CN114269784A - 具有选择性可切割接头的双特异性结合构建体 - Google Patents
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Abstract
描述了具有蛋白酶可切割接头的双特异性结合构建体的新形式及其制备方法。此外,还描述了在治疗性适应症中的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月7日提交的美国临时申请号62/858,509和2019年6月7日提交的美国临时申请号62/858,630的优先权。出于所有目的,上述申请各自通过引用并入本文。
序列表的引用
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且该序列表特此通过引用以其全文并入。创建于2020年6月4日的所述ASCII副本名为A-2406-WO-PCT_SL.txt且大小为164,621字节。
技术领域
本发明属于蛋白质工程领域。
背景技术
近年来,双特异性结合构建体已显示出治疗前景。例如,以双特异性T细胞衔接子形式靶向CD3和CD19两者的双特异性结合构建体在低剂量下显示出令人印象深刻的功效。Bargou等人(2008),Science[科学]321:974-978。此形式包含通过柔性接头连接的两种scFv,其中一种靶向CD3,另一种靶向肿瘤抗原CD19。此独特的设计允许双特异性结合构建体使活化的T细胞接近靶细胞,导致靶细胞的细胞溶解性杀伤。参见例如,WO 99/54440A1(美国专利号7,112,324 B1)和WO 2005/040220(美国专利申请公开号2013/0224205A1)。后来的发展是与CD3∈链的N-末端处的背景独立表位(context independentepitope)结合的双特异性结合构建体(参见WO 2008/119567;美国专利申请公开号2016/0152707A1)。
在生物制药工业中,分子会在接受治疗的患者中表现出不希望的、有害的副作用,特别是药物在施用于患者后具有活性的情况下。例如,在小分子药物中,这些副作用可以通过施用一旦代谢就变得有活性的无活性前药来最小化。介导细胞的细胞毒性的双特异性结合构建体会表现出这些不希望的副作用中的一些。因此,在本领域中需要具有有利的药代动力学特性及治疗功效以及提供有效的生产、增加的稳定性和最小化的副作用的形式的双特异性治疗剂。
发明内容
本文描述了双特异性结合构建体的几种新的形式。在一个实施例中,本发明提供了双特异性结合构建体,该双特异性结合构建体包含含有具有式VH1-L1-VH2-L2-VL1-L3-VL2的氨基酸序列的多肽链,其中VH1和VH2包含免疫球蛋白重链可变区,VL1和VL2包含免疫球蛋白轻链可变区,并且L1、L2和L3是接头,其中L1为至少10个氨基酸、L2为至少15个氨基酸、并且L3为至少10个氨基酸,其中L1或L3包含蛋白酶切割位点,并且其中该双特异性结合构建体可以与免疫效应细胞和靶细胞结合。
在另一个实施例中,本发明提供了双特异性结合构建体,该双特异性结合构建体包含含有具有式VH1-L1-Fc-L2-VH2-L3-VL1-L4-Fc-L5-VL2的氨基酸序列的多肽链,其中VH1和VH2包含免疫球蛋白重链可变区,VL1和VL2包含免疫球蛋白轻链可变区,Fc包含免疫球蛋白重链恒定结构域-2和免疫球蛋白重链恒定结构域-3,并且L1、L2、L3、L4、和L5是接头,其中L1为至少10个氨基酸、L2为至少10个氨基酸、L3为至少15个氨基酸、L4为至少10个氨基酸、并且L5为至少10个氨基酸,并且其中L1、L2、L4和L5进一步包含至少5个氨基酸的蛋白酶切割位点,并且其中该双特异性结合构建体可以与免疫效应细胞和靶细胞结合。
在另外的实施例中,本发明提供了编码本文所述的双特异性结合构建体的核酸,和包含这些核酸的载体。此外,本发明提供了包含本文所述的载体的宿主细胞。
在又其他实施例中,本发明提供了制造本文所述的双特异性结合构建体的方法,该方法包括(1)在表达双特异性结合构建体的条件下培养宿主细胞,以及(2)从细胞团或细胞培养上清液中回收双特异性结合构建体,其中该宿主细胞包含编码本文所述的双特异性结合构建体中的任一种的一种或多种核酸。
在其他实施例中,本发明提供了治疗癌症患者的方法,该方法包括向该患者施用治疗有效量的本文所述的双特异性结合构建体。
在其他实施例中,本发明提供了治疗患有感染性疾病的患者的方法,该方法包括向该患者施用治疗有效量的本文所述的双特异性结合构建体。
在其他实施例中,本发明提供了治疗患有自身免疫性、炎性、或纤维化病症的患者的方法,该方法包括向该患者施用治疗有效量的本文所述的双特异性结合构建体。
在另一个实施例中,本发明提供了包含本文所述的双特异性结合构建体的药物组合物。
附图说明
图1.HHLL形式A和B的示例性实施例的代表图,其指示蛋白酶切割位点、半胱氨酸钳、以及任选的CD3∈(对于形式A和B)和scFc部分(对于形式A)的位置。
图2.HHLL形式C和D的示例性实施例的代表图,并且指示蛋白酶切割位点、半胱氨酸钳、以及任选的CD3∈(对于形式C)、任选的HSA-CD3a.a 1-6或1-27(对于形式D)、和scFc部分(对于形式C和D)的位置。
图3.HHLL形式E的示例性实施例的代表图,其指示蛋白酶切割位点、半胱氨酸钳、以及任选的scFc-CD3∈部分的位置。
图4.指示双特异性构建体N4J的正确表达的色谱读数。
图5.指示双特异性构建体N7A的正确表达的色谱读数和SDS-PAGE。
图6.指示双特异性构建体V1E(但分子量低于预期)的表达的色谱读数和SDS-PAGE。
图7.指示双特异性构建体B1U的正确表达的色谱读数和SDS-PAGE。
图8.指示双特异性构建体Z9P的正确表达的色谱读数和SDS-PAGE。
图9.指示双特异性构建体O7H的正确表达的色谱读数和SDS-PAGE。
图10.指示双特异性构建体W9A的正确表达的色谱读数和SDS-PAGE。
图11.指示双特异性构建体B2P的正确表达的色谱读数和SDS-PAGE。
图12.指示双特异性构建体T7U的正确表达的色谱读数和SDS-PAGE。
图13.指示双特异性构建体L2G的正确表达的色谱读数和SDS-PAGE。
图14A.双特异性构建体(N4J、W2K、N7A、W9A和B2P)在存在或不存在重组人MMP-9时的SDS-PAGE。
图14B.双特异性构建体(W2K、Z9P、V1E、B1U、T7U和L2G)在存在或不存在重组人MMP-9时的SDS-PAGE。
图15A和图15B.通过具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的双特异性构建体N4J结合CD3表达细胞(图15A)和间皮素表达细胞(图15B)的FACS分析。
图16.通过具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的双特异性构建体N7A结合CD3和间皮素阳性细胞的FACS分析。
图17.通过不具有蛋白酶激活的双特异性构建体W2K、V1E,具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的双特异性构建体B1U、Z9P结合CD3和间皮素阳性细胞的FACS分析。
图18.通过具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的双特异性构建体B2P、W9A和N7A结合CD3阳性细胞的FACS分析。
图19.通过具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的双特异性构建体B2P、W9A和N7A结合间皮素阳性细胞的FACS分析。
图20.具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的双特异性构建体N4J和W2K的基于FACS的体外细胞毒性测定。
图21.具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的双特异性构建体N7A、W2K和阴性对照的基于FACS的体外细胞毒性测定。
图22.具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的双特异性构建体Z9P、V1E、B1U和阴性对照的基于FACS的体外细胞毒性测定。
图23.具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的双特异性构建体W9A、B2P、N7A的基于FACS体外细胞毒性测定。
图24.具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的双特异性构建体N7A、O7H和B2P的基于FACS的体外细胞毒性测定。
图25.具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的双特异性构建体T7U、L2G、N7A和B2P的基于FACS的体外细胞毒性测定。
图26.具有蛋白酶激活和不具有蛋白酶激活的每个双特异性构建体的EC50跨度、EC50值的平移因数和进行的体外细胞毒性测定的数量的概述。
具体实施方式
本文描述了双特异性结合构建体的新的形式。图1-图3描绘了这些构建体的代表性实例形式(A-E)。在一个实施例中,此形式包含单一多肽链,该单一多肽链包含按以下顺序排列的两个免疫球蛋白可变重链(VH)区、两个免疫球蛋白可变轻链(VL)区、蛋白酶切割位点、以及任选地Fc区:VH1-VH2-VL1-VL2(“HHLL”),并且更特别地,以第一种形式VH1-接头-VH2-接头-VL1-接头-VL2(任选地,在VL2和scFc或其他半衰期延长部分后具有另一个接头),以及第二种形式VH1-接头-CH2-CH3-接头-VH2-接头-VL1-CH2-CH3-接头-VL2。与例如HLHL形式相比,此双特异性构建体HHLL形式提供了增强的稳定性和增加的体外表达,但它保持了结合在免疫效应细胞和靶细胞上的所希望的靶标的预期功能。因此,本HHLL形式提供了能够被更有效地产生并具有更大稳定性的双特异性分子,这些特征是药物组合物中所追求的。
本发明提供的特定编号实施例包括但不限于以下:
1.一种双特异性结合构建体,该双特异性结合构建体包含含有具有式VH1-L1-VH2-L2-VL1-L3-VL2的氨基酸序列的多肽链,其中VH1和VH2包含免疫球蛋白重链可变区,VL1和VL2包含免疫球蛋白轻链可变区,并且L1、L2和L3是接头,其中L1为至少10个氨基酸、L2为至少15个氨基酸、并且L3为至少10个氨基酸,其中L1或L3包含蛋白酶切割位点,并且其中该双特异性结合构建体可与免疫效应细胞和靶细胞结合。
2.一种双特异性结合构建体,该双特异性结合构建体包含含有具有式VH1-L1-scFc子结构域1-L2-VH2-L3-VL1-L4-scFc子结构域2-L5-VL2的氨基酸序列的多肽链,其中VH1和VH2包含免疫球蛋白重链可变区,VL1和VL2包含免疫球蛋白轻链可变区,scFc包含免疫球蛋白重链恒定结构域-2和免疫球蛋白重链恒定结构域-3的子结构域1或子结构域2,并且L1、L2、L3、L4、和L5是接头,其中L1为至少10个氨基酸、L2为至少10个氨基酸、L3为至少15个氨基酸、L4为至少10个氨基酸、并且L5为至少10个氨基酸,并且其中L1、L2、L4和L5进一步包含至少5个氨基酸的蛋白酶切割位点,并且其中该双特异性结合构建体可与免疫效应细胞和靶细胞结合。
3.如实施例1所述的双特异性结合构建体,其中该蛋白酶切割位点存在于L1和L3两者中。
4.如实施例1或3所述的双特异性结合构建体,其进一步包含至少一个半胱氨酸钳。
5.如实施例4所述的双特异性结合构建体,其中该半胱氨酸钳位于促进该VH1和VL1亚基、该VH2和VL2亚基、或这些scFc亚基之间的连接的位置。
6.如实施例2所述的双特异性结合构建体,其进一步包含至少一个半胱氨酸钳。
7.如实施例6所述的双特异性结合构建体,其中该半胱氨酸钳位于促进该VH1和VL1亚基、该VH2和VL2亚基、和/或这些scFc亚基之间的连接的位置。
8.如实施例1-7中任一项所述的双特异性结合构建体,其进一步包含连接到该VL2结构域的半衰期延长部分。
9.如实施例8所述的双特异性结合构建体,其中该半衰期延长部分包含另外的接头和编码人IgG1、IgG2、或IgG4抗体的单链免疫球蛋白Fc区(scFc)。
10.如实施例9所述的双特异性结合构建体,其中该另外的接头包含蛋白酶切割位点。
11.如实施例10所述的双特异性结合构建体,其中该scFc多肽链包含抑制Fcγ受体(FcγR)结合的一种或多种改变和/或延长半衰期的一种或多种改变。
12.如实施例1-11中任一项所述的双特异性结合构建体,其中该VH1、VH2、VL1、和VL2都具有不同的序列。
13.如实施例1-12中任一项所述的双特异性结合构建体,其中
a.该VH1序列包含SEQ ID NO:65或67且该VL1序列包含SEQ ID NO:66或68,并且该VH2序列包含SEQ ID NO:75或77且该VL2序列包含SEQ ID NO:76或78,或者
b.该VH1序列包含SEQ ID NO:75或77且该VL1序列包含SEQ ID NO:76或78,并且该VH2序列包含SEQ ID NO:65或67且该VL2序列包含SEQ ID NO:66或68。
14.如实施例1-13中任一项所述的双特异性结合构建体,其进一步包含用另外的接头(L0)连接到VH1的另外的部分,其中L0的长度为至少5个氨基酸。
15.如实施例14所述的双特异性结合构建体,其中该另外的部分是CD3∈、或人血清白蛋白-接头-CD3(a.a.1-6)、或人血清白蛋白-接头-CD3(a.a.1-27)、或scFc-接头-CD3∈。
16.如实施例14或15所述的双特异性结合构建体,其中L0进一步包含蛋白酶位点。
17.如实施例1-16中任一项所述的双特异性结合构建体,其中这些接头长度不同。
18.如实施例1-16中任一项所述的双特异性结合构建体,其中这些接头长度相同。
19.如实施例1-16中任一项所述的双特异性结合构建体,其中L1和L2长度相同。
20.如实施例1-16中任一项所述的双特异性结合构建体,其中L1和L3长度相同。
21.如实施例1-16中任一项所述的双特异性结合构建体,其中L2和L3长度相同。
22.如实施例1-16中任一项所述的双特异性结合构建体,其中L1的氨基酸序列为至少10个氨基酸长,L2的氨基酸序列为至少15个氨基酸长,并且L3的氨基酸序列为至少15个氨基酸长。
23.如实施例1-22中任一项所述的双特异性结合构建体,其中该效应细胞表达效应细胞蛋白,该效应细胞蛋白为人T细胞受体(TCR)-CD3复合物的一部分。
24.如实施例1-22中任一项所述的双特异性结合构建体,其中该效应细胞蛋白是CD3∈链。
25.一种核酸,该核酸编码如实施例1-24中任一项所述的双特异性结合构建体。
26.一种载体,该载体包含如实施例25所述的核酸。
27.一种宿主细胞,该宿主细胞包含如实施例26所述的载体。
28.一种制造如实施例1-24中任一项所述的双特异性结合构建体的方法,该方法包括(1)在表达双特异性结合构建体的条件下培养宿主细胞,以及(2)从细胞团或细胞培养上清液中回收该双特异性结合构建体,其中该宿主细胞包含编码如实施例1-24中任一项所述的双特异性结合构建体的一种或多种核酸。
29.一种治疗癌症患者的方法,该方法包括向该患者施用治疗有效量的如实施例1-24中任一项所述的双特异性结合构建体。
30.如实施例29所述的方法,其中在施用该双特异性结合构建体的同时、之前或之后,向该患者施用化疗剂、非化疗性抗瘤剂和/或辐射。
31.一种药物组合物,该药物组合物包含如实施例1-24中任一项所述的双特异性结合构建体。
32.如实施例1-24中任一项所述的双特异性结合构建体在制造用于预防、治疗或缓解疾病的药物中的用途。
33.如实施例1-24中任一项所述的双特异性结合构建体,其中该结合构建体氨基酸序列包含选自以下的序列:SEQ ID NO:88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、或98。
应理解,如所声明的前述一般描述以及以下的详细描述均仅为示例性和说明性的,而不限制所要求的发明。在本申请中,除非另外特别说明,否则单数的使用包括复数。在本申请中,除非另外说明,否则“或”的使用意指“和/或”。此外,术语“包括(including)”、以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。同样,除非另外特别说明,否则术语如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分两者。而且,术语“部分(portion)”的使用可包括一部分(moiety)或整个部分(moiety)。
除非本文中另外定义,否则结合本发明所使用的科学及技术术语将具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外,除非上下文另有要求,否则单数术语将包括复数且复数术语将包括单数。通常,结合本文中所描述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质及核酸化学及杂交而使用的命名法及其技术是本领域中所熟知且通常使用的那些命名法及技术。本发明的方法和技术一般根据本领域熟知的常规方法且如各种通用及更特定参考文献中所描述来进行。
使用标准的一或三字母缩写表示多核苷酸和多肽序列。除非另外说明,否则多肽序列的氨基末端在左侧并且其羧基末端在右侧,单链核酸序列和双链核酸序列的上链的5’末端在左侧并且其3’末端在右侧。多肽的特定部分可通过氨基酸残基数(如氨基酸1至50)或该位点的实际残基(如天冬酰胺至脯氨酸)来指定。特定的多肽或多核苷酸序列也可以通过解释其与参考序列的区别来描述。
定义
关于分子(在该分子是例如多肽、多核苷酸、双特异性结合构建体或抗体的情况下)的术语“分离”是这样一种分子,根据其起源或衍生来源,其(1)不与在其天然状态下伴随其的天然相关的组分相连;(2)基本上不含来自相同物种的其他分子;(3)由不同物种的细胞表达;或(4)不存在于自然界中。因此,分子(其是化学合成的或在与作为其天然来源的细胞不同的细胞系统中表达)将与其天然相关的组分“分离”。还可使用本领域中熟知的纯化技术,通过分离使分子基本上不含天然相关的组分。分子纯度或均质性可以通过本领域中熟知的多种方式测定。例如,多肽样品的纯度可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳并使用本领域中熟知的技术对该凝胶染色以显现该多肽进行测定。出于某些目的,可以使用HPLC或本领域中熟知的其他纯化方式提供更高分辨率。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在全文中可互换使用,并且包括DNA分子(例如,cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如,mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物(例如,肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)、及其杂合物。核酸分子可以是单链或双链的。在一个实施例中,本发明的核酸分子包含编码本发明的抗体或其片段、衍生物、突变蛋白、或变体的连续开放阅读框。
“载体”是可用于将与其连接的另一种核酸引入细胞的核酸。一种类型的载体是“质粒”,其是指线性或环状双链DNA分子,其中可以连接另外的核酸区段。另一种类型的载体是病毒载体(例如,复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒),其中可以将另外的DNA区段引入病毒基因组中。某些载体(例如,包含细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如,非游离型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中,并且从而随着宿主基因组一起复制。“表达载体”是可以指导所选多核苷酸表达的一种载体。
如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如,表达的水平、时间或位置),则核苷酸序列与调控序列“可操作地连接”。“调控序列”是影响与其可操作地连接的核酸的表达(例如,表达的水平、时间或位置)的核酸。例如,调控序列可直接对受调控的核酸发挥作用,或通过一个或多个其他分子(例如,与调控序列和/或核酸结合的多肽)的作用发挥作用。调控序列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如,聚腺苷酸化信号)。
“宿主细胞”是可用于表达核酸(例如,本发明的核酸)的细胞。宿主细胞可以是原核生物(例如,大肠杆菌),或其可以是真核生物(例如,单细胞真核生物(例如,酵母或其他真菌)、植物细胞(例如,烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如,人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、或昆虫细胞))或杂交瘤。典型地,宿主细胞是可用多肽编码核酸转化或转染的培养细胞,然后该多肽编码核酸可在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可用于表示已经用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以是包含核酸但不以所希望的水平表达该核酸(除非将调控序列引入宿主细胞中以使该宿主细胞与该核酸可操作地连接)的细胞。应当理解术语宿主细胞不仅指特定的受试细胞,还指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于例如突变或环境影响而在随后世代中发生,这种后代事实上可能与亲本细胞不完全相同,但仍包括在本文所用术语的范围内。
“单链可变片段”(“scFv”)是以下融合蛋白,其中VL和VH区经由接头(例如,氨基酸残基的合成序列)连接以形成连续蛋白质链,其中该接头足够长以允许蛋白质链自身折回并形成单价抗原结合位点(参见例如Bird等人,Science[科学]242:423-26(1988)和Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-83(1988))。例如,当在其它附加部分(例如,Fc区)的上下文中时,scFv可排列为VH-接头-VL、或VL-接头-VH。
术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区(又称为“最小识别单元”或“高变区”)。CDR允许抗体或双特异性结合构建体特异性与目的特定抗原结合,并且本文提供的双特异性结合构建体可以包含来自重链和/或轻链的CDR。有三个重链可变区CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变区CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。两个链的每个中的CDR典型地通过框架区对齐以形成与靶蛋白上的特定表位或结构域特异性结合的结构。自N-末端至C-末端,天然存在的轻链和重链可变区典型地均遵循这些组件的以下次序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。编号系统是将编号指派给在这些结构域的每一个中占据位置的氨基酸来获得。此编号系统定义于以下文献中:Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列](1987及1991,NIH[美国国家卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州);或Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917;Chothia等人,1989,Nature[自然]342:878-883。给定抗体的互补决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用此系统标识。用于免疫球蛋白链中的氨基酸的其他编号系统包括(国际ImMunoGeneTics信息系统;Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学]29:185-203;2005)和AHo(Honegger和Pluckthun,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]309(3):657-670;2001)。可以将一个或多个CDR共价或非共价并入分子中以使其成为双特异性结合构建体。
术语“人抗体”包括具有抗体区的抗体,这些抗体区如实质上对应于本领域中已知的人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区或结构域,包括例如由Kabat等人(1991)(上述引文)描述的那些。本文提到的人抗体可以包括例如CDR中且特别是CDR3中不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个被不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替代的位置。如本文所用的人抗体的定义还考虑了完全人抗体,这些完全人抗体仅包括非人工和/或遗传改变的人抗体序列,如可以通过使用本领域已知的技术或系统(例如像,噬菌体展示技术或转基因小鼠技术,包括但不限于Xenomouse)衍生的那些。在本发明的上下文中,来自人抗体的可变区可用于预期的双特异性结合构建体形式。
与非人物种抗体相比,当向人试者施用人源化抗体时,该人源化抗体的序列与衍生自非人物种的抗体的序列不同之处在于一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加,使得人源化抗体不太可能诱导免疫应答和/或诱导不太严重的免疫应答。在一个实施例中,将非人物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定结构域中的某些氨基酸突变以产生人源化抗体。在另一个实施例中,来自人抗体的一个或多个恒定结构域铰链、CH2和CH3结构域融合至非人物种的一个或多个可变结构域。在另一个实施例中,当将非人抗体施用于人受试者时,改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基以降低该非人抗体可能的免疫原性,其中该改变的氨基酸残基对于该抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键的,或者对氨基酸序列所做的改变是保守的改变,使得人源化抗体与抗原的结合不显著劣于该非人抗体与该抗原的结合。如何制备人源化抗体的实例可以在美国专利号6,054,297、5,886,152和5,877,293中发现。在本发明的上下文中,来自人源化抗体的可变区可用于预期的双特异性结合构建体形式。
术语“嵌合抗体”是指含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区域的抗体。在一个实施例中,CDR中的一个或多个源自人抗体。在另一个实施例中,所有CDR均源自人抗体。在另一个实施例中,来自多于一种人抗体的CDR在嵌合抗体中混合和匹配。例如,嵌合抗体可以包含来自第一人抗体轻链的CDR1、来自第二人抗体轻链的CDR2和CDR3、以及来自第三抗体重链的CDR。此外,框架区可以源自相同抗体中的一种、源自一种或多种不同抗体(如人抗体)、或人源化抗体。在嵌合抗体的一个实例中,一部分重链和/或轻链与来自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体相同、与其同源或源自该抗体,而链的剩余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体相同、与其同源或源自该抗体。还包括展现所希望生物活性的此类抗体的片段。在本发明的上下文中,来自嵌合抗体的可变区可用于预期的双特异性结合构建体形式。
本发明提供了双特异性结合构建体,这些双特异性结合构建体包含HHLL形式,并且进一步包含含有蛋白酶切割位点的接头。在最一般的意义上,如本文所述的双特异性结合构建体包含具有不同氨基酸序列的几条多肽链,当这些多肽链连接在一起时,可与两种不同的抗原结合。由于在特定接头中包含蛋白酶切割位点(参见例如,图1和图2),因此未切割形式的结合构建体与希望的靶标的结合减少或没有结合。一旦暴露于蛋白酶,接头就会被切割,然后结合构建体就能够结合希望的靶标。任选地,HHLL分子进一步包含半衰期延长部分。在一些实施例中,半衰期延长部分是Fc多肽链。在其他实施例中,半衰期延长部分是单链Fc。在又其他实施例中,半衰期延长部分是异-Fc。在又其他实施例中,半衰期延长部分是人白蛋白。
接头
在免疫球蛋白可变区之间是肽接头,其可以是相同的接头或不同长度的不同接头。接头可以在双特异性结合构建体的结构中发挥作用。如果接头太短,则其将允许单一多肽链上的适当可变区具有足够的灵活性来相互作用以形成抗原结合位点。如果接头长度合适,其将允许一个可变区与同一多肽链上的另一个可变区相互作用,以形成抗原结合位点。在某些实施例中,HHLL形式包含二硫键-结构域内(H1、L1内)和结构域间(H1与L1之间)两者。为了实现本发明的双特异性结合构建体的适当表达和构象,在某些实施例中,在各种免疫球蛋白区域之间使用特定的接头(参见例如,本文中的图1)。示例性接头提供在本文的表1中。在某些实施例中,增加接头长度可能会导致蛋白质剪切增加(不希望的特性)。因此,希望在接头长度之间实现适当的平衡,以允许适当的多肽结构和活性,但不会导致剪切增加。
如本文意指的“接头”是连接两个多肽的肽。在某些实施例中,接头可以在双特异性结合构建体的情况下连接两个免疫球蛋白可变区。接头长度可以是2-30个氨基酸。在一些实施例中,接头可以是2-25、2-20、或3-18个氨基酸长。在一些实施例中,接头可以是不超过14、13、12、11、10、9、8、7、6、或5个氨基酸长的肽。在其他实施例中,接头可以是5-25、5-15、4-11、10-20、或20-30个氨基酸长。在其他实施例中,接头可以是约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸长。示例性接头包括,例如,氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:1)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:3)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:4)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:5)、GGGGQ(SEQ ID NO:6)、GGGGQGGGGQ(SEQ IDNO:7)、GGGGQGGGGQGGGGQ(SEQ ID NO:8)、GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ(SEQ ID NO:9)、GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ(SEQ ID NO:10)、GGGGSAAA(SEQ ID NO:11)、TVAAP(SEQ IDNO:12)、ASTKGP(SEQ ID NO:13)、和AAA(SEQ ID NO:14),其中包括上述氨基酸序列或氨基酸序列的亚基的重复(例如,GGGGS(SEQ ID NO:1)或GGGGQ(SEQ ID NO:6)重复)。
在本发明的HHLL分子的上下文中的某些实施例中,接头1的接头序列为至少10个氨基酸。在其他实施例中,接头1为至少15个氨基酸。在其他实施例中,接头1为至少20个氨基酸。在其他实施例中,接头1为至少25个氨基酸。在其他实施例中,接头1为至少30个氨基酸。在其他实施例中,接头1为10-30个氨基酸。在其他实施例中,接头1为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸。在又其他实施例中,接头1为大于30个氨基酸。
在本发明的HHLL分子的上下文中的某些实施例中,接头2的接头序列为至少15个氨基酸。在其他实施例中,接头2为至少20个氨基酸。在其他实施例中,接头2为至少25个氨基酸。在其他实施例中,接头2为至少30个氨基酸。在其他实施例中,接头2为15-30个氨基酸。在其他实施例中,接头2为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸。在又其他实施例中,接头2为大于30个氨基酸。
在本发明的HHLL分子的上下文中的某些实施例中,接头3的接头序列为至少15个氨基酸。在其他实施例中,接头3为至少20个氨基酸。在其他实施例中,接头3为至少25个氨基酸。在其他实施例中,接头3为至少30个氨基酸。在其他实施例中,接头3为15-30个氨基酸。在其他实施例中,接头3为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸。在又其他实施例中,接头3为大于30个氨基酸。
在本发明的HHLL分子的上下文中的某些实施例中,接头4的接头序列为至少5个氨基酸。在其他实施例中,接头4为至少10个氨基酸。在其他实施例中,接头4为至少15个氨基酸。在其他实施例中,接头4为至少20个氨基酸。在其他实施例中,接头4为至少25个氨基酸。在其他实施例中,接头4为至少30个氨基酸。在其他实施例中,接头4为5-30个氨基酸。在其他实施例中,接头4为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸。在又其他实施例中,接头4为大于30个氨基酸。
在本发明的HHLL分子的上下文中的某些实施例中,接头序列和位置在下表1中列出,其中接头位置与图1中列出的那些相对应,并且如果Fc区也附接到HHLL分子,则任选地使用接头4。
表1
*数字下标表示重复次数,例如,(GGGGS)2=GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:2)
注意,特意将3-3-2接头设计成了非最佳长度,以作为阴性对照。
蛋白酶切割位点
在某些治疗应用中,以使得仅在靶细胞或其局部微环境附近有活性的方式设计双特异性结合构建体可能是有利的。例如,在微环境中产生蛋白酶的某些癌症、炎性疾病、纤维化疾病和神经退行性疾病中,双特异性结合构建体一旦出现在患病细胞的微环境中,就会被激活。参见例如,Broder和Becker-Pauly(2013),Biochem.J.[生物化学杂志]450:第253-264页。还参见例如,Metz等人(2012),Protein Engineering[蛋白质工程],Designand Selection[设计和选择],第25卷,第10期,第571-580页。在此类型的疾病状态下,双特异性结合构建体可以在由疾病细胞产生的蛋白酶存在的情况下被激活,但在不存在蛋白酶的情况下则不能被激活。因此,如本文所述的双特异性结合构建体可以在疾病微环境中被特异性激活并且在身体的其他区域活性较低或无活性,这可以使接受疗法的患者经历较少的负面副作用。
因此,在某些实施例中,双特异性结合构建体在连接某些结构域的接头中包含蛋白酶切割位点,其中此蛋白酶切割位点可被由靶细胞(例如癌细胞或感染细胞、或病原体)产生的蛋白酶切割,并且其中此切割激活分子。
如本文意指的,“蛋白酶切割位点”包括可被蛋白酶切割的氨基酸序列,该蛋白酶例如像,金属蛋白酶(例如,基质金属蛋白酶(MMP),如MMP2、MMP9、MMP11等)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、或纤溶酶原激活剂(如尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)或组织纤溶酶原激活剂(tPA))、成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)、或弗林蛋白酶等。接头内蛋白酶切割位点的代表性位置示于本文图1和图2中。此类蛋白酶切割位点中包含的氨基酸序列的非限制性实例包括本文表2中所列的那些。
在一些实施例中,蛋白酶切割位点可以包括例如,由纤溶酶切割的位点。由u-PA通过蛋白水解切割激活前酶纤溶酶原,导致其转化为活性酶(纤溶酶)。纤溶酶(丝氨酸蛋白酶)可能在转移中发挥作用,因为其降解细胞外基质并激活其他酶(例如IV型胶原酶)。参见例如,Kaneko等人(2003),Cancer Sci.[癌症科学]94(1):43-39。
基质金属蛋白酶(MMP)MMP-2和MMP-9在多种人肿瘤(包括卵巢肿瘤、乳腺肿瘤和前列腺肿瘤,以及黑色素瘤)中过表达。此外,在临床和实验研究两者中均观察到侵袭性肿瘤生长与高水平的MMP-2和/或MMP-9之间的关联。参见例如,Roomi等人(2009),Onc.Rep.[肿瘤学报告]21:1323-1333。MMP-2或MMP-9切割位点可以表示为P4-P3-P2-P1|P1’-P2’-P3’-P4’,其中P1-P4和P1’-P4’是氨基酸,并且垂直线表示切割位点。可以对MMP-2切割位点进行一些概括。P1最可能是甘氨酸或脯氨酸。P2最可能是脯氨酸,丙氨酸、缬氨酸、或异亮氨酸的可能性较小。P3最可能是丙氨酸、丝氨酸、或精氨酸。P4最可能是丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、或丝氨酸。P1’最可能是亮氨酸,异亮氨酸、苯丙氨酸、或酪氨酸的可能性较小。P2’最可能是赖氨酸,丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、或酪氨酸的可能性较小。P3’最可能是丙氨酸、丝氨酸、或甘氨酸。P4’最可能是丙氨酸、赖氨酸、或天冬氨酸。MMP-9切割位点有更明确的偏好。P4最可能是甘氨酸。P3最可能是脯氨酸。P2最可能是赖氨酸。P1最可能是甘氨酸或脯氨酸。P1’最可能是亮氨酸,异亮氨酸的可能性较小。P2’最可能是赖氨酸。P3’最可能是甘氨酸或丙氨酸。P4’最可能是丙氨酸、脯氨酸、或酪氨酸。任何MMP-2或MMP-9切割位点可位于本文所述的双特异性结合构建体内(例如,在接头中),包括在表2或在以下文献中披露的那些:例如,Metz等人(2012),Protein Engineering[蛋白质工程],Design and Selection[设计和选择],第25卷,第10期,第571-580页或例如,Prudova等人(2010),Mol.Cell.Proteomics[分子与细胞蛋白质组学]9(5):894-911。
在一些实施例中,接头中使用的蛋白酶切割位点还包括,例如金属蛋白酶穿膜肽酶α和穿膜肽酶β的切割位点,这些切割位点可能与疾病有关,如某些癌症、炎性肠病、囊性纤维化、肾病、糖尿病肾病和真皮纤维化肿瘤。穿膜肽酶α和β的切割位点不限于这些蛋白酶中每一种的单一、确定的序列。然而,在相对于切割位点的某些氨基酸位置处,对一种或少数特定氨基酸有强烈的偏好。参见例如,Becker-Pauly等人(2011),Molecular andCellular Proteomics[分子与细胞蛋白质组学]10(9):M111.009233.DOI:10.1074/mcp.M111.009233,其中描述特定切割位点的部分(包括补充材料)通过引用并入本文。本文表2中提供了各种蛋白酶(包括穿膜肽酶α和穿膜肽酶β)的小部分已知切割位点。
已知高于正常水平的u-PA与各种癌症有关,包括例如结直肠癌,乳腺癌,单核细胞和骨髓性白血病,膀胱癌,甲状腺癌,肝癌,胃癌,和胸膜、肺、胰腺、卵巢、以及头颈的癌症。参见例如,Skelly等人(1997),Clin.Can.Res.[临床癌症研究]3:1837-1840;Han等人(2005),Oncol.Rep.[肿瘤学报告]14(1):105-112;Kaneko等人(2003),Cancer Sci.[癌症科学]94(1):43-49;Liu等人(2001),J.Biol.Chem.[生物化学杂志]276(21):17976-17984。在本文的表2中,报告了可以被u-PA切割的位点的小样品。因此,本文所述的双特异性结合构建体可以包含任何丝氨酸蛋白酶(包括u-PA和组织纤溶酶原激活剂(tPA))的切割位点,并包括表2中所列的那些切割位点中的任一个。
已经发现一些半胱氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶B)在肿瘤组织中过表达,并且可能在一些癌症中起致病作用。参见例如,Emmert-Buck等人(1994),Am.J.Pathol.[美国病理学杂志]145(6):1285-1290;Biniosseek等人(2011),J.Proteome Res.[蛋白质组学研究杂志]10:5363-5373。与穿膜肽酶α和穿膜肽酶β的切割位点一样,组织蛋白酶B切割位点也有很多异质性。组织蛋白酶B(以及其他蛋白酶)的切割位点可以表示为P3-P2-P1|P1’-P2’-P3’,其中P1-P3和P1’-P3’都是氨基酸,并且垂直线表示切割位点。一些概括适用于组织蛋白酶B切割位点。P3最常为G、F、L、或P(使用氨基酸的单字母代码)。P2最常为A、V、Y、F、或I。P1最常为G、A、M、Q、或T。P1’最常为F、G、I、V、或L。P2’最常为V、I、G、T、或A。P3’最常为G。此外,还有一些协同亚位点。例如,如果P2是F,则P3最可能是G并且最不可能是L,并且P1’最可能是F并且最不可能是L。协同亚位点的这个和其他实例详细描述于Biniossek等人(2011),J.Proteome Res.[蛋白质组学研究杂志]10:5363-5373。因此,所有的组织蛋白酶B切割位点(包括但不限于本文表2中的那些),都可以包含在本文所述的双特异性结合构建体中。
在一些实施例中,双特异性结合构建体包含蛋白酶切割位点Gly-Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Leu-Ser-Gln-Ser(SEQ ID NO:45)、Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln(SEQ IDNO:44)或Ala-Val-Arg-Trp-Leu-Leu-Thr-Ala(SEQ ID NO:102),该切割位点可以被金属蛋白酶切割。蛋白酶切割位点的其他实例包括Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg(SEQ ID NO:54),该切割位点被弗林蛋白酶切割。
蛋白酶切割位点处的切割可以通过本领域已知的多种测定来评估,例如通过SDS-PAGE和/或免疫印迹。在某些实施例中,当蛋白酶切割位点基本完全切割时,结合构建体更有效地与靶标结合,这可以通过例如SDS-PAGE和/或免疫印迹来评估。
表2:蛋白酶切割位点的实例
*垂直线(当存在时)表示预测的切割位点
**注意此序列也被MMP-9切割
半胱氨酸钳
“半胱氨酸钳”涉及典型地通过替代特定位置处的现有氨基酸将半胱氨酸引入多肽结构域的特定位置,使得当与在特定位置也引入半胱氨酸的另一个多肽结构域靠近时,二硫键(“半胱氨酸钳”)可在该两个结构域之间形成。
在一些实施例中,包含蛋白酶切割位点的接头序列可导致一旦蛋白酶切割位点被切割,由于适当多肽结构域之间缺乏共价连接而不能产生所希望分子结构的分子。因此,在某些实施例中,共价连接由在特定位置处引入的一个或多个工程化的二硫键(“半胱氨酸钳”)提供。这些半胱氨酸钳的非限制性实例可以在美国专利申请公开号2016/0193295A1、美国专利申请公开号2017/0306033A1、和美国专利申请公开号2018/0079790A1中找到。
在某些实施例中,抗体Fc结构域可以包含一个或多个半胱氨酸钳,如CH2和/或CH3结构域。参见例如,美国专利申请公开号2016/0193295A1。在特定实施例中,scFc包含至少一个半胱氨酸钳,该半胱氨酸钳产生跨两个CH2结构域的二硫键。在另一个特定实施例中,scFc包含至少两个半胱氨酸钳,这些半胱氨酸钳产生跨两个CH2结构域的二硫键。
在某些实施例中,CH2序列已被改变以产生一个或多个半胱氨酸钳的氨基酸残基可选自以下,其中一个或多个氨基酸被半胱氨酸取代:R72C、V82C、R329C、R339C。
在某些实施例中,特定残基对被取代以使其优先彼此形成二硫键,因此限制或防止二硫键混乱。这些特定对的非限制性实例包括但不限于72C-82C、329C-339C。
在其他实施例中,结合构建体的VH和VL结构域可包含一个或多个半胱氨酸钳以导致VH结构域与VL结构域之间形成二硫键。这些半胱氨酸钳将稳定抗原结合构型中的VH和VL结构域。参见例如,美国专利申请公开号2017/0306033A1。
在某些实施例中,VH和VL序列已被改变以产生一个或多个半胱氨酸钳的氨基酸残基可选自以下,其中一个或多个氨基酸被半胱氨酸取代:用于抗MSLN的Kabat VH44 VL100和用于抗CD3的VH103VL43。
在某些实施例中,特定残基对被取代以使其优先彼此形成二硫键,因此限制或防止二硫键混乱。这些特定对的非限制性实例包括但不限于MSLN VH44-VL100、抗CD3 VH103-VL43。
结合区的氨基酸序列
在本文所述的示例性实施例中,双特异性结合构建体保持与各种希望的靶标的希望结合,这是由于它们假定允许此结合的适当构象。免疫球蛋白可变区包含VH和VL结构域,这两个结构域缔合,以形成结合希望的靶标的可变结构域。
可变结构域可从具有所希望的特征的任何免疫球蛋白中获得,并且本文进一步描述实现该目的的方法。在一个实施例中,VH1和VL1缔合并结合CD3∈,并且VH2和VL2缔合并结合不同的靶标。在另一个实施例中,VH2和VL2结合CD3∈,并且VH1和VL1结合不同的靶标。
在另一个实施例中,轻链可变结构域包含与本文所列轻链可变结构域的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。
在另一个实施例中,轻链可变结构域包含由以下核苷酸序列编码的氨基酸的序列,该核苷酸序列与本文所列多核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。在另一个实施例中,轻链可变结构域包含由以下多核苷酸编码的氨基酸的序列,该多核苷酸在中等严格条件下与编码选自本文所列序列的轻链可变结构域的多核苷酸的互补序列杂交。在另一个实施例中,轻链可变结构域包含由以下多核苷酸编码的氨基酸的序列,该多核苷酸由在严格条件下与编码选自由本文所列序列组成的组的轻链可变结构域的多核苷酸的互补序列杂交。
在另一个实施例中,重链可变结构域包含与选自本文所列序列的重链可变结构域的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在另一个实施例中,重链可变结构域包含由以下核苷酸序列编码的氨基酸的序列,该核苷酸序列与编码选自本文所列序列的重链可变结构域的核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。在另一个实施例中,重链可变结构域包含由以下多核苷酸编码的氨基酸的序列,该多核苷酸在中等严格条件下与编码选自本文所列序列的重链可变结构域的多核苷酸的互补序列杂交。在另一个实施例中,重链可变结构域包含由以下多核苷酸编码的氨基酸的序列,该多核苷酸在严格条件下与编码选自本文所列序列的重链可变结构域的多核苷酸的互补序列杂交。
取代
应理解,本发明的双特异性结合构建体可具有至少一个氨基酸取代,前提是该双特异性结合构建体保留相同或更好的所希望的结合特异性(例如,与CD3结合)。因此,双特异性结合构建体结构的修饰包含在本发明的范围内。在一个实施例中,双特异性结合构建体包含序列,这些序列各自独立地与本文所述的那些的CDR序列相差5、4、3、2、1、或0个单一氨基酸添加、取代和/或缺失。如本文所用,与本文所述的CDR序列相差不超过总共例如四个氨基酸添加、取代和/或缺失的CDR序列是指与本文所述的序列相比具有4、3、2、1或0个单一氨基酸添加、取代、和/或缺失的序列。这些可以包括氨基酸取代,这些氨基酸取代可以是保守的或非保守的,其不会破坏结合构建体的所希望的结合能力。保守氨基酸取代可能涵盖典型地通过化学肽合成而非通过在生物系统中合成而并入的非天然存在氨基酸残基。这些包括肽模拟物和氨基酸部分的其他反向或逆向形式。保守性氨基酸取代还可涉及用标准残基取代原生氨基酸残基,使得对此位置处的氨基酸残基的极性或电荷具有少量影响或无影响。
非保守性取代可能涉及将一类氨基酸或氨基酸模拟物的成员换成具有不同物理特性(例如尺寸、极性、疏水性、电荷)的另一类的成员。在某些实施例中,可将此类经取代残基引入与非人抗体同源的人抗体区域中或引入该分子的非同源区域中。
此外,本领域技术人员可产生在每个所希望的氨基酸残基处含有单一氨基酸取代的测试变体。然后,可以使用本领域技术人员已知的活性测定筛选这些变体。此类变体可用于收集关于合适变体的信息。例如,如果发现特定氨基酸残基的改变导致受破坏、不希望地降低或不合适的活性,则可避免具有此改变的变体。换言之,基于从此类常规实验收集的信息,本领域普通技术人员可容易地确定其中应避免单独或与其他突变组合的进一步取代的氨基酸。
本领域技术人员将能够使用熟知的技术来确定如本文所述的双特异性结合构建体的合适变体。在某些实施例中,本领域技术人员可通过靶向据信对活性不重要的区域来鉴定在不破坏活性的情况下被改变的分子的合适区域。在某些实施例中,可鉴定在本文所述的相似多肽之间保守的分子的残基和部分。在某些实施例中,在不破坏生物活性或不会对多肽结构造成不利影响的情况下,即使可能对生物活性或对结构重要的区域也可以进行保守氨基酸取代。
另外,本领域技术人员可回顾鉴别类似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于该比较,可预测蛋白质中如下氨基酸残基的重要性,这些氨基酸残基对应于相似蛋白质中对于活性或结构重要的氨基酸残基。本领域技术人员可针对此类预测的重要氨基酸残基来选择化学上类似的氨基酸取代。
在一些实施例中,本领域技术人员可以确定可改变的残基,这些改变的残基产生所希望的增强特性。例如,氨基酸取代(保守的或不保守的)可能会导致对所希望的靶标的结合亲和力增强。
本领域技术人员还可分析与类似多肽的结构有关的三维结构及氨基酸序列。鉴于此种信息,本领域技术人员可根据抗体的三维结构来预测该抗体的氨基酸残基的比对。在某些实施例中,本领域技术人员可选择不对预计处于蛋白质表面上的氨基酸残基进行彻底变化,因为此类残基可能参与跟其他分子的重要相互作用。许多科学出版物已致力于二级结构的预测。参见Moult J.,Curr.Op.in Biotech.[当前生物技术观点],7(4):422-427(1996),Chou等人,Biochemistry[生物化学],13(2):222-245(1974);Chou等人,Biochemistry[生物化学],113(2):211-222(1974);Chou等人,Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.[酶学和分子生物学相关领域的进展],47:45-148(1978);Chou等人,Ann.Rev.Biochem.[生物化学年鉴],47:251-276和Chou等人,Biophys.J.[生物物理学杂志],26:367-384(1979)。此外,计算机程序当前可用于辅助预测二级结构。预测二级结构的一种方法基于同源性模型化。例如,具有大于30%的序列同一性或大于40%的相似性的两种多肽或蛋白质通常具有类似的结构拓扑学。蛋白质结构数据库(PDB)的增长提供了增强的二级结构(包括多肽的结构或蛋白质的结构中潜在的折叠数)的可预测性。参见Holm等人,Nucl.Acid.Res.[核酸研究],27(1):244-247(1999)。预测二级结构的其他方法包括“串线法(threading)”(Jones,D.,Curr.Opin.Struct.Biol.[结构生物学新见],7(3):377-87(1997);Sippl等人,Structure[结构],4(1):15-19(1996))、“特征分析(profileanalysis)”(Bowie等人,Science[科学],253:164-170(1991);Gribskov等人,Meth.Enzym.[酶学方法],183:146-159(1990);Gribskov等人,Proc.Nat.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊],84(13):4355-4358(1987))、和“进化性连锁(evolutionary linkage)”(参见Holm,同上(1999),和Brenner,同上(1997))。
在某些实施例中,双特异性结合构建体的变体包括如下糖基化变体,其中与亲本多肽的氨基酸序列相比,糖基化位点的数目和/或类型已发生改变。在某些实施例中,变体包含比天然蛋白质更多或更少数目的N连接的糖基化位点。可替代地,消除此序列的取代将移除已存在的N连接的碳水化合物链。还提供N连接的碳水化合物链的重排,其中消除一个或多个N连接的糖基化位点(典型地天然存在的那些)并且创造一个或多个新的N连接的位点。另外的抗体变体包括半胱氨酸变体,其中与亲本氨基酸序列相比,一个或多个半胱氨酸残基缺失或取代另一个氨基酸(例如,丝氨酸)。当抗体或双特异性结合构建体必须重新折叠成生物学活性构象时,如在分离不溶性包涵体之后,半胱氨酸变体可为有用的。半胱氨酸变体一般具有比天然蛋白质少的半胱氨酸残基,且典型地具有偶数个,以使由未配对的半胱氨酸引起的相互作用最小。
所希望的氨基酸取代(无论保守或非保守)可由本领域技术人员在需要此类取代时来确定。在某些实施例中,氨基酸取代可用于鉴别针对目的靶标的抗体或双特异性结合构建体的重要残基,或增加或减少抗体或双特异性结合构建体对本文所述的目的靶标的亲和力。
根据某些实施例,所希望的氨基酸取代为以下那些:(1)降低对蛋白质水解的敏感性;(2)降低对氧化的敏感性;(3)改变用于形成蛋白质复合物的结合亲和力;(4)改变结合亲和力和/或(4)赋予或改变此类多肽上的其他生理化学特性或功能特性。根据某些实施例,可在天然存在的序列中(在某些实施例中,在形成分子间接触的一个或多个结构域外的多肽部分中)进行单个或多个氨基酸取代(在某些实施例中为保守氨基酸取代)。在某些实施例中,保守氨基酸取代典型地基本上不会改变亲本序列的结构特性(例如替代氨基酸不应倾向于使亲本序列中存在的螺旋断裂,或破坏亲本序列特征性的其他类型二级结构)。领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins,Structures and MolecularPrinciples[蛋白质、结构和分子原理](Creighton编辑,W.H.Freeman and Company[W.H.弗里曼公司],纽约(1984));Introduction to Protein Structure[蛋白质结构简介](C.Branden和J.Tooze编辑,Garland Publishing[加兰出版社],纽约,纽约州(1991));以及Thornton等人Nature[自然]354:105(1991),将这些文献各自通过引用并入本文。
半衰期延长和Fc区
在某些实施例中,希望延长本发明双特异性结合构建体的体内半衰期。这可以通过包括半衰期延长部分作为双特异性结合构建体的一部分来实现。半衰期延长部分的非限制性实例包括Fc多肽、白蛋白、白蛋白片段、与白蛋白或新生儿Fc受体(FcRn)结合的部分、已经工程改造以结合白蛋白或其片段的纤连蛋白的衍生物、肽、单结构域蛋白片段、或可以增加血清半衰期的其他多肽。在替代实施例中,半衰期-延长部分可以是非多肽分子,例如像,聚乙二醇(PEG)。
如本文所用的术语“Fc多肽”包括衍生自抗体Fc区的天然和突变蛋白形式的多肽。还包括含有促进二聚化的铰链区的截短形式的此类多肽。除了本文所述的其他特性外,包含Fc部分的多肽提供了通过经例如蛋白A或蛋白G柱的亲和色谱法进行纯化的优点。
在某些实施例中,半衰期延长部分是抗体的Fc区。在某些实施例中,Fc区位于HHLL双特异性结合构建体的N末端。在其他实施例中,Fc区位于HHLL双特异性结合构建体的C末端。在又其他实施例中,如本文图2所示,Fc区可位于VH与VL亚基之间。在HHLL双特异性结合构建体与Fc区之间可以有但不必需有接头。如本文所解释的,Fc多肽链可以包含全部或部分铰链区,随后是CH2和CH3区。Fc多肽链可以是哺乳动物(例如,人、小鼠、大鼠、兔子、单峰骆驼、或新或旧大陆猴(new or old world monkey))、禽类、或鲨鱼的。另外,如本文所解释的,Fc多肽链可以包括有限数量的改变。例如,Fc多肽链可以包含一种或多种异源二聚化改变、抑制或增强与FcγR结合的一种或多种改变、或增加与FcRn结合的一种或多种改变。
在特定实施例中,用于半衰期延长的Fc是单链Fc(“scFc”)。
在一些实施例中,Fc多肽的氨基酸序列可以是哺乳动物(例如人)氨基酸序列。Fc多肽的同种型可以是IgG(如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)、IgA、IgD、IgE、或IgM。下表3示出了人IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4 Fc多肽链的氨基酸序列的比对。
SEQ ID NO:56-59中提供了可以使用的人IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4 Fc多肽的序列。还考虑了含有一种或多种异源二聚化改变、延长半衰期的一种或多种Fc改变、增强ADCC的一种或多种改变、和/或抑制Fcγ受体(FcγR)结合的一种或多种改变的这些序列的变体,以及也考虑了每100个氨基酸的序列含有不超过10个单一氨基酸缺失、插入、或取代的其他接近变体。
表3:人IgG Fc多肽链的氨基酸序列
表3中显示的编号是根据EU编号系统,该系统基于IgG1抗体恒定区的顺序编号。Edelman等人(1969),Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]63:78-85。因此,他不能容纳IgG3铰链孔的另外长度。尽管如此,这里仍使用它来指定Fc区中的位置,因为它在本领域中仍常用来指Fc区中的位置。IgG1、IgG2、和IgG4 Fc多肽的铰链区从约216位延伸至约230位。从比对中可以清楚地看出,IgG2和IgG4铰链区各比IgG1铰链短三个氨基酸。IgG3铰链更长,向上游延伸了另外的47个氨基酸。CH2区从约231位延伸至340位,CH3区从约341位延伸至447位。
Fc多肽的天然存在的氨基酸序列可以略有不同。此类变化可包括天然存在的Fc多肽链的序列的每100个氨基酸中不超过10个的单一氨基酸插入、缺失、或取代。如果有取代,这些取代可以是如本文定义的保守性氨基酸取代。第一和第二多肽链上的Fc多肽的氨基酸序列可以不同。在一些实施例中,它们可以包括促进异源二聚体形成的“异源二聚化改变”,例如,如本文所定义的电荷对取代。此外,PABP的Fc多肽部分还可以含有抑制或增强FcγR结合的改变。本文以及Xu等人(2000),Cell Immunol.[细胞免疫学]200(1):16-26(其相关部分通过引用并入本文)中描述了此类突变。Fc多肽部分还可以包括如本文所述的“延长半衰期的Fc改变”,包括以下文献中描述的那些:例如,美国专利7,037,784、7,670,600、和7,371,827,美国专利申请公开2010/0234575,以及国际申请PCT/US 2012/070146,将所有文献的相关部分通过引用并入本文。另外,Fc多肽可以包含如本文所定义的“增强ADCC的改变”。
PCT申请WO 93/10151(通过引用特此并入)中描述的另一种合适的Fc多肽是从人IgG1抗体的Fc区的N-末端铰链区延伸至天然C-末端的单链多肽。另一种有用的Fc多肽是Fc突变蛋白,描述于美国专利5,457,035以及Baum等人,1994,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]13:3992-4001中。此突变蛋白的氨基酸序列与WO 93/10151中呈现的天然Fc序列的氨基酸序列相同,不同的是氨基酸19已经从Leu变为Ala,氨基酸20已经从Leu变为Glu,并且氨基酸22已经从Gly变为Ala。突变蛋白展现了对Fc受体降低的亲和力。
通过将一个或多个突变引入Fc,可以增加、或减少抗体或结合构建体的效应子功能。本发明的实施例包括具有工程化来增加效应子功能的Fc的IL-2突变蛋白Fc融合蛋白(U.S.7,317,091和Strohl,Curr.Opin.Biotech.[生物技术当前述评],20:685-691,2009;将这两篇文献通过引用以其全文并入本文)。对于某些治疗性适应症,可能希望增加效应子功能。对于其他治疗性适应症,可能希望减少效应子功能。
具有增加的效应子功能的示例性IgG1 Fc分子包括具有以下取代的那些:
S239D/I332E
S239D/A330S/I332E
S239D/A330L/I332E
S298A/D333A/K334A
P247I/A339D
P247I/A339Q
D280H/K290S
D280H/K290S/S298D
D280H/K290S/S298V
F243L/R292P/Y300L
F243L/R292P/Y300L/P396L
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L
G236A/S239D/I332E
K326A/E333A
K326W/E333S
K290E/S298G/T299A
K290N/S298G/T299A
K290E/S298G/T299A/K326E
K290N/S298G/T299A/K326E
增加含IgG Fc的蛋白质的效应子功能的另一种方法是通过减少Fc的岩藻糖基化。从附接至Fc的双触角复合型寡糖移除核心岩藻糖增加ADCC效应子功能而不改变抗原结合或CDC效应子功能。已知几种方式来减少或消除含Fc分子(例如抗体)的岩藻糖基化。这些方式包括在某些哺乳动物细胞系中进行重组表达,这些细胞系包括FUT8敲除细胞系、变体CHO系Lec13、大鼠杂交瘤细胞系YB2/0、包含特异性针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系、以及共表达α-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III和高尔基α-甘露糖苷酶II的细胞系。可替代地,可以在非哺乳动物细胞(例如植物细胞、酵母、或原核细胞,例如大肠杆菌)中表达含Fc分子。
在本发明的某些实施例中,双特异性结合构建体包含工程化来减少效应子功能的Fc。具有减少的效应子功能的示例性Fc分子包括具有以下取代的那些:
N297A或N297Q(IgG1)
L234A/L235A(IgG1)
V234A/G237A(IgG2)
L235A/G237A/E318A(IgG4)
H268Q/V309L/A330S/A331S(IgG2)
C220S/C226S/C229S/P238S(IgG1)
C226S/C229S/E233P/L234V/L235A(IgG1)
L234F/L235E/P331S(IgG1)
S267E/L328F(IgG1)
已知人IgG1具有在N297(EU编号系统)处的糖基化位点,并且糖基化有助于IgG1抗体的效应子功能。在SEQ ID NO:36中提供了示例性IgG1序列。N297可以突变以形成无糖基化抗体。例如,突变可以用具有类似天冬酰胺的生理化学性质的氨基酸(如谷氨酰胺(N297Q))或用丙氨酸(N297A)(其模拟没有极性基团的天冬酰胺)取代N297。
在某些实施例中,将人IgG1的氨基酸N297突变为甘氨酸,即N297G,提供了远远比在此残基处的其他氨基酸取代更优越的纯化效能和生物物理特性。参见例如,美国专利号9,546,203和10,093,711。在特定实施例中,本发明的双特异性结合构建体包含具有N297G取代的人IgG1 Fc。
包含具有N297G突变的人IgG1 Fc的本发明的双特异性结合构建体还可以包含另外的插入、缺失、和取代。在某些实施例中,人IgG1Fc包含N297G取代并且与SEQ ID NO:36中列出的氨基酸序列具有至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、或至少99%同一性。在特别优选的实施例中,C末端赖氨酸残基被取代或缺失。
在某些情况下,含有无糖基化IgG1 Fc的分子可能不如含有糖基化IgG1 Fc的分子稳定。因此,可以将Fc区进一步工程化,从而增加无糖基化分子的稳定性。在一些实施例中,将一个或多个氨基酸取代为半胱氨酸,从而在二聚体状态下形成二硫键。在特定的实施例中,可以用半胱氨酸取代SEQ ID NO:56-59中列出的氨基酸序列的残基V259、A287、R292、V302、L306、V323、或I332。在其他实施例中,特定残基对是以下取代,该取代使得其优先彼此形成二硫键,因此限制或防止二硫键混乱。在特定的实施例中,对包括但不限于,A287C与L306C、V259C与L306C、R292C与V302C、以及V323C与I332C。
如本文在接头部分中所讨论的,在某些实施例中,本发明的双特异性结合构建体包含Fc与HHLL双特异性结合构建体之间(特别地,将Fc连接到VL2)的接头。在某些实施例中,肽的一个或多个拷贝由在Fc和HHLL多肽之间的GGGGS(SEQ ID NO:1)、GGNGT(SEQ IDNO:15)、或YGNGT(SEQ ID NO:16)组成。在一些实施例中,Fc区和HHLL多肽之间的多肽区包含以下的单拷贝:GGGGS(SEQ ID NO:1)、GGNGT(SEQ ID NO:15)、或YGNGT(SEQ ID NO:16)。在某些实施例中,当在适当细胞中表达时,接头GGNGT(SEQ ID NO:15)或YGNGT(SEQ ID NO:16)被糖基化,并且这种糖基化可以帮助在溶液中和/或在体内施用时稳定蛋白。因此,在某些实施例中,本发明的双特异性结合构建体包含Fc区与HHLL多肽之间的糖基化接头。
编码双特异性结合构建体的核酸
在另一个实施例中,本发明提供了编码本发明的双特异性结合构建体的分离的核酸分子。另外,提供了包含这些核酸的载体、包含这些核酸的细胞、和制备本发明的双特异性结合构建体的方法。这些核酸包含例如编码双特异性结合构建体的全部或一部分(例如,或其片段、衍生物、突变蛋白或变体)的多核苷酸,足以用作杂交探针的多核苷酸,用于对编码多肽的多核苷酸进行鉴别、分析、突变或扩增的PCR引物或测序引物,用于抑制多核苷酸表达的反义核酸,以及前述的互补序列。适当时,这些核酸可以为任何长度以用于所希望的用途或功能,且可包含一个或多个另外的序列,例如调控序列,和/或作为较长核酸,例如载体的一部分。核酸可以是单链或双链,且可以包含RNA和/或DNA核苷酸及其人工变体(例如肽核酸)。
编码多肽(例如,重链或轻链、仅可变结构域、或全长)的核酸可从已用抗原免疫的小鼠的B细胞中分离。可通过常规程序如聚合酶链式反应(PCR)来分离核酸。
编码重链和轻链可变区的可变区的核酸序列包括在本文中。本领域技术人员将理解,由于遗传密码的简并性,本文披露的每个多肽序列由大量其他核酸序列编码。本发明提供了编码本发明的每个双特异性结合构建体的每个简并核苷酸序列。
本发明进一步提供了可在特定杂交条件下与其他核酸杂交的核酸。使核酸杂交的方法在本领域中是所熟知的。参见例如,Current Protocols in Molecular Biology[当代分子生物学方案],John Wiley&Sons[约翰·威利父子公司],纽约(1989),6.3.1-6.3.6。如本文所定义,例如,中等严格杂交条件使用含5X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5%SDS、1.0mMEDTA(pH 8.0)的预洗涤溶液,具有约50%甲酰胺、6X SSC、和杂交温度为55℃的杂交缓冲液(或其他类似的杂交溶液,如含有约50%甲酰胺、杂交温度为42℃的杂交溶液),以及60℃下在0.5XSSC、0.1%SDS中的洗涤条件。严格杂交条件在45℃下于6X SSC中杂交,随后在68℃下于0.1X SSC、0.2%SDS中洗涤一次或多次。另外,本领域技术人员可以操作这些杂交和/或洗涤条件以增加或降低杂交的严格度,使得包含彼此具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的核苷酸序列的核酸典型地保持彼此杂交。影响杂交条件的选择的基本参数及关于设计适合的条件的指导阐述于例如以下中:Sambrook,Fritsch及Maniatis(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manuall[分子克隆:实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约,第9和11章;及Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法],1995,Ausubel等人编,John Wiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子公司],第2.10节及第6.3-6.4节),且可由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成而容易地确定。可通过突变将变化引入核酸中,从而引起其所编码的多肽(例如,双特异性结合构建体)的氨基酸序列的变化。可使用本领域中已知的任何技术来引入突变。在一个实施例中,使用例如定点诱变方案来改变一个或多个特定氨基酸残基。在另一个实施例中,使用例如随机诱变方案来改变一个或多个随机选择的残基。不管如何进行改变,均可以使突变多肽表达且针对所希望的特性进行筛选。
可将突变引入核酸中而不显著改变其编码的多肽的生物活性。例如,可进行核苷酸取代,从而在非必需氨基酸残基处进行氨基酸取代。在一个实施例中,本文提供的用于本发明的结合构建体的核苷酸序列,或其所希望的片段、变体或衍生物发生突变,以使其编码包含氨基酸残基的一个或多个缺失或取代的氨基酸序列,对于本发明的结合构建体的轻链或本发明的结合构建体的重链,本文示出了这些氨基酸残基为两个或更多个序列不同处的残基。在另一个实施例中,诱变插入与本发明结合构建体的轻链或本发明结合构建体的重链的一个或多个氨基酸残基相邻的氨基酸,以作为两个或多个序列不同的残基。可替代地,可将一个或多个突变引入核酸中,从而选择性地改变其编码的多肽的生物活性。
在另一个实施例中,本发明提供了包含编码本发明的多肽或其部分的核酸的载体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、非游离型哺乳动物载体和表达载体(例如,重组表达载体)。
本发明的重组表达载体可以包含本发明的核酸,该核酸呈适用于在宿主细胞中表达该核酸的形式。重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞而选择的一个或多个调控序列,其可操作地连接于待表达的核酸序列。调控序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些调控序列(例如,SV40早期基因增强子、劳氏肉瘤病毒启动子及巨细胞病毒启动子)、指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些调控序列(例如,组织特异性调控序列,参见Voss等人,1986,Trends Biochem.Sci.[生物化学科学趋势]11:287;Maniatis等人,1987,Science[科学]236:1237,将其通过引用以其全文并入本文)及指导响应于特定治疗或病症的核苷酸序列的诱导型表达的那些调控序列(例如,哺乳动物细胞中的金属硫蛋白启动子以及原核及真核系统中的四环素反应性和/或链霉素反应性启动子(参见同上))。本领域技术人员应理解,表达载体的设计可以取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞中,由此产生由如本文所述的核酸编码的蛋白质或肽,包括融合蛋白或肽。
在另一个实施例中,本发明提供了已引入本发明的重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。原核宿主细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体,例如大肠杆菌或杆菌(bacilli)。高等真核细胞包括昆虫细胞、酵母细胞、和哺乳动物来源的已建立的细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物(如Veggie CHO)和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见Rasmussen等人,1998,Cytotechnology[细胞工程学]28:31)或DHFR缺陷的CHO菌株DXB-11(参见Urlaub等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216-20)。另外的CHO细胞系包括CHO-K1(ATCC#CCL-61)、EM9(ATCC#CRL-1861)、和UV20(ATCC#CRL-1862)。另外的宿主细胞系包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC CRL 1651)(参见Gluzman等人,1981,Cell[细胞]23:175),L细胞,C127细胞,3T3细胞(ATCC CCL 163),AM-1/D细胞(描述于美国专利号6,210,924中),HeLa细胞,BHK(ATCC CRL 10)细胞系,衍生自非洲绿猴肾细胞系CV1(ATCC CCL 70)的CV1/EBNA细胞系(参见McMahan等人,1991,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]10:2821),人胚肾细胞(如293,293EBNA或MSR 293),人表皮A431细胞,人Colo205细胞,其他经转化的灵长类动物细胞系,正常二倍体细胞,衍生自初生组织、初生外植体的体外培养的细胞株,HL-60,U937,HaK或Jurkat细胞。用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当克隆和表达载体由以下描述:Pouwels等人(Cloning Vectors:A LaboratoryManual[克隆载体:实验室手册],Elsevier[爱思唯尔公司],纽约,1985)。
可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。为了稳定转染哺乳动物细胞,已知取决于所使用的表达载体及转染技术,仅一小部分细胞可将外来DNA整合至其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体,通常将编码可选择标志物(例如针对抗生素抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。另外的可选择标志物包括赋予药物(如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的那些。除其他方法以外,可通过药物选择(例如已并入可选择标志物基因的细胞将幸存,而其他细胞则死亡)来鉴别经所引入的核酸稳定转染的细胞。
可以在促进多肽表达的条件下培养转化的细胞,并通过常规蛋白质纯化程序回收多肽。考虑用于本文的多肽包括基本上不含污染性内源物质的基本上均质的重组哺乳动物多肽。
含有编码本发明的双特异性结合构建体的核酸的细胞还包括杂交瘤。本文讨论了杂交瘤的产生和培养。
在一些实施例中,提供了包含如本文所述的核酸分子的载体。在一些实施例中,本发明包含含有如本文所述的核酸分子的宿主细胞。
在一些实施例中,提供了编码如本文所述的双特异性结合构建体的核酸分子。
在一些实施例中,提供了包含本文所述的至少一种双特异性结合构建体的药物组合物。
生产方法
本发明的双特异性结合构建体可以通过任何本领域已知的用于合成蛋白质(例如抗体)的方法(特别是通过化学合成或优选地通过重组表达技术)产生。
双特异性结合构建体的重组表达需要构建含有编码该双特异性结合构建体的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得编码双特异性结合构建体的多核苷酸,就可以通过重组DNA技术产生用于产生该双特异性结合构建体的载体。构建了含有双特异性结合构建体编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术、以及体内基因重组。
通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞,并且然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的双特异性结合构建体。
可以利用各种宿主表达载体系统,并容易地进行调整以表达本发明的双特异性结合构建体。此类宿主表达系统代表媒介物(通过这些媒介物产生并随后纯化目的编码序列),而且还代表在用适当核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明的分子的细胞。细菌细胞(如大肠杆菌)和真核细胞常用于表达重组抗体分子,尤其是用于表达整个重组抗体分子。例如,哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))与载体(如来自人巨细胞病毒的主要中期早期基因启动子元件)相结合是抗体的有效表达系统(Foecking等人,Gene[基因]45:101(1986);Cockett等人,Bio/Technology[生物技术]8:2(1990))。
另外,可选择调节所插入序列的表达、或以所希望的特定方式来修饰并且加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白质的功能来说可能是重要的。不同宿主细胞对于蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征和特定机制。可选择适当细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此,可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、COS、293、3T3或骨髓瘤细胞。
为了长期、高产量的产生重组蛋白,稳定表达是优选的。例如,可以工程化稳定表达分子的细胞系。代替使用含有病毒复制起点的表达载体,宿主细胞可以使用由适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和可选择标志物来控制的DNA来转化。在引入外源DNA后,可以允许工程化的细胞在富集的培养基中生长1-2天,并且然后切换至选择性培养基。重组质粒中的选择标志物赋予对选择的抗性,并且允许细胞稳定地将质粒整合到其染色体中并生长以形成病灶,进而其可以进行克隆并扩展成细胞系。此方法可有利地用于将表达分子的细胞系工程化。此类工程化的细胞系可以特别地用于筛选和评估与分子直接或间接相互作用的化合物。
可使用许多选择系统,包括但不限于,单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,Cell[细胞]11:223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]48:202(1992))以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,Cell[细胞]22:817(1980))基因可分别用在tk-、hgprt-或aprt-细胞中。另外,可以将抗代谢药抗性作为选择以下基因的依据:dhfr,其赋予针对甲氨喋呤的抗性(Wigler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:357(1980);O'Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]78:1527(1981));gpt,其赋予针对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]78:2072(1981));neo,其赋予针对氨基糖甙G-418的抗性(Wu和Wu,Biotherapy[生物疗法]3:87-95(1991));以及hygro,其赋予针对潮霉素的抗性(Santerre等人,Gene[基因]30:147(1984))。可以将本领域公知的重组DNA技术的方法常规地应用于选择所希望的重组克隆,并且此类方法描述于例如,Ausubel等人(编辑),Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学现代方法],John Wiley&Sons[约翰·威利父子公司],纽约(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,ALaboratory Manual[基因转移和表达:实验室手册],Stockton Press[米斯托克顿出版社],纽约(1990);以及第12和13章,Dracopoli等人(编辑),Current Protocols in Human Genetics[当代人类遗传学实验手册],JohnWiley&Sons[约翰·威利父子公司],纽约(1994);Colberre-Garapin等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]150:1(1981),将这些文献通过引用以其全文并入本文。
分子的表达水平可以通过载体扩增来增加(关于综述,参见Bebbington和Hentschel,“The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells[使用基于基因扩增的载体来在哺乳动物细胞中表达克隆的基因]”(DNA Cloning[DNA克隆],第3卷Academic Press[学术出版社],纽约,1987))。当表达分子的载体系统中的标志物可扩增时,存在于宿主细胞培养物中的抑制剂的水平增加将使标志物基因的拷贝数目增加。由于扩增的区与抗体基因相关联,因此分子的产生将也增加(Crouse等人,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学杂志]3:257(1983))。
宿主细胞可与本发明的多个表达载体共转染。载体可含有相同的可选择标志物,这使得表达的多肽能相等表达。可替代地,可使用单个载体,该载体编码并且能够表达例如本发明的多肽。编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
一旦本发明的分子已经通过动物、化学合成或重组表达产生,就可以通过本领域中已知用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化该分子,例如,通过色谱法(例如,离子交换、亲和法(特别是通过蛋白质A后对特异性抗原的亲和法)和尺寸排阻色谱法)、离心、差别溶解度、或者通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。此外,本发明的结合构建体或其片段可融合到本文所述或其他本领域已知的异源多肽序列中以促进纯化。纯化技术可以是不同的,这取决于Fc区(例如,scFC)是否被附接到本发明的双特异性结合构建体。
在一些实施例中,本发明涵盖重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)到多肽的结合构建体。本发明的融合或缀合的结合构建体可用于方便纯化。参见例如,Harbor等人,同上,和PCT公开WO 93/21232;EP 439,095;Naramura等人,Immunol.Lett.[免疫学快报]39:91-99(1994);美国专利号5,474,981;Gillies等人,Proc.Natl.Acad.Sci.[国家科学院院刊]89:1428-1432(1992);Fell等人,J.Immunol.[免疫学杂志]146:2446-2452(1991)。
此外,本发明的结合构建体或其片段可以与标志物序列如肽融合以促进纯化。在优选的实施例中,标志物氨基酸序列是六组氨酸肽(SEQ ID NO:103),例如pQE载体中提供的标签(凯杰公司(QIAGEN,Inc.),伊顿大街(Eton Avenue)9259号,加利福尼亚州查茨沃思(Chatsworth,Calif),91311)等,其中许多是商购可得的。如Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:821-824(1989)中所述,例如六组氨酸(SEQ ID NO:103)提供了融合蛋白的方便纯化。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,Cell[细胞]37:767(1984))的“HA”标签和“旗帜(flag)”标签。
双特异性结合构建体的生成
在一般意义上,本发明的双特异性结合构建体是通过以下构建的:从所希望的抗体中选择VH和VL区并使用如本文所述的多肽接头将其连接起来以形成HHLL双特异性结合构建体,任选地附接有Fc区。更特别地,将编码VH、VL和接头、以及任选地Fc的核酸组合以产生编码本发明的双特异性结合构建体的HHLL核酸构建体。
抗体的生成
在某些实施例中,在生成本发明的双特异性结合构建体之前,首先生成对希望的靶标具有结合特异性的单特异性抗体。
用于产生本发明的双特异性结合分子的抗体可以通过本领域技术人员所熟知的技术制备。例如,通过免疫动物(如小鼠或大鼠或兔子),并且然后通过在完成免疫接种方案后,使从动物收集的脾细胞永生化来制备。可以使用本领域中已知的任何技术,例如通过使脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤来使脾细胞永生化。参见例如,Antibodies[抗体];Harlow和Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],第1版,例如来自1988年版,或第2版,例如来自2014年版)。
在一个实施例中,用于产生本发明的双特异性结合分子的人源化单克隆抗体包含鼠抗体的可变结构域(或其全部或部分抗原结合位点)和衍生自人抗体的恒定结构域。可替代地,人源化抗体片段可包含鼠单克隆抗体的抗原结合位点和衍生自人抗体的可变结构域片段(缺少抗原结合位点)。用于生产工程化单克隆抗体的程序包括Riechmann等人,1988,Nature[自然]332:323,Liu等人,1987,Proc.Nat.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]84:3439,Larrick等人,1989,Bio/Technology[生物/技术]7:934,以及Winter等人,1993,TIPS[植物科学趋势]14:139中描述的那些。在一个实施例中,嵌合抗体是CDR接枝抗体。用于人源化抗体的技术讨论于例如,美国专利号5,869,619;5,225,539;5,821,337;5,859,205;6,881,557,Padlan等人,1995,FASEB J.[美国实验生物学会联合会期刊]9:133-39,Tamura等人,2000,J.Immunol.[免疫学杂志]164:1432-41,Zhang,W.等人,Molecular Immunology.,[分子免疫学]42(12):1445-1451,2005;Hwang W.等人,Methods.[方法]36(1):35-42,2005;Dall’Acqua WF等人,Methods[方法]36(1):43-60,2005;以及Clark,M.,ImmunologyToday.[今日免疫学]21(8):397-402,2000中。
本发明的抗体还可以是用于产生本发明的双特异性结合分子的完全人单克隆抗体。完全人单克隆抗体可通过本领域普通技术人员熟悉的任何数量的技术生成。此类方法包括但不限于人外周血细胞(例如,含有B淋巴细胞)的爱泼斯坦病毒(Epstein BarrVirus,EBV)转化、人B细胞的体外免疫、融合来自携带插入的人免疫球蛋白基因的免疫转基因小鼠的脾细胞、从人免疫球蛋白V区噬菌体库分离、或本领域已知并基于本文披露的其他程序。
已经开发了用于在非人动物中产生人单克隆抗体的程序。例如,制备了其中一种或多种内源免疫球蛋白基因已通过各种手段失活的小鼠。人免疫球蛋白基因已被引入小鼠,以替代失活的小鼠基因。通过这种技术,人重链和轻链基因座的元件被引入到衍生自胚胎干细胞系的小鼠品系中,这些细胞系含有内源性重链和轻链基因座的靶向破坏(还参见Bruggemann等人,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术当前观点]8:455-58(1997))。例如,人免疫球蛋白转基因可以是微基因构建体、或酵母人工染色体上的反式基因座,其在小鼠淋巴组织中经历B细胞特异性DNA重排和超突变。
在动物中产生的抗体掺入了由引入到动物中的人遗传物质编码的人免疫球蛋白多肽链。在一个实施例中,用合适的免疫原对非人动物(如转基因小鼠)进行免疫。
产生和使用转基因动物用于产生人或部分人抗体的技术的实例描述于:美国专利5,814,318、5,569,825、和5,545,806中,Davis等人,Production of human antibodiesfrom transgenic mice[从转基因小鼠中产生人抗体]于Lo,编Antibody Engineering:Methods and Protocols[抗体工程:方法与方案],Humana Press[胡玛纳出版社],新泽西州:191-200(2003),Kellermann等人,2002,Curr Opin Biotechnol.[当前生物技术观点]13:593-97,Russel等人,2000,Infect Immun.[传染与免疫]68:1820-26,Gallo等人,2000,Eur J Immun.[欧洲免疫学杂志]30:534-40,Davis等人,1999,Cancer Metastasis Rev.[癌症和转移综述]18:421-25,Green,1999,J Immunol Methods.[免疫方法杂志]231:11-23,Jakobovits,1998,Advanced Drug Delivery Reviews[先进药物递送评论]31:33-42,Green等人,1998,J Exp Med.[实验医学杂志]188:483-95,Jakobovits A,1998,Exp.Opin.Invest.Drugs.[调研药物专家评论]7:607-14,Tsuda等人,1997,Genomics.[基因组学]42:413-21,Mendez等人,1997,Nat Genet.[自然遗传学]15:146-56,Jakobovits,1994,Curr Biol.[当代生物学]4:761-63,Arbones等人,1994,Immunity.[免疫力]1:247-60,Green等人,1994,Nat Genet.[自然遗传学]7:13-21,Jakobovits等人,1993,Nature.[自然]362:255-58,Jakobovits等人,1993,Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]90:2551-55.Chen,J.,M.Trounstine,F.W.Alt,F.Young,C.Kurahara,J.Loring,D.Huszar.“Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient micegenerated by targeted deletion of the JH locus.[通过JH基因座靶向缺失生成的B细胞缺陷小鼠中免疫球蛋白基因重排]”International Immunology[国际免疫学]5(1993):647-656,Choi等人,1993,Nature Genetics[自然遗传学]4:117-23,Fishwild等人,1996,Nature Biotechnology[自然生物技术]14:845-51,Harding等人,1995,Annals of theNew York Academy of Sciences[纽约科学院年鉴],Lonberg等人,1994,Nature[自然]368:856-59,Lonberg,1994,Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies[人单克隆抗体的转基因方法]于Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]113:49-101,Lonberg等人,1995,Internal Review of Immunology[免疫学内部评论]13:65-93,Neuberger,1996,Nature Biotechnology[自然生物技术]14:826,Taylor等人,1992,Nucleic Acids Research[核酸研究]20:6287-95,Taylor等人,1994,International Immunology[国际免疫学]6:579-91,Tomizuka等人,1997,NatureGenetics[自然遗传学]16:133-43,Tomizuka等人,2000,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA[美国科学院院报]97:722-27,Tuaillon等人,1993,Proceedings of the National Academy of Sciences USA[美国科学院院报]90:3720-24,以及Tuaillon等人,1994,Journal of Immunology[免疫学杂志]152:2912-20.;Lonberg等人,Nature[自然]368:856,1994;Taylor等人,Int.Immun.[国际免疫学]6:579,1994;美国专利号5,877,397;Bruggemann等人,1997Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术现状]8:455-58;Jakobovits等人,1995Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学学术年报]764:525-35。此外,涉及(安根尼克斯(Abgenix),现为美商安进公司(Amgen,Inc.))的方案描述于例如U.S.05/0118643和WO 05/694879、WO 98/24838、WO 00/76310、以及美国专利7,064,244中。
例如,来自免疫转基因小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。用于产生杂交瘤的融合程序的骨髓瘤细胞优选地是非抗体产生的,具有高融合效率和酶缺陷(使得它们不能在某些选择性培养基中生长,该培养基仅支持所希望的融合细胞(杂交瘤)的生长)。适用于此类融合的细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XX0 Bul;用于大鼠融合的细胞系的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210。可用于细胞融合的其他细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
淋巴(例如,脾)细胞和骨髓瘤细胞可与膜融合促进剂(如,聚乙二醇或非离子型洗涤剂)组合几分钟,然后以低密度铺板在支持杂交瘤细胞生长但不支持未融合的骨髓瘤细胞生长的选择培养基上。一种选择培养基是HAT(次黄嘌呤、氨蝶呤、胸苷)。在足够的时间(通常大约一到两周)后,观察到细胞菌落。分离单菌落,并且可以使用本领域已知的和本文所述的多种免疫测定中的任一种来测试由细胞产生的抗体与希望的靶标的结合活性。克隆杂交瘤(例如,通过有限稀释克隆或通过软琼脂斑块分离),并选择和培养产生对希望的靶标具有特异性的抗体的阳性克隆。可从杂交瘤培养物的上清液中分离来自杂交瘤培养物的单克隆抗体。因此,本发明提供了在细胞的染色体上包含编码本发明的双特异性结合构建体的多核苷酸的杂交瘤。这些杂交瘤可根据本文所述和本领域已知的方法培养。
产生用于产生本发明的双特异性结合分子的人抗体的另一种方法包括通过EBV转化使人外周血细胞永生化。参见例如美国专利号4,464,456。这种产生特异性结合希望的靶标的单克隆抗体的永生化B细胞系(或淋巴母细胞样细胞系)可通过如本文所提供的免疫检测方法(例如,ELISA)鉴定,并且然后通过标准克隆技术分离。产生抗体的淋巴母细胞样细胞系的稳定性可根据本领域已知的方法通过将转化的细胞系与鼠骨髓瘤融合以产生小鼠-人杂交细胞系来改进(参见例如Glasky等人,Hybridoma[杂交瘤]8:377-89(1989))。生成人单克隆抗体的又一种方法是体外免疫,其包括用抗原引发人脾B细胞,然后将引发的B细胞与异源杂合融合配偶体融合。参见例如Boerner等人,1991J.Immunol.[免疫学杂志]147:86-95。
在某些实施例中,选择产生所希望的抗体的B细胞,并根据本领域已知(WO 92/02551;美国专利5,627,052;Babcook等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]93:7843-48(1996))和本文所述的分子生物学技术从B细胞克隆轻链和重链可变区。来自经免疫动物的B细胞可通过选择产生所希望的抗体的细胞从脾、淋巴结或外周血样品中分离。B细胞也可以从人中(例如从外周血样品中)分离。用于检测产生具有所希望的特异性的抗体的单个B细胞的方法(例如通过斑块形成、荧光激活细胞分选、体外刺激然后检测特异性抗体等)是本领域所熟知的。选择产生特异性抗体的B细胞的方法包括,例如,在含有抗原的软琼脂中制备B细胞的单细胞悬浮液。通过B细胞产生的特异性抗体与抗原的结合导致形成复合物,该复合物作为免疫沉淀物可以是可见的。在选择产生所希望的抗体的B细胞后,可根据本领域已知和本文所述的方法通过分离和扩增DNA或mRNA来克隆特异性抗体基因,并且这些特异性抗体基因可用于产生本发明的双特异性结合分子。
用于获得用于产生本发明的双特异性结合分子的抗体的另一种方法是通过噬菌体展示。参见例如,Winter等人,1994 Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论]12:433-55;Burton等人,1994 Adv.Immunol.[免疫学进展]57:191-280。可在噬菌体载体中产生人或鼠免疫球蛋白可变区基因组合文库,这些噬菌体载体可经筛选以选择特异性结合到TGF-β结合蛋白或其变体或片段的Ig片段(Fab、Fv、sFv或其多聚体)。参见例如美国专利号5,223,409;Huse等人,1989 Science[科学]246:1275-81;Sastry等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:5728-32(1989);Alting-Mees等人,Strategies in MolecularBiology[分子生物学策略]3:1-9(1990);Kang等人,1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:4363-66;Hoogenboom等人,1992 J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]227:381-388;Schlebusch等人,1997 Hybridoma[杂交瘤]16:47-52和其中引用的参考文献。例如,含有编码Ig可变区片段的多个多核苷酸序列的文库可与编码噬菌体外壳蛋白的序列一起同框插入到丝状噬菌体(如,M13或其变体)的基因组中。融合蛋白可以是外壳蛋白与轻链可变区结构域和/或与重链可变区结构域的融合物。根据某些实施例,免疫球蛋白Fab片段也可展示在噬菌体颗粒上(参见例如,美国专利号5,698,426)。
重链和轻链免疫球蛋白cDNA表达文库也可以在λ噬菌体中制备,例如,使用λlmmunoZapTM(H)和λImmunoZapTM(L)载体(Stratagene公司,拉荷亚,加利福尼亚州)。简而言之,mRNA是从B细胞群体中分离的,并且用于在λImmunoZap(H)和λImmunoZap(L)载体中产生重链和轻链免疫球蛋白cDNA表达文库。这些载体可单独筛选或共表达以形成Fab片段或抗体(参见Huse等人,同上;还参见Sastry等人,同上)。阳性斑块随后可转化为非裂解质粒,该质粒允许来自大肠杆菌的单克隆抗体片段的高水平表达。
在一个实施例中,在杂交瘤中,使用核苷酸引物扩增表达目的单克隆抗体的基因的可变区,并且这些基因可用于产生本发明的双特异性结合分子。这些引物可以由本领域普通技术人员合成,或者可以从可商购获得的来源购买。(参见例如,Stratagene公司(拉荷亚,加利福尼亚州),该公司销售用于小鼠和人可变区的引物,尤其包括用于VHa、VHb、VHc、VHd、CH1、VL和CL区的引物)。这些引物可用于扩增重链或轻链可变区,然后可将这些重链或轻链可变区分别插入到载体(如ImmunoZAPTMH或ImmunoZAPTML(Stratagene公司))中。然后可以将这些载体引入到大肠杆菌、酵母或基于哺乳动物的系统中进行表达。使用这些方法可以产生大量含有VH结构域和VL结构域的融合物的单链蛋白质(参见Bird等人,Science[科学]242:423-426,1988)。
在某些实施例中,用于产生本发明的双特异性结合分子的抗体是从产生“仅重链”抗体或“HCAb”的转基因动物(例如,小鼠)中获得的。HCAb类似于天然存在的骆驼和美洲驼单链VHH抗体。参见例如,美国专利号8,507,748和8,502,014,以及美国专利申请公开号US2009/0285805A1、US 2009/0169548A1、US 2009/0307787A1、US 2011/0314563A1、US 2012/0151610A1、WO 2008/122886A2和WO 2009/013620A2。
在使用上述免疫法及其他技术中的任一种获得产生根据本发明的分子的细胞后,特异性抗体基因可以根据如本文所述的标准程序,通过自其中分离并扩增DNA或mRNA来克隆,并且然后用于产生本发明的双特异性结合构建体。由此产生的抗体可以进行测序并鉴别出CDR,且可以如先前所述操作编码这些CDR的DNA以产生根据本发明的其他双特异性结合构建体。
抗体结合位点的中心中互补决定区(CDR)的分子进化也已经被用于分离亲和力增加的抗体,例如由Schier等人,1996,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]263:551所述的那些。因此,此类技术可用于制备本发明的结合构建体。
尽管人、部分人或人源化抗体将适合于许多应用,特别是本发明的那些,但其他类型的双特异性结合构建体将适合于某些应用。这些非人抗体可以例如衍生自任何产生抗体的动物,如小鼠、大鼠、兔子、山羊、驴或非人灵长类动物(例如,猴(如食蟹猴或恒河猴,或猿(例如,黑猩猩)))。来自特定物种的抗体可以通过以下来制备:例如通过用所希望的免疫原免疫该物种的动物或使用用于生成该物种的抗体的人工系统(例如,用于生成特定物种的抗体的基于细菌或噬菌体展示的系统)、或者通过将来自一个物种的抗体转化为来自另一个物种的抗体(通过例如用来自其他物种的恒定区替代该抗体的恒定区、或者通过替代该抗体的一个或多个氨基酸残基,使其更接近于来自其他物种的抗体的序列)。在一个实施例中,该抗体是包含衍生自来自两个或多个不同物种的抗体的氨基酸序列的嵌合抗体。然后,所希望的结合区序列可用于产生本发明的双特异性结合构建体。
在希望改善含有一个或多个上述CDR的根据本发明的结合构建体的亲和力的情况下,这可通过许多亲和力成熟方案来获得,包括维持CDR(Yang等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],254,392-403,1995)、链改组(Marks等人,Bio/Technology[生物/技术],10,779-783,1992)、大肠杆菌突变菌株的使用(Low等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],250,350-368,1996)、DNA改组(Patten等人,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术现状],8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],256,7-88,1996)以及另外的PCR技术(Crameri等人,Nature[自然],391,288-291,1998)。所有这些亲和力成熟的方法均由Vaughan等人(Nature Biotechnology[自然生物技术],16,535-539,1998)讨论。
在某些实施例中,为了产生本发明的HHLL双特异性结合构建体,首先可能希望产生更典型的单链抗体,该单链抗体可以经由氨基酸桥(短肽接头)连接重链和轻链可变结构域(Fv区)片段来形成,从而形成单一多肽链。此类单链Fv(scFv)已通过在编码两个可变结构域多肽(VL和VH)的DNA之间融合编码肽接头的DNA来制备。所产生的多肽可自身折叠以形成抗原结合单体,或其可形成多聚体(例如,二聚体、三聚体或四聚体),这取决于两个可变结构域之间柔性接头的长度(Kortt等人,1997,Prot.Eng.[蛋白工程]10:423;Kortt等人,2001,Biomol.Eng.[生物分子工程]18:95-108)。开发用于产生单链抗体的技术包括以下描述的那些:美国专利号4,946,778;Bird,1988,Science[科学]242:423;Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879;Ward等人,1989,Nature[自然]334:544,de Graaf等人,2002,Methods Mol Biol.[分子生物学方法]178:379-87。这些单链抗体有别于本发明的双特异性结合构建体,并与之不同。
衍生自抗体的抗原结合片段也可以例如通过抗体的蛋白酶水解(例如,根据常规方法,胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体)来获得。举例来说,可通过用胃蛋白酶酶促切割抗体来产生抗体片段,以提供称为F(ab’)2的5S片段。此片段可使用硫醇还原剂进一步切割以产生3.5S Fab’单价片段。任选地,可使用由二硫键切割产生的巯基基团的阻断基团来进行切割反应。作为替代方案,使用木瓜蛋白酶酶促切割直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法由例如以下文献描述:Goldenberg,美国专利号4,331,647,Nisonoff等人,Arch.Biochem.Biophys.[生物化学与生物物理学集刊]89:230,1960;Porter,Biochem.J.[生物化学杂志]73:119,1959;Edelman等人,于Methods in Enzymology[酶学方法]1:422(Academic Press[学术出版社]1967)中;以及Andrews,S.M.和Titus,J.A.于Current Protocols in Immunology[当代免疫学方案](Coligan J.E.等人,编辑),JohnWiley&Sons[约翰·威利父子公司],纽约(2003),第2.8.1-2.8.10和2.10A.1-2.10A.5页。还可使用其他切割抗体的方法,例如将重链分离以形成单价的轻-重链片段(Fd),进一步切割片段或其他酶学技术、化学技术或遗传学技术,只要该片段能结合至可被完整的抗体识别的抗原。
在某些实施例中,双特异性结合构建体包含抗体的一个或多个互补决定区(CDR)。可以通过构建编码目的CDR的多核苷酸来获得CDR。例如,通过使用聚合酶链反应、使用产生抗体的细胞的mRNA作为模板合成可变区来制备此类多核苷酸(参见例如,Larrick等人,Methods:A Companion to Methods in Enzymology[方法:酶学方法指南]2:106,1991;Courtenay-Luck,“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体的遗传操作],”于Monoclonal Antibodies:Production[单克隆抗体制备]中,Engineering andClinical Application[工程及临床应用],Ritter等人(编辑),第166页(CambridgeUniversity Press[剑桥大学出版社]1995);以及Ward等人,“Genetic Manipulation andExpression of Antibodies[抗体的遗传操作和表达],”于Monoclonal Antibodies:Principles and Applications[单克隆抗体:原理与应用],Birch等人,(编辑),第137页(Wiley-Liss,Inc.[威利利斯出版公司]1995))。抗体片段可进一步包含本文所述的抗体的至少一个可变区结构域。因此,例如,如本文所述,V区结构域可以是单体并且可以是能够以至少等于10-7M或更小的亲和力独立地结合希望的靶标(例如,人CD3)的VH或VL结构域。
可变区可以是任何天然存在的可变结构域或其工程化版本。工程化版本意指已使用重组DNA工程技术生成的可变区。此类工程化版本包括例如通过特异性抗体的氨基酸序列中的或对其的插入、缺失或改变从特异性抗体可变区生成的那些。本领域的普通技术人员可以使用任何已知的方法来鉴定适合于工程化的氨基酸残基。另外的实例包括含有来自第一抗体的至少一个CDR和任选地一个或多个框架氨基酸以及来自第二抗体的可变区结构域的其余部分的工程化可变区。抗体可变结构域的工程化版本可通过本领域普通技术人员熟悉的任何数量的技术生成。一旦产生这些结构域,它们可进一步用于产生本发明的双特异性结合分子。
可变区可在C-末端氨基酸处共价附接至至少一个其他抗体结构域或其片段。因此,例如,存在于可变区中的VH可与免疫球蛋白CH1结构域连接。类似地,VL结构域可以与CK结构域连接。以此方式,例如,构建体可以是Fab片段,其中抗原结合结构域含有相关的VH和VL结构域(在其C-末端分别共价连接到CH1和CK结构域)。CH1结构域可以用另外的氨基酸延伸,例如以提供如在Fab'片段中发现的铰链区或铰链区结构域的一部分,或者以提供另外的结构域,如抗体CH2和CH3结构域。
结合特异性
如果抗体或双特异性结合构建体以10-7M或更小的平衡解离常数(如下定义的KD、或相应的KD)值确定的紧密结合亲和力结合抗原,则该抗体或双特异性结合构建体“特异性结合”此抗原。
可以使用本领域已知的多种技术来确定亲和力,例如但不限于平衡法(例如,酶联免疫吸附测定法(ELISA);KinExA,Rathanaswami等人Analytical Biochemistry[分析生物化学],第373卷:52-60,2008;或放射免疫测定(RIA))、或通过表面等离振子共振测定或其他基于动力学测定的机制(例如,分析或分析(forteBIO))、以及其他方法,如间接结合测定、竞争性结合测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳法和色谱法(例如,凝胶过滤)。这些方法和其他方法可以对一种或多种待检查的组分使用标记和/或使用多种检测方法,包括但不限于发色标记、荧光标记、发光标记或者同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述见于Paul,W.E.编辑,Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Lippincott-Raven[Lippincott-Raven出版社],费城(1999),其集中于抗体-免疫原相互作用。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定,其包括在增加量的未标记抗原存在的情况下,将经标记的抗原与目的抗体一起孵育,并检测与经标记的抗原结合的抗体。通过斯卡查德(scatchard)图分析,可以从数据中测定目的抗体对特定抗原的亲和力和结合解离速率(binding off-rate)。还可以使用放射免疫测定法测定与第二抗体的竞争。在该情况下,在增加量的未标记第二抗体存在的情况下,将抗原与标记的化合物缀合的目的抗体一起孵育。这些测定可以容易地适用于本发明的双特异性结合构建体。
本发明的另外的实施例提供了双特异性结合构建体,这些双特异性结合构建体以小于10-7M、或小于10-8M、或小于10-9M、或小于10-10M、或小于10-11M、或小于10-12M、或小于10-13M、或小于5x10-13M(较低的值表示更紧密的结合亲和力)的平衡解离常数或KD(koff/kon)结合希望的靶标。本发明的又另外的实施例是双特异性结合构建体,这些双特异性结合构建体以小于约10-7M、或小于约10-8M、或小于约10-9M、或小于约10-10M、或小于约10-11M、或小于约10-12M、或小于约10-13M、或小于约5x10-13M的平衡解离常数或KD(koff/kon)结合希望的靶标。
在仍另一个实施例中,与希望的靶标结合的双特异性结合构建体具有约10-7M与约10-8M之间、约10-8M与约10-9M之间、约10-9M与约10-10M之间、约10-10M与约10-11M之间、约10-11M与约10-12M之间、约10-12M与约10-13M之间的平衡解离常数或KD(koff/kon)。在仍另一个实施例中,本发明的结合构建体具有10-7M与10-8M之间、10-8M与10-9M之间、10-9M与10-10M之间、10-10M与10-11M之间、10-11M与10-12M之间、10-12M与10-13M之间的平衡解离常数或KD(koff/kon)。
分子稳定性
可能希望分子稳定性的各个方面,特别是在生物制药治疗分子的背景下。例如,可能希望在不同温度下的稳定性(“热稳定性”)。在一些实施例中,这可以涵盖在生理温度范围内(例如,在37℃或约37℃,或从32℃到42℃)的稳定性。在其他实施例中,这可以涵盖在更高温度范围内(例如,42℃至60℃)的稳定性。在其他实施例中,这可以涵盖在更冷温度范围内(例如,20℃至32℃)的稳定性。在又其他实施例中,这可以涵盖处于冷冻状态(例如0℃或更低)时的稳定性。
确定蛋白质分子的热稳定性的测定是本领域已知的。例如,使用全自动UNcle平台(Uncheed Lab公司)并在实例中进行进一步描述,该平台允许在热变温过程中同时获取固有蛋白质荧光和静态光散射(SLS)数据。此外,本文实例中所述的热稳定性和聚集性测定(如差示扫描荧光测定(DSF)和静态光散射(SLS))也可分别用于测量热熔融(Tm)和热聚集(Tagg)。
可替代地,也可以对分子进行加速应力研究。简而言之,这涉及在特定的温度(例如,40℃)下孵育蛋白质分子,然后在不同的时间点通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量聚集情况,其中聚集程度越低表明蛋白质稳定性越好。
可替代地,热稳定性参数可以根据分子聚集温度如下确定:将浓度为250μg/ml的分子溶液转移到一次性比色皿中并置于动态光散射(DLS)装置中。将样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热至70℃,恒定获取测量的半径。使用指示蛋白质和聚集物熔融的半径增加来计算分子的聚集温度。
可替代地,可以通过差示扫描量热法(DSC)确定温度熔融曲线以确定结合构建体的固有生物物理学蛋白质稳定性。这些实验使用微凯尔有限公司(MicroCal LLC)(美国马萨诸塞州的北安普顿(Northampton,MA,U.S.A))VP-DSC装置进行。与仅含有配制缓冲液的样品相比,从20℃至90℃记录含有结合构建体的样品的能量摄取。例如,在SEC运行缓冲液中将结合构建体调整至终浓度为250μg/ml。为了记录相应熔融曲线,逐步升高整个样品温度。在每个温度T下,记录样品和配制缓冲液参考物的能量摄取。将样品的能量摄取Cp(千卡/摩尔/℃)减去参考物的差针对相应温度作图。熔融温度被定义为第一次最大能量摄取时的温度。
在另外的实施例中,根据本发明的双特异性结合构建体在约生理pH(即约pH 7.4)下是稳定的。在其他实施例中,双特异性结合构建体在较低的pH(例如,低至pH 6.0)下是稳定的。在其他实施例中,双特异性结合构建体在较高的pH(例如,高达pH 9.0)下是稳定的。在一个实施例中,双特异性结合构建体在6.0至9.0的pH下是稳定的。在另一个实施例中,双特异性结合构建体在6.0至8.0的pH下是稳定的。在另一个实施例中,双特异性结合构建体在7.0至9.0的pH下是稳定的。
在某些实施例中,双特异性结合构建体对非生理pH(例如,pH 6.0)的耐受性越强,从离子交换柱洗脱的结合构建体相对于加载蛋白质总量的回收率就越高。在一个实施例中,结合构建体从离子(例如阳离子)交换柱的回收率为≥30%。在另一个实施例中,结合构建体从离子(例如阳离子)交换柱的回收率为≥40%。在另一个实施例中,结合构建体从离子(例如阳离子)交换柱的回收率为≥50%。在另一个实施例中,结合构建体从离子(例如阳离子)交换柱的回收率为≥60%。在另一个实施例中,结合构建体从离子(例如阳离子)交换柱的回收率为≥70%。在另一个实施例中,结合构建体从离子(例如阳离子)交换柱的回收率为≥80%。在另一个实施例中,结合构建体从离子(例如阳离子)交换柱的回收率为≥90%。在另一个实施例中,结合构建体从离子(例如阳离子)交换柱的回收率为≥95%。在另一个实施例中,结合构建体从离子(例如阳离子)交换柱的回收率为≥99%。
在某些实施例中,可能希望确定分子的化学稳定性。如本文实例中进一步所述的,双特异性结合构建体化学稳定性的测定可以经由等温化学变性(“ICD”)通过监测固有蛋白质荧光来进行。ICD产生C1/2和ΔG,它们可以作为蛋白质稳定性的良好量度。C1/2是使50%的蛋白质变性所需的化学变性剂的量,并且用于导出ΔG(或解折叠能)。
对于生物药物而言,蛋白质链的剪切是另一个关键的产品质量属性,对其进行仔细监测和报告。典型地,预期更长和/或更少结构化接头会导致剪切增加(作为孵育时间和温度的函数)。剪切是双特异性结合构建体的关键问题,因为对连接靶标或T细胞接合结构域的接头的剪切对药效和功效具有最终的不利影响。对另外的位点(包括scFc)的剪切可能会影响药效学/药代动力学特性。增加的剪切是药物产品中要避免的属性。因此,在某些实施例中,蛋白质剪切可以如本文实例中所述进行测定。
免疫效应细胞和效应细胞蛋白
双特异性结合构建体可以与在免疫效应细胞的表面表达的分子(本文称为“效应细胞蛋白”)和在靶细胞的表面表达的另一种分子(本文称为“靶细胞蛋白”)结合。免疫效应细胞可以是T细胞、NK细胞、巨噬细胞、或中性粒细胞。在一些实施例中,效应细胞蛋白是包括在T细胞受体(TCR)-CD3复合物中的蛋白质。TCR-CD3复合物是包含异源二聚体的异源多聚体,该异源二聚体包含TCRα和TCRβ或TCRγ和TCRδ以及CD3泽塔(CD3ζ)链、CD3伊普西龙(CD3∈)链、CD3伽马(CD3γ)链、和CD3德尔塔(CD3δ)链中的各种CD3链。
CD3受体复合物是蛋白质复合物,并且由四条链构成。在哺乳动物中,复合物含有CD3γ(伽马)链、CD3δ(德尔塔)链和两条CD3ε(伊普西龙)链。这些链与T细胞受体(TCR)和所谓的ζ(zeta)链缔合以形成T细胞受体CD3复合物,并在T淋巴细胞中生成激活信号。CD3γ(伽马)、CD3δ(德尔塔)和CD3ε(伊普西龙)链是含有单一细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3分子的细胞内尾含有对于TCR的信号传导能力所必需的单一保守基序,称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或简称ITAM。CD3ε分子是多肽,该多肽在人中由位于染色体11上的CD3E基因编码。CD3ε的最优选的表位包括在人CD3ε细胞外结构域的氨基酸残基1-27内。设想根据本发明的双特异性结合构建体典型地并且有利地显示出更少的非特异性T细胞激活,这在特异性免疫疗法中是不希望的。这意味着副作用的风险降低。
在一些实施例中,效应细胞蛋白可以是人CD3伊普西龙(CD3∈)链(其成熟氨基酸序列在SEQ ID NO:40中披露),其可以是多聚体蛋白质的一部分。可替代地,效应细胞蛋白可以是人和/或食蟹猴TCRα、TCRβ、TCRδ、TCRγ、CD3贝塔(CD3β)链、CD3伽马(CD3γ)链、CD3德尔塔(CD3δ)链、或CD3泽塔(CD3ζ)链。
此外,在一些实施例中,双特异性结合构建体也可以与来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔子、新大陆猴和/或旧大陆猴物种)的CD3∈链结合。此类物种包括但不限于以下哺乳动物物种:小家鼠;黑家鼠(Rattus rattus);褐家鼠(Rattus norvegicus);食蟹猴(cynomolgus monkey/Macaca fascicularis);阿拉伯狒狒(hamadryas baboon/Papiohamadryas);几内亚狒狒(Guinea baboon/Papio papio);东非狒狒(olive baboon/Papioanubis);草原狒狒(yellow baboon/Papio cynocephalus);豚尾狒狒(Chacma baboon/Papio ursinus);普通狨(Callithrix jacchus);绒顶柽柳猴(Saguinus Oedipus);和松鼠猴(Saimiri sciureus)。食蟹猴CD3∈链的成熟氨基酸序列在SEQ ID NO:41中提供。具有在人和常用于临床前试验的物种(如小鼠和猴子)中具有类似活性的治疗分子可以简化、加速并最终提供改善的药物开发结果。在将药物推向市场的漫长而昂贵的过程中,这些优势可能至关重要。
在某些实施例中,双特异性结合构建体可与CD3∈链前27个氨基酸内的表位(SEQID NO:43)结合,该表位可以是人CD3∈链或来自不同物种(特别是本文所列的哺乳动物物种之一)的CD3∈链。该表位可以含有氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(SEQ ID NO;104)。美国专利申请公开2010/0183615A1(其相关部分通过引用并入本文)中详细解释了结合这种表位的结合构建体的优点。抗体或双特异性结合构建体所结合的表位可以通过丙氨酸扫描来确定,这描述于例如美国专利申请公开2010/0183615A1中,其相关部分通过引用并入本文。在其他实施例中,双特异性结合构建体可以与CD3∈的细胞外结构域内的表位(SEQID NO:42)结合。
在T细胞为免疫效应细胞的实施例中,双特异性结合构建体可结合的效应细胞蛋白包括但不限于CD3∈链、CD3γ、CD3δ链、CD3ζ链、TCRα、TCRβ、TCRγ、和TCRδ。在NK细胞或细胞毒性T细胞是免疫效应细胞的实施例中,NKG2D、CD352、NKp46、或CD16a可以例如是效应细胞蛋白。在CD8+T细胞是免疫效应细胞的实施例中,4-1BB或NKG2D例如可以是效应细胞蛋白。可替代地,在其他实施例中,双特异性结合构建体可以与在T细胞、NK细胞、巨噬细胞、或中性粒细胞上表达的其他效应细胞蛋白结合。
靶细胞和在靶细胞上表达的靶细胞蛋白
如本文所解释的,双特异性结合构建体可与效应细胞蛋白和靶细胞蛋白结合。靶细胞蛋白可以例如在癌细胞、感染病原体的细胞或介导疾病(例如炎性、自身免疫性和/或纤维化病症)的细胞的表面上表达。在一些实施例中,靶细胞蛋白可以在靶细胞上高度表达,尽管不一定需要高水平表达。
当靶细胞是癌细胞时,如本文所述的双特异性结合构建体可与如本文所述的癌细胞抗原结合。癌细胞抗原可以是人蛋白质或来自其他物种的蛋白质。例如,双特异性结合构建体可以与来自小鼠、大鼠、兔子、新大陆猴、和/或旧大陆猴物种等的靶细胞蛋白结合。这些物种包括但不限于以下物种:小家鼠;黑家鼠(Rattus rattus);褐家鼠;食蟹猴(cynomolgus monkey/Macaca fascicularis);阿拉伯狒狒(hamadryas baboon/Papiohamadryas);几内亚狒狒(Guinea baboon/Papio papio);东非狒狒(olive baboon/Papioanubis);草原狒狒(yellow baboon/Papio cynocephalus);豚尾狒狒(Chacma baboon/Papio ursinus)、普通狨、绒顶柽柳猴、和松鼠猴。
在一些实例中,靶细胞蛋白可以是在感染细胞上选择性表达的蛋白质。例如,在HBV或HCV感染的情况下,靶细胞蛋白可以是在感染细胞的表面表达的HBV或HCV的包膜蛋白。在其他实施例中,靶细胞蛋白可以是由人类免疫缺陷病毒(HIV)-感染细胞上的HIV编码的gp120。
在其他方面,靶细胞可以是介导自身免疫性疾病或炎性疾病的细胞。例如,哮喘中的人嗜酸性粒细胞可以是靶细胞,在这种情况下,含有粘蛋白样激素受体(EMR1)的EGF样模块可以是例如靶细胞蛋白。可替代地,系统性红斑狼疮患者中过量的人B细胞可以是靶细胞,在这种情况下,CD19或CD20例如可以是靶细胞蛋白。在其他自身免疫性病症下,过量的人Th2 T细胞可以是靶细胞,在这种情况下,CCR4可以例如是靶细胞蛋白。类似地,靶细胞可以是介导以下疾病的纤维化细胞,该疾病如动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝硬化、硬皮病、肾移植纤维化、肾移植肾病(kidney allograft nephropathy)、或肺纤维化,包括特发性肺纤维化和/或特发性肺动脉高压。对于此类纤维化病症,成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)可以例如是靶细胞蛋白。
治疗方法和组合物
双特异性结合构建体可用于治疗多种病症,包括例如各种形式的癌症、感染、自身免疫性或炎性病症、和/或纤维化病症。
另一个实施例提供了本发明的结合构建体(或根据本发明的方法产生的结合构建体)在制造用于预防、治疗或缓解疾病的药物中的用途。
本文提供了包含双特异性结合构建体的药物组合物。这些药物组合物包含治疗有效量的双特异性结合构建体和一种或多种另外的组分,如生理上可接受的载剂、赋形剂、或稀释剂。在一些实施例中,这些另外的组分可以包括缓冲液、碳水化合物、多元醇、氨基酸、螯合剂、稳定剂、和/或防腐剂等。
在一些实施例中,双特异性结合构建体可用于治疗细胞增殖性疾病(包括癌症),这些疾病涉及不受控和/或不适当的细胞增殖,有时伴随着邻近组织的破坏和新血管的生长,这可能使癌细胞侵入到新的区域,即转移。可用双特异性结合构建体治疗的病症包括涉及不适当细胞生长的非恶性病症,包括结直肠息肉、脑缺血、巨囊性病(gross cysticdisease)、多囊肾病、良性前列腺增生、和子宫内膜异位。双特异性结合构建体可用于治疗血液学恶性肿瘤或实体瘤恶性肿瘤。更特别地,可以使用双特异性结合构建体治疗的细胞增殖性疾病是,例如癌症,包括间皮瘤,鳞状细胞癌,骨髓瘤,骨肉瘤,胶质母细胞瘤,神经胶质瘤,癌(carcinomas),腺癌,黑色素瘤,肉瘤,急性和慢性白血病,淋巴瘤,和脑膜瘤,霍奇金病,塞扎里综合征(Sézary syndrome),多发性骨髓瘤,和肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、喉癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌、胃癌、肾细胞癌、肾癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌和食道癌、肝胆癌、骨癌、皮肤癌和血液癌,以及鼻腔癌和鼻旁窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉癌、下喉癌、唾液腺癌、纵膈癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌和肛门区癌、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、外阴癌、内分泌系统癌、中枢神经系统癌和浆细胞癌。
为癌症疗法提供指导的文本包括Cancer,Principles and Practice ofOncology[癌症:肿瘤学原理与实践],第4版,DeVita等人,编辑J.B.Lippincott Co.[J.B.利平科特公司],宾夕法尼亚州费城(1993)。根据特定癌症类型以及相关领域公认的其他因素(如患者的一般情况),选择适当的治疗方法。在治疗癌症患者时,可将双特异性结合构建体添加到使用其他抗瘤剂的治疗方案中。
在一些实施例中,双特异性结合构建体可与广泛用于癌症治疗的多种药物和治疗(例如像,化疗剂、非化疗剂、抗瘤剂和/或辐射)同时、在其之前或之后施用。例如,化疗和/或辐射可以在本文所述的任何治疗之前、期间和/或之后进行。本文讨论了化疗剂的实例,这些化疗剂包括但不限于,顺铂、紫杉醇、依托泊苷、米托蒽醌放线菌素D、环己酰亚胺、喜树碱(或其水溶性衍生物)、甲氨喋呤、丝裂霉素(例如,丝裂霉素C)、达卡巴嗪(DTIC)、抗瘤抗生素(如阿霉素(多柔比星)和道诺霉素)、以及本文提及的所有化疗剂。
双特异性结合构建体也可用于治疗感染性疾病,例如慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染、或巨细胞病毒(CMV)感染等。
双特异性结合构建体可在有利于消耗某些细胞类型的其他类型的病症中进一步使用。例如,哮喘中的人嗜酸性粒细胞的消耗、系统性红斑狼疮中的过量人B细胞的消耗、自身免疫性病症中的过量人Th2 T细胞的消耗、或感染性疾病中的病原体-感染细胞的消耗可能是有益的。在纤维化病症中,消耗形成纤维化组织的细胞可能是有用的。
可以施用治疗有效剂量的双特异性结合构建体。构成治疗剂量的双特异性结合构建体的量可随治疗的适应症、患者的体重、计算的患者皮肤表面积而变化。可以调整双特异性结合构建体的给药以达到所希望的效果。在许多情况下,可能需要重复给药。
双特异性结合构建体或含有这种分子的药物组合物可以通过任何可行的方法施用。蛋白质治疗剂通常通过肠胃外途径(例如通过注射)施用,因为在没有一些特殊配方或情况下,口服施用会导致蛋白质在胃的酸性环境中水解。皮下、肌内、静脉内、动脉内、病灶内、或腹膜推注注射是可能的施用途径。双特异性结合构建体也可以通过输注(例如静脉内或皮下输注)施用。局部施用也是可能的,特别是对于涉及皮肤的疾病。可替代地,双特异性结合构建体可通过与粘膜接触来施用,例如通过鼻内、舌下、阴道或直肠施用或作为吸入剂施用。可替代地,某些包含双特异性结合构建体的适当药物组合物可以口服施用。
术语“治疗”涵盖减轻障碍的至少一种症状或其他实施例、或降低疾病严重程度等。根据本发明的双特异性结合构建体不需要达到完全治愈或根除疾病的每种症状或表现才可成为可行的治疗剂。如相关领域中所认识到,用作治疗剂的药物可降低既定疾病状态的严重度,但不必消除疾病的每种表现才被认为是有用治疗剂。仅仅降低疾病的影响(例如通过减少其症状的次数或降低其症状的严重度,或通过增加另一治疗的有效性,或通过产生另一有益作用)或降低疾病在受试者中发生或恶化的可能性即为足够。本发明的一个实施例涉及一种方法,该方法包括向患者施用一定量的本发明的双特异性结合构建体一段时间,该双特异性结合构建体施用的量和时间足以引起与反映特定障碍严重度的指标的基线相比的持续改善。
术语“预防”涵盖预防障碍的至少一种症状或其他实施例等。结合根据本发明的双特异性结合构建体的预防性施用的治疗不需要完全有效地预防病症发作才可成为可行的预防剂。仅仅降低疾病在受试者中发生或恶化的可能性即为足够。
如相关领域所理解,包含双特异性结合构建体的药物组合物以适合适应症和组合物的方式施用于受试者。药物组合物可通过任何合适的技术施用,包括但不限于肠胃外、局部或通过吸入。如果注射,该药物组合物可例如经由关节内、静脉内、肌内、病灶内、腹膜内或皮下途径,通过推注注射或持续输注来施用。通过吸入的递送包括,例如,经鼻或经口吸入、使用雾化器、以气溶胶形式吸入双特异性结合构建体等。其他替代品包括口服制剂,包括丸剂、糖浆或锭剂。
双特异性结合构建体可以以包含一种或多种另外的组分(如生理上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂)的组合物的形式施用。任选地,该组合物另外包含一种或多种生理活性剂。在各种特定的实施例中,除了一种或多种双特异性结合构建体之外,该组合物还包含一种、两种、三种、四种、五种或六种生理活性剂。
提供了用于由执业医师使用的试剂盒,这些试剂盒包括一种或多种双特异性结合构建体,以及用于在治疗本文讨论的任何病症中使用的标签或其他说明。在一个实施例中,试剂盒包括一种或多种双特异性结合构建体的无菌制剂,其可以呈本文所披露的组合物的形式,并且可以在一个或多个小瓶中。
施用的剂量和频率可能会根据如施用途径、使用的特定双特异性结合构建体、待治疗疾病的性质和严重程度、病症是急性或慢性、以及受试者的尺寸和一般状况的此类因素而有所不同。
上面已经用一般术语描述了本发明,以下实例是作为说明而非限制提供的。
实例
实例1
具有蛋白酶切割位点的双特异性HHLL结合构建体的生成和表达
将不同形式的开放阅读框(图1-图3)按基因合成订购,并亚克隆到含有IgG衍生信号肽的哺乳动物表达载体中,以用于分泌表达到细胞培养上清液中。将经序列验证的质粒克隆瞬时转染到293HEK细胞中,或稳定转染到CHO细胞中,在瞬时表达3天或稳定转染6天后收获细胞培养上清液。将细胞培养上清液储存在-80℃下,直至进行蛋白质纯化。
图1-图3显示了在不存在MMP2/9的情况下的单链前双特异性结合构建体形式(即,没有蛋白酶切割)以及在存在MMP2/9的情况下产生的片段。形式A从N末端至C末端含有以下结构域:CD3∈(a.a.1-6或a.a.1-27)肽-L0-抗CD3 VH-L1-抗MSLN VH-L2-抗CD3 VL-L3-抗MSLN VL-L4-HLE结构域1-L5-HLE结构域2,其中该抗CD3和抗MSLN可变结构域含有经工程化的二硫键,该二硫键在特定VH与VL结构域之间建立共价键。在此形式中,L0、L1、L3和L4含有MMP2/9限制性位点(SEQ ID NO:45)。形式B含有N末端CD3∈(a.a.1-6或a.a.1-27)肽-L0-抗CD3 VH-L1-HLE结构域1-L2-抗MSLN VH-L3-抗CD3 VL-L4-HLE结构域2-L5-抗MSLN VL,其中该抗CD3和抗MSLN可变结构域含有经工程化的二硫键,该二硫键在特定VH与VL结构域之间建立共价键。在此形式中,L0、L1、L2、L4和L5含有MMP2/9限制性位点。L3接头的长度在构建体V1E(G4S)3、B1U(G4S)6、Z9P(G4S)12之间不同。形式C含有以下结构域:N末端抗CD3 VH-L1-抗MSLN VH-L2-抗CD3 VL-L3-抗MSLN VL-L4-HLE结构域1-L5-HLE结构域2,其中该抗CD3和抗MSLN可变结构域含有经工程化的二硫键,该二硫键在特定VH与VL结构域之间建立共价键。在此形式中,L3含有MMP2/9限制性位点。形式D含有N末端CD3ε肽-L0-人血清白蛋白-L1-抗CD3 VH-L2-抗MSLN VH-L3-抗CD3 VL-L4-抗MSLN VL-L5-HLE结构域1-L6-HLE结构域2。CD3ε肽以两种不同的长度(G2P AA1-6、W9A AA1-27)使用,其中L0是SG接头,并且L5是G4接头。在此形式中,L1、L2、L4和L5含有MMP2/9限制性位点。此形式的第二构建体是省略N末端CD3肽(O7H)生成的。形式E含有N末端CD3肽(AA1-6或AA1-27)-L0-HLE结构域1-L1-HLE结构域2-L2-抗CD3 VH-L3-抗MSLN VH-L4-抗CD3 VL-L5-抗MSLN VL。在此形式中,L2、L3和L5含有MMP2/9限制性位点。此形式的第二构建体是省略N末端CD3肽(T7U)生成的。
实例2
色谱分析
通过蛋白A亲和色谱法然后尺寸排阻色谱法进行蛋白质纯化(图3-图12)。根据OD280nm对信号(蓝色)峰进行汇集并通过SDS-PAGE对MW进行分析。蛋白质单体峰在10mM柠檬酸盐、75mM赖氨酸、4%海藻糖中形成以将其等分以在-80℃下储存。图4-图13分别描绘了以下构建体的结果:N4J、N7A、V1E、B1U、Z9P、O7H、W9A、B2P、T7U、L2G,各种构建体的指示表达。
实例3
凝胶/印迹大小分析以确定切割位点在体外是否有功能
为了确定双特异性结合构建体的体外切割,将纯化的双特异性结合构建体与重组MMP-9以1:1的摩尔比在37℃下一起孵育18h(或PBS作为对照)。然后,将样品通过在95℃下变性5min并应用于非还原SDS-PAGE(图13-图14)。显示了双特异性结合构建体在不存在MMP9(-MMP9)的情况下,在其前-(即没有蛋白酶切割)构象中以及在存在MMP9(+MMP9)的情况下,在其活性形式(即被蛋白酶切割)中的预期MW。与MMP9一起孵育的样品随后未纯化,由另外的MMP9特异性条带(67,82kDa)表示。V1E(-MMP9)显示MW低于预期,并且其活化(+MMP9)构象没有差异。其结果在图14A和图14B中描绘。
实例4
体外FACS结合分析
将经纯化的双特异性结合构建体应用于流式细胞术,以确定与靶抗原转染的CHO细胞(MSLN+CHO)或人CD3阳性T细胞系(HPB-ALL)的结合。在两种条件下比较未消化和MMP-9消化的双特异性结合构建体和-HLE构建体(W2K)的结合信号(图15-图19)。将N4J双特异性结合构建体与huMMP-9或PBS以1:1摩尔比在37℃下一起预孵育20h。在图15-图17中,使用3E5A5小鼠抗-(抗CD3 scFv)Ab(5μg/ml)和PE抗小鼠IgG(1:200)对双特异性分子进行染色。在4℃下以100/10/1/0.1nM双特异性结合构建体运行测定30分钟。染色仅参考了由二级抗小鼠Fc特异性PE缀合的多克隆Ab染色的细胞。在图18和图19中,将双特异性结合构建体与huMMP-9或PBS以1:1摩尔比在37℃下一起预孵育18小时,并在4℃下以50/4.2/1/0.35nM双特异性结合构建体运行测定30分钟。
实例5
基于FACS的体外细胞毒性测定
将双特异性结合构建体应用于体外TDCC测定,以确定未消化构建体与MMP-9消化双特异性结合构建体之间的活性差异(图20-图25)。将双特异性结合构建体与重组MMP-9以1:1的摩尔比在37℃下一起孵育18h(或PBS作为对照)。在测定设置之前,使用Vybrant DiO标记靶抗原转染的CHO细胞(靶细胞),并使用泛T细胞分离试剂盒(美天旎公司(Miltenyi))从自愿、健康供体捐献的人PBMC中分离人泛T细胞(效应细胞)。将双特异性结合构建体稀释系列与靶细胞和效应细胞群的组合以10:1的效应物:靶标比率进行孵育,并在37℃、5%CO2、95%湿度下孵育48小时。48小时后,将细胞离心,用碘化丙啶(PI)染色并应用于流式细胞术。将Vybrant DiO和碘化丙啶(PI)阳性细胞的百分比与相应的双特异性结合构建体浓度作图,以确定用于活性比较的剂量-响应曲线的EC50值。通过将MMP9孵育的双特异性结合构建体的EC50除以PBS孵育的双特异性结合构建体的EC50来计算EC50值和因数(效力差异倍数)。EC50值的范围、测定的数量和因数(PBS和MMP9孵育的双特异性结合构建体之间的差异倍数)显示在图26中。非MMP9可切割的双特异性结合构建体(W2K)用作参考。
本文引用的每个参考文献出于所有目的均通过引用以全文并入本文。
本发明在范围上不受本文所述的特定实施例的限制,这些特定实施例旨在作为本发明各个实施例的单个说明,和本发明的功能上等效的方法和组分。实际上,除了本文中显示和描述的那些之外,根据前述描述和附图,本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这类修改旨在包含在权利要求的范围内。
序列
示例性接头序列
GGGGS(SEQ ID NO:1)
GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:2)
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:3)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:4)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:5)
GGGGQ(SEQ ID NO:6)
GGGGQGGGGQ(SEQ ID NO:7)
GGGGQGGGGQGGGGQ(SEQ ID NO:8)
GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ(SEQ ID NO:9)
GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ(SEQ ID NO:10)
GGGGSAAA(SEQ ID NO:11)
TVAAP(SEQ ID NO:12)
ASTKGP(SEQ ID NO:13)
AAA(SEQ ID NO:14)
GGNGT(SEQ ID NO:15)
YGNGT(SEQ ID NO:16)
Fc区(SEQ ID NO:56-59)
成熟人CD3∈的SEQ ID NO:60氨基酸序列
食蟹猴的成熟CD3∈的SEQ ID NO:61氨基酸序列
人CD3∈的细胞外结构域的SEQ ID NO:62氨基酸序列
人CD3∈的SEQ ID NO:63氨基酸1-27
人CD3∈的SEQ ID NO:64氨基酸1-6
抗CD3 VH(SEQ ID NO:65)
抗CD3 VL(SEQ ID NO:66)
包括W103C半胱氨酸钳(Kabat)的抗CD3 VH(SEQ ID NO:67)
包括A43C半胱氨酸钳(Kabat)的抗CD3 VL(SEQ ID NO:68)
抗CD3 VH CDR1(SEQ ID NO:69)
抗CD3 VH CDR2(SEQ ID NO:70)
抗CD3 VH CDR3(SEQ ID NO:71)
抗CD3 VL CDR1(SEQ ID NO:72)
抗CD3 VL CDR2(SEQ ID NO:73)
抗CD3 VL CDR3(SEQ ID NO:74)
抗MSLN VH(SEQ ID NO:75)
抗MSLN VL(SEQ ID NO:76)
包括G44C半胱氨酸钳(Kabat)的抗MSLN VH(SEQ ID NO:77)
包括Q100C半胱氨酸钳(Kabat)的抗MSLN VL(SEQ ID NO:78)
抗MSLN VH CDR1(SEQ ID NO:79)
抗MSLN VH CDR2(SEQ ID NO:80)
抗MSLN VH CDR3(SEQ ID NO:81)
抗MSLN VL CDR1(SEQ ID NO:82)
抗MSLN VL CDR2(SEQ ID NO:83)
抗MSLN VL CDR3(SEQ ID NO:84)
scFc(SEQ ID NO:85)
scFc子结构域1(SEQ ID NO:86)
scFc子结构域2(SEQ ID NO:87)
W2K(SEQ ID NO:88)
N4J(SEQ ID NO:89)
N7A(SEQ ID NO:90)
B1U(SEQ ID NO:91)
Z9P(SEQ ID NO:92)
V1E(SEQ ID NO:93)
B2P(SEQ ID NO:94)
W9A(SEQ ID NO:95)
L2G(SEQ ID NO:96)
T7U(SEQ ID NO:97)
O7H(SEQ ID NO:98)
Claims (32)
1.一种双特异性结合构建体,该双特异性结合构建体包含含有具有式VH1-L1-VH2-L2-VL1-L3-VL2的氨基酸序列的多肽链,其中VH1和VH2包含免疫球蛋白重链可变区,VL1和VL2包含免疫球蛋白轻链可变区,并且L1、L2和L3是接头,其中L1为至少10个氨基酸、L2为至少15个氨基酸、并且L3为至少10个氨基酸,其中L1或L3包含蛋白酶切割位点,并且其中该双特异性结合构建体可与免疫效应细胞和靶细胞结合。
2.一种双特异性结合构建体,该双特异性结合构建体包含含有具有式VH1-L1-scFc子结构域1-L2-VH2-L3-VL1-L4-scFc子结构域2-L5-VL2的氨基酸序列的多肽链,其中VH1和VH2包含免疫球蛋白重链可变区,VL1和VL2包含免疫球蛋白轻链可变区,scFc包含免疫球蛋白重链恒定结构域-2和免疫球蛋白重链恒定结构域-3的子结构域1或子结构域2,并且L1、L2、L3、L4、和L5是接头,其中L1为至少10个氨基酸、L2为至少10个氨基酸、L3为至少15个氨基酸、L4为至少10个氨基酸、并且L5为至少10个氨基酸,并且其中L1、L2、L4和L5进一步包含至少5个氨基酸的蛋白酶切割位点,并且其中该双特异性结合构建体可与免疫效应细胞和靶细胞结合。
3.如权利要求1所述的双特异性结合构建体,其中该蛋白酶切割位点存在于L1和L3两者中。
4.如权利要求1所述的双特异性结合构建体,其进一步包含至少一个半胱氨酸钳。
5.如权利要求4所述的双特异性结合构建体,其中该半胱氨酸钳位于促进该VH1和VL1亚基、该VH2和VL2亚基、或这些scFc亚基之间的连接的位置。
6.如权利要求2所述的双特异性结合构建体,其进一步包含至少一个半胱氨酸钳。
7.如权利要求6所述的双特异性结合构建体,其中该半胱氨酸钳位于促进该VH1和VL1亚基、该VH2和VL2亚基、或这些scFc亚基之间的连接的位置。
8.如权利要求1所述的双特异性结合构建体,其进一步包含半衰期延长部分。
9.如权利要求8所述的双特异性结合构建体,其中该半衰期延长部分包含另外的接头和编码人IgG1、IgG2、或IgG4抗体的单链免疫球蛋白Fc区(scFc)。
10.如权利要求9所述的双特异性结合构建体,其中该另外的接头包含蛋白酶切割位点。
11.如权利要求10所述的双特异性结合构建体,其中该scFc多肽链包含抑制Fcγ受体(FcγR)结合的一种或多种改变和/或延长半衰期的一种或多种改变。
12.如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体,其中该VH1、VH2、VL1、和VL2都具有不同的序列。
13.如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体,其中
a.该VH1序列包含SEQ ID NO:65或67且该VL1序列包含SEQ ID NO:66或68,并且该VH2序列包含SEQ ID NO:75或77且该VL2序列包含SEQ ID NO:76或78,或者
b.该VH1序列包含SEQ ID NO:75或77且该VL1序列包含SEQ ID NO:76或78,并且该VH2序列包含SEQ ID NO:65或67且该VL2序列包含SEQ ID NO:66或68。
14.如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体,其进一步包含用另外的接头(L0)连接到该VH1的另外的部分,其中L0的长度为至少5个氨基酸。
15.如权利要求14所述的双特异性结合构建体,其中该另外的部分是CD3∈、或人血清白蛋白-接头-CD3(a.a.1-6)、或人血清白蛋白-接头-CD3(a.a.1-27)、或scFc-接头-CD3∈。
16.如权利要求14或15所述的双特异性结合构建体,其中L0进一步包含蛋白酶位点。
17.如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体,其中这些接头长度不同。
18.如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体,其中这些接头长度相同。
19.如权利要求1所述的双特异性结合构建体,其中L1和L2长度相同。
20.如权利要求1所述的双特异性结合构建体,其中L1和L3长度相同。
21.如权利要求1所述的双特异性结合构建体,其中L2和L3长度相同。
22.如权利要求1所述的双特异性结合构建体,其中L1的氨基酸序列为至少10个氨基酸长,L2的氨基酸序列为至少15个氨基酸长,并且L3的氨基酸序列为至少15个氨基酸长。
23.如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体,其中该效应细胞表达效应细胞蛋白,该效应细胞蛋白为人T细胞受体(TCR)-CD3复合物的一部分。
24.如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体,其中该效应细胞蛋白是CD3∈链。
25.一种核酸,该核酸编码如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体。
26.一种载体,该载体包含如权利要求25所述的核酸。
27.一种宿主细胞,该宿主细胞包含如权利要求26所述的载体。
28.一种制造如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体的方法,该方法包括(1)在表达该双特异性结合构建体的条件下培养宿主细胞,以及(2)从细胞团或细胞培养上清液中回收该双特异性结合构建体,其中该宿主细胞包含编码如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体的一种或多种核酸。
29.一种治疗癌症患者的方法,该方法包括向该患者施用治疗有效量的如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体。
30.如权利要求29所述的方法,其中在施用该双特异性结合构建体的同时、之前或之后,向该患者施用化疗剂、非化疗性抗瘤剂和/或辐射。
31.一种药物组合物,该药物组合物包含如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体。
32.如权利要求1或2所述的双特异性结合构建体在制造用于预防、治疗或缓解疾病的药物中的用途。
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