 3을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 4를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 5를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 6을 포함하는 제3 VL CDR;
    (II):
    (a) 서열번호 11을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 12를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 13을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 14를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 15를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 16을 포함하는 제3 VL CDR; 또는
    (III):
    (a) 서열번호 21을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 22를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 23을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 24를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 25를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 26을 포함하는 제3 VL CDR.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호 1을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 2를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 3을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 4를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 5를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 6을 포함하는 제3 VL CDR.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 7의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 9의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함하는, 항체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 7의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 9의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함하는, 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호 11을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 12를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 13을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 14를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 15를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 16을 포함하는 제3 VL CDR.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 17의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 19의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함하는, 항체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 17의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 19의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함하는, 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호 21인 서열을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 22를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 23을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 24를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 25를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 26을 포함하는 제3 VL CDR.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 27의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 29의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함하는, 항체.
  10. 제8항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 27의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 29의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함하는, 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 재조합체인, 항체.
  12. 제1항에 있어서, 상기 항체가 IgG, IgM, IgA 또는 이의 항원 결합 단편인, 항체.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 Fab', F(ab')2, F(ab')3, 1가 scFv, 2가 scFv, 또는 단일 도메인 항체인, 항체.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 사람, 사람화된 항체, 또는 탈면역화된 항체인, 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 이미지화제, 화학치료학적 제제, 독소 또는 방사능핵종에 접합된, 항체.
  16. 약제학적으로 허용되는 담체 중에 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물.
  17. 제1항 내지 14항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  18. 클론 T26의 VH 도메인의 CDR 1-3 (서열번호 1, 2, 및 3)을 포함하는 VH 도메인 및 클론 T26의 VL 도메인의 CDR 1-3(서열번호 4, 5, 및 6)을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
  19. 클론 5B의 VH 도메인의 CDR 1-3 (서열번호 11, 12, 및 13)을 포함하는 VH 도메인 및 클론 5B의 VL 도메인의 CDR 1-3(서열번호 14, 15, 및 16)을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
  20. 클론 28B의 VH 도메인의 CDR 1-3 (서열번호 21, 22, 및 23)을 포함하는 VH 도메인 및 클론 28B의 VL 도메인의 CDR 1-3(서열번호 24, 25, 및 26)을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자(들)을 포함하는 숙주 세포.
  23. 제22항에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유동물 세포, 효모 세포, 세균 세포, 섬모 세포 또는 곤충 세포인, 숙주 세포.
  24. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 유효량의 항체를 대상체에게 투여함을 포함하는, 암을 갖는 상기 대상체를 치료하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암이 B 세포 악성 종양인, 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 항체가 약제학적으로 허용되는 조성물 중에 있는, 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 항체가 전신 투여되는, 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 항체가 정맥내, 피내, 종양내, 근육내, 복막내, 피하 또는 국소적으로 투여되는, 방법.
  29. 제24항에 있어서, 적어도 제2 항암 치료요법을 상기 대상체에게 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 제2 항암 치료요법이 수술 치료요법, 화학치료요법, 방사선 치료요법, 냉동치료요법, 호르몬 치료요법, 면역치료요법 또는 사이토킨 치료요법인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 제2 항암 치료요법이 입양 T-세포 치료요법을 포함하는, 방법.
  32. 다음을 포함하는 항원 결합 도메인을 갖는 가공된 CD79b CAR 또는 TCR:
    (I):
    (a) 서열번호 1을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 2를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 3을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 4를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 5를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 6을 포함하는 제3 VL CDR;
    (II):
    (a) 서열번호 11을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 12를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 13을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 14를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 15를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 16을 포함하는 제3 VL CDR; 또는
    (III):
    (a) 서열번호 21을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 22를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 23을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 24를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 25를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 26을 포함하는 제3 VL CDR.
  33. 제32항에 있어서, 상기 항원-결합 도메인이 다음을 포함하는, CAR 또는 TCR:
    (a) 서열번호 1을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 2를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 3을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 4를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 5를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 6을 포함하는 제3 VL CDR.
  34. 제33항에 있어서, 상기 항원-결합 도메인이 서열번호 7의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 9의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  35. 제33항에 있어서, 상기 항원-결합 도메인이 서열번호 7의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 9의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  36. 제32항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는 CAR 또는 TCR:
    (a) 서열번호 11을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 12를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 13을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 14를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 15를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 16을 포함하는 제3 VL CDR.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항원-결합 도메인이 서열번호 17의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 19의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  38. 제36항에 있어서, 상기 항원-결합 도메인이 서열번호 17의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 19의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  39. 제32항에 있어서, 상기 항원-결합 도메인이 다음을 포함하는, CAR 또는 TCR:
    (a) 서열번호 21을 포함하는 제1 VH CDR;
    (b) 서열번호 22를 포함하는 제2 VH CDR;
    (c) 서열번호 23을 포함하는 제3 VH CDR;
    (d) 서열번호 24를 포함하는 제1 VL CDR;
    (e) 서열번호 25를 포함하는 제2 VL CDR; 및
    (f) 서열번호 26을 포함하는 제3 VL CDR.
  40. 제39항에 있어서, 상기 항원-결합 도메인이 서열번호 27의 VH 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 29의 VL 도메인과 적어도 약 80% 동일한 VL 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  41. 제39항에 있어서, 상기 항원-결합 도메인이 서열번호 27의 VH 도메인과 동일한 VH 도메인 및 서열번호 29의 VL 도메인과 동일한 VL 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  42. 제32항에 있어서, 상기 CAR이 CD3ζ, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, 또는 이의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  43. 제32항에 있어서, 상기 CAR이 CD3ζ 및 CD28 신호전달 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  44. 제32항에 있어서, 상기 CAR이 CD3ζ 및 4-1BB 신호전달 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  45. 제32항에 있어서, 상기 CAR이 CD3ζ 및 OX-40 신호전달 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  46. 제32항에 있어서, 상기 CAR 또는 TCR이 바이러스 벡터에 의해 암호화된, CAR 또는 TCR.
  47. 제46항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, CAR 또는 TCR.
  48. 제32항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 도메인이 링커에 의해 VL 도메인에 연결된 VH 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  49. 제48항에 있어서, 상기 링커가 링커 1 (서열번호 45) 또는 서열번호 44의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 링커, 링커 2 (서열번호 47) 또는 서열번호 46의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 링커, 링커 3 (서열번호 49) 또는 서열번호 48의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 링커, 또는 링커 4 (서열번호 51) 또는 서열번호 50의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 링커를 포함하는, CAR 또는 TCR.
  50. 제32항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 VL-링커1-VH; VL-링커2-VH; VL-링커3-VH; VL-링커4-VH; VH-링커1-VL; VH-링커2-VL; VH-링커3-VL; 또는 VH-링커4-VL을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  51. 제32항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR 또는 TCR이 힌지를 포함하는, CAR 또는 TCR.
  52. 제51항에 있어서, 상기 힌지가 CD8 힌지 1 (서열번호 53), 또는 서열번호 52의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 힌지, CD8 힌지 2 (서열번호 55) 또는 서열번호 54의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 힌지, CD8 힌지 3 (서열번호 57) 또는 서열번호 56의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 힌지, CD28 힌지(서열번호 59) 또는 서열번호 58의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 힌지, IgG4 힌지 (서열번호 60 또는 61), IgG4 CH2 (서열번호 63) 또는 서열번호 62의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 힌지, IgG4 CH2CH3 (서열번호 65) 또는 서열번호 64의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 힌지, 또는 IgG4 CH1CH2CH3 (서열번호 67) 또는 서열번호 66의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 힌지인, CAR 또는 TCR.
  53. 제32항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 막관통 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  54. 제53항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD8 TM1 1 (서열번호 69) 또는 서열번호 68의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 막관통 도메인, CD8 TM2 (서열번호 71) 또는 서열번호 70의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 막관통 도메인, CD28 TM (서열번호 73) 또는 서열번호 72의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 막관통 도메인, 또는 CD8α TM (서열번호 87) 또는 서열번호 86의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 막관통 도메인인, CAR 또는 TCR.
  55. 제32항에 있어서, 형질도입 마커 및/또는 안전성 스위치를 추가로 포함하는 CAR 또는 TCR.
  56. 제55항에 있어서, 상기 형질도입 마커가 증진된 녹색 형광 단백질(eGFP)인, CAR 또는 TCR.
  57. 제56항에 있어서, 상기 eGFP가 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는, CAR 또는 TCR.
  58. 제55항에 있어서, 상기 형질도입 마커 및/또는 안전성 스위치가 절단된 상피 성장 인자 (EGFR)인, CAR 또는 TCR.
  59. 제58항에 있어서, 상기 EGFR이 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는, CAR 또는 TCR.
  60. 제55항에 있어서, 상기 형질도입 마커 및/또는 안전성 스위치가 절단 펩타이드에 의해 CAR에 연결된, CAR 또는 TCR.
  61. 제60항에 있어서, 상기 절단 펩타이드가 2A 펩타이드인, CAR 또는 TCR.
  62. 제61항에 있어서, 상기 2A 펩타이드가 T2A 펩타이드인, CAR 또는 TCR.
  63. 제62항에 있어서, 상기 T2A 펩타이드가 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는, CAR 또는 TCR.
  64. 제32항에 있어서, 상기 CAR이 제2 항원 결합 도메인을 추가로 포함하는, CAR 또는 TCR.
  65. 제64항에 있어서, 상기 제2 항원 결합 도메인이 CD19, CD20, 또는 CD22 항원 결합 도메인인, CAR 또는 TCR.
  66. 제32항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR 또는 TCR이 서열번호 87을 포함하는 CD8α 힌지 및 막관통 도메인 또는 서열번호 86의 폴리펩타이드에 의해 암호화된 막관통 도메인, 서열번호 79를 포함하는 사람 OX-40 신호전달 도메인 또는 서열번호 78의 폴리펩타이드에 의해 암호화된 신호전달 도메인, 및 서열번호 81을 포함하는 CD3ζ 도메인 또는 서열번호 81의 폴리펩타이드에 의해 암호화된 도메인을 포함하는, CAR 또는 TCR.
  67. 제32항 내지 제66항 중 어느 한 항의 CAR 또는 TCR을 암호화하는 발현 벡터.
  68. CD79b CAR 또는 CD79b TCR을 발현하도록 가공된 숙주 세포.
  69. 제68항에 있어서, 상기 세포가 제30항 내지 제65항 중 어느 한 항의 CAR을 발현하도록 가공된, 세포.
  70. 제68항에 있어서, 상기 숙주 세포가 면역 세포인, 세포.
  71. 제70항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포인, 세포.
  72. 제71항에 있어서, 상기 T 세포가 1차 사람 T 세포 또는 TIL인, 세포.
  73. 제71항에 있어서, 상기 T 세포가 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포인, 세포.
  74. 제72항에 있어서, 상기 1차 사람 T 세포가 건강한 공여자로부터 수득된, 세포.
  75. 제71항에 있어서, 상기 T 세포가 자가유래인, 세포.
  76. 제71항에 있어서, 상기 T 세포가 동종이계인, 세포.
  77. 제68항에 있어서, 상기 세포가 CRISPR 또는 트랜스포사제 시스템을 사용하여 가공된, 세포.
  78. CD79b 표적화된 T 세포 및 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서, 상기 CD79b 표적화된 T 세포가 제32항 내지 제66항 중 어느 한 항의 CAR 또는 TCR을 발현하도록 가공된, 약제학적 조성물.
  79. 대상체에서 암의 치료를 위해 유효량의 CD79b 표적화된 T 세포를 포함하는 조성물로서, 여기서, 상기 CD79b 표적화된 T 세포가 제32항 내지 제66항 중 어느 한 항의 CAR 또는 TCR을 발현하도록 가공된, 조성물.
  80. 대상체에서 암의 치료를 위해 유효량의 CD79b 표적화된 T 세포를 포함하는 조성물의 용도로서, 여기서, 상기 CD79b 표적화된 T 세포가 제32항 내지 제66항 중 어느 한 항의 CAR 또는 TCR을 발현하도록 가공된, 용도.
  81. 유효량의 CD79b 표적화된 T 세포를 대상체에게 투여함을 포함하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법으로서, 여기서, 상기 CD79b 표적화된 T 세포가 제32항 내지 제66항 중 어느 한 항의 CAR 또는 TCR을 발현하도록 가공된, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 암이 B 세포 악성 종양인, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 B 세포 악성 종양이 B 세포 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 미만성, 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 변연부 림프종, 림프질세포 림프종, 버킷 림프종 또는 만성 림프구 백혈병인, 방법.
  84. 제81항에 있어서, 상기 대상체가 이전에 CD19 CAR 치료요법을 투여받은 적이 있는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 대상체가 CD19 CAR 치료요법에 내성인, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 대상체가 CD19 항원 상실을 갖는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 대상체에서 CD19-음성 종양이 재발된, 방법.
  88. 제81항에 있어서, 상기 CD79b 표적화된 T 세포가 정맥내, 피내, 종양내, 근육내, 복막내, 피하 또는 국소적으로 투여되는, 방법.
  89. 제81항에 있어서, 상기 CD79b 표적화된 T 세포가 정맥내 투여되는, 방법.
  90. 제81항에 있어서, 적어도 제2 항암 치료요법을 상기 대상체에게 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 제2 항암 치료요법이 수술 치료요법, 화학치료요법, 방사선 치료요법, 냉동치료요법, 호르몬 치료요법, 면역치료요법 또는 사이토킨 치료요법인, 방법.
  92. 제81항에 있어서, 상기 암이 CD79b-발현 암인, 방법.
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