ES2225838T3 - Estructuras de receptor bacteriano. - Google Patents
Estructuras de receptor bacteriano.Info
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Abstract
SE PRESENTAN NUEVAS PROTEINAS QUE SE OBTIENEN MEDIANTE MUTAGENESIS DE AMINOACIDOS DE SUPERFICIE EXPUESTA DE DOMINIOS DE RECEPTORES BACTERIANOS NATURALES, LAS PROTEINAS SE OBTIENEN SIN PERDIDA SUBSTANCIAL DE LA ESTRUCTURA BASICA Y DE LA ESTABILIDAD DE LOS RECEPTORES BACTERIANOS NATURALES; TAMBIEN SE PRESENTAN LAS PROTEINAS QUE HAN SIDO SELECCIONADAS ENTRE UNA LIBRERIA DE PROTEINAS QUE CONFORMA UN REPERTORIO DE LAS NUEVAS PROTEINAS; ASI COMO METODOS PARA LA MANUFACTURA DE ESTRUCTURAS RECEPTORAS BACTERIANAS ARTIFICIALES.
Description
Estructura de receptor bacteriano.
La presente invención se refiere a nuevas
estructuras de receptor bacteriano que proceden de estructuras de
receptor bacteriano naturales que han sido modificadas con respecto
a los residuos aminoácidos implicados en la función de interacción
original, en que dicha función de interacción adicional ha sido
sustancialmente inhibida y reemplazada por una función de
interacción modificada dirigida a un participante en la interacción
deseado.
Varias bacterias que se sabe invaden a mamíferos
han desarrollado proteínas de la superficie capaces de unirse a una
diversidad de sustancias, incluidos hidratos de carbono y proteínas
específicos del huésped. Varios receptores de este tipo procedentes
de agentes patógenos bacterianos Gram-positivos han
sido aislados y caracterizados en detalle según se mostrará a
continuación. Los mejor caracterizados son los receptores Fc,
nombrados por la capacidad de unirse a la parte Fc constante de
IgG. Basado en experimentos de unión a IgG procedente de diversas
fuentes de mamíferos, y subclases de las mismas, los receptores Fc
se han dividido en seis tipos I-VI. El receptor
procedente de la proteina A de S. aureus [SPA], que define al
receptor de tipo I, ha sido el objeto de inmensos estudios.
SPA se une a IgG procedente de la mayoría de las
especies de mamíferos, incluido el hombre. De las cuatro subclases
de IgG humana, SPA se une a IgG1 e IgG4, pero muestra una
interacción muy débil o ninguna interacción con IgG3 [Eliasson, M.
et al, 1989 J. Biol. Chem. 9:4323-4327]. Esta
reacción pseudoinmune ha sido utilizada durante más de 20 años para
la purificación y detección de anticuerpos en aplicaciones de
diagnóstico, investigación y terapéuticas. La clonación,
secuenciación y expresión en Escherichia coli de fragmentos
definidos del gen SPA revelaron una organización muy repetitiva, con
cinco dominios de unión a IgG
[E-D-A-B-C],
una región que abarca la pared celular y una secuencia de anclaje a
la membrana [XM] [Uhlén, M. et al, 1984 J. Biol. Chem.
259:1695-1702; Moks, T. et al, 1986 Eur. J.
Biochem. 156: 637-643]. Se ha construido un gran
número de vectores de plásmido, permitiendo fusiones del gen a
diferentes fragmentos del gen con el fin de la producción de
proteínas de fusión en diferentes huéspedes [Nilsson B. y Abrahmsén,
L. 1990 Meth. Enz. 185: 144-161] (fig. 2A).
La estructura para un complejo entre Fc humano
[IgG1] y un dominio sencillo [B] de SPA ha sido determinado por
cristalografía de rayos X a una resolución de 2,8 \ring{A}
[Deisenhofer, J. et al 1981 Biochemistry 20:
2361-2370]. Basada en esta estructura y en la
información adicional procedente de experimentos de RMN, el dominio
B puede considerarse como una estructura compacta que consiste en
tres hélices \alpha anti-paralelas conectadas con
bucles. En la unión de Fc, que es de naturaleza tanto electrostática
como hidrófoba, únicamente están implicadas las cadenas laterales de
residuos procedentes de las hélices 1 y 2, mientras que la tercera
hélice no participa en la unión. En base a este dominio B, se ha
construido un dominio de unión a IgG sintético [Z] [Nilsson, B.
et al 1987 Prot. Eng. 1: 107-113], adecuado
como participante en la fusión para la producción de proteínas
recombinantes, que permite la purificación mediante cromatografía
de afinidad de IgG. La elevada solubilidad y la estructura estable
del dominio Z han sido utilizadas para la producción, purificación
y renaturalización de un gran número de proteínas recombinantes.
[Josephsson, S. y Bishop, R. Trends Biotechnol. 6:
218-224; Samuelsson, E. et al 1991 Bio.
Technol. 9: 363-366].
Las cepas de estreptococos de los grupos C y G
serológicos exhiben un repertorio de unión para IgGs de mamíferos,
incluida IgG3 humana, que es incluso más amplio que para el
receptor de tipo I. El nombre proteína G fue sugerido para este
receptor de tipo III procedente de estreptococos del grupo G. En
1986 Olsson y colaboradores informaron sobre la clonación y
secuenciación del gen procedente de los estreptococos del grupo G
serológico [G148] [Guss, B. et al, 1987 EMBO J.
5:1567-1575; Olsson, A. et al, 1987 Eur. J.
Biochem. 168: 319-324]. En analogía con SPA, SPG es
una molécula dispuesta repetitivamente, que comprende una región de
unión a IgG de tres dominios homólogos [C1, C2, C3], separados por
regiones D más pequeñas (fig. 2A). En comparación con SPA, SPG
exhibe espectros de unión diferentes para inmunoglobulinas
procedentes de diferentes especies y subclases de las mismas. Los
dominios de unión a IgG de la proteína G se utilizan ahora
ampliamente como una herramienta inmunológica, es decir en la
purificación por afinidad de anticuerpos monoclonales. La producción
de subfragmentos construidos mediante tecnología de ADN ha
demostrado que una región C individual es suficiente para la unión
completa a IgG. Recientemente, se determinó por cristalografía de
rayos X (fig. 2B) la estructura para un complejo entre el dominio
C1 procedente de SPG y Fc humano. Esto demuestra que SPG se une a
la interfaz CH2-CH3, pero en un sitio diferente en
comparación con SPA. La unión es principalmente de naturaleza
electrostática, lo que está en contraposición con la amplia
contribución de fuerzas hidrófobas observadas para interacciones
SPA-Fc. Además, la estructura tridimensional de C1
difiere de la estructura X debido a que está constituida por dos
láminas \beta conectadas por una hélice \alpha
[\beta\beta-\alpha-\beta\beta].
Los residuos de C1 que de acuerdo con la estructura están
implicados en la unión corresponden a la hélice \alpha, el bucle
y la siguiente lámina \beta.
Una actividad adicional de SPG es la capacidad de
unir albúmina de suero. La resistencia de la unión depende de la
especie y, entre las muestras sometidas a ensayo, SPG se une lo más
intensamente a la albúmina de suero procedente de rata, hombre y
ratón. Estudios de producción y de unión de subfragmentos de SPG
demuestran que las dos actividades de unión están estructuralmente
separadas y que la función de unión a la albúmina de suero está
localizada en la región A-B repetitiva [Nygren
et al 1990 Eur. J. Biochem. 193:143-148].
Esta región ha sido utilizada para varios fines biotecnológicos.
Proteínas recombinantes se han producido como fusiones a la región
que permite la purificación por cromatografía de afinidad, en que
la albúmina de suero humano se ha utilizado, de la manera más
frecuente, como ligando inmovilizado. Proteínas que se encuentran
que son proteolíticamente sensibles han sido producidas como
"fusiones de afinidad doble" en el sentido de que están
flanqueadas por dos colas de afinidad diferente derivadas de SPA y
SPG, respectivamente. Así, son posibles esquemas de purificación
que empleen tanto el extremo N como el C, lo que asegura la
recuperación de una proteína diana intacta [Hammarberg et al
1989 Proc. Nat. Acad. Sciences USA 86: 4367-4371].
La unión fuerte y específica a la albúmina de suero ha sido
también utilizada para la estabilización in vivo de proteínas
terapéuticas.
A través de la formación del complejo con la
albúmina de suero de muy larga vida, el receptor es transportado en
la circulación (monos macacos) con una semivida que está próxima a
la semivida para la propia albúmina de suero. Estudios en ratones
con el receptor CD4 de células T interesante para la terapia de
VIH/SIDA, pero rápidamente clarificado, demostraron que este
receptor estaba sustancialmente estabilizado cuando se fusionaba
con la región de unión a albúmina de suero, cuando se compara con
una proteína control no fusionada [Nygren et al 1991
Vaccines 91 Cold Spring Harbor Press 363-368]. La
lenta clarificación puede ser explicada probablemente por la
formación del complejo con la albúmina de suero que evita la
eliminación por parte del hígado y la excreción en el riñón.
Con el fin de determinar la extensión mínima
requerida para una unión mantenida a la albúmina de suero, se han
producido y analizado varios fragmentos menores de la región
A-B. El fragmento más pequeño hasta la fecha con la
actividad de unión a albúmina de suero es un fragmento de 46
residuos ["B2A3"] que comprende la región A3 flanqueada por
los residuos 13 y 9, respectivamente, procedentes de las regiones
B2 y S.
Basado en la homología y en estudios de unión de
otros fragmentos parciales, SPG se considera que es trivalente con
respecto a la unión a albúmina de suero. De manera similar a los
dominios Z y C1 de unión a IgG monovalentes, B2A3 es relativamente
pequeño y muestra una alta solubilidad y estabilidad y, por lo
tanto, es un candidato adecuado para la modificación.
La presente invención tiene por fin principal
proporcionar nuevas estructuras de receptor bacteriano al modificar
receptores bacterianos naturales con relación a sus funciones de
interacción originales, para dar como resultado nuevas estructuras
con funciones de interacción modificadas.
Otro objeto de la invención es proporcionar
estructuras de receptor bacteriano artificiales que sean estables y
más resistentes a diversas condiciones, tales como temperaturas
incrementadas.
Todavía otro objeto de la invención es
proporcionar estructuras de receptor bacteriano artificiales, cuyas
funciones de interacción han sido modificadas para dirigir las
mismas a otros participantes deseados en la interacción.
Con estos y otros objetos que resultarán
evidentes teniendo en mente la siguiente descripción, la invención
proporciona nuevas proteínas que se pueden obtener por mutagénesis
de aminoácidos expuestos en la superficie de dominios de receptores
bacterianos naturales, obteniéndose dichas proteínas sin una pérdida
sustancial de estructura básica y estabilidad de dichos receptores
bacterianos naturales. Dichas proteínas han sido seleccionadas
preferiblemente a partir de un banco de proteínas que constituye un
repertorio de dichas nuevas proteínas. En estructuras de receptor
bacteriano nuevas de este tipo, al menos un residuo aminoácido
implicado en la función de interacción del receptor bacteriano
original ha sido objeto de sustitución por otro residuo aminoácido,
con el fin de dar como resultado una pérdida sustancial de la
capacidad de interacción original, creándose una capacidad de
interacción modificada, realizándose dicha sustitución sin una
pérdida sustancial de la estructura básica y la estabilidad del
receptor bacteriano original.
El receptor bacteriano a utilizar como material
de partida para la modificación de las estructuras de receptor
bacteriano de la función de interacción procede de la proteína A de
estafilococos.
Con el fin de mantener una estabilidad y las
propiedades de la estructura de receptor bacteriano original, se
prefiere, de acuerdo con la presente invención, que la sustitución
que implica los residuos aminoácidos que participan en la función
de interacción del receptor bacteriano original no implique a más
de aproximadamente el 50% de los residuos aminoácidos del receptor
bacteriano original. Se prefiere particularmente que no más de
aproximadamente 25% de los residuos aminoácidos del receptor
bacteriano original sean objeto de sustitución.
En relación con las estructuras del receptor
bacteriano original seleccionadas para la modificación de sus
funciones de interacción, se prefiere particularmente utilizar
receptores que procedan del dominio Z de unión a IgG.
Con el fin de mantener lo más posible la
estabilidad y las propiedades de la estructura del receptor
original objeto de modificación de acuerdo con la presente
invención, se prefiere que su sustitución implique no más de
esencialmente todos los residuos aminoácidos que participen en la
función de interacción del receptor bacteriano original.
Con el fin de obtener propiedades favorables que
conciernen a la estabilidad y resistencia a diversas condiciones,
se prefiere que el receptor bacteriano de acuerdo con la presente
invención esté constituido por no más de aproximadamente 100
residuos aminoácidos. Se conoce a partir de informes científicos
que las proteínas de un tamaño relativamente pequeño son bastante
resistentes a temperaturas incrementadas y también a un pH bajo y a
determinados productos químicos. Para detalles concernientes a la
resistencia a la temperatura, véase el artículo de Alexander et
al. en Biochemistry 1992, 31, págs.
3597-3603.
Con respecto a la modificación de la estructura
de receptor bacteriano natural, se prefiere realizar la sustitución
del mismo recurriendo a la ingeniería genética tal como una
mutagénesis dirigida al lugar.
Con respecto al participante en la interacción
del receptor bacteriano natural modificado, se puede concebir una
multitud de sustancias tales como proteínas, lípidos, hidratos de
carbono y sustancias inorgánicas. Entre los ejemplos de hidratos de
carbono se encuentran los determinantes del grupo sanguíneo y
oligosacáridos específicos de patógenos.
En relación con las proteínas, participantes en
la interacción concebibles son IGF-I,
IGF-II, hGH, factor VIII, insulina y apolipoproteína
y sus respectivos receptores en calidad de participantes en la
interacción. Además, al seleccionar nuevas variantes de receptores
con una especificidad para diferentes formas de plegamiento de
proteínas, se pueden producir resinas de afinidad o herramientas
analíticas para facilitar el aislamiento de moléculas correctamente
plegadas. Ejemplos adicionales son proteínas de revestimiento
vírico, antígenos bacterianos, biotina y marcadores de células
tales como CD34 y CD4.
A pesar de que la presente invención es aplicable
a una diversidad de receptores bacterianos naturales, la siguiente
ilustración de la invención más en detalle se dirigirá al uso del
dominio Z de unión a IgG. El concepto de la presente invención, que
reside en el uso de receptores bacterianos artificiales basados en
las estructuras naturales de receptores bacterianos que se producen
de un modo natural, está asociado con varias ventajas. Así, la
invención hace posible utilizar receptores robustos y estables, muy
solubles y competentes para la selección. Esto está en
contraposición con las técnicas previas basadas en el uso de
componentes policlonales y monoclonales tales como para fines
diagnósticos, que no son muy estables en relación con el
almacenamiento, condiciones variables, tales como temperaturas
variables, etc. Además, la invención hace posible modificar
receptores bacterianos naturales para obtener capacidades de
interacción deseadas para fines específicos.
Para la selección variantes funcionales de este
tipo en un amplio repertorio, debe emplearse un potente sistema de
selección. Desarrollos recientes en este campo ofrecen métodos
alternativos. Una de las herramientas más importantes para la
ingeniería de las proteínas que ha surgido durante los últimos años
es la exhibición del fago de proteínas. Mediante técnicas de ADN
recombinante se pueden preparar partículas de fagos sencillas que
portan sobre su superficie una proteína fusionada a una proteína
revestida con un fago. Al encuadrar una gran agrupación de fagos
que portan diferentes proteínas, o variantes de una proteína
específica, se pueden clasificar clones de fago específicos que
exhiben una determinada característica de unión [documento WO
92/20791 expedido a Winter et al]. Dado que la partícula de
fago contiene ADN empaquetado que codifica los componentes de la
proteína del fago, se obtiene un acoplamiento entre la variante
específica de la proteína exhibida y la correspondiente información
genética. Al utilizar esta técnica, típicamente, 10^{9} clones de
fagos se pueden generar simultáneamente y someter a un
encuadramiento en cuanto al rastreo de características deseadas. La
técnica de exhibición del fago se puede utilizar para la selección
tanto de péptidos pequeños, así como de proteínas más complicadas
tales como anticuerpos, receptores y hormonas. Para la selección de
proteínas que no se pueden segregar, lo que es un requisito previo
para la exhibición del fago, se han desarrollado sistemas
intracelulares en los que el banco de proteínas se fusiona a una
proteína represora con afinidad por una región de operador portada
por el plásmido específica que resulta en un acoplamiento entre la
variante de proteína específica y el plásmido que lo codifica. Una
alternativa a fagos como portadores de bancos de proteínas sería
utilizar células bacterianas. Recientemente, se demostró la
exhibición de proteínas recombinantes sobre la superficie de
Staphylococcus xylosus basada en fusiones al dominio de
anclaje de la pared celular, lo que abre la posibilidad de exhibir
también repertorios de proteínas para la selección de afinidad de
variantes específicas [Hansson, M. et al 1992, J.
Bacteriology 174:4239-4245]. Además, mediante la
modelación de la estructura utilizando simulaciones gráficas por
ordenador, se pueden realizar en teoría predicciones de la unión y
función de variantes alteradas de una proteína antes de la
construcción del gen que codifica la proteína.
Como se ha indicado anteriormente, la presente
invención describe la construcción de nuevas proteínas basada en la
mutagénesis de aminoácidos expuestos en la superficie de dominios
derivados de receptores bacterianos. Estos receptores bacterianos
artificiales se pueden seleccionar en cuanto a diferentes
aplicaciones utilizando un sistema de exhibición del fago. Los
beneficios de utilizar receptores bacterianos como armazones
estructurales son varios. Han evolucionado para expresar una
función de unión sin perturbar la estructura global. Por naturaleza
son muy solubles, robustos a estados no fisiológicos tales como el
pH y el calor, eficaces para el plegamiento y, además, son
competentes en la secreción.
La invención encuentra uso en varias áreas
diferentes.
La parte de introducción de la memoria
descriptiva de la patente WO92/20791 antes identificada da una
excelente perspectiva sobre anticuerpos y su estructura. Se hace
particular referencia a su página 1.
El receptor bacteriano SPA ha sido ampliamente
utilizado en la tecnología de anticuerpos para la detección y
purificación de anticuerpos procedentes, por ejemplo, de
sobrenadantes de hibridoma y fluidos ascites. Sin embargo, no todos
los anticuerpos son reconocidos por estos receptores, dependiendo de
la especie y de la subclase. Para subfragmentos más pequeños de
anticuerpos (fig. 4), SPA y SPG muestran una unión limitada y no
están presentes herramientas eficaces para esquemas generales de
purificación. Sin embargo, a partir de un repertorio de receptores
de mutantes, incluido SPA, se pueden seleccionar en potencia formas
que exhiban una mayor afinidad para anticuerpos y subfragmentos de
los mismos.
La organización estructural compleja de
anticuerpos tiene un cierto número de consecuencias en cuanto a su
uso en diferentes aplicaciones, así como para la producción de
derivados recombinantes. Para uso en inmunosorbentes, la
disposición de subunidades conectadas por enlaces disulfuro puede
conducir a una pérdida de las cadenas pesadas y ligeras liberadas a
partir de las columnas. El requisito de un bloqueo con éxito de las
dos subunidades que contribuyen al sitio de unión al antígeno hace
difícil la producción en bacterias de pequeños subfragmentos con
una baja asociación. El plegamiento del anticuerpo depende de la
formación de enlaces disulfuro intra- e inter-cadena
que no son capaces de formarse en el entorno intracelular de las
células bacterianas. Sistemas de expresión intracelular de alto
nivel para anticuerpos recombinantes conduce a la formación de
cuerpos de inclusión que han de ser renaturalizados para obtener
una actividad biológica. Estas limitaciones hacen merecedora la
investigación de alternativas para uso como dominios de proteínas
capaces de unión específica, de reemplazar anticuerpos en un amplio
número de aplicaciones.
Las regiones CDR que forman la parte de unión al
antígeno de un anticuerpo forman una superficie total disponible
para el antígeno de aproximadamente 800 A^{2}, estando implicados
en la unión típicamente 10-20 residuos procedentes
del anticuerpo. Al utilizar la estructura del complejo determinado
por cristalografía de rayos X entre un dominio B individual de SPA
y fc[IgGI] humano como punto de partida, se pueden
determinar o postular aproximadamente 15 aminoácidos de dicho
dominio implicados en esta unión. La superficie de unión de
aproximadamente 600 A^{2}, es del mismo orden de magnitud que
entre un anticuerpo y su antígeno. Mediante mutagénesis in
vitro arbitraria de estas posiciones simultáneamente se obtiene
un gran banco de variantes Z con propiedades funcionales
modificadas. A la vista del hecho de que las regiones del dominio Z
que constituyen el denominado haz de tres hélices muy estable se
mantienen en su forma nativa, se generan espectros de proteínas que
podrían considerarse como "anticuerpos artificiales" y que
tienen la esperada elevada solubilidad y excelentes propiedades de
plegamiento capaces de unirse a un gran número de nuevos ligandos.
Fusiones de estos receptores artificiales a regiones constantes se
pueden construir para reclutar funciones de efector tales como la
unión al complemento o el disparo de CCDA (citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos).
Hay varias ventajas potenciales de utilizar la
estructura de SPA [Z] como punto de partida para "anticuerpos
artificiales" o receptores bacterianos artificiales de este
tipo. Durante un período de aproximadamente 10 años se ha producido
un gran número de proteínas como fusiones a SPA, en que se han
utilizado las propiedades únicas del participante en la fusión en la
expresión, replegamiento y purificación. En estas aplicaciones, se
ha encontrado que el dominio Z es extremadamente soluble, estable
frente a proteasas, fácil de producir en grandes cantidades y
plegable para formar una estructura correcta, también de modo
intracelular en Escherichia coli (sin cisternas). Las
inmunoglobulinas (Ig:s) son esencialmente tetrámeros constituidos a
partir de las denominadas estructuras de láminas \beta que
estabilizan la orientación de los bucles de unión al antígeno que,
a su vez, consisten en secuencias peptídicas continuas. Esto se ha
de comparar con el dominio Z monómero constituido a partir del
denominado haz de tres hélices que consiste en tres estructuras de
hélice \alpha estrechamente empaquetadas, en que los aminoácidos
de unión a Fc se encuentran discontinuamente en la secuencia, pero
en la proteína plegada están situados en la misma superficie de
unión. Esta diferencia con respecto a los elementos estructurales
que contribuye a la formación de la superficie de unión permite
nuevas posibles conformaciones que no pueden obtenerse en
anticuerpos naturales. La capacidad de Z de plegarse a la
estructura nativa, también bajo condiciones que prevalecen en el
sitio del citoplasma, abre la posibilidad de utilizar también
clínicamente derivados del mismo. Genes que codifican anticuerpos
artificiales, por ejemplo con capacidad neutralizante de virus, se
pueden distribuir a células a través de la denominada terapia
génica, que resulta en interrumpir la infección en una fase
temprana.
Cuando se producen proteínas recombinantes, la
purificación del producto es frecuentemente un gran problema. Al
expresar la proteína diana como una fusión a una denominada cola de
afinidad, el producto híbrido puede recuperarse de manera eficaz y
selectiva a partir del lisado de la célula o, en determinados
casos, a partir del medio de cultivo mediante el paso a través de
una columna que contiene un ligando inmovilizado. Se han descrito
varios sistemas de fusión de genes de este tipo que se basan en la
interacción de una determinada proteína con un ligando. Para
aplicaciones industriales es a menudo deseable limpiar eficazmente
las columnas entre las operaciones para satisfacer los requisitos de
pureza de parte de las autoridades. En función de la naturaleza de
las proteínas, normalmente no se pueden utilizar las condiciones
relativamente estrictas (NaOH, ácidos, calor), utilizadas a menudo
para matrices orgánicas o físicas, por ejemplo en la cromatografía
de intercambio de iones y en la filtración en gel. En este caso, es
de gran importancia el uso de nuevos ligandos basados en
estructuras estables que proceden de receptores bacterianos. A este
respecto, el dominio Z procedente de SPA es un excelente ejemplo, ya
que dicho dominio puede ser sometido a condiciones difíciles de
este tipo tales como a un pH de 1 o a calentamiento hasta 80ºC sin
una desnaturalización no reversible (véase el Ejemplo 2 más abajo).
A partir del banco, por ejemplo de variantes Z, se pueden
seleccionar para su uso interesantes productos proteínicos
inmovilizados sobre una fase sólida para la cromatografía de
afinidad. Estos ligandos de proteínas son resistentes a condiciones
de purificación eficaces y, por lo tanto, son útiles
repetitivamente a gran escala. En la cromatografía de
inmunoafinidad tradicional en la que se utilizan anticuerpos
monoclonales inmovilizados para la purificación selectiva de un
determinado producto, existen problemas con la fuga de la columna de
subunidades (cadenas pesada y ligera) del anticuerpo, ya que éste
consiste en cuatro cadenas polipeptídicas enlazadas por puentes
cisteína. Dado que los receptores bacterianos artificiales
consisten sólo en una cadena polipeptídica, este problema se evita.
Un área de interés particular es la selección de la unión a
hidratos de carbono. Se ha encontrado que lectinas, ligantes por
naturaleza a este gran e importante grupo de biomoléculas, son
difíciles de purificar y tienen una estabilidad limitada. Dado que
se ha encontrado que la generación de anticuerpos contra hidratos
de carbono es bastante complicada, será de gran importancia una
selección de nuevas lectinas artificiales para la investigación, el
diagnóstico y la terapia.
En la producción de proteínas recombinantes en
huéspedes bacterianos se forman frecuentemente precipitados del
producto génico, los denominados cuerpos de inclusión. Con el fin
de obtener una estructura nativa de la proteína, ésta se ha de
someter a un replegamiento in vitro. Una limitación en un
proceso de este tipo con la que a menudo uno se confronta es el
hecho de que una gran parte del material precipita en el proceso,
lo que resulta en bajos rendimientos. Al producir la proteína con
una extensión en la forma de un péptido hidrófilo corto o de un
dominio completo fácilmente soluble [Samuelsson, E. et al
1991 Bio/Technol. 9:363-366], se obtendrán
concentraciones esencialmente mayores de la proteína, sin que tenga
lugar una precipitación durante la renaturalización. Por ejemplo,
la elevada solubilidad de dicho dominio permite el uso de una
solubilidad incrementada de proteínas en el replegamiento a partir
de cuerpos de inclusión o en la llamada redistribución de puentes
disulfuro. A partir de bancos de receptores artificiales se pueden
seleccionar nuevas formas con propiedades mejoradas para facilitar e
incluso hacer posible el replegamiento de proteínas recombinantes
(chaperones cis-actuantes).
Recientemente, se ha descrito una nueva operación
para la purificación de proteínas recombinantes basada en la
cromatografía de intercambio de iones en el denominado lecho
expandido [Hansson, M. et al 1994 Bio/Technol. en prensa]. A
este respecto, se utiliza una diferencia en el punto isoeléctrico
entre la proteína diana y las proteínas de la célula huésped para
el enriquecimiento selectivo en una matriz de intercambio de iones
positivamente cargada. Mediante la fusión al dominio Z ácido (pI
4,7), la etapa de intercambio de iones puede tener lugar a un pH al
que la mayoría de los contaminantes eran de carga opuesta en
comparación con la proteína de fusión. Al construir bancos de
receptores bacterianos en los que se ha reemplazado una selección
de aminoácidos por los aminoácidos aspartato y glutamato, también
se pueden producir dominios muy ácidos y de solubilidad creciente
para uso como participantes en la fusión en la producción de
proteínas recombinantes.
Como se ha descrito previamente, sistemas de
afinidad basados en ligandos de proteínas son totalmente adecuados
para fines industriales a la vista de las rígidas condiciones
requeridas en la limpieza de las columnas. Por lo tanto, existe la
necesidad de participantes en la fusión con una afinidad específica
hacia ligandos orgánicos simples y baratos. El encuadramiento de
bancos de presentación del fago de diferentes receptores
bacterianos frente a tales ligandos proporciona nuevas colas de
afinidad, adecuadas para uso como participantes en la fusión para
la producción/purificación de proteínas recombinantes.
La presente invención proporciona medios para
producir y seleccionar proteínas con nuevas funciones. De acuerdo
con la invención, esto se consigue mediante una amplia mutación de
residuos definidos de dominios estables de receptores bacterianos.
Debido a las nuevas funciones de los receptores bacterianos
artificiales, éstos se pueden utilizar como ligantes específicos
para el sector terapéutico, el diagnóstico, la biotecnología o en la
investigación.
La presente invención se describirá ahora con
mayor detalle mediante ejemplos específicos con referencia a los
dibujos adjuntos. En los dibujos:
Figura 1. A. Representación esquemática de
proteína A de estafilococos que a los dibujos muestra el péptido
señal (S), cinco regiones de unión a IgG [E-
D-A-B-C], seguido
por una región de anclaje a la pared celular
[X-M].
B. Representación gráfica por ordenador del
complejo entre el dominio B de SPA y FcI humano determinada por
cristalografía de rayos X. Obsérvese que en esta figura no se ve la
tercera hélice de SPA.
Figura 2. A. Representación esquemática de la
proteína G de estreptococos procedente de la cepa G148 que muestra
el péptido señal (Ss), la región E (E), la región
A-B repetitiva de unión a la albúmina de suero, la
región de espaciador (S), seguida de los dominios C1 a C3 de unión
a IgG, separada por las regiones D y, finalmente, la región W de
anclaje a la pared celular.
B. Representación gráfica por ordenador del
complejo entre el dominio C1 de SPG y FcI humano determinada por
cristalografía de rayos X.
Figura 3. Representación esquemática de la
estructura de haz de tres hélices del análogo Z de SPA de 58
residuos. Se indican algunas de las cadenas laterales que se
proponen están implicadas en la unión a Fc, con la excepción de F30,
que estabiliza el empaquetamiento de
hélice-hélice.
Figura 4. Estructura de anticuerpo IgG, que
muestra los diferentes subfragmentos Fab, Fd, Fc y scFv compuesto
por el VH y VL conectados por un enlazador corto (aprox. 15 aa).
Figura 5: A. Concepto general para la estrategia
de ensamblaje del gen utilizada para la generación de bancos del
gen Z. Para la construcción del banco de derivados Z ácidos,
únicamente se alteraron los residuos 9, 11, 14, 27 y 35 utilizando
los oligonucleótidos ACID-1, ACID-2
degenerados. Los cebadores de PCR utilizados para la amplificación
del banco ensamblado eran ZLIB-3 (cebador 5' de
PCR) y ZLIB-5 (cebador 3' de PCR).
B. Los productos de PCR procedentes de la
amplificación del banco ensamblado que codifica 46 de los 58
residuos del dominio Z pueden clonarse en ADN fagémido que alberga
la parte C-terminal de Z restante. Este gen se
fusiona en el marco con el gen para la proteína III de la familia
M13 de bacteriófagos de E. coli. Esto permite la exhibición
en la superficie del fago del repertorio de variantes Z ácidas.
Figura 6. Oligonucleótidos utilizados para la
construcción de bancos Z. Para el banco de variantes Z ácidas
descritas en el Ejemplo 2, únicamente se utilizaron los
oligonucleótidos ZLIB-1, 2, 3, 4, 5, LONGBRIDGE,
ACID-1 y ACID-2.
Figura 7. Secuencias de ADN de clones derivados
del banco de proteínas Z ácidas. Las cifras en negrita indican las
posiciones de aminoácido en el dominio Z. Para claridad, se muestran
las posiciones de los sitios de restricción Acc I y Nhe I.
Figura 8. Resultado del análisis de la
estabilidad a la temperatura del dominio Z individual a pH 2,9. El
contenido de helicidad \alpha en la muestra se vigiló midiendo la
elipticidad a s222 nm durante un barrido de temperaturas.
Figura 9. Vector fagémido pKN1. Los productos de
PCR del banco que codifican las hélices 1 y 2 variegadas (tanto el
banco ácido como el banco extensivo) se subclonaron en el vector
fagémido, pKN1, que contenía el gen para los residuos
44-58 del dominio Z de tipo salvaje (esencialmente
hélice 3), seguido del gen para una región (PAA) de unión a albúmina
de suero de 46 residuos derivada de la proteína G de estreptococos
enlazada en marco con una versión truncada del gen de la proteína 3
del revestimiento del fago M13. El fagémido contiene el origen de la
replicación derivado del plásmido pBR322, así como la región
intergénica (fl ori) requerida para el empaquetamiento en las
partículas de fago.
Figura 10. SDS-PAGE. Proteínas
purificadas por afinidad HSA procedentes del periplasma de células
de Escherichia coli que producen el dominio Z de tipo salvaje
y dos variantes Z ácidas diferentes como proteínas de fusión PAA
codificadas a partir de sus respectivos vectores fagémidos se
analizaron mediante SDS/PAGE. M, marcador del peso molecular; pista
1, dominio Z de tipo salvaje; pista 2, clon 10; pista 3, clon
12.
Figura 11. Datos de DC. Gráfica de superposición
de espectros de DC obtenidos para el dominio Z de tipo salvaje y
dos variantes del banco de proteínas Z. Las señales de las
proteínas se obtuvieron después de restar la contribución de la
señal de DC a la cola de PAA, presente durante el análisis.
Figura 12. Cromatografía de intercambio de iones.
Las dos proteínas nº 10 y nº 12 de variantes Z ácidas junto con el
dominio Z de tipo salvaje (producidas como proteínas de fusión PAA)
se sometió cada una de ellas a análisis a pH 5,5, empleando una
columna de cromatografía de intercambio de aniones. La elución de
las proteínas a partir de la columna se obtuvo mediante un gradiente
de NaCl. Parte superior: variante Z ácida nº 12; central, variante
Z ácida nº 10; inferior, Z (tipo salvaje). Obsérvese que la
proteína Z de tipo salvaje no se retardó en la columna a este
pH.
Figura 13. Estructura del dominio Z. Una
representación traza de la cadena principal del modelo de la
estructura del dominio Z nativo. La estructura de las hélices una y
dos son de la co-estructura cristalina entre el
dominio B de SPA y Fc (Deisenhofer (1981) Biochemistry, 20,
2361-2370). La tercera hélice se constituyó en base
a las asignaciones estructurales secundarias a partir de
espectroscopia de RMN (Gouda et al., (1992) Biochemistry, 31,
9665-9672). Los átomos de no hidrógeno de las
cadenas laterales de residuos que se mutaron en la construcción del
banco combinatorio se exhiben en forma de modelos de bola y palo.
La exhibición se generó mediante el programa MOLSCRIPT (Kraulis
(1991) J. Appl. Cryst., 24, 946-950).
Figura 14. Secuencia de aminoácidos. Resultado de
la secuenciación de ADN de 31 variantes Z elegidas al azar del
banco. Los residuos sometidos a la mutagénesis están enmarcados.
Las líneas horizontales indican identidad de nucleótidos, con la
secuencia Z de tipo salvaje listada en la parte superior. Se indican
los clones que se expresaron y se caracterizaron como proteínas de
fusión a la cola de PAA.
Figura 15. Distribución de aminoácidos. Resultado
del análisis estadístico de los aminoácidos deducidos en las
posiciones mutadas. En total, en el cálculo se incluyeron 13
residuos procedentes de 31 clones (403 codones). Las relaciones
entre las frecuencias observadas y esperadas se muestran para la
totalidad de los 20 aminoácidos, así como para la única señal de
terminación (TAG) incluida en el perfil de degeneración NNG/T.
Figura 16. Análisis por SDS-PAGE.
Proteínas purificadas por afinidad de HSA a partir del periplasma
de células de E. coli que producen el dominio Z de tipo
salvaje y cuatro variantes Z diferentes en forma de proteínas de
fusión PAA codificadas a partir de sus respectivos vectores
fagémidos se analizaron mediante SDS/PAGE. Pistas
1-5: condiciones reducidas. Pistas 6 y 7:
condiciones no reducidas. Pista 1, dominio Z de tipo salvaje; pista
2, clon 16; pista 3, clon 21; pista 4, clon 22; pista 5, clon 24;
M, marcador del peso molecular; pista 6, clon 16 y pista 7, clon
22.
Figura 17. Datos de DC. Gráfica superpuesta de
espectros de DC obtenidos para el dominio Z de tipo salvaje y cuatro
variantes del banco de la superficie de la proteína
\alpha-helicolidal. Las señales de las variantes
se obtuvieron después de restar la contribución de la señal de DC
de la cola de PAA presente durante el análisis.
Figura 18. Análisis del biosensor. Una gráfica
superpuesta de sensogramas, obtenida a partir del análisis
BIA-core® del dominio Z de tipo salvaje de cuatro
variantes diferentes (nºs 16, 21, 22, 24; figura 4) condensadas a la
cola de PAA. Las actividades de unión a IgG de las diferentes
proteínas se analizaron utilizando un chip sensor revestido con
aproximadamente 5000 UR de IgG policlonal humana e inyecciones de
45 \mul a impulsos a 2 \mul/min de soluciones 1500 nM de las
diferentes proteínas. Obsérvese que las diferencias de los valores
de la meseta de las señales durante las inyecciones de las variantes
nºs 16, 21, 22 y 24 se debe a las diluciones divergentes en el
tampón de accionamiento.
Todos los reactivos y construcciones de ADN están
disponibles en el Departamento de Bioquímica y Biotecnología, Royal
Institute of Technology, Estocolmo, Suecia.
Los oligonucleótidos (fig. 6) se adquirieron de
Scandinavian Gene Synthesis (Suecia) y se fosforilaron en los casos
indicados de acuerdo con [Maniatis et al (1988) Molecular
Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press].
ZLIB-1 se biotiniló en el extremo 5', permitiendo la
inmovilización en perlas paramagnéticas de estreptavidina
M-280 adquiribles de Dynal A/S (Noruega). El tampón
de lavado/unión era NaCl 1 M, Tris-HCl 10 mM, pH
7,5, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 1 mM. El tampón de
reasociación/ligación era Tris-HCl 30 mM, pH 7,5,
MgCl_{2} 10 mM, ATP 0,2 mM, 1,4-ditiotreitol (DDT)
1 mM. La ADN ligasa era de Boehringer Mannheim, Alemania. El tampón
10 x PCR contenía MgCl_{2} 20 mM, dNTPs 2 mM,
Tris-HCl 100 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, Tween 20 al 1%.
ADN polimerasa de Taq procedía de Cetus Inc., EE.UU. El ciclador
térmico era un Perkin-Elmer 9600. Para el rastreo de
la temperatura/estabilidad se utilizó un espectropolarímetro
J-720 (JASCO, Japón). La cepa RR1\DeltaM15 de
Escherichia coli [Rüther, U. (1982) Nucl. Acids Res.
10:5765-5772] preparada para competencia [Maniatis
et al (1988) Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press] se utilizó como huésped para la
transformación. Las placas de agar contenían 100 \mug/ml de
ampicilina.
El análogo Z de SPA de 58 residuos sintético
[Nilsson et al. Prot. Eng] se sometió a un proceso de
mutagénesis para construir nuevas variantes con un pI alterado, con
el fin de producir participantes en la fusión para las proteínas
recombinantes a purificar mediante cromatografía de intercambio de
iones. En base a la estructura cristalina del complejo entre el
dominio B de SPA y FcI humano [Deisenhofer, J. et al 1981,
Biochemistry 20:2361-2370], se eligieron como
dianas para la mutagénesis cinco residuos procedentes del dominio B
que participan en la unión. Estos cinco codones, correspondientes a
los residuos Z nºs 9, 11, 14, 27 y 35 situados en las hélices 1 y 2
se alteraron simultáneamente utilizando oligonucleótidos
degenerados con la secuencia de tripletes G(C/A)(C/A) en
estas posiciones, dando como resultado los codones para los
aminoácidos alanina (50%), ácido aspártico (25%) y ácido glutámico
(25%), respectivamente. Al utilizar una estrategia de ensamblaje de
genes en fase sólida [Stähl et al, Biotechniques
14:424-434] se creó un banco de genes que codifica
3^{5}(243) variantes de carácter ácido del dominio Z de
unión a IgG sintético (fig. 5). Veinte microlitros (200 \mug) de
perlas revestidas con estreptavidina paramagnéticas se lavaron con
tampón de lavado/unión y se incubaron con 15 pmol de
oligonucleótidos ZLIB-1 (biotinilado) y
ZLIB-2 prehibridados durante 15 min a TA a un
volumen final de tampón de lavado/unión de 40 \mul. Después de la
ligación y el lavado, se añadieron de una manera repetitiva
aproximadamente 15 pmol de cada uno de los oligonucleótidos
ACID-1 (degenerado), LONGBRIDGE y
ACID-2 (degenerado) y el par de enlazador
ZLIB-4/ZLIB-5
pre-reasociado, interviniendo etapas de lavado de
acuerdo con Stähl et al [Biotechniques
14:424-434]. Después de haberse completado el
ensamblaje, los diferentes fragmentos se ligaron durante 15 min a
37ºC. Para amplificar la cantidad de ADN que codifica el banco Z
(Acid), todavía inmovilizado sobre las perlas, se retiró una
fracción y se sometió a PCR. La mezcla de PCR (50 \mul) contenía
un pmol de cada uno de los cebadores y ZLIB-3 y
ZLIB-5 de PCR, 5 \mul de cada una de las mezclas
de ligación, tampón 10 x PCR y 10 x CHASE, 1 unidad de polimerasa
de Taq y agua estéril hasta 50 \mul. El programa de ciclo de
temperaturas era: 96ºC, 1 min, 60ºC, 1 min y 72ºC, 2 min, repetido
durante 35 ciclos. El análisis mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1% mostró una banda del tamaño esperado de 179 pb,
mostrando la capacidad del concepto de ensamblaje. La banda de 179
pb procedente de la PCR del banco Z (Acid) se cortó del gel y se
purificó (Geneclean®, Bio 101, Inc. EE.UU.) antes de la inserción
en un vector plásmido (kit TA-cloning®, Invitrogen,
Inc. EE.UU.) adecuado para la secuenciación de ADN en fase sólida
[Hultman et al, 1988]. Después de la transformación y de
distribución en placas de agar con contenido en ampicilina, se
eligieron dos colonias para el análisis de las secuencias
obtenidas. Los resultados (fig.6) muestran que la degeneración
esperada se encontró en las posiciones deseadas.
La estabilidad a la temperatura de la
conformación Z se determinó siguiendo la elipticidad a 222 nm
mediante espectroscopia por dicroismo circular (DC) a través de un
barrido de temperaturas. Esta longitud de onda se utiliza para
vigilar la presencia de la helicidad \alpha de Z [Cedergren et
al. 1993 Prot. Eng. 6:441-448]. El experimento
se realizó a un pH más bien bajo (aproximadamente 2,9), con el fin
de desestabilizar la molécula, ya que el punto medio de la
temperatura de desnaturalización (Tm) ^{\sim} 95ºC a pH neutro
(datos no mostrados), que está fuera del intervalo que puede
determinarse mediante un barrido completo a través de la transición
bajo presión atmosférica normal. El experimento muestra (fig. 4)
que la Tm (según se define por el punto de inflexión del barrido de
temperaturas) del dominio Z es tan elevado como 71ºC a pH 2,9. Esto
demuestra la estabilidad a la temperatura extrema de las hélices á
en la molécula Z.
El experimento se llevó a cabo en un
espectropolarímetro J-720 (JASCO, Japón), y la
temperatura se controló haciendo circular agua a través del soporte
de la cubeta procedente de un baño de agua NESLAB. La temperatura se
vigiló en la cubeta a través de un dispositivo microsensor (JASCO,
Japón). El tampón era ácido acético 50 mM, pH 2,9. La proteína era
dominio Z [Cedergren et al 1993 Prot. Eng.
6:441-448] a una concentración de proteínas de 50
\mug/ml y la longitud del recorrido de las células en la cubeta
era de 1 cm. La velocidad de barrido de la temperatura en el
experimento era 50ºC/h.
Dos variantes de proteínas derivadas del banco Z
ácido se expresaron en Escherichia coli, se purificaron y
caracterizaron utilizando SDS-PAGE, dicroismo
circular y cromatografía de intercambio de iones. Los productos de
PCR procedentes de un conjunto de genes en fase sólida (véase el
Ejemplo 1) se restringieron con 45 U de Esp 3I (Labassco AB,
Suecia) y 50 U de Nhe I (Pharmacia, Suecia) en 200 \mul de
tampón (Tris-acetato 33 mM, pH 7,9, acetato de Mg
10 mM, acetato de potasio 66 mM, DTT 0,5 mM y 0,1 mg/ml de BSA). La
mezcla se recubrió con aceite mineral y se incubó a 37ºC durante
una noche. Los fragmentos restringidos (aproximadamente 5 \mug)
se purificaron mediante extracción con fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico, seguido de un lavado adicional con cloroformo y luego se
precipitaron con etanol antes de la ligación a 15ºC durante una
noche al vector pKN1 escindido con Mlu I-Nhe I (1
\mug) (véase más abajo) utilizando 13,5 unidades de Weiss de T4
ADN ligasa. La mezcla de ligación se trató térmicamente a 70ºC
durante 20 min, se extrajo con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico,
seguido del lavado con cloroformo, se precipitó con etanol y se
redisolvió en 20 \mul de agua estéril.
El vector pKN1 fagémido (figura 9) se construyó
en varias etapas como sigue. Un enlazador de doble cadena que
codifica los residuos 44-58 invariables del dominio
Z se formó a partir de los oligonucleótidos ZLIB-6 y
ZLIB-7 y se clonó en forma de un fragmento
Mlu I-Xho I en el fagémido pKP986 (una amable
donación del Dr. Lars Abrahmsén. Pharmacia BioScience Center,
Suecia), dando como resultado pKN. El plásmido pKP986 codifica el
péptido conductor Omp A de E. coli, seguido de los residuos
249-406 de la proteína 3 de revestimiento del fago
filamentoso fd (Lowman et al (1991) Biochemistry, 30,
10832-10844) bajo el control de un promotor
lac. Un fragmento de gen que codifica una región de unión a
albúmina de suero monovalente derivada de la proteína G de
estreptococos se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pB2T
(Eliasson et al., Molecular Immunol., 28,
1055-1061), utilizando los cebadores
ABP-1 y ABP-2 (que contienen los
sitios de reconocimiento Xho I y Sal I,
respectivamente) y se clonó en el plásmido pKN restringido con
Xho I, proporcionando pKN1. Este vector fagémido codifica así
el péptido señal Omp A, la tercera hélice del dominio Z de tipo
salvaje, seguido de una proteína de unión a albúmina (PAA) de 46
residuos enlazada a los residuos 249-406 de la
proteína III del fago fd y está destinada para la inserción de
productos de PCR digeridos con Esp 3I/Nhe I que
codifican hélices variegadas una y dos del dominio Z.
Células RR1\DeltaM15 de E. coli
competentes congeladas (supE44 lacY1 lacZ
ara-14 galK2 xyl-5 mtl-1 leuB6
proA2 \Delta(mrcC-mrr) recA^{+}
rpsL20 thi-1 lambda^{-} F[lcc19
lacZ\DeltaM15]) (Rüther, (1982), Nucleic Acids Research,
10, 5765-5772) se transformaron con la mezcla de
ligación de acuerdo con Maniatis y colaboradores (Maniatis et
al. (1982) Molecular clonig: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y se
extendieron en placas de agar que contenían 100 \mug/ml de
ampicilina (Sigma. EE.UU.) y glucosa al 1%. Pequeñas cantidades de
células procedentes de colonias tomadas al azar se sometieron
separadamente a amplificaciones por PCR en dos etapas (30 ciclos:
96ºC, 15 s; 72ºC, 2 min) en un sistema de PCR GeneAmp 9600 (Perkin
Elmer, EE.UU.) utilizando 5 pmol de cebadores RJT-27
y NOKA-2 (biotinilado) en TAPS 20 mM (pH 9,3),
MgCl_{2} 2 mM, KCl 50 mM, Tween 20 al 0,1%, desoxirribonucleósido
trifosfatos (dNTPs) 0,2 mM y 1,0 U de ADN polimerasa de Taq
(Perkin-Elmer). La secuenciación de ADN en fase
sólida de los productos de PCR se efectuó empleando los cebadores
NOKA-3 (para la cadena inmovilizada) y
ABP-2 (para la cadena eluída) de secuenciación
marcados con FITC en una estación de trabajo robótica (Biomek®
1000, Beckman Instruments, Fullerton, CA) y un Automated Laser
Fluorescent (A.L.F.) DNA Sequencer® (Pharmacia Biotech, Suecia)
según se describe por Hultman y colaboradores (Hultman et
al., (1989) Nucleic Acids Research, 17,
4937-4946.
Para el análisis ulterior se seleccionaron dos
clones con las sustituciones de aminoácidos ácidas diferentemente
codificadas (en negrillas) en las posiciones 9, 11, 14, 27 y 35 en
el dominio Z de acuerdo con la tabla 1. El dominio Z de tipo
salvaje y las dos proteínas de variante Z ácidas diferentes (clones
nºs 10 y 12) se expresaron a partir de sus respectivos vectores
fagémidos como fusiones a la cola de unión a albúmina (PAA) del
suero y se purificaron mediante cromatografía de afinidad en
albúmina de suero humana.
Clon nº | Aminoácido codificado en la posición nº | |||||
9 | 11 | 14 | 27 | 35 | ||
t.s. | Gln | Asn | Tyr | Arg | Lys | |
10 | Glu | Asp | Asp | Ala | Glu | |
12 | Glu | Asp | Asp | Ala | Ala | |
a. letras en negrillas indican aminoácidos |
Colonias de células RR1\DeltaM15 de E.
coli que albergan los correspondientes vectores fagémidos se
utilizaron para inocular 100 ml de caldo de soja tríptico (Difco)
suplementado con ampicilina (100 \mug/ml). Los cultivos se
desarrollaron a 37ºC hasta una DO_{\text{600 nm}}= 1, seguido de
inducción con una concentración final de 1 mM de IPTG e incubación a
30ºC durante la noche. Las células se recolectaron mediante
centrifugación a aproximadamente 5000 g durante 10 min y las
proteínas periplásmicas se liberaron mediante choque osmótico. El
contenido periplásmico procedente de células se sometió a
cromatografía de afinidad en HSA-Sepharose, según se
describe por Nygren y colaboradores (Nygren et al., (1988)
J. Mol. Recognit., 1, 69-74) y se analizaron
mediante SDS/PAGE en un gel auxiliar homogéneo al 12% (BioRad Inc.,
EE.UU.) que se tiñó con azul brillante Coomassie
R-250. Para todas las proteínas se pudieron
recuperar aproximadamente 1,5-2,5 mg/l de cultivo,
indicando eficacias de producción y secreción similares para las
variantes y el dominio de tipo salvaje. Además, los resultados del
análisis SDS-PAGE (figura 10) de proteínas
purificadas sugiere que las variantes Z ácidas analizadas se
expresan de modo estable en E. coli.
Para investigar si el contenido en estructura
secundaria de los derivados se conservaba después de la mutagénesis
en superficie, se realizó un análisis por dicroismo circular
sustractivo. Proteínas Z purificadas por cromatografía de afinidad
de IgG o HSA, Z-PAA, los derivados de ácidos nºs 10
y 12 condensados a la cola de PAA, así como la propia cola de PAA
se sometieron a un análisis de dicroismo circular a 250 hasta 184
nm (más allá del UV) a la temperatura ambiente utilizando un
instrumento espectropolarímetro J-720 (JASCO,
Japón). La velocidad de rastreo era de 10 nm/min. La longitud del
recorrido de las células era 1 mm. Se prepararon soluciones
(aproximadamente 0,1 mg/ml) de las diferentes proteínas en tampón
fosfato 20 mM, pH 6,5, suplementado con Tween 20 al 0,05% (Kebo AB,
Suecia). Se determinaron concentraciones precisas de proteína
determinadas mediante el análisis de aminoácidos en un analizador de
aminoácidos Beckmann 6300 equipado con un sistema de tratamiento de
datos System Gold. Las señales de DC para los derivados se
obtuvieron sustrayendo la señal obtenida para la cola de PAA
después de ajustes para las diferencias en las concentraciones de
proteínas, seguido de normalización para los contenidos en
aminoácidos.
Una comparación de las señales obtenidas desde
250 hasta 184 nm para el dominio Z de tipo salvaje y las variantes
ácidas condensadas a la cola de PAA se efectuó después de sustraer
la contribución procedente de la propia cola de PAA. El resultado
demuestra que para los dos derivados Z ácidos, se obtuvieron
espectros similares al dominio Z de tipo salvaje con un mínimo
característico a 208 nm y un punto de inflexión a 222 nm (Johnson,
1990) (figura 11). Esto sugiere que el marco de haz de tres hélices
está conservado en estos mutantes.
Las dos variantes Z, nºs 10 y 12, contienen
cuatro y tres aminoácidos ácidos introducidos, respectivamente, en
comparación con el dominio Z nativo. Con el fin de investigar si la
acidez introducida se reflejaba como diferencias en sus puntos
isoeléctricos, se sometieron a una elución de gradiente a partir de
una columna de intercambio de aniones. Las proteínas Z (tipo
salvaje) y las variantes ácidas nº 10 y nº 12 (todas producidas en
forma de proteínas de fusión PAA) se disolvieron cada una (5
\mug) en 300 \mul de tampón piperazina 20 mM (pH 5,5) y se
aplicaron por separado a razón de 100 \mul/min en una columna
MonoQ.PC 1.6/5 (Pharmacia, Suecia). La elución de las proteínas se
realizó aplicando un gradiente de NaCl en tampón piperazina (pH
5,5) (Sigma, EE.UU.) que oscilaba desde 0-50% de
NaCl en 20 min. Los resultados procedentes del análisis (figura 12)
muestran que las dos proteínas de variante Z ácidas eluyeron a
diferentes concentraciones de NaCl, sugiriendo claras diferencias en
los puntos isoeléctricos. En contraposición, al pH elegido durante
los experimentos, el dominio Z de tipo salvaje no interactuaba con
la resina y, por lo tanto, se observa en el flujo.
Así, la serie de experimentos llevados a cabo en
las dos variantes Z ácidas muestra que el comportamiento de
expresión, la estabilidad proteolítica y el contenido en estructura
secundaria de las variantes se mantenían inalterados cuando se
comparan con el dominio Z nativo. Además, se introdujeron en las dos
variantes Z dos nuevas funciones mediante la sustitución de las
posiciones situadas en la superficie con aminoácidos. Las dos
variantes ácidas se pueden utilizar, por ejemplo, como
participantes en la fusión para facilitar la purificación de
proteínas recombinantes mediante cromatografía de intercambio de
iones a bajo pH. Así, se demuestra que entre los miembros del banco
Z ácido, se pueden aislar variantes con funciones nuevas.
Un banco de variantes Z se ensambló utilizando
una estrategia de ensamblaje de gen en fase sólida (véase el
Ejemplo 1). Se encontró que la mayoría de los residuos aminoácidos
que sugerían que tomaban parte en la unión a Fc (Deisenhofer,
(1981) Biochemistry, 20, 2361-2370) estaban en la
superficie de la molécula (Q9, Q10, N11, F13, Y14, L17, N28, Q32 y
K35) y, por lo tanto, estaban incluidos en la mutagénesis. Además,
en base a su localización superficial, también se decidió que
estaban incluidos otros residuos (H18, E24, E25 y R27). En total,
13 residuos en el andamio de Z se eligieron de esta forma para la
mutagénesis simultánea y al azar. Un conjunto de oligonucleótidos
(figura 6) se sintetizó para la construcción del banco de mutantes
de superficie del dominio de unión a IgG monovalente de 58
residuos, denominado Z. En este banco, los codones para Q9, Q10,
N11, F13, Y14, L17 y H18 situados en la primera hélice \alpha, y
E24, E25, R27, N28, Q32 y K35 en la segunda hélice \alpha del
dominio Z (figura 13) se sustituyeron por codones NNK (K= G o T)
degenerados utilizando una estrategia en fase sólida que utiliza
los oligonucleótidos degenerados de cadena sencilla para el
ensamblaje. La degeneración de NNK elegida incluye 32 codones que
cubren los 20 aminoácidos, incluida la señal de terminación TAG
(ámbar).
El oligonucleótido ZLIB-1 se
sintetizó con un grupo biotina 5' para permitir un anclaje firme
sobre perlas paramagnéticas revestidas con estreptavidina
utilizadas como soporte sólido durante el ensamblaje del gen. Este
oligonucleótido ZLIB-1, junto con su secuencia
complementaria (ZLIB-2), codifica los residuos
1-8 del dominio Z, precedido por los primeros seis
residuos de la región E de la proteína A que se incluían para
facilitar la secreción en E. coli de las variantes Z
(Abrahmsén et al., (1986) EMBO J., 4,
3901-3906). Los oligonucleótidos
DEGEN-1 y DEGEN-2 (Tabla I)
codifican las dos hélices mutadas del dominio Z, respectivamente,
implicadas normalmente en la unión a Fc. En teoría, una
degeneración completa y simultánea de NNK en las 13 posiciones
seleccionadas proporcionaría un banco combinatorio de
aproximadamente 8\cdot10^{16} variantes de proteínas codificadas
por 3,7\cdot10^{19} secuencias de ADN diferentes. Sin embargo,
en este caso, el ensamblaje del banco se inició mediante la
inmovilización de aproximadamente 15 pmol de oligonucleótidos
ZLIB-1 y ZLIB-2 prehibridados
(figura 6), lo que limita el tamaño teórico del banco Z a
aproximadamente 0,9\cdot10^{13} secuencias de ADN diferentes que
codifican aproximadamente 2\cdot10^{10} variantes Z. El
ensamblaje se continuó mediante la adición y ligación de una
construcción preconformada, obtenida después de la ligación de
cantidades equimolares de los oligonucleótidos
DEGEN-1 y DEGEN-2, facilitado por el
oligonucleótido de puenteo BRIDGE (figura 6).
Para completar el ensamblaje, un fragmento que
consiste en los oligonucleótidos ZLIB-4 y
ZLIB-5 prehibridados se añadió a las perlas para la
ligación. Este fragmento codifica el segundo bucle y los primeros
seis residuos de la tercera hélice inalterada del dominio Z.
Después de completado el ensamblaje, los oligonucleótidos
ZLIB-3 y ZLIB-5, que contenían las
secuencias de reconocimiento para las endonucleasas Esp3I y
NheI, respectivamente, se utilizaron como cebadores para la
amplificación por PCR de las construcciones ensambladas utilizando
un décimo del ADNss inmovilizado con perlas en forma de plantilla
(correspondiente teóricamente a 2\cdot10^{9} variantes de
proteínas). Para evitar una interferencia indeseada durante la
amplificación, los oligonucleótidos ZLIB-2, BRIDGE
y ZLIB-5 se eluyeron primeramente con álcali. El
producto de PCR resultante se analizó mediante electroforesis en gel
de agarosa y se encontró homogéneo y del tamaño esperado de 179
pb.
El producto de PCR se subclonó en el vector
fagémido pKN1 que contenía el gen para los residuos
44-58 del dominio Z de tipo salvaje en el marco con
una versión truncada del gen proteína 3 revestida con fago fd para
la exhibición en superficie en las partículas de fago tras la
superinfección con fago helper de células de E. coli
transformadas con fagémido (Lowman et al., (1991)
Biochemistry, 30, 10832-10844) (figura 9). Además,
el vector fagémido contiene una casete en marco interespaciada que
codifica una región de unión a albúmina de suero de 5 kDa (46 aa)
(denominada PAA) derivada de la proteína G de estreptococos (Nygren
et al., (1988) J. Mol. Recognit., 1,
69-74; Nilsson et al., (1994) Eur. J.
Biochem., 224, 103-108), permitiendo una
purificación por afinidad eficaz de variantes Z producidas
desprovistas de su actividad de unión a Fc activa. Además, la
actividad de unión a albúmina de suero se puede utilizar en
potencia para la pre-selección de partículas de fago
que portan moléculas recombinantes antes del encuadramiento para
variantes Z con nuevas funciones de unión, para disminuir el fondo
que procede de partículas de fago no recombinantes unidas de manera
inespecífica.
Después de la transformación, el rastreo por PCR
(utilizando los oligonucleótidos RJT-27 y
NOKA-2) de 25 clones mostró que más del 95% (24/25)
de los clones contenía una inserción de la longitud esperada,
sugiriendo que el proceso de ensamblaje del gen se llevó a cabo con
una elevada eficacia. Cuarenta y cinco transformantes se
seleccionaron al azar y se sometieron a secuenciación de ADN en
fase sólida directa (véase el Ejemplo 3) con el fin de analizar
adicionalmente la calidad y heterogeneidad del banco.
Aproximadamente el 69% de los clones era correcto, conteniendo
codones de tipo salvaje y degenerados en las posiciones esperadas.
Los clones restantes tenían discrepancias esporádicas que, en
parte, pueden atribuirse a la síntesis de oligonucleótidos o errores
introducidos durante la PCR. Los clones correctos (31 clones)
(figura 14) se analizaron adicionalmente para la representación de
codones en las 13 posiciones degeneradas. La distribución de los
403 aminoácidos deducidos resultantes totales entre los 32 codones
incluidos en el perfil de degeneración NNK muestra una estrecha
correlación con las frecuencias esperadas para estos clones todavía
no seleccionados (figura 15). Para investigar la expresión y
estabilidad de las variantes Z, cuatro clones (nºs 16, 21, 22, 24;
(figura 14) con diferentes grados de sustitución, así como el
dominio Z de tipo salvaje se produjeron en forma de fusiones de PAA
codificadas a partir de sus respectivos vectores fagémidos.
Proteínas solubles procedentes del periplasma de cultivos inducidos
por IPTG se sometieron a cromatografía de afinidad HSA empleando la
cola de PAA para una recuperación general y eficaz (Nygren et
al., (1988). J. Mol. Recognit., 1,
69-74). Para todas las proteínas, se pudieron
recuperar aproximadamente 1,5-2,5 mg/l de cultivo,
indicando eficacias de producción y secreción similares para las
variantes y el dominio de tipo salvaje. Los resultados procedentes
de un análisis por SDS-PAGE (figura 16) de proteínas
purificadas sugiere que las cuatro variantes Z analizadas se
expresan de modo estable en E. coli. La banda más pequeña
con actividad de unión de HSA, observada con diferentes
intensidades, corresponde lo más probablemente a la propia cola de
PAA (5 kDa), resultante de la escisión proteolítica entre la
variante Z y la cola de PAA. De modo interesante, las dos variantes
Z (nºs 16 y 22) con residuos cisteína introducidos formaban dímeros
que podían ser observados en condiciones no reductoras durante la
SDS-PAGE (figura 13; pistas 6 y 7).
Para investigar si el contenido en estructura
secundaria de los derivados se conservaba después de la mutagénesis
en superficie extensiva, se llevó a cabo un análisis de dicroismo
circular sustractivo (véase el Ejemplo 3). Una comparación de
señales obtenidas desde 250 a 184 nm para el dominio Z de tipo
salvaje y las cuatro variantes condensadas a la cola de PAA se llevó
a cabo después de la sustracción de la contribución procedente de
la propia cola de PAA. El resultado demuestra que para tres de los
cuatro derivados se obtuvieron espectros similares al dominio Z de
tipo salvaje, con un mínimo característico a 208 nm y un punto de
inflexión a 222 nm (Johnson, (1990) Proc. Struct. Funct.,
Genet., 7, 205-224) (figura 17). Esto sugiere
que la estructura de marco de tres hélices se conserva
probablemente en estos mutantes. Sin embargo, para el cuarto
derivado (nº 24) se obtuvo un espectro que se asemeja a espectros
observados para espirales aleatorias, indicando un bajo contenido en
elementos de estructura secundaria (Johnson, 1990). Este derivado
contiene una sustitución de glutamina por prolina en la posición 32
en la hélice 2, sugiriendo una desestabilización que conduce a un
colapso del marco de haz de la hélice.
Con el fin de investigar adicionalmente las
cuatro variantes Z, la interacción con IgG humana (hIgG) policlonal
(Pharmacia AB) para Z de tipo salvaje y cuatro clones diferentes de
variante Z (nºs 16, 21, 22, 24; figura 14) condensados a la cola de
PAA se comparó utilizando una tecnología de biosensor (BIAcore®,
Pharmacia Biosensor AB, Suecia). La capa de dextrano carboxilada de
un chip sensor CM-5 se activó utilizando la química
de N-hidroxisuccinimida (NHS) y
N-etil-N'-[3-dietilaminopropil]-carbodiimida
(EDC) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para la
inmovilización de hIgG, 20 \mul de una solución de hIgG 500 mM en
acetato 50 mM, pH 4, se inyectó a un caudal de 5 \mul/min sobre
la superficie activada, dando como resultado la inmovilización de
aproximadamente 5000 unidades de resonancia (UR). Muestras de 45
microlitros de las cinco proteínas de fusión, disueltas a
concentraciones aproximadas de 1500 nM en NaCl/Hepes (Hepes 10 mM,
pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, tensioactivo P-20
al 0,5%) se inyectaron en experimentos separados a un caudal de 2
\mul/min. Después de cada inyección de muestra, la superficie de
hIgG se regeneró con HCl 20 mM. Como se esperaba, sólo el dominio Z
de tipo salvaje mostró una actividad de unión a Fc detectable
(figura 18).
En conclusión, los resultados demuestran que se
puede construir un banco de variantes SPA con una superficie
constituida a partir de 13 residuos situados en las hélices
\alpha. El alto grado de conservación del marco general del
dominio Z nativo sugiere que derivados con nuevas funciones
injertadas sobre un andamiaje estable y soluble podrían aislarse
para uso como anticuerpos artificiales en bioquímica, inmunología y
biotecnología.
Claims (15)
1. Un método para la identificación y/o
fabricación de una estructura receptora bacteriana artificial, que
comprende las etapas:
a) proporcionar un repertorio de proteínas
diferentes, siendo el repertorio un conjunto de estructuras de
receptor bacteriano artificial diferentes, en cada una de las
cuales la secuencia de aminoácidos de la estructura receptora
bacteriana artificial corresponde a la de un receptor bacteriano
natural con al menos un residuo aminoácido expuesto en la superficie
sustituido con otro residuo aminoácido, siendo el receptor
bacteriano natural el dominio Z derivado de la proteína A de
Staphylococcus aureus;
b) someter dicho repertorio a un proceso de
selección basado en una función de interacción deseada, para la
selección de estructuras de receptor bacteriano artificial en las
que las sustituciones son tal que no se pierde la estructura básica
ni la estabilidad del receptor bacteriano natural, en que la
estructura del receptor bacteriano artificial carece de una
capacidad de interacción del receptor bacteriano natural, y en que
la estructura del receptor bacteriano artificial se une a un
participante en la interacción al que no se une el receptor
bacteriano natural; y
c) aislar la estructura del receptor
seleccionada.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la estructura del receptor bacteriano artificial tiene al
menos una sustitución en la posición de aminoácido seleccionada de
las posiciones 9, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 24, 25, 27, 28, 32 y 35
de la secuencia del dominio Z.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, en el que la estructura del receptor bacteriano artificial tiene
sustituciones en las posiciones de aminoácidos 9, 11, 14, 27 y 35
de la secuencia del dominio Z.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que la estructura del receptor bacteriano artificial tiene
sustituciones también en las posiciones de aminoácidos 10, 13, 17,
18, 24, 25, 28 y 32 de la secuencia del dominio Z.
5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la estructura del receptor
bacteriano artificial se condensa a una proteína revestida con
fago.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicha sustitución se ha
obtenido mediante mutagénesis dirigida al lugar.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho participante en la
interacción al que no se une el receptor bacteriano natural se
selecciona del grupo que consiste en proteínas, lípidos, hidratos
de carbono y sustancias inorgánicas.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicho participante en la interacción es un hidrato de
carbono tal como un determinante del grupo sanguíneo o un
oligosacárido específico de patógenos.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicho participante en la interacción se selecciona del
grupo que consiste en IGF-I, IGF-II,
hGH, factor VIII, insulina, apolipoproteína y sus receptores
respectivos.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicho participante en la interacción se selecciona del
grupo que consiste en una proteína de revestimiento viral, un
antígeno bacteriano, biotina y un marcador de células, tal como
CD34 o CD4.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicho participante en la interacción es un fragmento de
anticuerpo tal como Fv, scFv, Fab o Fc.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicho participante en la interacción es un ligando
orgánico.
13. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que comprende las etapas:
a1) preparar, mediante técnicas de ADN
recombinante, partículas de fago que portan en sus respectivas
superficies proteínas procedentes de dicho repertorio condensado de
proteínas de revestimiento de fago;
a2) encuadrar a partir de una agrupación de
partículas de fago que resultan de la etapa a1) para seleccionar
clones de fago específicos que exhiban características de unión
deseadas; y
b) aislar dichos clones de fago específicos
utilizando interacciones asociadas con dichas características de
unión.
14. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-4 y 6-12, que
comprende las etapas:
a) preparar, mediante técnicas de ADN
recombinante, proteínas de fusión en que las proteínas de dicho
repertorio se condensan a una proteína represora con afinidad por
una región específica de operador portada por plásmido que resulta
en la interacción entre una variante de proteína específica y un
plásmido que codifica el mismo; y
b) aislar las proteínas seleccionadas utilizando
dicha interacción.
15. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-4 y 6-12, que
comprende las etapas:
a1) preparar, mediante técnicas de ADN
recombinante, células bacterianas que portan en sus respectivas
superficies proteínas procedentes de dicho repertorio condensadas a
dominios de anclaje célula-pared funcionales en
dichas células bacterianas;
a2) encuadrar a partir de una agrupación de
partículas de fago que resultan de la etapa a1) para seleccionar
clones de fago específicos que exhiban características de unión
deseadas; y
b) aislar dichos clones específicos utilizando
interacciones asociadas con dichas características de unión.
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