ES2283355T3 - Anticuerpos que activan un receptor de eritropoyetina. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo, o su fragmento bivalente, que activa un receptor de eritropoyetina, en el que el anticuerpo, o su fragmento bivalente, se une a un péptido de restos de aminoácidos 49 a 78, inclusive de un receptor de eritropoyetina humano.
Description
Anticuerpos que activan un receptor de
eritropoyetina.
Esta invención se refiere a anticuerpos y
fragmentos bivalentes de los mismos, que reconocen un receptor de
eritropoyetina y activan un receptor de eritropoyetina y estimulan
la eritropoyesis.
La eritropoyetina (EPO) es una hormona
glicoproteica implicada en el crecimiento y maduración de células
progenitoras eritroides para producir eritrocitos. La EPO se
produce en el hígado durante la vida fetal y en el riñón en
adultos, y estimula la producción de glóbulos rojos a partir de
precursores eritroides. La disminución en la producción de EPO, que
normalmente se produce en adultos como resultado de una
insuficiencia renal, conduce a la anemia. Se ha producido EPO
mediante técnicas de ingeniería genética, que implacan la expresión
y secreción de la proteína por parte de una célula hospedante
transfectada con el gen que codifica la eritropoyetina. La
administración de EPO recombinante ha resultado eficaz en el
tratamiento de la anemia. Por ejemplo, Eschbach et al. (N.
Engl J Med, 316, 73 (1987)) describen el uso de EPO para
corregir la anemia resultante de una insuficiencia renal
crónica.
La purificación de EPO urinaria humana ha sido
descrita por Miyake et al. (J. Biol. Chem., 252, 5558
(1977)). La identificación, clonación y expresión de los genes que
codifican la eritropoyetina se describe en la patente US 4,703,
008 de Lín. Una descripción de un método para la purificación de
EPO recombinante a partir de un medio celular se incluye en la
patente US 4,667,016 de Lai et al.
El mecanismo mediante el cual la EPO estimula la
eritropoyesis apenas es conocido. Aunque es evidente que la EPO
activa a las células para que crezcan y/o se diferencien mediante
su unión a receptores específicos de la superficie celular, el
mecanismo específico de activación, así como la estructura del
receptor y de cualquier proteína(s) asociada(s), no
se entiende por completo. Se cree que el receptor de eritropoyetina
(EPO-R) existe como un complejo multímero. Los
estudios de sedimentación sugieren que su peso molecular es de 330
\pm 48 kDa (Mayeux et al., Eur. J. Biochem., 194,
271 (1990)). Los estudios de entrecruzamiento indican que el
complejo del receptor consiste en al menos dos polipéptidos
distintos, una especie de 66-72 kDa, y una especie
de 85 y 100 kDa (Mayeux et al., J. Biol. Chem., 266,
23380 (1991); McCaffery et al., J. Biol. Chem., 264,
10507 (1991)). También se ha detectado una proteína de 95 kDa
distinta mediante inmunoprecipitación del receptor EPO (Miura e
Ihle, Blood, 81, 1739 (1993)). Otro estudio de
entrecruzamiento reveló tres complejos que contienen EPO de 110,
130 y 145 kDa. Los complejos de 110 y 145 kDa contenían el receptor
EPO, puesto que podían inmunoprecipitarse con anticuerpos
generados contra el receptor (Miura e Ihle, supra). La
expresión de un receptor EPO truncado en el extremo carboxiterminal
da como resultado la detección del complejo de 110 kDa, pero no
del complejo de 145 kDa. Esto sugiere que el complejo de mayor peso
molecular contiene polipéptidos presentes en el complejo de 110 kDa
y otra proteína de 35 kDa.
Se obtuvo un mayor conocimiento de la estructura
y función del complejo del receptor EPO tras la clonación y
expresión de los receptores EPO de ratón y humano (D'Andrea et
al., Cell, 57, 277 (1989); Jones et al., Blood,
76, 31 (1990); Winkelmann et al., Blood, 76,
24 (1990); solicitud PCT WO90/08822; patente US 5,278,065 de
D'Andrea et al.). El receptor EPO humano de longitud
completa es una proteína transmembrana de 483 aminoácidos con un
dominio extracelular de aproximadamente 224 aminoácidos y un
péptido señal de 25 aminoácidos. El receptor humano tiene una
homología de secuencia de aproximadamente 82% de aminoácidos con el
receptor de ratón. Se ha demostrado que el receptor EPO clonado de
longitud completa expresado en células de mamífero
(66-72 kDa) se une con la EPO con una afinidad
(100-300 nM) similar a la del receptor nativo en
células progenitoras eritroides. Por tanto, se cree que esta forma
contiene el determinante de unión a EPO principal, y se denomina
receptor EPO. Las proteínas de 85 y 100 kDa observadas como parte
de un complejo entrecruzado son distintas del receptor EPO, pero
deben encontrarse muy cerca de EPO porque EPO puede unirse a
ellas. Las proteínas de 85 y 100 kDa están relacionadas entre sí, y
la proteína de 85 kDa puede ser un producto de rotura proteolítica
de la especie de 100 kDa (Sawyer, J. Biol. Chem., 264, 13343
(1989)).
Se ha producido una forma soluble (truncada) del
receptor EPO que contiene sólo el dominio extracelular, y se ha
descubierto que se une con la EPO con una afinidad de
aproximadamente 1 nM, o aproximadamente 3 a 10 veces menor que el
receptor de longitud completa (Harris et al., J. Biol.
Chem., 267, 15205 (1992)); Yang y Jones, Blood, 82, 1713
(1993)). Se desconoce la razón de la afinidad reducida cuando se
compara con la proteína de longitud completa. Existe la posibilidad
de que otra especie de proteína también forme parte del complejo
EPOR y que contribuya a la unión de la EPO, aumentando con ello la
afinidad. En apoyo a esta posibilidad se encuentra la observación
de Dong y Goldwasser (Exp. Hematol., 21, 483 (1993)) de que
la fusión de una línea celular que tienen un receptor EPO de baja
afinidad, con una célula CHO que no une la EPO da como resultado
una línea celular híbrida que muestra una elevada afinidad de unión
a EPO del receptor para EPO. Además, la transfección de un EPOR de
longitud completa en células CHO da como resultado una línea
celular con receptores de alta y baja afinidad, según se mide
mediante el análisis de Scatchard. La amplificación del número de
copias de EPOR aumenta la unión de baja afinidad, pero no la de alta
afinidad. Estos resultados son coherentes con la presencia de una
cantidad limitada de la proteína presente en las células CHO, que
convierte el EPOR de baja afinidad en EPOR de alta afinidad.
La activación del receptor EPO da como resultado
varios efectos biológicos. Tres de las actividades incluyen la
estimulación de la proliferación, la estimulación de la
diferenciación y la inhibición de la apoptosis (Liboi et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11351 (1993);
Koury, Science, 248, 378 (1990)). Las vías de transducción
de la señal que dan como resultado la estimulación de la
proliferación y la estimulación de diferenciación parecen ser
separables (Noguchi et al., Mol. Cell. Biol., 8, 2604
(1988); Patel et al., J. Biol. Chem., 267, 21300
(1992); Liboi et al., ibid). Algunos resultados sugieren que
puede resultar necesaria una proteína accesoria para mediar en la
señal de diferenciación (Chiba et al., Nature, 362,
646 (1993); Chiba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90, 11593 (1993)). Sin embargo, existe controversia acerca
del papel de las proteínas accesorias en la diferenciación, puesto
que una forma constitutivamente activada del receptor puede
estimular la proliferación y la diferenciación (Pharr et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 938 (1993)).
La activación del receptor EPO puede ser debida
a su dimerización. Es decir, la EPO puede actuar como entrecruzador
entre dos moléculas de receptor EPO. Una mutación de argigina a
cisteína en la posición 129 del receptor EPO murino da como
resultado una activación constitutiva del receptor, probablemente
debido al enlace disulfuro formado entre dos subunidades de los
receptores (Yoshimura et al., Nature, 348, 647
(1990)). Además, EPOR aparece en complejos multímeros en células
(Miura e Ihle, Arch. Biochem. Biophys., 306, 200 (1993)).
Sin embargo, no se ha indicado el aislamiento de una forma multímera
estable del receptor soluble EPO purificado. Además, puede
requerirse la dimerización de EPOR, pero por sí misma puede no ser
suficiente para la activación completa de las células. Por ejemplo,
la dimerización puede dar como resultado una señal de
proliferación, pero no una señal de diferenciación. Es decir,
pueden requerirse proteínas accesorias para enviar la señal de
diferenciación.
La posible relación entre la dimerización y la
activación del receptor EPO puede explotarse para identificar
compuestos que son diferentes de EPO pero que activan el receptor.
Por ejemplo, los anticuerpos poseen dos sitios de unión idénticos
para el antígeno. Un anticuerpo anti-EPOR puede
unirse a dos moléculas EPOR y las puede aproximar entre sí para
que se pueda producir la dimerización. Con el fin de funcionar
in vivo, estos anticuerpos deben reconocer el EPOR sobre la
superficie de las células y unirse de modo que se pueda producir la
activación de la vía de transducción de señal. Además, resulta
deseable que la activación de como resultado la proliferación y
diferenciación de los progenitores eritroides. Se ha indicado un
enfoque similar para entender la activación del receptor de la
hormona del crecimiento humana (Fuh et al., Science,
256, 1677 (1992)) y el receptor del factor del crecimiento
epidérmico (Schreíber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
78, 7535 (1981)).
Resultaría deseable identificar moléculas que
tienen la propiedad de activar el receptor EPO y estimular la
eritropoyesis. Con el fin de lograrlo, resulta importante entender
el mecanismo de la transducción de señal y la activación del
receptor EPO. Un enfoque para comprender este mecanismo puede ser
identificar anticuerpos que reconocen el receptor EPO, de modo que
se active el receptor y se estimule la eritropoyesis. Estos
anticuerpos son útiles en aplicaciones terapéuticas y de
diagnóstico, y también serían útiles para investigar la función del
receptor EPO.
Las siguientes referencias describen anticuerpos
que se unen al receptor EPO de ratón o humano:
D'Andrea et al., en The Biology of
Hematopoiesis, Wiley-Liss, Inc. (1990), pp.
153-159, generaron anticuerpos policlonales
antipéptidos contra péptídos amino-terminales y
carboxi-terminales del receptor EPO murino. Se
demostró que los anticuerpos reaccionaban con el receptor EPO de
ratón en una transferencia Western.
Bailey et al., Exp. Hematol., 21,
1535-1543 (1993) generaron anticuerpos policlonales
antipéptidos contra péptidos sintéticos homólogos a los dominios
extracelular y citoplásmico del receptor EPO de ratón. No se
detectó la activación del receptor por estos anticuerpos, según se
midió mediante la captación de ^{3}H-timidina por
las células pancreáticas en ratones tratados con
fenilhidrazina.
Baynes et al., Blood, 82,
2088-2095 (1993) generaron un anticuerpo policlonal
contra un péptido amino-terminal en el receptor EPO
humano. Se demostró que el anticuerpo reaccionaba con una forma
soluble del receptor presente en suero humano.
D'Andrea et al., Blood, 82,
46-52 (1993) generaron anticuerpos monoclonales
contra el receptor EPO humano. Los anticuerpos se unen a células
Ba/F3 transfectadas con el clon de cDNA de EPO humana, y algunos
inhibían la unión de EPO y neutralizaban el crecimiento dependiente
de EPO.
Fisher et al., Blood, 82, 197A
(1993) utilizaron los mismos anticuerpos monoclonales que los
descritos en
D'Andrea, supra, para diferenciar entre células progenitoras eritroides que tienen un crecimiento y maduración dependientes de EPO, y las que tienen un crecimiento y maduración independientes de EPO.
D'Andrea, supra, para diferenciar entre células progenitoras eritroides que tienen un crecimiento y maduración dependientes de EPO, y las que tienen un crecimiento y maduración independientes de EPO.
No se ha indicado que ninguno de los anticuerpos
descritos en las referencias mencionadas anteriormente haya
activado el receptor EPO, o haya estimulado el crecimiento y/o
maduración de las células progenitoras eritroides.
Por tanto, un objeto de la invención es producir
anticuerpos y fragmentos bivalentes de los mismos, que reconocen
un receptor EPO y se unen a él, entre los restos de aminoácidos 49
a 78, de forma que el receptor se activa. Otro objeto de la
invención es producir anticuerpos y fragmentos bivalentes de los
mismos,que se unen a un receptor EPO entre los restos de
aminoácidos 49 a 78, y estimulan la eritropoyesis, mediante la
estimulación de la proliferación y/o la diferenciación de células
progenitoras eritroides para producir eritrocitos. Estos
anticuerpos y fragmentos bivalentes de los mismos resultan útiles
en el tratamiento de la anemia o en el diagnóstico de enfermedades
caracterizadas por un receptor EPO disfuncional. Además, estos
anticuerpos y fragmentos bivalentes de los mismos pueden conducir a
la identificación de agentes terapéuticos para el tratamiento de la
anemia.
La invención se refiere a anticuerpos o
fragmentos bivalentes de los mismos, según se define en la
reivindicación 1. La investigación de anticuerpos que reconocen el
receptor EPO humano ha revelado que dos anticuerpos, denominados
Mab 71 y Mab 73, estimulan la proliferación de células
UT7-EPO, una línea celular dependiente de EPO que
no prolifera en ausencia de EPO añadida. Además, Mab 71 estimula la
formación de colonias eritroides a partir de progenitores
eritroides en sangre humana. Los anticuerpos son preferiblemente
anti- cuerpos monoclonales, y pueden ser anticuerpos humanizados o
humanos. También se incluyen líneas celulares de hibridoma que
producen los anticuerpos de la invención.
También se suministran métodos y kits de ensayo
para detectar receptores EPO en muestras biológicas, y estos
métodos y kits de ensayo comprenden anticuerpos del receptor EPO o
sus fragmentos bivalentes de la invención. También se incluyen en
la invención las composiciones farmacéuticas que comprenden
anticuerpos del receptor EPO o fragmentos bivalentes de los mismos
y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones
pueden utilizarse para tratar pacientes que tienen trastornos
caracterizados por bajos niveles de glóbulos rojos.
La figura 1 muestra los resultados de un ensayo
ELISA que mide la unión, a las concentraciones indicadas, de
péptidos sintéticos por Mab 71. Los péptidos se corresponden con
los restos aminoácidos indicados del receptor EPO humano. El resto
1 es la prolina amino terminal que se halla en EPOR segregado,
después de la escisión de la secuencia conductora.
La figura 2 muestra el efecto de cantidades
variables de proteína rHuEPO y de Mab 71 y 73 purificados sobre la
captación de ^{3}H-timidina de células
UT7-EPO.
La figura 3 muestra los efectos de cantidades
variables de proteína rHuEPO, Mab 71, Mab 73 o un Mab control no
neutralizante dirigido contra EPO (Mab F12), sobre la inhibición
de la unión de ^{125}I-EPO a los receptores EPO
sobre la superficie de células OCIMI.
La figura 4 muestra el gel SDS teñido con
Coomassie de preparaciones purificadas de anticuerpos monoclonales
71 y 73, así como de fragmentos de anticuerpo monoclonal (Fab)
derivados de Mab 71 y 73. Las muestras se ensayaron en condiciones
reductoras (con 2-mercaptoetanol) o no reductoras
(sin 2-mercaptoetanol).
La figura 5 muestra el efecto de concentraciones
variables de proteína rHuEPO, Mab 71 o Fab 71 purificados, sobre
la captación de ^{3}H-timidina en células
UT7-EPO.
La figura 6 muestra el efecto de cantidades
variables de Mab 71 o Fab 71 purificados, sobre la captación de
^{3}H-timidina en células
UT7-EPO, a las que también se le había añadido 30
munidades/ml de EPO recombinante humana (rHuEPO).
La figura 7 muestra una fotografía de células CD
34^{+} purificadas a partir de sangre periférica, que fueron
cultivadas 21 días en metilcelulosa en presencia de EPO o Mab71,
bajo condiciones de crecimiento exentas de suero. Las fotografías
son de células incubadas con 500 munidades/ml de EPO (A), 25 de EPO
(B), o 2,1 microgramos/ml de Mab 71 (C).
La figura 8 muestra el efecto de cantidades
variables de rHuEPO, Mab 71 y un anticuerpo monoclonal control
generado contra Her2/neu, en la formación de colonias eritroides a
partir de precursores esferoides cuando se cultivan en condiciones
de crecimiento exentas de suero en agar blando.
Se han generado anticuerpos monoclonales (Mab)
que reconocen el receptor de eritropoyetína, mediante la
inmunización de ratones con el receptor EPO humano soluble
purificado. El receptor EPO humano soluble se expresó y se purificó
como se describe en los ejemplos 1 y 2. De todos los Mab que
reaccionaron con el receptor EPO humano soluble en ensayos
inmunoabsorbentes de enzimas ligados (ELISA), se seleccionaron 96
Mab para su posterior investigación. Estos Mab se ensayaron para
detectar la unión al receptor EPO mediante un análisis BIAcore
(ejemplo 4A), y para detectar la unión al receptor EPO sobre la
superficie de células CHO transfectadas mediante FACS (ejemplo 4C).
Los resultados de estas investigaciones aparecen en la tabla 1.
Aunque varios anticuerpos se unieron al receptor EPO, según se
determinó mediante el análisis BIAcore, sólo cinco anticuerpos de
los 96 ensayados se unieron al receptor EPO que aparece sobre la
superficie de células CHO transfectadas, según se determinó
mediante barrido FACS. Los 24 anticuerpos que eran positivos en los
ensayos ELISA (incluyendo los cinco que eran positivos con barrido
FACS) se ensayaron para detectar la estimulación de la
proliferación de células UT7-EPO. De modo
sorprendente, se descubrió que dos anticuerpos, denominados Mab 71
y Mab 73, estimulaban la captación de
^{3}H-timidina en la línea celular
UT7-EPO (Komatsu et al., Blood, 82,
456 (1993)) en ausencia de EPO (ejemplo 8A). La línea celular
UT7-EPO requiere la presencia de EPO en el medio
para su crecimiento. Por tanto, la estimulación del crecimiento de
células UT7-EPO probablemente es debida a la
activación del receptor EPO por Mab 71 y Mab 73. Tal como aparece
en la figura 2, la respuesta de las células UT7-EPO
es mayor en presencia de Mab 71 que de Mab 73. También se descubrió
que Mab 71 estimula la formación de colonias eritroides a partir
de precursores eritroides humanos (véase el ejemplo 9). Éste es el
primer caso de un anticuerpo que estimula la formación de colonias
eritroides a partir de precursores eritroides.
La invención suministra un anticuerpo, o su
fragmento, que activa un receptor de eritropoyetina y se une a un
péptido de restos de aminoácidos 49 a 78. Tal como se utiliza en
la presente, la expresión "activación de un receptor EPO"
indica uno o más procesos moleculares que sufre un receptor EPO,
que dan como resultado una transducción de la señal hacia el
interior de una célula que porta el receptor, en la cual la señal,
en último término, produce uno o más cambios en la fisiología
celular. Las respuestas celulares a la activación del receptor EPO
son típicamente cambios en la proliferación o diferenciación de las
células que portan el receptor. Las células que portan el receptor
son típicamente células progenitoras eritroides. En la actualidad,
los acontecimientos moleculares que conducen a la transducción de
la señal por el receptor EPO apenas se comprenden. Sin embargo,
como se ha indicado en los antecedentes, algunas pruebas sugieren
que la dimerización del receptor EPO es al menos un acontecimiento
que probablemente sea necesario para la activación. La presente
memoria también apoya esta idea. Tal como aparece en la figura 5,
la estimulación de la captación de ^{3}H-timidina
en células UT7-EPO por Mab 71 se suprime cuando
éste se sustituye por el correspondiente fragmento Fab, denominado
Fab 71.
Por tanto, la sustitución del anticuerpo
bivalente intacto por un correspondiente fragmento monovalente
elimina la respuesta proliferativa. Además, Mab 71 inhibe la
activación del receptor EPO a concentraciones elevadas. Ambas
observaciones apoyan el modelo de dimerización de la activación
del receptor EPO. Se ha demostrado que Mab 71 interacciona con un
péptido sintético de los restos 49 a 78 del EPO-R
humano (véase el ejemplo 6). Por tanto, esta región del
EPO-R, cuando se une a un entrecruzador como Mab 71,
puede dar como resultado una activación del EPO-R.
Las moléculas que entrecruzan dos moléculas EPO-R
mediante la unión a los restos 49 a 78 representan la invención.
Estas moléculas son anticuerpos o fragmentos bivalentes de los
mismos, que tienen la propiedad de reticular los dos receptores EPO
mediante la unión a los restos contenidos en la región entre los
restos 49 y 78, dando con ello como resultado la dimerización y
activación del receptor EPO.
Los receptores EPO mencionados en esta
descripción son preferiblemente receptores EPO de mamífero, y en
una realización particularmente preferida, son el receptor EPO
humano. Se entiende que los análogos de los receptores EPO humanos
también se incluyen en la invención. Estos análogos se construyen
mediante inserciones, deleciones, extensiones o sustituciones de
aminoácidos en la secuencia del receptor EPO humano. Los ejemplos
de análogos de EPO-R se han descrito en la patente
US 5,292,654 de Yoshimura et al., mientras que la
sustitución de un resto cisteína en la posición 129 de la secuencia
de aminoácidos de EPOR da como resultado una EPOR constitutivamente
activada. En general, los análogos de EPO-R que
tienen cambios en los aminoácidos en otras regiones diferentes de
los dominios de unión a anticuerpos necesarios para la activación
que mantienen la estructura secundaria y terciaria del receptor EPO
humano, pueden ser reconocidos por los anticuerpos de la presente
invención. Se ha demostrado que Mab 71 interacciona con un péptido
sintético de restos 49 a 78 del EPO-R humano (véase
el ejemplo 6). Por tanto, los análogos de EPO-R que
tienen cambios en restos aminoácidos diferentes de los que se
encuentran en las posiciones 49 a 78, y que mantienen la estructura
secundaria y terciaria del receptor EPO humano, es probable que
sean reconocidos por Mab 71. La numeración de los restos
aminoácidos en el polipéptido EPOR humano, tal como se utiliza en
la presente, comienza con la prolína en la posición 1, que es el
resto amino-terminal después de la escisión del
péptido señal de 25 aminoácidos.
Los anticuerpos de la invención se unen a un
epítopo sobre un receptor EPO que abarca los restos aminoácidos 49
a 78 en la EPO-R humana. Por tanto, es probable que
Mab 71 reconozca un epítopo sobre EPO-R que es
definido, en todo o en parte, por esta secuencia. Tal como se
utiliza en la presente, la expresión "epítopo" hace referencia
a la región de un EPO-R unida por un anticuerpo, y
esta unión evita la asociación de un segundo anticuerpo a un
EPO-R.
La invención también proporciona anticuerpos
policlonales, y anticuerpos monoclonales y sus fragmentos
bivalentes. Los fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos
que activan un receptor EPO uniéndose a un epítopo de un péptido
que abarca los restos aminoácidos 49 a 78 de la
EPO-R. También se incluyen anticuerpos humanizados,
de forma típica producidos mediante métodos recombinantes, en los
cuales las secuencias humanas comprenden todo o parte de un
anticuerpo de la invención. Los ejemplos de anticuerpos humanizados
incluyen anticuerpos quiméricos o injertados con CDR (patentes US
4,816,567 y 5,225,539). Los anticuerpos de la invención también
pueden tener unido un marcador detectable. Este marcador puede ser
fluorescente (p. ej., isotiocianato de fluoresceína, FITC),
enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano), de afinidad (p. ej.,
biotina) o isotópico (p. ej., ^{125}I).
También se incluyen en la invención las líneas
celulares de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la
invención. La generación de líneas celulares de hibridoma que
producen anticuerpos monoclonales contra el EPO-R
humano se describe en el ejemplo 3. La línea celular de hibridoma
que produce el Mab 71 se ha depositado en la American Type Culture
Collection, Rockville, MD, el 26 de julio de 1994, con número de
registro HB11689. La línea celular de hibridoma que produce el Mab
73 se ha depositado en la American Type Culture Collection,
Rockville, MD, el 26 de julio de 1994, con número de registro
HB11690.
Los anticuerpos de la presente invención
resultan útiles para diagnosticar la anemia y otras enfermedades
caracterizadas por un EPO-R disfuncional. En una
realización, un método para detectar en una muestra biológica un
receptor EPO que es capaz de ser activado comprende las etapas de:
(a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que activa un
receptor EPO; y (b) detectar la activación del receptor por el
anticuerpo. Las muestras biológicos incluyen especímenes de
tejidos, células intactas o sus extractos. Los anticuerpos pueden
utilizarse como parte de un kit de ensayo de diagnóstico para
detectar la presencia de receptores EPO en una muestra biológica.
Estos kits de ensayo emplean anticuerpos que tienen unido un
marcador para permitir la detección. Los anticuerpos resultan
útiles para identificar receptores normales o anómalos. La
presencia de receptores anómalos en una muestra biológica puede ser
indicativa de trastornos como la anemia de Diamond Blackfan, en la
cual se cree que el receptor EPO es
disfuncional.
disfuncional.
Los anticuerpos de la invención resultan útiles
para tratar trastornos que se caracterizan por niveles bajos de
glóbulos rojos. Se incluyen en la invención los métodos para
modular la actividad endógena de un receptor EPO en un mamífero,
preferiblemente los métodos para aumentar la actividad de un
receptor EPO. En general, cualquier trastorno que puede tratarse
con eritropoyetina, como la anemia, también puede tratarse con los
anticuerpos de la invención. Los anticuerpos terapéuticos se
administran en una cantidad y mediante una vía de administración
que son las apropiadas para la naturaleza y gravedad del trastorno
que se está tratando, y un experto en la técnica puede
determinarlas. Preferiblemente, la administración se realiza
mediante inyección subcutánea, intramuscular o intra-
venosa.
venosa.
La invención suministra una composición
farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de
un anticuerpo que activa un EPO-R, junto con un
adyuvante farmacéuticamente aceptable, y el adyuvante puede
seleccionarse de uno o más diluyentes, vehículos, conservantes,
emulgentes, antioxidantes y/o estabilizantes. Una "cantidad
terapéuticamente eficaz", tal como se usa en la presente, hace
referencia a la cantidad de anticuerpo que proporciona un efecto
terapéutico para un trastorno y un régimen de administración
concretos. En esta invención, el efecto terapéutico es la
estimulación de la producción de glóbulos rojos, según se pone de
manifiesto por un aumento del hematocrito en el paciente que se
está tratando. En una realización preferida, los anticuerpos son
anticuerpos humanizados o humanos, que pueden prepararse usando
procedimientos conocidos por un experto en la técnica. Los
adyuvantes farmacéuticamente aceptables son conocidos por los
expertos, y se analizan en profundidad en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, A.R. Gennaro, ed. Mack,
Easton, PA (1990).
Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar
mejor la invención, pero no se considera que limiten su
alcance.
Utilizando un clon que contiene el receptor de
eritropoyetina humano según se describe en Jones et al.,
supra, se empleó la técnica de PCR para obtener un clon para la
expresión del receptor de eritropoyetina humano soluble (sHu
EPOR). Los cebadores para la amplificación PCR del receptor de
eritropoyetina humano son:
cebador 5': | |
CTC CAA GCT TGC CGT CAC CAT GGA CCA CCT CGG GGC GTC CCT | (SEQ. ID No:1), y |
cebador 3': | |
CAG GTC TAG ATT ACT AGG GAT CCA GGT CGC TAG GC | (SEQ. ID NO:2) |
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando
2,5 ng de un plásmido que contenía el EPOR humano, 5 pmol de cada
uno de los anteriores cebadores oligonucleótidos, Tris HCl 10 mM
(pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de cada dNTP, y
1 unidad de Taq-polimerasa. La amplificación se
realizó durante 5 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 50°C, 1
minuto a 72°C, seguidos de 20 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1
minuto a 55°C, 1 minuto a 72°C. El DNA se purificó mediante el
tránsito a través de una columna de exclusión de tamaño
G-50 (Boehringer Mannheim Corp.), después se digirió
con Hind III y XbaI, y se ligó en el vector de expresión
pDSR\alpha2 (DeClerck et al., J. Biol. Chem., 266,
3893 (1991)), que también se había digerido con Hind III y XbaI.
Los clones que contenían el inserto deseado se verificaron mediante
un análisis de la secuencia de DNA.
El clon d40EPOR se preparó mediante PCR a partir
de un clon de EPOR humano de longitud completa (ver antes). El
carboxi-terminal de d40EPOR es tyr 467, el resultado
de añadir un codón de terminación dentro del cebador. Los cebadores
para la amplificación PCR son:
cebador 5': | |
5'-CTC CAA GCT TGC CGT CAC CAT GGA CCA CCT CGG GGC GTC CCT-3' | (SEQ. ID NO:1); y |
cebador 3': | |
5'-AGG TCG ACT ACT AGT AGT CAG TTG AGA-3' | (SEQ. ID NO:3) |
La amplificación PCR utilizó
pfu-polimerasa en tampón pfu 2 (Stratagene, La
Jolla, CA). Las condiciones de reacción son: 1 ciclo a 96°C durante
30 segundos, 45°C durante 1 minuto, 72°C durante 1 minuto; 25
ciclos a 96°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto, 72°C durante
2 minutos. Entonces se llevó a cabo una incubación final a 72°C
durante 5 minutos. Los productos de reacción se separaron mediante
una electroforesis en gel de agarosa, y la banda de aproximadamente
1,3 Kb se aisló utilizando un kit de ensayo de gen definido (BIO
101, Vista, Ca.). El fragmento purificado se ligó en PCR II (kit de
ensayo de clonación TA, Invitrogen, San Diego, CA). Se
identificaron los recombinantes mediante análisis de restricción y
se secuenciaron para confirmar que los insertos deseados estaban
presentes. Se aisló un fragmento HindIII-SalI como
se ha descrito previamente, y se ligó en un vector pDSR\alpha2
aislado que antes se había cortado con HindIII y SalI. El vector
resultante, pDSR\alphaEPORd40, se utilizó para la expresión en
células CHO.
La expresión del plásmido
pDSR\alpha2-EPOR-X contiene
secuencias que codifican los aminoácidos del EPOR humano Met
1-Pro 249, como se demuestra en Jones et al.,
supra. El plásmido pDSR\alphaEPORd40 contiene secuencias que
codifican Met 1-Tyr 467. Diez microgramos de cada
plásmido se introdujeron independientemente en células CHO mediante
transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al.,
Cell, 11, 233 (1977)). Las colonias individuales se
seleccionaron basándose en la expresión del gen de la
dihidrofolato-reductasa a partir del vector. La
expresión de EPOR humano se controló mediante hibridación de RNA
(Hunt et al., Exp. Hematol., 19: 779 (1991)) y mediante
inmunotransferencia Western utilizando un anticuerpo purificado por
afinidad. Las líneas celulares que eran positivas en estos ensayos
se seleccionaron para su posterior expansión. Las líneas celulares
se adaptaron a metotrexato (Mtx) 30 nM para estimular la
amplificación de la expresión de EPO-R.
La generación de medios condicionados que
contienen EPOR humano soluble se realizó en botellas giratorias y
en un biorreactor de fibra hueca. Las botellas giratorias se
inocularon con 2 x 10^{7} células en 200 ml de medio de
crecimiento (DMEM:F12 de Ham (1:1) suplementado con aminoácidos no
esenciales (NEAA), Mtx 30 nM y suero bovino fetal al 5% (FBS)
(reactivos de GIBCO, Grand Island, NY). Después de alcanzar la
confluencia en 3-4 días, el medio se sustituyó con
200 ml de DMEM:F12 de Ham, NEAA, Mtx 30 nM sin suero. El medio
condicionado se recogió después de 6-7 días y se
sustituyó por medio exento de suero fresco. Se recogió una segunda
y una tercera recolección.
Se inoculó un cartucho de biorreactor Cell Pharm
con 5 x 10^{8} células en medio de crecimiento (como
anteriormente) suplementado con 5 ug/ml de gentamicina. El pH se
mantuvo a 7,3. Comenzando en el día 12 después de la inoculación,
las células se fueron retirando del suero para generar un medio
condicionado exento de suero. La recolección del medio condicionado
comenzó el día 17.
Se realizaron cuatro preparaciones diferentes de
EPOR humano recombinante soluble. En la primera preparación, se
acopla Sepharose 6B activado con Epoxi (Pharmacia, Piscataway, NJ)
con eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO), esencialmente
según las instrucciones del fabricante. Se añade 218 mg de rHuEPO
en 4,5 ml de ZnCl_{2} 32 mM a 7,2 g de Sepharose 6B activado con
Epoxi previamente hidratado y lavado con H_{2}O. Esta suspensión
se valora hasta pH 10,8, luego se mezcla durante la noche a
temperatura ambiente. Cualquier grupo reactivo remanente entonces
se bloquea mediante la adición de etanolamina hasta una
concentración final de 1 M y se mezcla durante 4 horas a
temperatura ambiente. Las posteriores etapas se llevan a cabo a 8°C
\pm 2°C. La resina acoplada (Epoxi-EPO) se
introduce en una columna y se lava con ciclos alternantes de NaCl
0,5 M/HOAc 0,1 M, pH 4, y NaCl 0,5 M/borato 0,1 M, pH 8. La columna
se equilibra con NaCl 140 mM/Tris 10 mM, pH 7,6 (TBS). Se carga con
1560 ml del medio condicionado producido en las botellas giratorias
a partir de células CHO que expresan EPO-R soluble
(sHuEPO-R). Después de finalizar la introducción,
la columna se lava con NaCl 300 mM/Tris 10 mM, pH 7,6, después el
sHuEPOR unido se eluye con NaCl 1 M/urea 3M/Tris 10 mM, pH 7,6. Dos
picos de absorción a UV280 eluyen con este tampón. El segundo pico
que eluye, que contiene el sHuEPOR, se reúne y se diluye 20 veces
con H_{2}O. La reunión diluida entonces se carga en una columna
precargada con 1 ml de Mono Q (Pharmacia) y se eluye con un
gradiente NaCl en Tris 10 mM, pH 7,6. Eluye un único pico, que se
reúne, se divide en partes alícuotas y se conserva congelado
a -80°C.
a -80°C.
En la segunda preparación, se prepara una
columna Epoxi-EPO mayor. Se hidratan 20,4 g de
Sepharose 6B activada con Epoxi y se lava con H_{2}O, después con
acetona y por último con formamida al 50% en H_{2}O, pH 10, 6. Se
valoran 729 mg de rHuEPO en 15 ml de H_{2}O hasta pH 10,6, se
añade a la resina y se mezcla durante la noche a temperatura
ambiente. Cualquier grupo reactivo remanente entonces se bloquea
mediante la adición de etanolamina hasta una concentración final
de 1 M y se mezcla durante 140 minutos a temperatura ambiente. Las
posteriores etapas se llevan a cabo a 8°C \pm 2°C. La
Epoxi-EPO se introduce en una columna y se lava con
urea 3 M/NaCl 750 mM/Tris 10 mM, pH 7,6, y después la columna se
equilibra con TBS. Se mezclan 100 ml de medio condicionado
producido en el biorreactor a partir de células CHO que expresan
sHuEPOR, con 2 ml de Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Se incuba
durante 30 minutos a 8°C \pm 2°C con agitación frecuente, después
se filtra a través de un filtro de tapón de botella de nitrato de
celulosa de 0,45 micras (Corning). El filtrado se carga en la
columna Epoxi-EPO, se lava con NaCl 250 mM/Tris 10
mM, pH 7,6, después se eluye con urea 3 M/NaCl 750 mM/Tris 10 mM,
pH 7,6. El pico eluido se reúne y se diluye 20 veces con H_{2}O.
La reunión diluida entonces se carga en una columna de 15 ml de Q
Sepharose Fast Flow y se eluye con un gradiente de NaCl en Tris 10
mM, pH 7,6. El único pico que eluye se reúne, se divide en partes
alícuotas y se conserva congelado a -80°C.
En la tercera preparación, se emplea la misma
columna Epoxi-EPO utilizada en la preparación 2. Se
mezclan 850 ml del medio condicionado producido en botellas
giratorias a partir de células CHO que expresan
sEPO-R, con 1,7 ml de Q Sepharose Fast Flow. Se
procesa de la misma manera que en la preparación 2.
En la cuarta preparación, 7,25 l del medio
condicionado producido en el biorreactor a partir de células CHO que
expresan sHuEPOR, se mezclan con 110 ml de Q Sepharose Fast Flow.
Se incuba durante 1 hora a 8°C \pm 2°C con agitación frecuente,
después se filtra a través de un filtro de tapón de botella de
nitrato de celulosa de 0,45 micras. El filtrado entonces se diluye
con 7,25 1 de H_{2}O y se carga en una columna de 770 ml de Q
Sepharose Fast Flow equilibrada con Tris 20 mM, pH 7,6. La columna
se eluye con un gradiente de NaCl en Tris 20 mM, pH 7,6. Se reúnen
las fracciones que contienen cantidades significativas de sHuEPOR,
basándose en un análisis SDS-PAGE. Se añade
(NH_{4})_{2}SO_{4} sólido a la reunión hasta una
concentración final de 1,2 M, después se filtra a través de un
filtro de tapón de botella de nitrato de celulosa de 0,45 micras.
El filtrado se carga en una columna de 60 ml de Phenyl Sepharose 6
(bajo sub, Pharmacia) y se eluye con un gradiente descendiente de
(NH_{4})_{2}SO_{4} desde 1,2 M a 0 M en Tris 20 mM, pH
7,6. El principal pico de elución se reúne y se hace 2,4 M en
(NH_{4})_{2}SO_{4} para que precipite el sHuEPORt. El
sHuEPOR precipitado se recoge mediante centrifugación, se resuspende
con H_{2}O y se valora hasta pH 7,9 con Tris\cdotHCl. La
disolución resultante se filtra a través de un filtro de nitrato de
celulosa de 0,45 micras, se divide en partes alícuotas y se
conserva congelado a -80°C.
En primer lugar se llevaron a cabo EIA para
determinar las valoraciones de anticuerpos (Ab) séricos de animales
individuales, y después para la investigación de los hibridomas
potenciales. Se revistieron placas de EIA/RIA de microvaloración de
96 pocillos de fondo plano y elevada unión (Costar Corporation,
Cambridge, MA) con sHuEPOR purificado a 5 \mug por ml de tampón
de carbonato-bicarbonato, pH 9,2 (Na_{2}CO_{3}
0,015 M, NaHCO_{3} 0,035 M). Se añadieron 50 \mul de Ab a cada
pocillo. Las placas entonces se cubrieron con una película de
acetato (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) y se incubaron a
temperatura ambiente sobre una plataforma oscilante durante 2
horas, o durante la noche a 4°C. Se utilizó el sHuEPOR lote n° 1
después del primer y segundo refuerzo, y se utilizó el lote n° 2
después del tercer refuerzo. Se utilizaron los sHuEPOR lotes n° 3 y
4 para la investigación de los hibridomas. Las placas se bloquearon
durante 30 minutos a temperatura ambiente con 250 \mul por pocillo
de una disolución de BSA al 5% preparada mezclando 1 parte de
diluyente BSA/concentrado de disolución de bloqueo (Kirkegaard and
Perry Laboratories, Inc.) con 1 parte de agua desionizada
(dH_{2}O). Después de eliminar la disolución de bloqueo, se añade
a cada pocillo 50 \mul de diluciones en 2 veces de suero (desde
1:400 a 1:51.200), o sobrenadantes de cultivo de tejidos de
hibridoma. El diluyente del suero era BSA al 1% (diluyente BSA al
10%/concentrado de disolución de bloqueo diluida 1:10 en disolución
salina tamponada con fosfato de Dulbecco, D-PBS;
Gibco BRL, Grand Island, NY), mientras que los sobrenadantes de los
hibridomas se ensayaron sin diluir. En el caso del ensayo de los
hibridomas, un pocillo se mantuvo como conjugado control, y un
segundo pocillo como control Ab positivo. Las placas de nuevo se
incubaron a temperatura ambiente con oscilación durante 1 hora, y
después se lavaron 4 veces utilizando 1 x preparación de disolución
de lavado, 20 x concentrado (Kirkegaard and Perry Laboratories,
Inc.) en dH_{2}O. Entonces se incubó durante 30 minutos en cada
pocillo Ab secundario conjugado con peroxidasa de rábano de cabra
específico anti-cadena pesada y ligera de IgG de
ratón (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) diluido
1:1000 en BSA al 1%. Las placas se lavaron como antes, se secaron
con papel secante y se añadió sustrato de componente único de
peroxidasa ABTS (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.). Se leyó
la absorbancia a 405 nm para cada pocillo utilizando un lector de
microplacas EL310 (Bio-tek Instrments, Inc.,
Winooski, VT). Se calculó la valoración semimáxima de anticuerpo
sérico mediante la representación del log_{10} de la dilución de
suero frente a la densidad óptica a 405 nm, y después se extrapoló
en el punto del 50% de máxima densidad óptica obtenida en ese
suero. Se consideró que los hibridomas eran positivos si la
densidad óptica obtenida era mayor que 5 veces el efecto de
fondo.
Diez ratones Babl/c de 4,5 semanas (Charles
Rivers Laboratories, Wilmington, MA) se inyectaron por vía
subcutánea con 50 \mug de sHuEPOR; lote 1; antígeno, emulsionados
en adyuvante de Freund completo (CFA al 50% v/v; Difco
Laboratories, Detroit, MI). Estos animales recibieron un refuerzo
(por vía subcutánea) 4 semanas después con 25 \mug de antígeno
(Ag; lote 1) preparado de forma similar utilizando adyuvante de
Freund incompleto (ICFA; Difco Laboratories, Detroit, MI). Los
ratones se sangraron a través de la cola 9 días después y se
determinaron las valoraciones de anticuerpos (Ab) séricos mediante
un ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (EIA). A medida que
la valoración semimáxima de cada ratón aumentaba por encima de
5000, los animales individuales se fueron seleccionando para la
preparación de los hibridomas. Los tres animales (n° 7, 8 y 9) que
se utilizaron para generar los híbridos de interés (n° 71A y 73A)
requirieron más refuerzos a las 5 semanas, y de nuevo a las 29
semanas utilizando 12,5 \mug de Ag (lote 1) y 25 \mug de Ag
(lote 2), respectivamente. Estos refuerzos se llevaron a cabo de
la misma manera que el refuerzo inicial; es decir, como una emulsión
en ICFA al 50% vol/vol. Se siguieron controlando las valoraciones
de Ab séricos 9 días después de cada refuerzo. Las valoraciones
finales de estos ratones antes de la fusión eran de 5026, 6842 y
12,945 para los animales 7, 8 y 9, respectivamente.
Se inyectó a los animales 7, 8 y 9 por vía
intravenosa 25 \mug de sHuEPOR (lote n° 3), 8 semanas después del
refuerzo final. Cuatro días después, los ratones se sacrificaron
con dióxido de carbono y se recogieron los bazos bajo condiciones
estériles con 25 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco que
contenía 200 U/ml de penicilina G, 200 \mug/ml de sulfato de
estreptomicina, y glutamina 4 mM (2 x P/S/G DMEM). Se cortó el
exceso de tejido graso de los bazos y después se enjuagaron en 3
placas de 2 x P/S/G DMEM limpio. Después se trasladaron a una bolsa
estomaguera estéril (Tekmar, Cincinnati, OH) que contenía 10 ml de
2 x P/S/G DMEM, y se rompieron hasta conseguir una suspensión de
células separadas con el mezclador de laboratorio estomaguero 80
(Seward Laboratory UAC House; Londres, Reino Unido). A medida que
las células se liberaban de la cápsula del bazo hacia el medio,
iban siendo retiradas de la bolsa y se las hacía pasar a través de
un filtro de células de malla de nailon de 70 \mum (Becton
Dickinson and Company; Lincoln Park, NJ). Se introdujo medio fresco
en la bolsa y el proceso continuó hasta que se liberó el contenido
en células enteras del bazo. Estos esplenocitos se lavaron 3 veces
mediante centrifugación a 225 x g durante 10 minutos. En la primera
fusión, se usaron los esplenocitos del animal n° 9; en la segunda,
se reunieron los de los animales n° 7 y 8.
Al mismo tiempo, se lavaron de manera similar
cultivos en fase logarítmica de células de mieloma de ratón
Sp2/0-Ag14 (disponibles en la American Type Culture
Collection, Rockville, MD, con el número de registro CRL 1581)
cultivadas en medio completo (DMEM, suero bovino fetal al 10%,
glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato de
sodio 1 mM, y tampón Hepes 10 mM; Gibco Laboratories, Inc., Grand
Island, NY). A partir de esta población de mieloma, se cogieron 4 x
10^{7} células (fusión 1), u 8 x 10^{7} células (fusión 2), se
mezclaron con la suspensión de esplenocitos y se volvieron a
sedimentar. Los medios se aspiraron del sedimento celular, y 2 ml
de polietilenglicol (PEG de peso molecular 1500; Boehringer
Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) se mezclaron con suavidad
en el medio durante 1 minuto para la fusión 1 de 3,5 ml de PEG,
para la fusión 2 a 37°C. Después se añadió lentamente un volumen
igual de 2 x P/S/G DMEM. Se dejaron las células en reposo a 37°C
durante 2 minutos, después se añadieron 9 ml más de 2 x P/S/G DMEM.
Las células se volvieron a poner a 37°C durante 4 minutos.
Por último, se añadieron 30 ml de 2 x P/S/G DMEM
a la suspensión celular, y las células se sedimentaron mediante
centrifugación. El medio se aspiró del sedimento y las células se
resuspendieron con suavidad en aproximadamente 56 ml (fusión 1) o
74 ml (fusión 2) de medio completo que contenía 100 U/ml de
penicilina G y 100 \mug/ml de sulfato de estreptomicina. Las
células se distribuyeron en 10 placas de cultivo de tejidos de
fondo plano de 96 pocillos (Becton Dickinson Labware; Lincoln Park,
NJ) mediante gotas individuales con una pipeta de 5 ml. Las placas
se incubaron en condiciones humidificadas a 37°C, CO_{2} al 5%,
durante la noche. Al día siguiente se añadió un volumen igual de
medio de selección a cada pocillo. La selección consistía en
hipoxantina 0,1 mM, aminopterina 4 x 10^{-4} mM, y timidina 1,6 x
10^{-2} mM en medio completo. Las placas de fusión se incubaron
durante 7 a 10 días con 2 cambios de medio durante este tiempo;
después de cada cambio de fluido se utilizó el medio de selección
HAT. Se recogieron los sobrenadantes de los cultivos de tejidos de
cada pocillo que contenía un híbrido, y se ensayaron mediante EIA
para detectar reactividad de anticuerpos específicos contra
sHuEPOR. Los 96 pocillos que dieron positivo en EIA se sometieron a
investigaciones posteriores.
Se utilizaron transferencias por puntos de
sHuEPOR reducido (lote n° 4) como segundo método de investigación
para los hibridomas EIA-positivos. Se montó el
aparato de microvaloración SF de transferencia por puntos
(Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA) según el
manual de instrucciones; se emplearon membranas de nitrocelulosa (9
x 12 cm; Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA).
Se preparó primero el antígeno hirviendo durante 5 minutos bajo
condiciones reductoras con 2-mercaptoetanol (al 5%
vol/vol; Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA)
en disolución salina tamponada con Tris (TBS; Tris 10 mM, pH 7, 5,
NaCl 154 mM, azida de Na al 0,01% p/v). Se cargaron veinticinco ng
de sHuEPOR (lote n° 4) en cada pocillo, y se aspiraron a través de
la membrana de nitrocelulosa para su unión. Los pocillos se
llenaron con 250 \mul de disolución Blotto-Tween
(disolución de bloqueo; leche en polvo desnatada al 2% p/v, Tris 50
mM, pH 7,5, NaCl 25 mM, EDTA 0,1 mM, Tween 20 al 0,09% v/v,
antiespumante A al 0,01% v/v) y se incubó a temperatura ambiente
durante 30 minutos. La disolución de bloqueo se aspiró de los
pocillos y el procedimiento se repitió una segunda vez para
asegurar el bloqueo completo de los sitios no específicos de la
membrana. Esto fue seguido de 3 lavados a través de la membrana
con D-PBS que contenía monolaurato de
polioxitetilensorbitán al 0,1% v/v (Tween-20;
Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA). Después
se añadieron 95 \mul de medio condicionado de hibridoma
EIA-positivo a cada pocillo y se incubó durante 45
minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 x con
TBS-Tween (Tris 20 mM, pH 7, 5, NaCl 50 mM, Tween 20
al 0,02% v/v) y 2 x con TBS-Tween (Tris 20 mM, pH
7,5, NaCl 0,5 M, Tween 20 al 0,09% v/v) con 250 \mul por lavado,
aspirando a través de la membrana después de cada adición. Se
incubó en cada pocillo a temperatura ambiente durante 45 minutos
100 \mul de anticuerpo secundario conjugado con HRP de cabra
específico anti-cadena pesada y ligera de IgG de
ratón (diluido 1:1000 en TBS-Tween; Boehringer
Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN). Las membranas se lavaron
como antes, se retiraron del aparato de transferencia, se
introdujeron en reactivo quimioluminiscente potenciado preparado
(reactivo ECL; Amersham Life Sciences, Corporation; Arlington
Heights, IL) y se expuso a una película X-OMAT AR
(Kodak Scientific Imaging, Rochester, Nueva York). Quince segundos
después, se retiró la película de los casetes de película y se
reveló. Se asignó una puntuación desde 3+ a 0 a cada pocillo
basándose en la intensidad de puntos para los sobrenadantes de
hibridoma individuales.
Se utilizó un análisis de interacción
bioespecífico en tiempo real (BIA, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala,
Suecia) basado en la resonancia de plasma de superficie (SPR)
(Fiagerstam et al., J. Mol. Recognition, 3, 208
(1990); Malmbory et al., Scand. J. Immunol., 35, 643
(1992)) para la investigación de anticuerpos monoclonales
ELISA-positivos.
El HuEPOR soluble preparado como se describe en
los ejemplos 1 y 2 se acopló covalentemente al chip detector CM5 a
través del grupo amino primario. La inmovilización se llevó a cabo
con un flujo de 5 ul/min en HBS (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM,
EDTA 3,4 mM, tensioactivo P-20 BIAcore al 0,05%). La
matriz carboxilada del chip detector se activó en primer lugar con
una inyección de 40 ul de una mezcla de EDC
(N-etil-N-(dimetilaminopropil)carbodiimida
400 mM en agua, Pharmacia Biosensor AB) y NHS
(N-hidroxisuccinimida 100 mM en agua, Pharmacia
Biosensor AB) 1:1. Se inyectaron 65 ul de EPO-R
soluble (50 ug/ml en acetato de Na 10 mM, pH 4,0) para
inmovilizarlo sobre el chip detector. El exceso de grupos reactivos
del chip detector se desactivó con una inyección de 50 ul de
etanolamina (Pharmacia Biosensor AB).
Cada ciclo de análisis incluía una inyección de
20 ul de sobrenadante de hibridoma, seguida de una inyección de 10
ul de HCl 10 mM para la regeneración del chip. La respuesta SPR se
mide en unidades de resonancia (RU). Para la mayoría de las
proteínas, 1000 RU se corresponde con una concentración en
superficie de aproximadamente 1 ng/mm^{2}. Los resultados de la
investigación de los 96 pocillos que eran
EIA-positivos aparecen en la tabla 1. En estos
experimentos, el efecto de fondo es de forma típica aproximadamente
20 RU. La unión a EPOR es significativa a 50 RU y por encima de
este valor.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó el medio de cultivo de tejidos
condicionado por hibridomas que segregaban los anticuerpos
indicados, con los ensayos indicados. Los sobrenadantes que
contenían todos los anticuerpos mostrados produjeron una señal
positiva en los ensayos ELISA. +++, ++, + indican una respuesta
positiva; +++ indica los que tienen mayor efecto.
- indica una respuesta menor o igual que la
respuesta del medio control. NE indica que las muestras no se
ensayaron. ¿ indica que no se pudo asignar una respuesta a la
muestra.
(1) Los anticuerpos 1-61 son de
los ratones número 7 y 8. Los anticuerpos 62-96 son
del ratón número 9.
(2) Unidades de respuesta de Mab utilizando el
chip BIAcore con sHuEPOR unido.
(3) La competencia en BIAcore era contra
anti-sHuEPOR Mab 1G2. El sHuEPOR unido a un chip
detector se incubó con 1G2, y después se determinó el efecto sobre
la unión de Mab comparada con la unión a EPOR no preincubado con
1G2. Los anticuerpos cuya unión resultó completamente bloqueada
(80-100%) son A. Los anticuerpos cuya unión resultó
bloqueada 50-80% son C. Los anticuerpos cuya unión
resultó bloqueada en menos de 50% son B.
(4) Se muestran los valores para los anticuerpos
que dieron a las células una fluorescencia media mayor que el
control (12,73). "-" indica los anticuerpos con una
fluorescencia media menor o igual que el control.
(5) Inhibición de la captación de ^{3}H por
células UT7-EPO. Se incubaron con las células 30
munidades de EPO y cantidades variables de anticuerpo. Después de
una incubación durante la noche, las células se marcaron mediante
pulsos con ^{3}H-timidina y se determinó la
cantidad de cuentas captadas. Se definió una respuesta positiva
como la respuesta que presentaba una disminución progresiva con
cantidades crecientes de anticuerpo.
(6) Estimulación de la captación de ^{3}H por
células UT7-EPO. Se incubaron con las células
cantidades variables de anticuerpo. Después de una incubación
durante la noche, las células se marcaron mediante pulsos con
^{3}H-timidina y se determinó la cantidad de
cuentas captadas. Se definió una respuesta positiva como la
respuesta que presentaba un aumento progresivo en la incorporación
con cantidades crecientes de anticuerpo.
(7) La inhibición se produjo a unas
concentraciones mayores que las necesarias para la activación.
El chip detector que estaba inmovilizado con
sHuEPOR podía saturarse mediante una inyección de 65 \mul de
sobrenadante de hibridoma 1G2. El 1G2 es un anticuerpo monoclonal
generado contra sHuEPOR utilizando procedimientos descritos en el
ejemplo 3. Cada ciclo de análisis incluye inyecciones de 20 ul del
sobrenadante de hibridoma con y sin un epitopo saturado por la
inyección de 65 ul de 1G2. La proporción de la señal de unión en RU
de la inyección de 20 \mul después de la saturación, frente a la
señal de unión en RU de la inyección de 20 \mul solo, se define
como el porcentaje de bloqueo por 1G2. Los anticuerpos con un
bloqueo de 80-100% se denominan grupo A, los que
tienen un bloqueo menor que 50% son el grupo B, y los que tienen un
bloqueo de 50-80% son el grupo C. Los resultados
aparecen en la tabla 1.
Se ensayaron sobrenadantes de hibridoma
generados contra EPOR para determinar su unión al receptor EPO
sobre la superficie de células CHO transfectadas con
pDSR\alphaEPORd4O mediante un análisis FACS. Se construyeron
células CHO transfectadas con DNA que codifica el receptor d40 EPO
como se describe en el ejemplo 1. Las células CHO/EPOR se rascaron
de las placas de cultivo de tejidos y se resuspendieron como
células individuales en una disolución de PBS/BSA al 0,5%, y
después se distribuyeron en una placa de fondo redondo de 96
pocillos a aproximadamente 3 x 10^{5}/pocillo. La placa entonces
se colocó en una centrífuga a 1000 x g durante 5 minutos. Después
de la centrifugación, se retiró el sobrenadante de PBS/BSA y cada
una de las células sedimentadas se resuspendió en un medio control,
o en uno de los sobrenadantes de hibridoma EPOR. Las células se
incubaron a 4°C durante 1 hora. Después de la incubación, las
células se lavaron con PBS/BSA y después se resuspendieron en una
disolución de anticuerpo monoclonal de cabra
anti-ratón marcado con isotiocianato de
fluoresceína (FITC) (Southern Biotech, Birmingham, Ala.). Las
células se incubaron de nuevo a 4°C durante 1 hora, se lavaron y se
analizaron mediante FACS. De los 96 sobrenadantes ensayados, cinco
tenían una fluorescencia celular media mayor que el medio control
(ver tabla 1). El Mab 71 produjo el nivel mayor de fluorescencia,
seguido por Mab 74, 58, 73 y 87. Ninguno de los sobrenadantes
ensayados mostró una fluorescencia mayor que los valores
control.
control.
Se cebaron ratones Balb/c (Charles River
Laboratories, Wilmington, MA) de más de 5 semanas con
2,4,10,14-tetrametilpentadecano (Pristane; Sigma,
St. Louis, MO) de 7 a 10 días antes de la inyección de las líneas
celulares. Cada ratón recibió una única inyección intraperitoneal
de 0,5 ml; se inyectaron de 10 a 20 animales por cada línea celular
de la cual se iba a preparar el fluido de ascites.
Las líneas de hibridoma cultivadas en medio
completo hasta que se alcanzó la confluencia se lavaron una vez con
D-PBS, y después se contaron usando un
hemacitómetro Neubauer. Después cada ratón fue inyectado por vía
intraperitoneal con 107 células, y se les suministró pienso Rodent
Lab Chow y agua sin límite hasta que se desarrolló el fluido de
ascites. Los ratones se controlaron para detectar la máxima
formación de ascites, se sacrificaron con CO_{2} y se realizaron
punturas para la recogida del fluido usando una aguja 18G insertada
en la cavidad llena de fluido. El fluido se aclaró mediante
centrifugación a 225 x g durante 15 minutos, o durante 3 minutos en
una microcentrífuga (Eppendorf). Entonces se conservaron partes
alícuotas de 4 ml a -20°C hasta que se purificaron mediante
cromatografía en columna de proteína-A.
Se purificó la inmunoglobulina de 4 ml de fluido
de ascites, o de 10 ml de medio condicionado de hibridoma, mediante
cromatografía en columna de proteína-A. Se utilizó
el sistema de purificación de anticuerpos monoclonales
Bio-Rad II (MAPS II; Bio-Rad
Laboratories; Richmond, CA). Brevemente, 5 ml de suspensión de
proteína-A Affi-gel se introdujeron
en una columna de vidrio desechable de 1 x 10 cm. El gel de
proteína-A se lavó con aproximadamente 30 ml de
D-PBS, y después se preparó haciendo correr 20 ml de
tampón de unión (MAPS II Binding Buffer; Bio-Rad) a
través de la columna. Entonces se añadió el fluido de ascites o el
medio condicionado diluido 1:1 con el tampón de unión a la parte
superior de la columna, y se dejó que fluyese por ella. Después de
la unión de la inmunoglobulina a la proteína-A, se
desechó la fracción sin unir. La columna después se enjuagó para
eliminar la proteína sin unir con 30 ml de tampón de unión, para
producir una absorbancia a 280 nm menor que 0,01. La fracción que
contenía inmunoglobulina entonces se eluyó con tampón de elución
Bio-Rad, aproximadamente 30 ml. Esta fracción se
sometió a un intercambio de tampón durante la noche a 4°C mediante
diálisis contra 4 litros de D-PBS. La
inmunoglobulina equilibrada con PBS resultante se concentró
mediante centrifugación a 1700 x g en unidades Centricon
Concentrator (Amicon Inc., Beverly, MA).
La inmunoglobulina purificada con
proteína-A se volvió a fraccionar en sus 2 partes
componentes, la fracción cristalizable (Fc) y la fracción de unión
al anticuerpo (Fab), utilizando un kit de ensayo de preparación de
Fab Pierce ImmunoPure (Pierce Chemical Company, Rockford, IL). La
inmunoglobulina purificada con proteína-A se
dializó en tampón fosfato 20 mM/EDTA 10 mM a pH 7,0, y después se
concentró hasta aproximadamente 20 mg/ml. Se fraccionaron 10 mg de
inmunoglobulina. Un gel de papaína inmovilizada se enjuagó dos
veces con tampón de digestión que contenía 42 mg de cisteína en 12
ml de tampón fosfato, tal como se suministra. La muestra de
inmunoglobulina entonces se añadió al gel y se incubó a 37°C
durante la noche en un agitador giratorio. El Fab solubilizado se
separó de Fc y la inmunoglobulina sin digerir mediante purificación
con proteína-A; la fracción sin unir se recogió
como en la muestra Fab. Esta porción sin unir se dializó durante la
noche contra 4 litros de D-PBS a 4°C y se concentró
como antes.
Se prepararon péptidos sintéticos solapantes de
17 a 30 aminoácidos de longitud, que abarcaban los restos 1 a 224
del receptor EPO humano, en el que el resto 1 es prolina y el resto
224 es ácido aspártico. Los diez péptidos diferentes se solapaban
en seis aminoácidos en ambos extremos. Las secuencias de los
péptidos y su colocación dentro de la secuencia de aminoácidos del
EPO-R humano son como sigue:
SE-1 PPPNLPDPKFESKAALLAARGPEELCFTE |
(restos 1-30) |
SE-2A LLCFTERLEDLVCFWEEA |
(restos 25-42) |
SE-2B CFWEEAASAGVGPGNYSF |
(restos 37-54) |
SE-3 PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV |
(restos 49-78) |
SE-4 TARGAVRFWCSLPTADTSSFVPLELRVTAA |
(restos 73-102) |
SE-5 LRVTAASGAPRYHRVIHINEVVLLDAPVGL |
(restos 97-126) |
SE-6 DAPVGLVARLADESGHVVLRVLPPPETPMT |
(restos 121-150) |
SE-7 PETPMTSHIRYEVDVSAGNGAGSVQRVEIL |
(restos 145-174) |
SE-8 QRVEILEGRTECVLSNLRGRTRYTFAVRAR |
(restos 169-198) |
SE-9 FAVRARMEAPSFGGFWSAWSEPVSLLTPSDLD |
(restos 193-224) |
Se revistieron pocillos de poliestireno (Costar,
Cambridge, MA) con los anteriores péptidos EPO-R a
concentraciones de 100 \mug/ml, 20 \mug/ml y 0,8 \mug/ml,
respectivamente, en tampón de carbonato-bicarbonato
(Na_{2}CO_{3} 0,015 M, NaHCO_{3} 0,035 M, pH 9,2). La placa
se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas, y después durante
la noche a 4°C. El HuEPOR soluble se revistió a concentraciones de
10 \mug/ml, 2 \mug/ml, 0,4 \mug/ml y 0,08 ug/ml, como
controles positivos bajo las mismas condiciones. Después de
bloquear con BSA al 5% en PBS a temperatura ambiente durante 30
minutos, la placa se incubó con Mab 71 purificado, como se describe
en el ejemplo 5, a una concentración de 5 \mug/ml en BSA al 1% a
temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar con tampón
de lavado (Kirkegaard and Perry Labs, Inc.), la placa se incubó
con una dilución 1:1000 de anti-IgG de ratón de
cabra conjugado con peroxidasa de rábano (Boehringer Mannheim)
durante una hora a temperatura ambiente. La placa se lavó y se
reveló con disolución sustrato ABTS (Kirkegaard and Perry Labs,
Inc.). La colorimetría se llevó a cabo a 405 nm. Los resultados de
la unión de Mab a los péptidos sintéticos aparecen en la figura 1,
e indican que Mab 71 une cantidades significativas de péptido
SE-3 (restos aminoácidos 49 a 78 inclusive del
EPO-R humano), comparado con los otros péptidos
ensayados. Esto indica que Mab 71 se une a una región del
EPO-R humano que contiene o se solapa con los
restos 49 a 78.
Se ensayaron anticuerpos en medio condicionado
preparado como se ha descrito anteriormente, para comprobar su
capacidad para estimular la captación de
^{3}H-timidina por células
UT7-EPO (Komatsu et al., supra). Las células
UT7-EPO responden frente a EPO y expresan los
receptores EPO humanos sobre su superficie celular. Las células
UT7-EPO se cultivaron en medio de crecimiento (1 x
medio de Dulbecco modificado de Iscove con
L-glutamina, tampón HEPES 25 mM, y 3204 mg/1 de
bicarbonato de sodio, pero sin alfa-tioglicerol ni
beta-mercaptoetanol (GIBCO)/suero bovino fetal al
10% v/v/ disolución de
L-glutamina-penicilina-estreptomicina
al 1% v/v (Irvine Scientific)/1 unidad/ml de rHuEPO) hasta
aproximadamente 3 x 10^{5} células/ml. Las células se recogieron
mediante centrifugación (aproximadamente 500 x g), se lavaron dos
veces con disolución salina tamponada con fosfato, y se
resuspendieron a 5 x 10^{4} células/ml en medio de ensayo (1 x
medio RPMI 1640 sin L-glutamina
(GIBCO)/L-glutamina al 1%/ suero bovino fetal al
4%). Las muestras de ensayo o el patrón de EPO (rHuEPO), 100 \mul
diluidos en medio de ensayo al menos 5 veces, se añadieron a los
pocillos en una placa de microvaloración de 96 pocillos. Entonces se
añadieron 50 \mul de células (5000 células/pocillos), y las
placas se incubaron en una incubadora humidificada a 37°C y
CO_{2} al 5%. Después de 72 horas, se añadieron 50 \mul de
metil-^{3}H-timidina (1 mCi/ml;
20 Ci/mmol) diluida 1:100 en medio de ensayo. Las células se
incubaron durante 4 horas más a 37°C y 002 al 5%. Las células
marcadas se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio utilizando
un recolector de células PHD (Cambridge Technology Inc.) y agua
desionizada como disolución de lavado. Los filtros se enjuagaron
finalmente con 2-propanol, después se secaron y se
contaron en un contador de centelleo Beckman modelo LS6000IC.
Se ensayó medio condicionado de las placas de
cultivo de tejidos que contiene Mab anti-EPOR para
determinar su capacidad para estimular la proliferación, como se ha
descrito anteriormente. Se ensayaron muestras con varias
diluciones. Se define una respuesta positiva como la respuesta que
estimula la captación de timidina al menos 2 veces más que los
niveles de fondo, y también produce una estimulación decreciente a
medida que las muestras se diluyen. Tal como aparece en la tabla 1,
dos muestras de las 24 ensayadas produjeron una respuesta positiva
(Mab 71 y 73). Cuatro muestras pueden tener una actividad
estimulante débil (? en la tabla 1). El resto de las muestras no
mostraron un aumento significativo sobre el efecto de fondo. Un
suero policlonal del ratón utilizado para generar los anticuerpos
monoclonales también estimuló la captación de timidina. Esto
sugiere que el anticuerpo policlonal en este suero también es capaz
de estimular la proliferación de las células
UT7-EPO.
También se ensayaron los sobrenadantes para
determinar su capacidad para inhibir la estimulación inducida por
EPO de la captación de timidina por las células
UT7-EPO. Las células se incubaron con 25
munidades/ml de rHuEPO y cantidades variables de medio que contiene
anticuerpo. Se midió la captación de timidina como se ha descrito
anteriormente. Los resultados aparecen en la tabla 1. La mayoría de
los anticuerpos no se diferenciaban significativamente del medio
control. De los anticuerpos que inhibían la captación de timidina,
dos muestras (Mab 58 y 73) mostraron una inhibición definida,
mientras que tres muestras (Mab 65, 88 y 89) mostraron una posible
inhibición. El Mab 73 inhibía a las dosis más altas, pero en dosis
bajas estimula la captación de timidina por encima de los
valores
control.
control.
Los Mab 71 y 73 se purificaron como se describe
en el ejemplo 5. Se determinó la actividad proliferativa con
ensayos de captación de timidina por UT7-EPO como
se ha descrito en el ejemplo 7. Los Mab 71 y 73 estimulaban la
captación por las células UT7-EPO de una manera
dependiente de la dosis, tal como rHuEPO (véase la figura 2). La
actividad se redujo a dosis elevadas de Mab 71. Los picos en la
actividad estimulante se observaron a dosis de 1-2
\mug/ml para Mab 71, y a >100 \mug/ml para Mab 73. Un
anticuerpo control no neutralizante (Mab F12
anti-EPO) no produjo estimulación, lo cual sugiere
que la estimulación es específica para los anticuerpos del receptor
EPO.
Los anticuerpos contra el receptor EPO pueden
unirse a la misma región que se une EPO. Para ensayar esta
posibilidad, se llevaron a cabo ensayos de desplazamiento frío
utilizando células OCIM1. Las células OCIM1 son de origen humano y
se sabe que contienen receptores EPO sobre su superficie celular
(Broudy et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85, 6517
(1988)). Las células se cultivaron en medio de crecimiento OCIM1
(medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)/suero bovino fetal
al
10%/penicilina-estreptomicina-fungisona
al 1%) hasta aproximadamente 2-5 x 10^{5}
células/ml. Las células se recogieron mediante centrifugación, se
lavaron dos veces en tampón de unión (RPMI 1640/BSA al 1%/HEPES 25
mM, pH 7,3), después se resuspendieron en tampón de unión que
contenía azida al 0,1% y 10 \mug/ml de citocalisina B a
1-2 x 10^{7} células/ml. Las células (100 \mul)
en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos entonces se
incubaron con 10 \mul de muestra y 10 \mul de
^{125}I-EPO (Amersham de alta actividad
específica; 3000 Ci/mmol, 2 \muCi/ml) en una incubadora de
cultivo de tejidos humidificada a 37°C. Después de 3 horas, las
células se centrifugaron a través de aceite de ftalato (ftalato de
dibutilo/dinonilo 60:40 v/v) en tubos de valoración. Los tubos que
contienen células se congelaron rápidamente en un baño de hielo
seco-etanol, y el sedimento celular se cortó y
después se contó en un contador gamma automático Gammamaster LKB
1277.
La figura 3 muestra los resultados del
experimento de desplazamiento frío. Cantidades crecientes de
^{125}I-EPO fueron desplazadas de los receptores
EPO sobre las células, a medida que aumentaba la cantidad de rHuEPO
sin marcar añadido. De forma similar, el Mab 71 purificado como se
describe en el ejemplo 5 también desplaza cantidades crecientes de
^{125}I-EPO con cantidades crecientes de
anticuerpo. En este caso, se necesitó aproximadamente 4.000 veces
más de Mab 71 que de rHuEPO para desplazar cantidades equivalentes
de 125I-EPO. Por contraste, Mab 73 no mostró
indicaciones de desplazamiento en las dosis mayores, pero un Mab
anti-rHuEPO no neutralizante (F12) no desplazó de
forma significativa. Estos resultados indican que Mab no interfiere
con la unión de EPO a su receptor, pero Mab 71 y 73 sí. Este
resultado también indica que Mab 71 se une al receptor EPO y lo
activa uniéndose al sitio de unión de EPO o cerca de él.
\newpage
Se prepararon fragmentos del receptor EPO de Mab
71 como se describe en el ejemplo 5. Las preparaciones se
caracterizaron mediante una electroforesis en gel de SDS (Laemmli
et al., Nature, 227, 680 (1970), como aparece en la
figura 4. Las muestras se hirvieron en SDS al 2% que contenía
tampón de muestra con o sin 2-mercaptoetanol 0,7 M,
para distinguir las proteínas reducidas
(2-mercaptoetanol) de las no reducidas (sin
2-mercaptoetanol), y después se ensayó en geles de
SDS-acrilamida al 12,5%. Los geles se tiñeron con
azul de Coomassie para visualizar las proteínas. Se estimaron los
tamaños de las proteínas mediante la comparación de sus movilidades
con las movilidades de patrones de proteínas. Los Mab 71 y 73 se
separaron en sus cadenas ligera y pesada cuando se ensayaron bajo
condiciones reductoras. Las cadenas pesadas eran aproximadamente 52
kDa. La cadena ligera de Mab 73 era ligeramente más pequeña (28
kDa) que la de Mab 71 (28,5 kDa). Los fragmentos Fab también tenían
dos cadenas: de 28,3 y 27,3 kDa para Fab 71, y de 27,5 y 26,5 kDa
para Fab 73. Cuando estos fragmentos Fab se ensayan bajo condiciones
no reductoras, los tamaños de los Fab 71 y 73 eran aproximadamente
48 y 47 kDa, respectivamente. Esto indica que los fragmentos Fab
son monovalentes, el complejo tiene una cadena ligera y una cadena
pesada. Por contraste, las movilidades en geles de SDS no
reductores para Mab 71 y 73 indican que sus tamaños son
aproximadamente 200 kDa. Esto indica que estos Mab son bivalentes,
tienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.
Para comprobar si los fragmentos Fab 71
monovalentes pueden activar el receptor EPO, el Mab 71 y el
fragmento Fab 71 se incubaron con células UT7-EPO,
y se midió la captación de timidina como se describe en el ejemplo
7. Tal como aparece en la figura 5, rHuEPO y Mab 71 estimulan la
captación de timidina. Sin embargo, el fragmento Fab 71 monovalente
no. Un anticuerpo monoclonal control generado contra un receptor
no relacionado (Her2/neu) tampoco estimula la captación de
timidina. Esto indica que los anticuerpos deben ser bivalentes para
activar el receptor.
El hecho de que Mab 71 inhibe la unión de EPO a
los receptores EPO sugiere que el anticuerpo puede no activar el
receptor EPO en presencia de EPO. Para ensayar esta posibilidad, se
incubaron células UT7-EPO con 30 munidades/ml de
rHuEPO y cantidades variables de Mab 71, Fab 71 o Mab control
(generado contra Her2/neu) purificados. Se midió la captación de
timidina como antes descrito. Tal como aparece en la figura 6, Mab
71 y Fab 71 inhiben la captación de timidina en dosis elevadas. Sin
embargo, en dosis entre aproximadamente 30 y 3000 \mug/ml, el Mab
71 estimula la captación de timidina por encima de los niveles
estimulados por rHuEPO por sí solo. El Fab 71 y los anticuerpos
control no producían este efecto. Esto indica que Mab 71 y rHuEPO
pueden tener un efecto aditivo en la activación del receptor
EPO.
Para comprobar si el Mab 71 purificado puede
estimular la formación de células eritroides a partir de
precursores en sangre periférica, se llevó a cabo un ensayo eBFU.
Para purificar precursores de células eritroides, se linfoferizaron
según un protocolo convencional. Las células linfoferizadas (250
ml) se lavaron con 250 ml de disolución salina equilibrada de Hank
(HBSS). Las células se resuspendieron en HBSS y se separaron
mediante centrifugación de densidad a través de un gradiente
(Ficoll-paque) durante 30 minutos a 500 x g. Las
células de baja densidad (BD) se recogieron del gradiente, se
lavaron con 500 ml de HBSS y se resuspendieron en PBS suplementado
con albúmina de suero bovino al 0,5% y EDTA 5 mM a una
concentración de 5 x 10^{8} células/ml. Las células BD se
purificaron más utilizando un kit de ensayo de aislamiento de
células progenitoras CD34 (QBend/10), fabricado por Miltenyl
Biotech GmbH. Brevemente, las células se marcaron con un anticuerpo
monoclonal anti-CD34, entonces se unieron a
microsferas magnéticas según un protocolo. Las células marcadas
entonces se hicieron pasar a través de unas columnas de separación
MiniMacs prellenas, las columnas se lavaron y las células CD34+
entonces se eluyeron de la columna. Este proceso se repitió una vez
más para lograr una mayor pureza de las células CD34+. El ensayo
in vitro se realizó en las células CD34+ purificadas como
describen Iscove et al. (J. Cell. Physiol., 83, 309
(1974)) con las siguientes modificaciones. El medio de cultivo se
obtuvo en Gibco BRL (kit de ensayo de proliferación de células
progenitoras de médula ósea humanas; Grand Island, NY). Para lograr
placas duplicadas de muestras de 1 ml, sobre placas de cultivo de
tejidos de 35 x 100 mm, se preparó un exceso de 3 ml en tubos de
poliestireno estéril 17 x 100. Cada tubo recibió 2,5 ml de medio de
crecimiento de células progenitoras, 0,1 ml de células CD34+
(resuspendidas a 90.000 células/ml), 0,015 ml de factor de células
progenitoras (20 \mug/ml), y una combinación de una muestra y el
medio de dilución de células progenitoras igual a 0,385 ml. Los
tubos se agitaron en torbellino y se dejaron en reposo para que las
burbujas subieran. Entonces se establecieron partes alícuotas del
contenido utilizando una jeringa de 3 ml con una aguja 17 x
1-1/2. Las placas se incubaron a 37°C y CO_{2} al
10% en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada. Se
contaron las colonias eritroides (de color naranja a rojo) después
de 21 días. No se observaron colonias eritroides en las placas que
carecían de EPO o Mab 71. El rHuEPO (30 munidades/placa) produjo un
exceso de 400 colonias por placa. El Mab 71 también produjo
colonias eritroides. El pico de actividad se observó a
2-6 \mug/ml. Este resultado indica que el Mab 71
estimula la formación de colonias eritroides.
También se ensayó la actividad del Mab 71
purificado para determinar su capacidad para formar colonias
eritroides utilizando condiciones de crecimiento exentas de suero
en metilcelulosa. Se aislaron células CD34+ como se ha descrito
anteriormente, y se incubaron utilizando el medio de crecimiento
exento de suero en el documento WO 95/00632, con las siguientes
modificaciones. Los tubos de ensayo se prepararon sin utilizar
moléculas de matriz extracelular, hidrocortisona, y los factores
del crecimiento EGF, FGF y PDGF. Como se ha descrito anteriormente,
se prepararon 3 ml de muestra para lograr placas por duplicado de
muestras de 1 ml. Cada tubo recibió 0,030 ml de cada uno de las
siguientes 100 x disoluciones patrón
(2-mercaptoetanol, nucleósidos, colesterol,
piruvato de sodio, Hu-transferrina, lípidos,
Hu-insulina), 0,4 ml de BSA desionizado (al 15%),
0,015 ml de SCF (20 ug/ml, 0,1 ml de células CD34+ (resuspendidas a
300.000 células/ml), 1,080 ml de metilcelulosa (al 2,3%) y una
combinación de muestra e IMDM igual a 1,195 ml, en la que la
muestra no excedía de 150 \mul. Las placas entonces se incubaron
como se describe anteriormente, y se contaron las colonias después
de 21 días. Se observaron colonias eritroides cuando se cultivaba
en presencia de EPO o Mab 71, pero no bajo las condiciones que no
tenían estos dos factores. Un ejemplo de los tipos de colonias
eritriodes observadas se muestra en la figura 7. Las colonias
incubadas con 25 munidades de rHuEPO parecían similares a las
cultivadas con 2,1 \mug/ml de Mab 71 purificado. Unas dosis
mayores de rHuEPO produjeron colonias mayores. En la figura 8
aparece una curva de dosis-respuesta. El Mab 71
tiene un pico de actividad en las dosis entre 1 y 5 \mug/ml. Unas
dosis menores y mayores produjeron menos colonias eritroides. Un
anticuerpo monoclonal control generado contra Her2/Neu no produjo
ninguna colonia en este intervalo de dosis. Este resultado indica
que el Mab 71 estimula la formación de colonias eritroides a
partir de precursores eritroides, y que no existe un requerimiento
adicional de suero. Por tanto, el Mab 71 puede estimular la
diferenciación de los precursores eritroides para producir células
eritroides.
Aunque la invención se ha descrito en términos
de las realizaciones preferidas, debe entenderse que los expertos
en la técnica pueden pensar en variaciones y modificaciones. Por
tanto, se pretende que las reivindicaciones adjuntas cubran todas
estas variaciones equivalentes, que se encuentran dentro del
alcance de la invención, tal como se reivindica.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Amgen Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPOS QUE ACTIVAN UN RECEPTOR DE ERITROPOYETINA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Acogen Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1840 Dehavilland Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Thousand Oaks
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 91320-1789
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release n° 1.0, versión n° 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Winter, Robert B.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: A-307
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCCAAGCTT GCCGTCACCA TGGACCACCT CGGGGCGTCC CT
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGTCTAGA TTACTAGGGA TCCAGGTCGC TAGGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGTCGACTA CTAGTAGTCA GTTGAGA
\hfill27
Claims (19)
1. Un anticuerpo, o su fragmento bivalente, que
activa un receptor de eritropoyetina, en el que el anticuerpo, o su
fragmento bivalente, se une a un péptido de restos de aminoácidos
49 a 78, inclusive de un receptor de eritropoyetina humano.
2. El anticuerpo, o su fragmento bivalente, de
la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal, o su
fragmento bivalente.
3. El anticuerpo, o su fragmento bivalente, de
la reivindicación 1, que es un anticuerpo humanizado, o su
fragmento bivalente.
4. El anticuerpo, o su fragmento bivalente, de
la reivindicación 1, que es un anticuerpo humano, o su fragmento
bivalente.
5. El anticuerpo, o su fragmento bivalente, de
la reivindicación 1, que tiene un marcador detectable.
6. Un método para detectar en una muestra
biológica un receptor de eritropoyetina que es capaz de ser
activado, y dicho método comprende las etapas de:
(a) poner en contacto la muestra con el
anticuerpo o un fragmento bivalente del mismo;
(b) detectar la activación del receptor por el
anticuerpo, o un fragmento bivalente del mismo, determinando con
ello la presencia de un receptor de eritropoyetina capaz de ser
activado.
7. Un kit para detectar en una muestra
biológica un receptor de eritropoyetina que es capaz de ser
activado, que comprende el anticuerpo o su fragmento bivalente, de
cualquiera de la reivindicaciones 1 a 5.
8. Un anticuerpo o su fragmento bivalente,
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para modular la
actividad endógena de un receptor de eritropoyetina en un
mamífero.
9. Un anticuerpo, o su fragmento bivalente,
según la reivindicación 8, en el que la modulación consiste en la
regulación de la proliferación o diferenciación de células
progenitoras eritroides.
10. Un anticuerpo o su fragmento bivalente,
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para tratar la
anemia en un paciente.
11. Una composición farmacéutica que comprende
una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la
reivindicación 1 a 5, en un adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
12. La composición de la reivindicación 11, en
la que el anticuerpo, o su fragmento bivalente, es un anticuerpo
monoclonal, o su fragmento bivalente.
13. La composición de la reivindicación 11, en
la que el anticuerpo, o su fragmento bivalente, es un anticuerpo
humanizado, o su fragmento bivalente.
14. La composición de la reivindicación 11, en
la que el anticuerpo, o su fragmento bivalente, es un anticuerpo
humano, o su fragmento bivalente.
15. El uso del anticuerpo, o su fragmento
bivalente, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la
preparación de un medicamento para modular la actividad endógena de
un receptor de eritropoyetina en un paciente.
16. El uso de la reivindicación 15, en el que la
modulación consiste en la regulación de la proliferación o
diferenciación de células progenitoras eritroides.
17. El uso del anticuerpo, o su fragmento
bivalente, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para
preparar un medicamento para el tratamiento de la anemia en un
paciente.
18. Un método in vitro para modular la
actividad endógena de un receptor de eritropoyetina en una célula,
que comprende la administración de una cantidad del anticuerpo, o
su fragmento bivalente, según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 5, eficaz para modular la actividad del receptor.
19. El método de la reivindicación 18, en el que
la modulación de la actividad del receptor de eritropoyetina
consiste en la regulación de la proliferación o diferenciación de
la célula.
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