PT1146056E - Anticorpos que activam um receptor da eritropoietina - Google Patents
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Description
1
Descrição "Anticorpos que activam um receptor da eritropoietina" Campo da Invenção A presente invenção diz respeito a anticorpos e a seus fragmentos bivalentes que reconhecem um receptor de eritropoietina, e activam um receptor de eritropoietina e estimulam a eritropoiese.
Antecedentes da Invenção A eritropoietina (EPO) é uma hormona glicoproteica envolvida no crescimento e na maturação de células progenitoras eritróides que passam a eritrócitos. A EPO é produzida pelo fígado durante a vida fetal e pelos rins dos adultos e estimula a produção de eritrócitos a partir de precursores eritróides. Uma diminuição da produção de EPO, que ocorre vulgarmente nos adultos em consequência de uma insuficiência renal, origina anemia. A EPO tem sido produzida por técnicas de engenharia genética envolvendo a expressão e a secreção da proteína a partir de uma célula hospedeira transfectada com um gene codificador da eritropoietina. A administração de EPO recombinante tem sido eficaz para o tratamento da anemia. Por exemplo, Eschbach et al. (N. Engl. J. Med. 316, 73 (1987)) descrevem a utilização de EPO para corrigir a anemia resultante de uma insuficiência renal crónica. A purificação da EPO urinária humana foi descrita por Miyake et al. (J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977)). A identificação, a clonagem e a expressão de genes codificadores da eritropoietina estão descritas na patente de invenção norte-americana n° 4 703 008 de Lin. 2 A descrição de um método para a purificação de EPO recombinante a partir do meio celular está contida na patente de invenção norte-americana n° 4667016 de Lai et al.
Sabe-se pouco sobre o mecanismo segundo o qual a EPO estimula a eritropoiese.
Embora se saiba que a EPO activa as células levando-as a crescerem e/ ou a diferenciarem-se mediante a ligação a receptores específicos da superfície das células, o mecanismo específico de activação e também a estrutura do receptor e de quaisquer proteínas associadas não é ainda perfeitamente conhecido. Pensa-se, que o receptor da eritropoietina (R-EPO, em inglês EPO-R) exista como um complexo multimérico. Estudos de sedimentação sugerem que o seu peso molecular seja de 330±4 8 kDa (Mayeux et al. Eur. J. Biochem. 194, 271 (1990)). Estudos de reticulação indicaram que o complexo receptor compreende pelo menos dois polipéptidos distintos, uma espécie de 66-72 kDa e espécies de 85 a 100 kDa (Mayeux et al. J. Biol. Chem. 266, 23380 (1991); McCaffery et al. J. Biol. Chem. 264, 10507 (1991)) . Também foi detectada uma proteína distinta de 95 kDa por imunoprecipitação do receptor da EPO (Miura & Ihle Blood 81, 1739 (1993)). Um outro estudo de reticulação revelou a existência de três complexos de 110, 130 e 145 kDa que contêm EPO. Os complexos de 110 e de 145 kDa continham o receptor da EPO, uma vez que foi possível fazê-los ímunoprecipitar com anticorpos criados contra o receptor (Miura & Ihle, supra) . A expressão de um receptor de EPO truncado no terminal carbóxilo permitiu detectar o complexo de 110 kDa, mas não o complexo de 145 kDa. Isto sugere que o complexo de peso molecular mais elevado contém os polipéptidos presentes no complexo de 110 kDa e mais uma proteína de 35 kDa. 3
Foi obtido um melhor conhecimento da estrutura e da função do complexo receptor de EPO ao fazer-se a clonagem e a expressão dos receptoras de EPO de murganhos e de seres humanos (D'Andrea et al., Cell 57_, 277 (1989); Jones et al., Blood 7_6, 31 (1990); Winklemann et ai., Blood ]_6, 24 (1990); pedido de patente de invenção do PCT com o n° W090/08822; patente de invenção norte-americana n° 5 278 065 de D'Andrea et al) . 0 receptor de EPO humano de comprimento completo é uma proteína transmembranar de 483 aminoácidos que possui um domínio extracelular que tem aproximadamente 224 aminoácidos e um péptido de sinal com 25 aminoácidos. A homologia entre as sequências de aminoácidos do receptor humano e do receptor do murganho é de cerca de 82%. Demonstrou-se que o receptor de EPO de comprimento completo clonado, expresso em células de mamíferos (66-72 kDa),se liga à EPO com uma afinidade (100-300 nM) semelhante à do receptor natural nas células progenitoras eritróides. Assim, presume-se que esta forma contenha o determinante principal de ligação da EPO e designa-se por receptor de EPO. As proteínas de 85 e de 100 kDa observadas como parte de um complexo reticulado são distintas do receptor da EPO, mas devem ser bastante próximas da EPO, porque a EPO pode interligar-se com elas. As proteínas de 85 e de 100 kDa estão relacionadas entre si e a proteína de 85 kDa pode ser um produto de clivagem proteolítica da espécie de 100 kDa (Sawyer J. Biol. Chem. 264, 13343 (1989)).
Foi já produzida uma forma solúvel (truncada) do receptor da EPO que contém apenas o domínio extracelular e constatou-se que se liga à EPO com uma afinidade de cerca de 1 nM, ou cerca de 3 a 10 vezes inferior à do receptor de comprimento completo (Harris et al., J. Biol. Chem. 267,
15205 (1992); Yang & Jones, Blood 82, 1713 (1993)). A razão para a afinidade reduzida, quando comparada com a da 4 proteína de comprimento completo, não é conhecida. Há a possibilidade de outras espécies de proteínas também poderem fazer parte do complexo de R_EPO e contribuírem para a ligação da EPO, aumentando assim a afinidade. Para fundamentar esta possibilidade referem-se os resultados das observações de Dong & Goldwasser (Exp. Hematol. 21, 483 (1993)) que concluíram que a fusão de uma linha celular com um receptor de EPO de fraca afinidade com uma célula de OCC (em inglês CHO) que não se liga à EPO teve como consequência uma linha celular híbrida que manifesta elevada afinidade de ligação da EPO ao receptor da EPO. Além disso, a transfecção de um R-EPO de comprimento completo em células de OCC teve como consequência uma linha celular que possui simultaneamente os receptores de elevada e de fraca afinidade, conforme medido pela análise de Scatchard. A amplificação do número de cópias de R-EPO fez aumentar a ligação de fraca afinidade, mas não a de elevada afinidade. Estes resultados são consistentes com a presença de uma quantidade limitada de uma proteína presente nas células de OCC que converte o R-EPO de fraca afinidade em elevada afinidade. A activação do receptor da EPO tem como consequência diversos efeitos biológicos. Três dessas actividades incluem a estimulação da proliferação, a estimulação da diferenciação e a inibição da apóptose (Liboi et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA _90, 11351 (1993); Koury, Science 248, 378 (1990)). Os circuitos de transdução do sinal que resultam na estimulação da proliferação e na estimulação da diferenciação parecem ser separáveis (Noguchi et al., Mol Cell. Biol. £, 2604 (1988); Patel et al., J. Biol. Chem. 2 67, 21300 (1992); Liboi et al., ibid). Alguns resultados sugerem que pode ser necessária uma proteína acessória para mediar o sinal de diferenciação (Chiba et al. Nature 362, 646 (1993); Chiba et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 5 11593 (1993)). No entanto, há controvérsia relativamente ao papel das proteínas acessórias na diferenciação, uma vez que uma forma constitutivamente activada do receptor pode estimular simultaneamente a proliferação e a diferenciação (Pharr et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA _90, 938 (1993)). A activação do receptor da EPO pode ser devida à sua dimerização. Significa isto, que a EPO pode actuar como um agente de interligação entre duas moléculas receptoras de EPO. Há provas que fundamentam esta hipótese. Uma mutação de arginina para cisteína na posição 129 do receptor da EPO dos murinos tem como consequência a activação constitutiva do receptor, presumivelmente devido a uma ponte de dissulfureto formada entre duas subunidades receptoras (Yoshimura et ai., Nature 348, 647 (1990)). Além disso, o R-EPO encontra-se em complexos multiméricos em células (Miura & Ihle, Arch. Biochem. Biophys. 306, 200 (1993)). No entanto, ainda não foi descrito o isolamento de uma forma multimérica estável do receptor solúvel purificado da EPO. Além do mais, a dimerização da R-EPO pode eventualmente ser necessária, mas não é suficiente só por si para completar a activação das células. Por exemplo, a dimerização pode ter como consequência um sinal proliferativo, mas não um sinal de diferenciação. Significa isto que podem ser necessárias proteínas acessórias para enviar um sinal de diferenciação. A possível relação entre a dimerização e a activação do receptor da EPO pode ser explorada para identificar compostos que sejam diferentes da EPO, mas que activem o receptor. Por exemplo, os anticorpos possuem dois locais de ligação idênticos para o antigénio. Um anticorpo anti-R-EPO pode ligar-se a duas moléculas do R-EPO e pode colocá-las em estreita proximidade entre si para permitir a dimerização.' Para funcionarem in vivo, estes anticorpos têm que reconhecer a R-EPO sobre superfícies de células e têm de se ligar de uma forma que permita a activação do 6 circuito de transdução do sinal. Além disso, é desejável que a activação tenha como consequência tanto a proliferação como a diferenciação dos progenitores eritroides. Foi descrita uma explicação semelhantes para se compreender a activação do receptor da hormona do crescimento humano (Fuh et al., Science 256, 1677 (1992)) e do receptor do factor de crescimento epidérmico (Schreiber et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78_, 7535 (1981)).
Seria desejável identificar moléculas que tivessem a propriedade de activar o receptor da EPO e de estimular a eritropoiese. Para que isso seja possível é importante conhecer o mecanismo de activação do receptor da EPO e de transdução do sinal. Uma forma de abordar este problema para esclarecer este mecanismo consiste em identificar anticorpos que reconheçam o receptor da EPO de forma a activarem o receptor e a estimularem a eritropoiese.
Tais anticorpos são úteis em aplicações terapêuticas e de diagnóstico e também poderiam ser úteis para testar a actividade dos receptores da EPO.
As referências seguintes descrevem anticorpos que se ligam ao receptor da EPO dos murganhos ou dos seres humanos. D'Andrea et al. em The Biology of Hematopoiesis, Wiley-Liss, Inc. (1990), págs. 153-159, geraram anticorpos policlonais anti-peptídicos contra um péptido de terminal amino e contra um péptido de terminal carbóxilo do receptor da EPO dos murinos. Demonstrou-se pelo método da transferência de Western que os anticorpos reagem com o receptor da EPO de murganhos.
Baíley et al., em Exp. Hematol. 21, 1535-1543 (1993), geraram anticorpos monoclonais anti-peptidicos contra péptidos sintéticos homólogos dos domínios extracelulares e citoplásmicos do receptor da EPO dos murganhos. A activação dos receptores por acção destes anticorpos, conforme medido 7 pela incorporação de 3H-timidina em células do baço de murganhos tratados com fenil-hidrazina, não foi detectada. Baynes et al em Blood 8_2, 46-52 (1993), geraram anticorpos monoclonais para o receptor da EPO dos seres humanos. Os anticorpos ligam-se às células Ba/F3 transfectadas com o clone de ADNc da EPO dos seres humanos e alguns inibem a ligação da EPO e neutralizam o crescimento dependente da EPO.
Baynes et ai, em Blood 82^ 2088-2095 (1993), geraram um anticorpo monoclonal contra um péptido do terminal amino no receptor da EPO dos seres humanos. Demonstrou-se que o anticorpo reage com uma forma solúvel do receptor existente no soro dos seres humanos. D'Andrea et al em Blood 8_2, 46-52 (1993), geraram anticorpos monoclonais para o receptor da EPO dos seres humanos. Os anticorpos ligam-se às células Ba/F3 transfectadas com o clone de ADNc da EPO dos seres humanos e alguns inibem a ligação da EPO e neutralizam o crescimento dependente da EPO.
Fisher et al, em Blood _82, 197A (1993), utilizaram os mesmos anticorpos monoclonais descritos por D'Andrea, supra, para efectuar a distinção entre células progenitoras eritróides com crescimento e maturação dependentes da EPO e aquelas que têm crescimento e maturação independentes da EPO. Não há nenhuma indicação quanto ao facto de os anticorpos descritos nos documentos anteriormente referidos activarem o receptor da EPO ou estimularem o crescimento e/ ou a maturação das células progenitoras eritróides.
Assim sendo, constitui um objectivo da invenção produzir anticorpos e seus fragmentos bivalentes que reconheçam um receptor da EPO e que a ele se liguem entre os resíduos de aminoácidos 49-78, por forma a que o receptor seja activado. Constitui um outro objectivo da 8 presente invenção produzir anticorpos e seus fragmentos bivalentes que se liguem a um receptor da EPO entre os resíduos de aminoácidos 49 a 78 e que estimulem a eritropoiese mediante a estimulação da proliferação e/ ou da diferenciação de células progenitores eritróides em eritrócitos. Tais anticorpos e seus fragmentos bivalentes são úteis para o tratamento da anemia, ou para o diagnóstico de doenças caracterizadas por receptores disfuncionais da EPO. Além do mais, tais anticorpos e seus fragmentos bivalentes podem levar à identificação de agentes terapêuticos para o tratamento da anemia.
Descrição Abreviada da Invenção A invenção diz respeito a anticorpos ou aos seus fragmentos bivalentes de acordo com o definido na reivindicação 1. A pesquisa de anticorpos que reconhecem o receptor da EPO dos seres humanos veio revelar que há dois anticorpos designados por AcM 71 e AcM 73 (em inglês Mab71 e Mab 73), que estimulam a proliferação das células UT7-EPO, pertencentes a uma linha celular dependente da EPO, que não proliferam na ausência de EPO acrescentada.
Além disso, o AcM 71 estimulou a formação de colónias eritróides a partir de progenitores eritróides no sangue humano. De preferência, os anticorpos são monoclonais e podem ser anticorpos humanos ou humanizados. Também estão aqui abrangidas as linhas celulares de hibridomas que produzem os anticorpos da invenção. A invenção também disponíbiliza métodos e estojos (em inglês kits) para a detecção de receptores de EPO em amostras biológicas, em que esses métodos e estojos compreendem anticorpos de receptores da EPO, ou dos seus fragmentos bivalentes da invenção. As composições farmacêuticas compreendendo receptores da EPO, ou os seus 9 fragmentos bivalentes e adjuvantes farmaceutícamente aceitáveis também estão contempladas na presente invenção. Tais composições podem ser utilizadas para tratar doentes que padeçam de doenças caracterizadas por niveis baixos de eritrócitos.
Descrição das figuras A figura 1 mostra os resultados de um protocolo de EISLE (em inglês ELISA) para a medição da ligação aos péptidos sintéticos pelo AcM 71, para as concentrações indicadas. Os péptidos correspondem aos resíduos de aminoácidos indicados do receptor de EPO dos seres humanos. 0 resíduo 1 é a prolina do terminal amino que se encontra no R-EPO secretado após clivagem da sequência leader. A figura 2 mostra o efeito de quantidades variáveis de proteína EPOrHu (em inglês rHUEPO) e dos AcM 71 e 73 purificados sobre a incorporação de 3H-timidina nas células UT7-EP0. A figura 3 mostra o efeito de quantidades variáveis de proteína EPOrHu, do AcM 71, do AcM 73 ou de um AcM de contraprova não neutralizantes dirigido contra a EPO (o AcM F12) sobre a inibição da ligação de 125I-EPO aos receptores da EPO sobre a superfície de células 0CIM1. A figura 4 corresponde a um gel de DSS (em inglês SDS) contrastado com o corante de Coomassie, no caso de preparações purificadas dos anticorpos monoclonais 71 e 73, assim como fragmentos de anticorpos monoclonais (Fia, em inglês Fab) obtidos a partir dos AcM 71 e 73. As amostras foram testadas quer em condições redutoras (com 2-mercaptoetanol), quer em condições não redutoras (sem 2-mercaptoetanol). 10 A figura 5 mostra o efeito de quantidades variáveis de proteína EPOrHU purificada, de AcM 71 ou de Fia 71 sobre a incorporação de 3H“Timidina pelas células UT7-EP0. A figura 6 mostra o efeito de quantidades variáveis de AcM 71 purificado, de AcM 71 ou de Fia 71 sobre a incorporação de 3H-Timidina pelas células UT7-EP0 às quais se acrescentou também a EPO recombinante humana (EPOrHu) na concentração de 30 munídades/ml. A figura 7 representa uma fotografia de células CD34+ purificadas provenientes de sangue periférico que se desenvolveram em 21 dias em metilcelulose na presença de EPO ou de AcM 71 em condições de crescimento na ausência de soro. As fotografias correspondem a células incubadas com EPO na concentração de 500 m(Jnidades/ml (A), EPO na concentração de 25 miliunidades/ml (B) ou AcM 71 na concentração de 2,1 μς/ιηΐ (C) . A figura 8 ilustra o efeito de quantidades variáveis de proteína EPOrHU, de AcM 71 e de um anticorpo monoclonal de contraprova criado para o Her2/neu, sobre a formação de colónias eritróides a partir de precursores eritróides quando desenvolvidos em condições de crescimento na ausência de soro em agar mole.
Descrição Minuciosa da Invenção
Os anticorpos monoclonais (AcM) que reconhecem o receptor da eritropoietina foram gerados imunizando murganhos com o receptor de EPO do seres humanos, solúvel e purificado. O receptor de EPO dos seres humanos, solúvel foi expresso e purificado conforme descrito nos exemplos 1 e 2. Dos AcM que reagiram com o receptor solúvel de EPO dos seres humanos em ensaios de imunossorção ligados a enzimas (ELISA em inglês) foram seleccionados 96 AcM para pesquisa posterior. Estes AcM foram testados para pesquisa da 11 ligação ao receptor de EPO por análise do tipo "BIAcore" (Exemplo 4A) e para a pesquisa da ligação ao receptor de EPO sobre a superfície de células transfectadas de OCC pelo método de SCAF (em inglês FACS) (Exemplo 4C) . Os resultados destas pesquisas estão ilustrados no quadro 1. Apesar de haver diversos anticorpos ligados ao receptor de EPO, conforme determinado pela análise do tipo "BIAcore", apenas 5 anticorpos dos 96 testados e ligados ao receptor de EPO se apresentam sobre a superfície das células transfectadas de OCC, conforme determinado pelo método de varrimento SCAF. Foram efectuados testes com 24 anticorpos, que revelaram reacções positivas nos protocolos de EISLE (incluindo os 5 anticorpos que revelaram ser positivos pelo método de varrimento SCAF) para estimulação da proliferação das células UT7-EP0, De forma surpreendente, concluiu-se que dois anticorpos designados por AcM 71 e AcM 73, estimularam a incorporação da 3H-timidina na linha celular UT7-EP0 (Komatsu et al., Blood £2, 456 (1993)) na ausência de EPO (Exemplo 8A) . A linha celular UT7-EP0 exige a presença de EPO no seu meio para o crescimento. Assim sendo, a estimulação do crescimento das células UT7-EP0 deve-se provavelmente à activação do receptor de EPO pelos AcM 71 e AcM 73. Conforme ilustrado na figura 2, a resposta das células UT7-EP0 na presença do AcM 71 foi maior do que na presença do AcM 73. Também se conclui que o AcM 71 estimulou a formação de colónias eritróides a partir dos precursores eritróides dos seres humanos (ver o Exemplo 9). Este é o primeiro caso de um anticorpo que estimula a formação de colónias eritróides a partir de precursores eritróides. A invenção disponibiliza um anticorpo ou um seu fragmento que activa um receptor da eritropoietina e liga-se a um péptido de resíduos de aminoácidos 49 a 78. Quando aqui utilizada, a expressão "activação de um receptor de 12 EPO" designa um ou vários processos moleculares que um receptor de EPO experimenta para dai resultar a transdução de um sinal para o interior de uma célula portadora de um receptor, em que o sinal ocasiona em última instância uma ou várias alterações na fisiologia celular. As respostas celulares à activação dos receptores de EPO são tipicamente modificações da proliferação ou da diferenciação das células portadoras dos receptores. As células portadoras dos receptores são tipicamente células progenitoras eritróides. Presentemente, os fenómenos moleculares que levam à transdução do sinal pelos receptores da EPO são mal compreendidos. No entanto, conforme se disse nos parágrafos antecedentes, determinadas provas sugerem que a dimerização dos receptores da EPO é pelo menos um fenómeno que é provavelmente necessário para a activação. A presente memória descritiva também apresenta argumentos que fundamentam esta ideia. Conforme ilustrado na figura 5, a estimulação da incorporação da 3H-timidina nas células UT7-EPO por acção do AcM 71 foi suprimida quando este foi substituído pelo correspondente fragmento Fia designado por Fia 71.
Posto isto, a substituição do anticorpo bivalente intacto por um fragmento monovalente correspondente elimina a resposta proliferativa. Além disso, o AcM 71 inibe a activação do receptor da EPO a concentrações elevadas. Estas duas observações servem de suporte ao modelo de dimerização de activação para o receptor da EPO. Comprovou-se que o AcM 1 interactua com o péptido sintético de resíduos 49 a 78 do R-EPO dos seres humanos (ver o exemplo 6). Assim, esta região do R-EPO, quando ligada por meio de um agente de reticulação tal como o AcM 71, pode originar a activação do R-EPO. As moléculas que se ligam a duas moléculas de R-EPO, através da ligação aos resíduos 49 a 78, representam a invenção. Estas moléculas são anticorpos 13 ou os seus fragmentos bivalentes que possuem a propriedade de se interligarem com dois receptores de EPO, através de ligação aos resíduos contidos dentro da região entre os resíduos 49 e 78, daí resultando pois a dimerização e a activação do receptor da EPO.
Os receptores de EPO referidos nesta descrição irão ser preferencialmente os receptores de EPO dos mamíferos e numa concretização particularmente preferida irão ser o receptor de EPO dos seres humanos. Entende-se que os análogos dos receptores de EPO dos seres humanos também estão contemplados na presente invenção. Tais análogos são construídos por inserções, supressões, extensões ou substituições de aminoácidos na sequência do receptor da EPO dos seres humanos. Como exemplos de análogos de R-EPO refere-se os que já foram descritos na patente de invenção norte-americana n° 5 292 654 da autoria de Yoshimura et ai., em que a substituição de um resíduo de cisteína na posição 129 da sequência de aminoácidos do R-EPO teve como resultado a obtenção de um R-EPO activado de forma constitutiva. Em geral, ao análogos de R-EPO em que há mudanças de aminoácidos em regiões diferentes dos domínios de ligação dos anticorpos necessários para a activação, em que os referidos análogos conservam as estruturas secundária e terciária do receptor da EPO dos seres humanos, podem ser reconhecidos pelos anticorpos da presente invenção. Foi já demonstrado que o AcM 71 interactua com um péptido sintético de resíduos 49 a 78 do R-EPO dos seres humanos (ver o Exemplo 6). Assim sendo, os análogos de R-EPO, em que há modificações nos resíduos de aminoácidos diferentes dos resíduos nas posições 49 a 78 e que conservam as estruturas secundária e terciária do receptor da EPO dos seres humanos, são reconhecidos provavelmente pelo AcM 71. A numeração aqui utilizada para os resíduos de aminoácidos no polipéptido R-EPO dos seres 14 humanos começa com a prolina na posição 1, que é o resíduo do terminal amino após a clivagem do péptido de sinal de 25 aminoácidos.
Os anticorpos da invenção ligam-se a um epítopo sobre um receptor de EPO que abrange os resíduos de aminoácidos 49 a 78 no R-EPO dos seres humanos. Posto isto, é provável que o AcM71 reconheça um epítopo sobre o R-EPO definido na totalidade ou em parte por esta sequência. Quando aqui utilizado o termo "epítopo" designa uma região de um R-EPO ligado por um anticorpo em que a ligação evita a associação de um segundo anticorpo a um R-EPO. A invenção também proporciona anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais e os seus fragmentos bivalentes. Os fragmentos de anticorpos são todos aqueles fragmentos que activem um receptor de EPO, através da ligação a um epítopo de um péptido que abrange os resíduos de aminoácidos 49 a 78 do R-EPO. Também estão contemplados os anticorpos humanizados, tipicamente produzidos por métodos recombinantes, em que as sequências humanas compreendem uma parte, ou a totalidade de um anticorpo da invenção. Exemplos de anticorpos humanizados incluem os anticorpos quiméricos ou com enxertos de RDC (em inglês CDR) (patentes de invenção norte-americanas n°s 4816 567 e 5 225 539). Aos anticorpos da invenção também pode estar acoplado um marcador detectável. Tal marcador pode ser de tipo fluorescente (por ex. isotiocianato de fluoresceína, ITCF), enzimático (por ex. peroxidase de Armoracia rusticana) , afinidade (por ex. biotina) , ou isotópico (por ex. 125I) .
Também estão contempladas pela invenção as linhas celulares de hibridomas produtoras de um anticorpo monoclonal da invenção. A geração de linha celulares de hibridomas produtoras de anticorpos monoclonais para a R-EPO dos seres humanos está descrita no exemplo 3. A linha celular produtora do AcM 71, foi depositada na Colecção 15
Americana de Culturas Tipo em Rockville, MD em 26 de Julho de 1994 com ο n° HB11689 de admissão. A linha celular produtora do AcM 73, foi depositada na Colecção Americana de Culturas Tipo em Rockville, MD em 26 de Julho de 1994 com ο n° HB11690 de admissão.
Os anticorpos da presente invenção são úteis para o diagnóstico da anemia e de outras doenças caracterizadas por disfunções dos R-EPO. Numa concretização, um método para detectar numa amostra biológica um receptor de EPO, susceptível de ser activado, compreende os passos seguintes: (a) fazer contactar a amostra com um anticorpo que active um receptor de EPO; e (b) detectar a activação do receptor pelo anticorpo. As amostras biológicas incluem especímens de tecidos, células intactas ou os seus extractos. Os anticorpos podem ser utilizados como parte de um estojo de diagnóstico para a detecção da presença dos receptores de EPO numa amostra biológica. Tais estojos utilizam anticorpos aos quais está acoplado um marcador para permitir a detecção. Os anticorpos são úteis para identificar receptores normais, ou anormais. A presença de receptores anormais numa amostra biológica pode ser um sinal indicador de doenças tais como a anemia de "Diamond Blackfan", caso em que se admite que o receptor de EPO seja disfuncional.
Os anticorpos da invenção são úteis para tratar doenças caracterizadas por níveis baixos de glóbulos vermelhos. A invenção também compreende métodos para modular a actividade endógena de um receptor de EPO num mamífero, de preferência os métodos para fazer aumentar a actividade de um receptor de EPO. Em geral, todas as doenças tratáveis por meio de eritropoietina, tais como anemia, podem ser tratadas também pelos anticorpos da invenção. Os anticorpos terapêuticos são administrados numa quantidade e por uma via de administração adequada para a 16 natureza e para a gravidade da doença que se pretende tratar, sendo isso da competência de um perito no estado da técnica. De preferência, a administração far-se-á por injecção, quer seja subcutânea, intramuscular ou intravenosa. A invenção proporciona uma composição farmacêutica que incorpora uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que activa um R-EPO conjuntamente com um adjuvante aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, em que o adjuvante pode ser seleccionado entre várias substâncias seleccionadas entre diluentes, veículos, conservantes, emulsionantes, anti-oxidantes e/ ou estabilizadores. A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" aqui utilizada designa uma quantidade de anticorpos que proporcione um efeito terapêutico para uma determinada doença e segundo um determinado regime de administração. Na presente invenção, o efeito terapêutico é a estimulação da produção de eritrócitos, conforme evidenciado por um aumento no hematócrito no doente que se pretende tratar. Numa concretização preferida, os anticorpos são anticorpos humanos, ou humanizados que podem ser preparados recorrendo a procedimentos conhecidos pelos peritos no estado da técnica. Os adjuvantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico são conhecidos pelos especialistas na matéria e estão exaustivamente descritos na obra "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a ed., A. R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1990).
Os exemplos a seguir apresentados são fornecidos para ilustrar melhor a invenção, não sendo todavia limitativos do seu âmbito.
Exemplo 1
Produção do receptor solúvel da eritropietina dos seres humanos 17 A. Isolamento de clones para a expressão do receptor solúvel da eritropoietina dos seres humanos.
Utilizando um clone que contém o receptor da eritropoietina dos seres humanos, conforme descrito por Jones et ai., supra, utilizou-se a técnica de RCP (em inglês RCP) para se obter um clone para expressão do receptor solúvel da eritropietina dos seres humanos (R-EPOsHu, em inglês sHuEPOR). Os iniciadores para a amplificação do receptor da eritropoietina dos seres humanos por RCP foram:
Iniciador de 5': CTC CAA GCT TGC CGT CAC CAT GGA CCA CCT CGG GGC GTC CCT (SEQ ID N° : 1); e iniciador de 3': CAG GTC TAG ATT ACT AGG GAT CCA GGT CGC TAG GC (SEQ ID N° : 2 ) .
As RCP foram executadas utilizando 2,5 ng de um plasmídeo que contém o R-EPQ dos seres humanos, 5 pmol de cada um dos iniciadores olinucleotídicos referidos supra, Tris 10 mM-HCl (pH 8,3), KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM de cada um dos dNTP e uma unidade de polimerase de Taq. A amplificação decorreu durante 5 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 50°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 20 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 55°C e 1 minuto a 72°C.
Purificou-se o ADN por passagem através de uma coluna de exclusão' por tamanho "G-50" (Boehringer Mannheim Corp.) e depois efectuou-se a digestão com Hind III e Xbal e ligou-se dentro do vector de expressão pDSRa2 (DeClerck et al., 18 J. Biol. Chem. 266, 3893 (1991)) que também havia sido digerido com Hind III e Xbal. Os clones que continham o segmento intercalar desejado foram verificados por análise da sequência do ADN.
Produziu-se um clone d40EPOR por RCP a partir de um clone de R-EPO de comprimento completo dos seres humanos (ver supra). 0 terminal carbóxilo do clone d40EP0R é tyr467, que é o resultado da adição de um codão de paragem dentro do iniciador. Os iniciadores para a amplificação por RCP foram: iniciador em 5': 5',-CTC CAA GCT TGC CGT CAC CAT GGA CCA CCT CGG GGC GTC CCT-3' (SEQ ID N°: 1); e iniciador em 3' 5'-AGG TCG ACT ACT AGT AGT CAG TTG AGA-3' (SEQ ID N°: 3)
Na amplificação por RCP utilizou-se polimerase de pfu em tampão 2 de pfu (Stratagene, La Jolla, CA). As condições de reacção foram as seguintes: 1 ciclo a 96°C durante 30 segundos, 45°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto; 25 ciclos a 96°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos. Depois executou-se uma incubação final a 72°C durante 5 minutos. Efectuou-se a separação dos produtos de reacção por electroforese em gel de agarose e realizou-se o isolamento de uma banda com aproximadamente 1,3 kb utilizando um estojo depurado de genes (BIO 101, Vista, CA) . O fragmento purificado foi ligado por RCP II (estojo de clonagem TA, Invitrogen, San Diego, CA). Os recombinantes foram identificados por análise de restrição 19 e foram sequenciados para confirmar se estavam presentes as inserções desejadas. Isolou-se um fragmento HindIII-SalI conforme descrito acima e ligou-se dentro de um vector isolado pDSRa2 que havia sido previamente cortado com HindIII e Sall. Utilizou-se o vector resultante pDSRaEPORd40 para a expressão em células de OCC.
B. Expressão do R-E_PO solúvel dos seres humanos e do R-EPO d40 em células OCC 0 pl asmideo de expressão pDSRa2-EP0R-X contém as sequências que codificam para os aminoácidos Metl-Pro249 do R-EPO humano, conforme indicado na obra de Jones et al., supra, 0 plasmideo pDSRaEPORd40 contém as sequências que codificam para Metl-Tir467. Introduziu-se de forma independente 10 microgramas de cada plasmideo dentro das células de OCC por transfecção mediada pelo fosfato de cálcio (Wigler et al., Cell 11/ 233 (1977)). As colónias individuais foram seleccionadas com base na expressão do gene da di-hidrofolato-redutase a partir do vector. A monitorização da expressão do R-EPO dos seres humanos foi feita por hibridação de ARN (Hunt et al., Exp. Hematol., 19: 779 (1991)) e por imunotransferência de Western, utilizando um anticorpo purificado por afinidade. As linhas celulares positivas nestes ensaios foram seleccionadas para expansão subsequente. As linhas celulares foram adaptadas para uma concentração de metotrexato (Mtx) 30 nM para estimular a amplificação da expressão do R-EPO.
A geração de meios acondicionados contendo o RR-EPO solúvel dos seres humanos foi realizada em garrafas giratórias e num bioreactor de fibras ocas. Efectuou-se a inoculação das garrafas giratórias com 2 x 107 células em 200 ml de meio de crescimento (MEMD: F12 de Ham (1:1) suplementado com aminoácidos não essenciais (AANE), 30 nM 20 de Mtx e 5% de soro fetal de bovino (SFB) (reagentes fornecidos por GIBCO, Grand Island, NY)). Depois de atingida a confluência ao fim de 3-4 dias, substitui-se o meio por 200 ml de MEMD-.F12 de Ham, ΑΆΝΕ e Mtx 30 nM sem nenhum soro. Colheu-se o meio acondicionado ao fim de 6-7 dias e substituiu-se por meio fresco isento de soro. Foram ainda colhidos um segundo e um terceiro lote. O carregador do bioreactor de tipo "Cell Pharm" foi inoculado com 5 x 106 células em meio de crescimento (conforme indicado supra) suplementado com gentamicina na concentração de 5 μg/ml. Manteve-se o pH no valor de 7,3. Ao 12° segundo dia após a inoculação as células começaram a ser separadas do soro para se obter meio acondicionado isento de soro. A colheita do meio acondicionado começou ao 17° dia.
Exemplo 2
Purificação do receptor solúvel da eritropoietina dos seres humanos
Foram produzidas quatro preparações diferentes de R-EPO solúvel recombinante dos seres humanos. Na primeira preparação utilizou-se "Sepharose 6B", activada com epóxi (Pharmacia, Piscataway, NJ) , que foi acoplado com eritropoietina recombinante humana (EPOHu), essencialmente em conformidade com as instruções do fabricante. Adiciona-se 218 mg de EPOrHU em 4,5 ml de ZnCl2, 32 mM a 7,2g de "Sepharose 6B" activada com epóxi previamente hidratada e lavada com H2O. Titulou-se esta suspensão para o valor de pH 10,8 e depois misturou-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Todos os grupos reactivos restantes foram então bloqueados por adição de etanolamina até uma concentração final de 1 M, e depois misturados durante 4 21
horas à temperatura ambiente. Os passos subsequentes foram executados a 8°C ± 2°C. Empacotou-se uma coluna com a resina acoplada (epóxi-EPO) e lavou-se em ciclos alternados com NaCl 0,5 M/ HOAc 0,1 M a pH 4 e NaCl 0,5 M/ borato 0,1 M a pH 8. Equilibrou-se a coluna com NaCl 140 mM/ Tris 10 mM a pH 7,6 (STT, em inglês TBS), Carregou-se a coluna com 1560 ml de meio acondicionado produzido em garrafa giratória a partir de células de OCC que exprimem o R-EPO solúvel (R-EPOsHu). Depois de completada a cargalavou-se a coluna com NaCl 300 mM/Tris 10 mM a pH 7,6 e depois o R-EPOsHu ligado foi eluido com NaCl 1 mM/ ureia 3M/ Tris 10 mM a pH 7,6. Com este tampão ocorre a eluição de dois picos com absorção UV280 . Juntou-se toda a fracção do segundo pico, que contém o R-EPOsHU, e diluiu-se 20 vezes com H20. Com este produto diluído carregou-se' uma coluna precondicionada de 1 mL de "Mono Q" (Pharmacia) e efectuou-se a eluição com um gradiente de NaCl em Tris 10 mM a pH 7.6. Observa-se a eluição de uma fracção com um único máximo que é reunida, distribuída por aliquotas e guardada congelada a -80°C.
Na segunda preparação utilizou-se uma coluna maior de epóxi-EPO. Hidratou-se e lavou-se com H20 uma quantidade de 20,4 g de "Sepahrose 6B" activada com epóxi e depois lavou-se com acetona e finalmente com formamida a 50% em H20 a pH 10.6. Titulou-se para pH 10,6 numa quantidade de 729 mg de EPOrHu em 15 ml de H20, juntou-se à resina e misturou-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Todos os grupos reactivos restantes foram depois bloqueados por adição de etanolamina até uma concentração final de 1 M e misturou-se durante 140 minutos à temperatura ambiente. Os passos subsequentes foram efectuados a 8°C ± 2°C. Acondicionou-se o produto epóxi-EPO dentro de uma coluna e lavou-se com ureia 3M / NaCl 750 mM/ Tris 10 mM a pH 7,6 e a seguir equilibrou-se a coluna com STT (em inglês TBS). Utilizou-se 22 uma quantidade de 100 ml do meio acondicionado produzido no bioreactor a partir de células OCC que exprimem o R-EPOsHU e misturou-se com 2 ml de meio "Q Sepharose fast Flow" (Pharmacia). Efectuou-se a incubação durante 30 minutos a 8°C ± 2°C com mistura frequente e depois filtrou-se através de um filtro no topo da garrafa, feito com nitrato de celulose de 0,45 pm (Corning). Carregou-se a coluna de epóxi-EPO com o filtrado, lavou-se com NaCl 250 mM/ Tris 10 mM a pH 7,6 e depois efectuou-se a eluição com ureia 3 M, NaCl 750 mM/ Tris 10 mM a pH 7,6 e depois efectuou-se a eluição com ureia 3 M, NaCl 750 mM/ Tris 10 mM a pH 7,6. Juntou-se toda a fracção correspondente ao pico de eluição e diluiu-se 20 vezes com H20. Com este produto diluído carregou-se então uma coluna de 15 ml de "Q Sepahrose Fast Flow" e efectuou-se a eluição com um gradiente de NaCl em Tris 10 mM a pH 7,6. Juntou-se toda a fracção do único máximo observado, distribuiu-se por aliquotas e guardou-se congelada a -80°C.
Na terceira preparação utilizou-se a mesma coluna de epóxi-EPO que havia sido utilizada na preparação 2. Utilizou-se uma quantidade de 850 ml de meio acondicionado produzido na garrafa giratória a partir de células OCC que exprimem o R-EPO e misturou-se com 1,7 ml de "Q Sepharose Fast Flow". Os procedimentos subsequentes foram efectuados da mesma maneira que na preparação 2.
Na quarta preparação foram utilizados 7,25 1 do meio acondicionado produzido no bioreactor a partir de células de OCC que exprimem o R-EPOsHU e misturou-se com 110 ml de "Q Sepharose Fast Flow". Efectuou-se a sua incubação durante 1 hora a 8°C ± 2°C com mistura frequente e depois filtrou-se através de um filtro de topo de garrafa feito de nitrato de celulose de 0,45 micron. A seguir diluiu-se o filtrado com 7,25 1 de Η20 e carregou-se numa coluna de 770 ml de "Q Sepharose Fast Flow" equilibrada com tris 20 mM a 23 ρΗ 7,6. Efectuou-se a eluição da coluna com um gradiente de NaCl em Tris 20 mM a pH 7,6. Juntou-se as fracções que continham quantidades significativas de R-EPOsHu, conforme se concluiu por análise por SDS-PAGE. Acrescentou-se (NH4)2S04 sólido às fracções reunidas até uma concentração final de 1,2 M e depois filtrou-se através de um filtro de topo de garrafa, feito de nitrato de celulose de 0,45 μπι. Carregou-se uma coluna de 60 ml de "PhenylSepharose 6" (substituição fraca, Pharmacia) e efectuou-se a eluição com um gradiente a decrescer de 1,2 M até 0 M de (NPU^SCh em Tris 20 mM a pH 7,6. Juntou-se as fracções do pico principal e ajustou-se para 2,4 M em (NH4)2S04 para fazer precipitar o Rt-EPOsHU. Recolheu-se por centrifugação o R-EPOsHu precipitado, colocou-se novamente em suspensão em H20 e titulou-se para pH 7,9 com Tris.HCl. Filtrou-se a solução resultante através de um filtro de nitrato de celulose de 0,45 μιη, distribuiu-se em aliquotas e guardou-se congelada a -80°C.
Exemplo 3
Preparação e pesquisa de linhas celulares de hibridomas A. Ensaio de imunossorção ligado a enzimas (EIE)
Os EIE foram executados inicialmente para se determinar os títulos de anticorpos (Ac) séricos em cada animal e posteriormente para pesquisa dos hibridomas potenciais. Foram utilizadas placas de EIE/RIE de microtitulação de 96 cavidades de fundo redondo e de elevada ligação (Costar Corporation, Cambrídge, MA) que foram revestidas com R-EPOsHu purificado à razão de 5 \iq por ml de tampão de carbonato/ bicarbonato a pE 9,2 (Na2C03 0,015 M, NaHC03 0,035 M) . Juntou-se a cada cavidade 50 μΐ de Ac. 24
Revestiram-se depois as placas com película de acetato (ICN Bimedicals, Inc., Costa Mesa, CA) e efectuou-se a incubação à temperatura ambiente (TA) sobre uma plataforma oscilante durante 2 horas ou de um dia para o outro a 4°C. Utilizou-se R-EPOsHu do lote n°l a seguir ao primeiro e ao segundo estímulos e utilizou-se o lote n° 2 a seguir ao terceiro estímulo. Os lotes n°s 3 e 4 de R-EPOsHu foram utilizados para pesquisa dos hibridomas. Efectuou-se o bloqueio das placas durante 30 minutos à ta com uma solução de ASB à razão de 250 μΐ por cavidade, preparada misturando uma parte de diluente de ASB/concentrado de solução de bloqueio ("Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.") com 1 parte de água desionizada (dH20) . Depois de se ter deitado for a solução de bloqueio acrescentou-se a cada cavidade 50 μΐ de diluições séricas à razão de 1:2 (desde 1:400 até 1: 51200) ou dos sobrenadantes das culturas dos tecidos dos hibridomas. O diluente do soro foi a ASB a 1% (10% de diluente de ASB/ concentrado de solução de bloqueio diluído à razão de 1:10 em meio de tampão fosfato salino de Dulbecco (STP-D, em inglês D-PBS); Gibco BRL, Gran Island, NY) , ao passos que os sobrenadantes dos hibridomas foram testados sem terem sido diluídos. No caso dos testes efectuados aos hibridomas, manteve-se uma cavidade como contraprova de conjugado e manteve-se uma segunda cavidade como uma contraprova aos Ac. Efectuou-se nova incubação das placas ta em plataforma oscilante durante 1 hora e depois lavou-se 4 vezes utilizando uma preparação de IX de solução de lavagem concentrada 20 vezes ("Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.") em dt^O. Depois, durante 30 minutos, efectuou-se a incubação em cada cavidade de Ac secundário de cabra anti IgG de murganho de cadeia pesada e de cadeia leve específico conjugado com peroxidase de armoracia rusticana (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) diluído de 1:1000 em 1% BSA foi então incubado em cada 25 cavidade durante 30 minutos. As placas foram lavadas como anteriormente efectuou-se a transferência a seco e acrescentou-se substracto de um só componente de peroxidase de "ABTS" ("Kirkegaard e Perry Laboratories, Inc.").
Efectuou-se a leitura da absorvância a 405 nm para cada cavidade utilizando para tal um leitor de microplacas EL310 ("Bio-tek Instruments, Inc.", Winooski, VT) . Calculou-se metade do valor máximo do título de anticorpos séricos traçando um gráfico da variação de logio da diluição do soro em função da densidade óptica a 405 nm e extrapolando então o ponto correspondente a 50% da densidade óptica máxima obtida com esse soro. Considerou-se que os híbridomas eram positivos se o valor determinado para a densidade óptima fosse 5 vezes superior ao valor espontâneo. B. Imunização
Inj ectou-se por via subcutânea (ISC) 10 murganhos da estirpe Balb/c com 4,5 semanas de idade (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA), com 50 μς de R-EPOsHU (lote 1; antigénio) emulsionado em adjuvante de Freund Completo (AFC; 50% volume/volume; Difco Laboratories, Detroit, MI) . Estes animais foram estimulados (ISC) 4 semanas mais tarde com 25 μg de antigénio (Ag; lote 1) preparado de um modo idêntico, utilizando Adjuvante de Freund Incompleto (AFIC; Difco Laboratories, Detroit, MI) . Extraiu-se sangue dos murganhos pelas caudas 9 dias mais tarde e efectuou-se uma determinação dos títulos em anticorpos (Ac) no soro por meio de um ensaio de imunossorção ligado a enzimas (EIE). Uma vez que h do titulo máximo para cada murganho subiu acima de 5000, foram seleccionados animais individualizados para a preparação dos hibridomas. Foi necessário estimular novamente os três animais (n°s 7, 8 e 9) que foram 26 utilizados para a geração dos híbridos relevantes (n°s 71A e 73A) às 5 semanas e novamente às 29 semanas, utilizando respectivamente 12,5 μg de Ag (lote 1) e 25 pg de Ag (lote 2). Estes estímulos foram produzidos de forma idêntica à do estímulo inicial, isto é sob a forma de uma emulsão de AFIC a 50% volume/volume. A monitorização das titulações dos Ac séricos prosseguiu durante 9 dias a seguir a cada estímulo. Os títulos finais nesses murganhos antes da fusão foram de 5026, 6842 e 12 945 respectivamente para os animais com os números 7, 8 e 9. C. Fusão celular
Injectou-se por via intravenosa os animais com os números 7, 8 e 9 utilizando 25 pg de R-EPOsHu (lote n° 3) às 8 semanas a seguir ao estímulo final. Decorridos mais 4 dias os murganhos foram sacrificados com dióxido de carbono, tendo-lhes sido retirados os baços em condições estéreis para dentro de 25 ml de meio de Eagle Modificado por Dulbecco contendo penicilina G na concentração de 200 U/ml, sulfato de estreptomicina na concentração de 200 pg/ml e glutamina 4 mM (MEMD P/S/G 2x) . Removeu-se o excesso de tecido gordo dos baços e depois efectuou-se o enxaguamento através de três pratos contendo MEMD P/S/G 2x. A seguir foram transferidos para um saco estéril do tipo "Stomacher" (Tekmar, Cincinnati, OH) contendo 10 ml de MEMD P/S/G 2x e foram desfeitos até se obter uma suspensão de células simples, utilizando para tal uma homogeneizadora do tipo "Stomacher Lab Blender 80" (Seward Laboratory UAC House; Londres, Inglaterra) . À medida que as células se foram libertando da cápsula do baço para dentro do meio foram sendo retiradas do saco e foram obrigadas a passar através de um filtro de células de malha de nylon de 70 pm (Becton Dickinson and Company; Lincoln Park, NJ) . 27
Introduziu-se meio fresco dentro do saco, tendo o processo prosseguido até ser libertado todo o conteúdo celular dos baços. Estes esplenócitos foram lavados 3 vezes por centrifugação a 225 x g durante 10 minutos. Na primeira fusão foram utilizados os esplenócitos do animal n° 9; na segunda fusão foram reunidos os esplenócitos dos animais n°s 7 e 8.
Em simultâneo efectuou-se a lavagem, de uma forma idêntica, de culturas em fase logarítmica de células do mieloma de murganho Sp2/P-Agl4 (disponíveis na Colecção Americana de Culturas Tipo, Rockville, MD, com o n° CRL 1581 de admissão) que cresceram em meio completo (MEMD, 10% de soro fetal de bovino, glutamina 2 mM, aminoácidos não essenciais 0,1 mM, piruvato de sódio 1 mM e tampão de HEPES 10 mM; Gibco Laboratories, Inc., Grand Island, NY) . A partir desta população de mieloma foram retirados 4 xlO7 células (fusão 1) ou 8 x 107 células de (fusão 2) que foram misturadas com a suspensão de esplenócitos, tendo-se misturado tudo mais uma vez. Efectuou-se a aspiração do meio para o retirar do agregado celular e acrescentou-se suavemente ao meio durante o período de 1 minuto, 2 ml de polietileno-glicol (PEG 1500 (peso molecular); Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) para a fusão 1 e 3,5 ml de PEG para a fusão 2 a 37°C. A seguir acrescentou-se lentamente igual volume de MEMD P/S/G 2x. Deixou-se ficar as células em repouso a 37°C durante 2 minutos e depois acrescentou-se mais 9 ml de MEMD P/S/G 2 x. Deixou-se ficar as células outra vez em repouso a 37°C durante 4 minutos. Finalmente acrescentou-se à suspensão de células 30 mL de MEMD P/S/G 2 x e agregaram-se as células por centrifugação. Aspirou-se o meio para fora do agregado e com as células preparou-se suavemente nova suspensão em aproximadamente 56 ml (fusão 1) ou em 74 ml (fusão 2) de meio completo contendo penicilina G na concentração de 100 28 U/ml e sulfato de estreptomicina na concentração de 100 μς/πιΐ. As células foram então distribuídas sobre 10 placas de cultura de tecidos de 96 cavidades de fundo plano (Becton Dickinson Labware; Lincoln Park, NJ) por aplicação de gotas individuais com uma pipeta de 5 ml. Efectuou-se a incubação das placas em condições humidificadas a 37°C com 5% de C02, de um dia para o outro. No dia seguinte acrescentou-se a cada cavidade um volume igual de meio de selecção. O meio de selecção era constituído por hipoxantina 0,1 mM, aminopterina 4 x 1CT4 mM e timidina 1,6 x 10 -2 mM em meio completo. Efectuou-se a incubação das placas de fusão durante 7 a 10 dias com duas substituições de meio durante este período; utilizou-se meio de selecção com HAT a seguir a cada substituição de fluido. De cada cavidade que continha os híbridos foram retirados os sobrenadantes da cultura de tecidos e foram testados por EIE para pesquisa da reactividade específica dos anticorpos contra o R-EPOsHu. As 96 cavidades que eram positivas no protocolo de EIE foram a seguir novamente investigados. D. Manchas de Pingos
Foi utilizado o método das manchas de pingos de R-EPOsHu reduzido (lote n° 4) como método de pesquisa secundário para os híbridomas positivos no protocolo de EIE. Fez-se o ajustamento inicial do dispositivo de microtitulação de manchas de pingos de modelo "Dot Blot SF" (Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA) em conformidade com o manual de instruções; foram utilizadas membranas de nitrocelulose (9 cm x 12 cm; Bio-Rad Laboratories Inc.; Richmond, CA). 0 antigénio foi preparado em primeiro lugar por fervura durante 5 minutos, sob condições redutoras, com 2- mercaptoetanol (5% vol/ vol; Bio-Rad Laboratories.; Richmond, CA) em solução salina com tampão Tris (STT; Tris 29 10 mM a pH 7,5, NaCl 154 mM, azida de sódio (Na) a 0,01% peso/volume). Em cada cavidade introduziu-se vinte e cinco ng de R-EPOsHu (lote n° 4) e fez-se a aspiração através da membrana de nitrocelulose para ligação. As cavidades foram cheias com 250 μΐ de solução de "Blotto-Tween" (solução de bloqueio; leite em pó não gordo a 2% peso/ volume, Tris 50 mM a pH 7,5, NaCl 25 mM, EDTA 0,1 mM, Tween 20 a 0,09% volume/ volume, anti-espumante A a 0,01% vol/ vol) e manteve-se a incubar à ta durante 30 minutos. Aspirou-se a solução de bloqueio para fora das cavidades e repetiu-se o procedimento uma segunda vez para se garantir o bloqueio completo dos locais não específicos sobre a membrana. A seguir foram realizadas 3 lavagens através da membrana com. STP-D (em inglês D-PBS) contendo monolaurato de polióxido de etileno -sorbitano a 0,1% vol/ vol (Tween 20; Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA). A seguir juntou-se a cada cavidade noventa e cinco μΐ de meio acondicionado de hibridomas positivos no EIE e efectuou-se a incubação durante 45 minutos à ta. Lavaram-se as cavidades 3 vezes com STP-Tween (Tris 20 mM a pH 7,5, NaCl 50 mM, Tween 20 a 0,02% vol/vol) e 2 vezes com STP Tween (Tris 20 mM a pH 7,5, NaCl 50 mM, Tween 20 a 0,09% vol/vol), com 250 μΐ para cada lavagem e com aspiração através da membrana após cada adição. Durante 45 minutos e à ta incubou-se cada cavidade com cem μΐ de anticorpo secundário de cabra anti- IgG de murganho específico de cadeia pesada e de cadeia longa conjugado com peróxidase de armoracia rusticana (em inglês HRP) ( diluído a 1:1000 em STP-Tween; Boehringer Mannheim Bíochemicals; Indianapolis, IN) . Efectuou-se a lavagem das membranas conforme descrito antes, tendo estas sido removidas do aparelho de transferência e mergulhadas no reagente quimioluminescente reforçado já preparado (reagente QLR (em inglês ECL); Amersham Life Sciences, Corporation; Arlington Heights, IL) e depois foram expostas 30 a uma película fotográfica X-OMAT (Kodak Scientific Imaging, Rochester, New York). Quinze segundos mais tarde a película foi removida dos respectivos carregadores e revelou-se. A cada cavidade atribuiu-se uma classificação entre 3+ e 0 com base na intensidade dos pontos obtidos para cada um dos sobrenadantes dos hibridomas.
Exemplo 4
Anticorpo anti-R-EPO que se liga ao R-EPO A Anticorpo que se liga ao R-EPO por análise de tipo "Biacore"
Recorreu-se a uma análise de interacção bioespecífica (AIB) em tempo real (em inglês BIA) (Pharmacia Biosensor AB, CJppsala, Suécia) com base na ressonância do plasmão da superfície (RPS) (Fiagerstam et al. J. Mol. Recognition 3, 208 (1990); Malmbory et al., Scand. J. Immunol. _35, 64 3 (1992)) para pesquisar os anticorpos monoclonais positivos no protocolo de EISLE (em inglês ELISA).
Utilizou-se o R-EPQHu, preparado conforme descrito nos exemplos 1 e 2, e acoplou-se de forma covalente ao microcircuito detector CM5 através do grupo amina primária. A imobilização foi realizada com um caudal de HBS de 5 μΐ/ minuto (HEPES 10 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM e agente tensioactivo P-20 "BIAcore" na concentração de 0,05%). A matriz carboxilada do microcircuito detector foi activada primeiro com uma injecção de 40 μΐ de uma mistura 1:1 de EDB (N-etil-N-(dimetilamina-propil)-carbodiimida 400 mM em água, Pharmacia Biosensor AB) e de NHS (N-hidróxi-succinimida 100 mM em água, Pharmacia Biosensor AB). Injectou-se 65 μΐ de R-EPO solúvel (50 μg/ ml em acetato de sódio (Na)) 10 mM a pH 4,0) para imobilização sobre o circuito detector. Os grupos reactivos em excesso no 31 microcircuito detector foram desactivados por meio de. uma injecção de 50 μΐ de etanolamina (Pharmacia Biosensor AB).
Cada ciclo de análise inclui uma injecção de 20 μΐ de sobrenadante do hibridoma seguido por uma injecção de 10 μΐ de HC1 10 mM para a regeneração do microcircuito. Mediu-se a resposta RPS em Unidades de ressonância (UR). Para a maior parte das proteínas, 1000 UR corresponde a uma concentração superficial de aproximadamente 1 ng/mm2. Os resultados da pesquisa de 96 cavidades que foram positivas nos protocolos de EIE são apresentados no quadro 1. Nestas experiências, a linha de base é tipicamente de cerca de 20 UR. A ligação ao R-EPO é significativa para um valor de 50 UR e para valores superiores. 32 QUADRO1
Anticorpos naonodonais do R-EPO
.Airôcorpo (1) ‘BÍAcore’ (2) Grupo de competição BIAcore’ (3) Mwrescênda mé<liaSCAF(4) Wbiçlo daacflvidade ditEPO® Esítaulação das «Mas TJT7-EPO(6) 1 98 A - 2 8 NT NT NT 3 7 NT ** NT NT 4 65 ΝΓ ** NT NT S 13 NT “ NT NT 6 9 NT “ - 7 89 C ' NT NT 8 46 NT “ NT NT 9 29 NT NT NT 10 69 NT NT NT 11 4 NT ’ NT NT 12 153 C " NT NT 13 1499 B NT NT 14 87 NT NT NT 15 29 NT - NT NT 16 8 NT " NT NT 17 7 NT - NT NT 18 46 NT " - “ 19 9 NT ' NT NT 20 7 NT - NT NT 21 49 NT - NT NT 22 8 NT " NT NT 23 4 NT - “ 24 26 NT NT NT 25 8 NT " NT NT
Quadro 1 (cont)
Anticoipo ‘BIAjwtc’ Gnipode competição Eluorescêuda Inibição da adi viiktfe Estimulação das células 0) (?) ‘MAcore’® média SCAF(4) daEÉO© UTMEPO® 26 84 NT NT NT 27 2 NT NT NT 28 11 NT • , NT NT 29 1 NT - NT NT 30 270 A “ - 31 16 NT " " NT 32 18 NT “ NT NT 33 15 NT NT NT 34 25 NT - NT NT 35 363 A NT NT 36 4 NT - NT NT 37 16 NT * " 38 13 NT NT NT 39 574 B - " 40 15 NT “ NT NT 41 22 NT " NT NT 42 23 NT “ NT NT 43 6 NT NT NT 44 13 NT ’ NT NT 45 13 NT - NT NT 46 7 NT NT NT 47 10 NT - NT ' NT 48 5 NT NT NT 49 69 NT NT NT 50 345 C * 51 31 NT - NT NT 52 6 NT NT NT 34
Quadro 1 fcont.)
Anticorpo (1) ‘BIAcore’ (2) Grupo de compdição ‘BIAicorc’ (3) Fluorescência médiaSCAF(4} M)içãòiLu«iviila& daEPOg) Estimulação das células UT7-EPO (6) 53 130 A * NT NT 54 13 NT NT NT 55 34 NT “ * NT NT 56 11 NT ~ NT NT 57 10 NT NT NT 58 15 NT 14,99 "F ? 59 10 NT - NT NT 60 10 NT “ NT NT 61 48 NT NT NT 62 814 A " “ 63 1539 B * NT NT 64 1222 C NT NT 65 -5 NT ± ? 66 975 C “ m NT 67 1000 A * - 7 68 495 C - NT NT 69 877 A - - - 70 789 A - ? 71 1584 C 23,55 + (7) +++ 72 1190 B - " 73 354 C 13,71 “ H’ li 408 A 18,53 - 75 947 B " NT NT 76 6 NT - NT NT 77 434 C " " _ 78 119 • A ’ NT NT 79 8 NT “ NT NT 35
Quadro 1 fcont.1
ÁHiic/jqw ‘BIAcore’ GnçodeeouBprfçiio Eluorescêccia Inibição da aUMdade Esdmtílação das células (1) P) ‘BIAcore’ (3) máfiiiSCAF(4) daEPO(5) Ι7Γ7-ΕΡΟ (5) 80 11 NT * NT NT 81 4 NT NT NT 82 4 NT - . NT NT 82B -13 NT NT NT NT 83 1025 C - * " 84 5 NT NT NT 85 11 NT - NT NT 8(5 859 C * NT NT 87 4 NT 12,81 - 88 4 NT ± “ 89 -1 NT ' i " 90 4 NT " NT NT 91 0 NT - - 92 -3 NT - NT NT 93 2 NT - NT NT 94 5 NT “ NT NT 95 437 A - NT NT 95 7 NT NT NT O meio de cultura dos tecidos acondicionado pelos hibridomas que segregam os anticorpos indicados foi testado por meio dos ensaios indicados. Os sobrenadantes que contêm todos os anticorpos indicados dão um sinal positivo nos protocolos de EISLE. Os símbolos +++, ++, + indicam a existência de uma resposta positiva, indicando o símbolo +++ aqueles em que o efeito foi maior. 0 símbolo - indica uma resposta inferior ou igual à resposta do meio de contraprova. A abreviatura NT indica que as amostras não foram testadas. 0 símbolo ? identifica as amostras a que não foi possível atribuir uma resposta. (1) Os anticorpos 1-61 são dos murganhos com os números 7 e 8. Os anticorpos 62-96 são do murganho n“ 9, 36 (2) Unidades de resposta pelos AcM utilizando o microcircuito "BIAcore" ao qual se encontra acoplado o R-EPOsHu. (3) A competição no "Biacore" foi com o AcM 1G2 anti-R-EPOsHu. 0 R-EPOsHu ligado a um microcircuito detector foi incubado com IG2 e depois determinou-se o efeito da ligação do AcM comparado com a ligação ao R-EPO que não havia sido pré-incubado com 1G2. Os anticorpos cuja ligação foi completamente bloqueada (80%—100%) são designados por A Os anticorpos cuja ligação foi bloqueada entre 50% e 80% são designados por C. Os anticorpos cuja ligação foi bloqueada em menos de 50% são designados por B. (4) São apresentados os valores para os anticorpos que conferem às células uma fluorescência média superior à da contraprova (12,73). O símbolo identifica os anticorpos com uma fluorescência média inferior ou igual à da contraprova. (5) Inibição da incorporação de 3H pelas células UT7-EP0. Efectuou-se a incubação conjunta com as células de 30 mUnidades de EPO e de quantidades variáveis de anticorpo. Após uma incubação que teve lugar de um dia para o outro, efectuou-se a marcação radioactiva pulsada das células com 3H-timidina e determinou-se a quantidade de radiação incorporada em unidades de contagem. Definiu-se uma resposta positiva como sendo aquela em que houve uma diminuição progressiva com quantidades cada vez maiores de anticorpo. (6) Estimulação da incorporação de 3H pelas células UT7-EP0. Efectuou-se a incubação de quantidades variáveis de anticorpos com as células. Após uma incubação que teve lugar de um dia para o outro, efectuou-se a marcação radioactiva pulsada das células com 3H-Timidina e determinou-se a quantidade de radiação, incorporada em unidades de contagem. Definiu-se uma resposta positiva como sendo aquela em que houve um aumento progressivo com quantidades cada vez maiores de anticorpo. (7) A inibição ocorreu a uma concentração superior à necessária para activar. B. Análise de competição dos epítopos 37
Foi possível saturar o microcircuito detector, que estava imobilizado com R-EPOsHu, por meio de uma injecção de 65 μΐ de 1G2 do sobrenadante do hibridoma. 0 1G2 é um anticorpo monoclonal criado contra a R-EPOsHu utilizando o procedimento descrito no exemplo 3. Cada ciclo de análise inclui injecções de 20 μΐ do sobrenadante do hibridoma na presença e na ausência de um epítopo saturável pela injecção de 65 μΐ de 1G2. A razão entre o sinal de ligação em UR de uma injecção de 20 μΐ por si só é por definição a percentagem (%) de bloqueio pelo 1G2. Aqueles anticorpos com um bloqueio entre 80% e 100% são classificados como pertencentes ao grupo A, aqueles com um bloqueio inferior a 50% são incluídos no grupo B e aqueles em que o bloqueio ficou compreendido entre 50% e 80% correspondem ao grupo C. Os resultados são ilustrados no quadro 1. C. Ligação do anticorpo à R-EPOd4Q sobre células de OCC transfectadas, por análise de selecção de células activadas pela fluorescência (SCAF)
Os sobrenadantes dos hibridomas criados contra a R-EPO foram testados por análise por SCAF para pesquisa da ligação ao receptor de EPO sobre a superfície de células de OCC transfectadas com o pDSRaEPORd40. As células de OCC transfectadas com o ADN que codifica para o receptor de EPO de d4 0 foram construídas conforme descrito no exemplo 1. As células de OCC/R-EPO foram raspadas para fora dos pratos de cultura de tecidos e novamente colocadas em suspensão, como células individuais, numa solução de STP/ASB a 0,5% e depois foram distribuídas sobre uma placa de 96 cavidades de fundo redondo à razão aproximada de 3 x 105 células/ cavidade. Depois colocou-se a placa na centrífuga a trabalhar a 1000 x g durante 5 minutos. Após a centrifugação, removeu-se o sobrenadante de STP/ASB e com 38 cada agregado de células preparou-se nova suspensão, quer em meio de contraprova, quer num dos sobrenadantes do hibridoma de R-EPO. Efectuou-se a incubação das células a 4°C durante 1 hora. A seguir à incubação efectuou-se a lavagem das células com STP/ASB e depois preparou-se nova suspensão dessas células numa solução de anticorpo monoclonal de cabra anti-murganho marcado com isotiocianato de fluoresceína (ITCF) (Southern Biotech, Birmingham Ala) . Efectuou-se a incubação das células outra vez a 4°C durante 1 hora, tendo depois sido lavadas e analisadas por SCAF. Dos 96 sobrenadantes testados havia 5 que tinham uma fluorescência celular média superior à do meio de contraprova (ver o quadro 1) . 0 AcM 71 originou o nivel mais elevado de fluorescência, seguindo-se os AcM 74, 58, 73 e 87. Não houve mais nenhuns sobrenadantes testados que tivessem exibido uma fluorescência acima dos valores de contraprova.
Exemplo 5
Purificação de anticorpos anti-R-EPO e de fragmentos de Fac A Produção de fluido ascítico
Foram utilizados murganhos da estirpe Balb/c (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) com idade superior a 5 semanas, que foram estimulados com 2,4,10,14-tetrametil-pentadecano (Pristane; Sigma, St. Louis, MO) entre 7 a 10 dias antes da injecção de linhas celulares. Cada murganho recebeu uma única injecção intraperitoneal de 0,5 ml; foram injectados entre 10 e 20 animais com cada linha celular para a qual se pretendia preparar o fluido ascítico.
As linhagens de hibridomas cresceram em meio completo até ter sido atingida a confluência e foram lavadas uma vez 39 com STP-D (em inglês D-PBS) e depois foram contadas utilizando para tal o hemacitómetro de modelo "Neubauer". Cada murganho foi depois injectado por via intraperitoneal com 107 células, tendo sido mantidos em laboratório com ração para roedores e água ad libitum, até se ter desenvolvido o fluido ascítico. Efectuou-se uma monitorização dos murganhos para investigar a formação máxima do fluido ascítico, tendo os animais sido sacrificados em atmosfera de CO2 e tendo-lhes sido introduzidas cânulas para recolha do fluido, utilizando para tal uma agulha de calibre 18G inserida na cavidade repleta de fluido. Clarificou-se o fluido por centrifugação a 225 x g durante 15 minutos ou durante 3 minutos numa microcentrífugadora (Eppendorf). A seguir foram guardadas aliquotas de 4 ml a -20°C, até serem purificadas por cromatografia em coluna de "Proteína A".
B, Purificação de anticorpos monoclonais pela proteína A
Purificou-se a imunoglobulina proveniente de 4 ml de fluido ascítico ou de 10 ml de meio acondicionado dos hibridomas, recorrendo para tal à cromatografia em coluna com "Proteína A". Utilizou-se 0 sistema II de purificação de anticorpos monoclonais da "Bio-Rad" (MAPS II; Bio-Rad Laboratories; Richmond, CA): Dito de forma abreviada, aplicou-se 5 ml de uma suspensão de "Proteína A" em Affi-gel" a uma coluna de vidro descartável de 1 cm x 10 cm. 0 gel de "Proteína A" foi lavado aproximadamente com 30 ml de DTP-D e depois fez-se a preparação fazendo passar através da coluna 20 ml de tampão de ligação (tampão de ligação MAPS II; Bio-Rad). A seguir introduziu-se o fluido ascítico ou o meio acondicionado diluído a 1:1 com tampão de ligação pela parte de cima da coluna e deixou-se eluir. Após a ligação da imunoglobulina à "Proteína A" deitou-se fora a 40 fracção não ligada. A seguir lavou-se a coluna de proteína não ligada com 30 ml de tampão de ligação para se obter uma absorvância inferior a 0,01 com leitura a 280 nm. A fracção que continha a imunoglobulina foi então objecto de eluição com aproximadamente 30 ml de tampão de eluição da "Bio-Ras". Substituiu-se o tampão desta fracção de um dia para o outro a 4°C por diálise em presença de 4 1 de STP-D. A imunoglobulina resultante equilibrada com STP foi concentrada por centrifugação a 1700 x g em unidades de concentração de modelo "Centricon" (Amicon Inc., Beverly, MA) . C. Fraccionamento do domínio de ligação dos anticorpos
Fraccionou-se ainda mais a imunoglobulina purificada pela "Proteína A", de modo a obter-se 2 partes componentes, a fracção cristalizável (Fc) e a fracção de ligação dos anticorpos (Fia, em inglês Fab), utilizando um estojo de preparação "Pierce ImunoPure Fab" (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) . A imunoglobulina purificada pela "Proteína A" foi objecto de diálise em tampão de fosfato 20 mM/ EDTA a 10 mM a pH 7,0 e depois concentrou-se até ao valor aproximado de 20 mg/ml. Efectuou-se o fraccionamento de dez mg de imunoglobulina. O gel de papaína imobilizado foi lavado duas vezes com tampão de digestão que continha 42 mg de cisteína em 12 ml de tampão fosfato, tal como fornecido. A seguir adicionou-se a amostra de imunoglobulina ao gel e incubou-se a 37°C, num agitador rotativo de um dia para o outro. A fracção Fia solubilizada foi separada da fracção Fc e da imunoglobulina não digerida, por purificação com a "Proteína A"; a fracção não ligada foi recolhida e designada por amostra Fia. Esta parte não ligada foi submetida a diálise de um dia para o outro na presença de 4 41 1 de STP-D a 4°C e depois concentrou-se conforme se descreveu anteriormente.
Exemplo 6
Cartografia do epitopo de AcM 71 no R-EPO
Efectuou-se a sobreposição de péptidos sintéticos com 17 a 30 aminoácidos de comprimento de modo a abranger os resíduos 1 a 224 do receptor de EPO dos seres humanos, em que o resíduo 1 é a prolina e o resíduo 224 é o ácido aspártico. Os 10 péptidos diferentes ficaram sobrepostos em 6 aminoácidos de ambas as extremidades. As sequências dos péptidos e a sua localização dentro da sequência de aminoácidos da R-EPO são as seguintes: SE-1 PPPNLPDPKFESKAALLAARGPEELCFTE (resíduos 1-30) SE-2A LLCFTERLEDLVCFWEEA (resíduos 25-42) SE-2B CFWEEAASAGVGPGNYSF (resíduos 37-54) SE-3 PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV (resíduos 49-78) SE-4 TARGAVRFWCSLPTADTSSFVPLELRVTAA (resíduos 73-102) SE-5 LRVTAASGAPRYHRVIHINEVVLLDAPVGL (resíduos 97-126) 42 SE-6 DAPVGLVARLADESGHVVLRVLPPPETPMT (resíduos 121-150) SE-7 PETPMTSHIRYEVDVSAGNGAGSVQRVEIL (resíduos 145-174) SE-8 QRVEILEGRTECVLSNLRGRTRYTFAVRAR (resíduos 169-198) SE-9 FAVRARMEAPSFGGFWSAWSEPVSLLTPSDLD (resíduos 193-224)
Revestiram-se cavidades de poliestireno (Costar, Cambridge, MA) com os péptidos de R-EPO referidos supra em concentrações de 100 pg/ml, 20 μρ/κιΐ e 0,8 μg/ml, em tampão de carbonato/ bicarbonato respectivamente (Na2C03 0,015 M e NaHC03 0,035 M a pH 9,2). Efectuou-se a incubação da placa à temperatura ambiente (ta) durante 2 horas e depois de um dia para o outro a 4°C. Efectuou-se o revestimento com o R-EPOHu solúvel, nas concentrações de 10 pg/ml, 2 pg/ml, 0,4 μg/ml e 0,08 μg/ml como contraprovas positivas nas mesmas condições. Após o bloqueio com ASB a 5% em STP à ta durante 30 minutos, efectuou-se a incubação da placa com o AcM 71 purificado conforme descrito no exemplo 5, para uma concentração de 5 μρ/πιΐ em ASB a 1% à ta durante 2 horas. Após a lavagem com tampão de lavagem (Kirkegaard and Perry Labs, Inc.), manteve-se a placa a incubar com uma diluição a 1:1000 de anticorpo de cabra anti-IgG de murganho conjugado com peroxidase de armoracia rusticana (Boehringer Mannheim) durante 1 hora à ta. Lavou-se a placa e revelou-se com solução de substracto de "ABTS" (Kirkegaard e Perry Labs, Inc.). As medições colorimétricas foram realizadas a 405 nm. Os resultados da ligação do AcM aos péptidos sintéticos são ilustrados na figura 1 e indicam que o AcM 43 71 liga quantidades significativas de péptido SE-3 (resíduos de aminoácidos 49 a 78 inclusivé do R-EPO dos seres humanos), comparativamente com os outros péptidos testados. Isto indica que o AcM 71 se liga a uma região do R-EPO dos seres humanos que contém os resíduos 49 a 78 ou que se sobrepõe a eles.
Exemplo 7
Actívidades dos anticorpos anti-R-EPO em ensaios de proliferação de células
Foram estudados anticorpos, em meio acondicionado e preparado conforme descrito acima para se investigar a sua capacidade para estimularem a incorporação de 3H-timidina pelas células UT7-EP0 (Komatsu et al. supra). As células UT7-EP0 reagem à EPO e exprimem os receptores de EPO dos seres humanos sobre as suas superfícies celulares. As células de UT7-EP0 cresceram em meio de crescimento (meio de Dulbecco modificado por Iscove IX com L-glutamina, tampão HEPES 25 mM e bicarbonato de sódio na concentração de 3024 mg/1, mas sem α-tioglicerol ou β-mercaptoetanol (GIBCO)/ soro fetal de bovino a 10% v/v / solução de L-glutamina- penicilina- estreptomicina a 1% v/v (Irvine Scientific)/ EPOrHu na concentração de 1 Unidade/ml) aproximadamente até 3 x 105 células/ml. Efectuou-se a colheita das células por centrifugação (aproximadamente 500 x g) , tendo sido lavada duas vezes com solução salina de tampão fosfato e novamente colocadas em suspensão à razão de 5 x 104 células/ ml em meio de ensaio (meio RPMI 1640 IX sem L-glutamina (Gibco) / 1 % de L-glutamina/ 4% de soro fetal de bovino) . Às cavidades de uma placa de microtitulação de 96 cavidades adicionou-se as amostras de teste ou EPO padrão (EPOrHu) numa quantidade de 100 μΐ 44 diluídos em meio de ensaio, pelo menos 5 vezes. A seguir adicionou-se 50 μΐ de células (5000 células/ cavidade) e efectuou-se a incubação das placas numa incubadora humidificada a 37 °C e em atmosfera com 5% de CO2. Decorridas 72 horas, adicionou-se 50 μΐ de metil- 3H-timidina (1 mCi/ml; 20 Ci/mmol) diluída a 1:100 em meio de ensaio. Efectuou-se a incubação das células durante mais 4 horas a 37°C e em atmosfera com 5% de CO2. As células marcadas foram colhidas sobre placas filtrantes de fibra de vidro tendo para tal sido utilizado o dispositivo de colheita de células PHD (Cambridge Technology Inc.) e tendo sido utilizada água desionizada como solução de lavagem. No fim lavou-se os filtros uma vez com 2-propanol e a seguir efectuou-se a secagem e a contagem num contador de cintilação de modelo "Beckman LS6000IC". O meio acondicionado proveniente das placas de cultura de tecidos contendo os AcM anti-R-EPO foram testados para pesquisar a sua capacidade para estimularem a proliferação, conforme descrito antes. Foram testadas amostras para várias diluições. Definiu-se como respostas positivas aquelas que estimularam a incorporação de timidina pelo menos 2 vezes comparativamente à linha de base, e donde resultou também uma estimulação cada vez menor à medida que as amostras foram sendo diluídas. Conforme se observa no quadro 1, duas das 24 amostras testadas deram origem a uma resposta positiva (os AcM 71 e 73). Há quatro amostras que podem ter eventualmente uma actividade estimuladora fraca (? No quadro 1) . As amostras restantes não originaram um aumento significativo em relação à linha de base. Um soro policlonal de murganho utilizado para gerar anticorpos monoclonais também estimulou a incorporação de timidina. Isto sugere que o anticorpo policlonal neste soro também foi capaz de estimular a proliferação de células UT7-EP0. 45
Os sobrenadantes também foram testados para se pesquisar a sua capacidade para inibirem a estimulação, induzida pela EPO, da incorporação da timidina pelas células UT7-EP0. Efectuou-se a incubação das células com EPOrHu na concentração de 25 mUnidades/ml e com quantidades variáveis de meio acondicionado que continha os anticorpos. Mediu-se a incorporação da timidina conforme anteriormente descrito. Os resultados estão indicados no quadro 1. A maior parte dos anticorpos não diferiu de forma significativa do meio de contraprova. Dos anticorpos que demonstram possuir capacidade de inibição da incorporação de timidina, houve duas amostras (os AcM 58 e 73) que demonstraram uma capacidade de inibição definida, ao passo que houve três amostras (os AcM 65, 88 e 89) que demonstraram uma possível capacidade de inibição. 0 AcM 73 inibiu os valores mais elevados das doses, mas para as doses mais baixas estimulou a incorporação de timidina acima dos valores de contraprova.
Exemplo 8
Activação do R-EPO pelos anticorpos e seus fragmentos anti-R-EPO A Ensaio de proliferação das células UT7-EP0
Efectuou-se a purificação dos AcM 71 e 73 conforme descrito no exemplo 5. Determinou-se a actividade proliferativa com ensaios de incorporação da timidina pelas células UT7-EP0, descritos no exemplo 7. Qualquer dos AcM 71 e 73 estimulou a incorporação pelas células UT7-EP0 segundo uma forma dependente da dose, tal como aconteceu com a EPOrHu (ver a figura 2) . A actividade foi reduzida aos valores mais elevados das doses de AcM 71. Foram 46 observados máximos da actividade estimuladora para as doses de 1-2 μρ/ιηΐ no caso do AcM 71 e para doses superiores a 100 pg/ml no caso do AcM 73. Não houve estimulação com um anticorpo de contraprova não neutralizante (o AcM F12 anti-EPO) , o que sugere que a estimulação é específica para os anticorpos dos receptores da EPO.
B. Ensaios a frio de deslocamento da EPO
Os anticorpos para os receptores da EPO podem ligar-se à mesma região a que se liga a EPO. Para se testar esta possibilidade foram realizados ensaios de deslocamento a frio utilizando células OCIM1. As células OCIM1 são de origem humana e sabe-se que contêm receptores da EPO sobre as suas superfícies celulares (Broudy et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_5, 6517 (1988)). As células cresceram em meio de crescimento OCIMl (Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (MDMI)/ 10% de soro fetal de bovino/ 1 % de pen estrep-fungisona) até ao valor aproximado de 2-5 x 105 células/ml. Efectuou-se a colheita das células por centrifugação, lavou-se 2 vezes em tampão de ligação (RPMI 1640/ 1% de ABS/HEPES 25 mM a pH 7,3), tendo sido depois recolocadas novamente em suspensão em tampão de ligação contendo 0,1% de azida e citocalisina B na concentração de 10 pg/ml, à razão de 1-2 x 107 células/ml. As células (100 μΐ) contidas nas placas de cultura de tecidos de 96 cavidades foram então incubadas com 10 μΐ de amostra e 10 μΐ de 125I-EPO (Amersham; elevada actividade específica; 3000 Ci/mmol, 2 μΟί/ιππιοΙ, 2 μΟί/πιΙ) numa incubadora de cultura de tecidos, humidificada e a 37°C. Decorridas 3 horas efectuou-se a centrifugação das células, através de óleo de ftalato (ftalato de dibutilo/ dinonilo a 60:40 (v/v)) em tubos de ensaio para titulação. Os tubos que 47 continham as células foram rapidamente congelados num banho de neve carbónica/ etanol e a massa de células foi rapidamente acondicionada tendo sido depois feita a contagem num contador automático de radiação γ de modelo LKB 1277. A figura 3 mostra os resultados da experiência de deslocamento a frio. Foram deslocadas quantidades cada vez maiores de 125I-EPO a partir dos receptores de EPO sobre as células, à medida que foi aumentando a quantidade adicionada de EPOrHu não marcada. De um modo semelhante, o AcM 71 purificado, conforme descrito no exemplo 5, também deslocou quantidades cada vez maiores de 125I-EPO, à medida que foram aumentando as quantidades de anticorpos. Neste caso, foi necessário aproximadamente 4000 vezes mais AcM 71 do que EPOrHU para deslocar quantidades equivalente de 125I-EPO. Pelo contrário, o AcM 73 revelou indícios de deslocamento para as doses mais elevadas, mas um AcM (F12) anti-EPOrHu não neutralizante não fez um deslocamento significativo. Estes resultados indicam que o AcM F12 não interferiu com a ligação da EPO com o seu receptor, mas que isso aconteceu com o AcM 71 e 73. Este resultado indica também que o AcM 71 se liga ao receptor da EPO e que o activa ao ligar-se no local de ligação da EPO ou próximo desse local. C. Comparação das actividades do AcM 71 e do Fia 71
Efectuou-se a preparação de fragmentos de AcM 71 do receptor da EPO conforme descrito no exemplo 5. As preparações foram caracterizadas por electroforese em gel de DSS (Laemmli et al., Nature 227, 680 (1970), conforme ilustrado na figura 4. As amostras foram fervidas em tampão de amostras contendo 2% de DSS na presença ou na ausência de 2-mercaptoetanol 0,7 M, para se efectuar a distinção 48 entre proteínas reduzidas (com 2-mercapto-etanol) e não reduzidas (sem 2-mercaptoetanol), e a seguir fizeram-se correr as amostras sobre geles de acrilamida-DSS a 12,5%. Os geles foram contrastados com o corante azul de coomassie para permitir a visualização das proteínas. Estimou-se o tamanho das proteínas comparando as suas mobilidades com as mobilidades de padrões proteicos. Os AcM 71 e 73, separados em cadeias leves e pesadas, foram experimentados em condições redutoras. As cadeias pesadas possuíam aproximadamente 52 kDa. A cadeia leve do AcM 73 era ligeiramente mais pequena (28 kDa) do que a do AcM 71 (28,5 kDa). Os fragmentos Fia também tinham duas cadeias: de 28,3 e 27,3 kDa no caso do Fia 71 e de 27,5 e 26,5 kDa no caso de Fia 73. Quando estes fragmentos Fia foram corridos em condições não redutoras, os tamanhos dos Fia 71 e 73 foram aproximadamente 48 e 47 kDa respectivamente. Isto significa que os fragmentos Fia são monovalentes e que o complexo possui uma de cada uma das cadeias leves e pesadas. Pelo contrário, as mobilidades sobre os geles de DSS não redutores, no caso dos AcM 71 e 73, indicaram que os seus tamanhos eram aproximadamente de 200 kDa. Isto significa que estes AcM são bivalentes e que há duas de cada tipo de cadeias pesadas e leves. Para ver se os fragmentos Fia 71 monovalentes poderiam activar o receptor de EPO, fez-se uma incubação de AcM 71 e de fragmento Fia 71 com células UT7-EPO e mediu-se a incorporação de timidina conforme descrito no exemplo 7. Conforme se observa na figura 5, tanto a EPOrHu como o AcM 71 estimularam a incorporação de timidina. No entanto, o fragmento Fia 71 monovalente não fez tal estimulação. Um anticorpo monoclonal de contraprova criado contra um receptor não congénere (Her2/neu) também não estimulou a incorporação de timidina. Isto significa que os anticorpos têm de ser bivalentes para poderem activar o receptor. 49 D. Estimulação da incorporação de timidina por acção do AcM 71 e do Fia 71 na presença de EPQrHu 0 facto de o AcM 71 inibir a ligação de EPO aos receptores de EPO sugere que o anticorpo pode não activar o receptor de EPO na presença de EPO. Para se testar esta hipótese efectuou-se a incubação de células UT7-EP0 com EPOrHu na concentração de 30 mUnidades/ml e com quantidades variáveis de AcM 71, Fia 71 ou AcM de contraprova (criado contra Her2/neu). Mediu-se a incorporação de timidina conforme descrito supra. Conforme se observa na figura 6, tanto o AcM 71 como o Fia 71 inibiram a incorporação de timidina para valores elevados de doses. No entanto, para doses, compreendidas aproximadamente entre 30 e 3000 μρΛηΙ, o AcM 71 estimulou a incorporação de timidina acima dos níveis estimulados pela EPOrHu por si só. O Fia 71 e os anticorpos de contraprova não revelaram este efeito. Isto significa que o AcM 71 e a EPOrHu podem ter um efeito aditivo na activação do receptor da EPO.
Exemplo 9
Estimulação da formação de colónias eritróides pelos anticorpos anti-R-EPO
Para se verificar se o AcM 71 purificado poderia estimular a formação de células eritróides a partir de precursores no sangue periférico, realizou-se um ensaio "BFUe". Para purificar os precursores de células eritróides realizou-se a linfoforese de dadores humanos normais, em conformidade com um protocolo convencional. As células da linfoforese (250 ml) foram lavadas com 250 ml de solução salina equilibrada de Hank (SSEH, em inglês HBSS) . Com as 50 células preparou-se nova suspensão em SSEH e efectuou-se a sua separação por centrifugação em função do gradiente de densidade ("Ficoll-paque") durante 30 minutos a 500 x g. As células de baixa densidade (BD) foram retiradas do gradiente e lavadas com 500 ml de SSEH e novamente colocadas em suspensão em STP suplementado com 0,5% de albumina do soro de bovino e EDTA 5 mM, segundo uma concentração de 5 x 108 células/ml. As células de BD foram então purificadas ainda mais tendo para tal sido utilizado o estojo de isolamento de células progenitoras de CD34 (Qbend/10) fabricado por "Miltenyi Biotech GmbH'7. Resumidamente, efectuou-se a marcação das células com um anticorpo monoclonal anti-CD34 e foram então ligadas a microsferas magnéticas de acordo com o protocolo. A seguir fez-se passar essas células marcadas através de colunas de separação "MiniMacs" pré-carregadas, efectuou-se a lavagem das colunas e a seguir efectuou-se a eluição das células CD34+ nas colunas. Repetiu-se este processo mais uma vez para se obter células CD34 + com uma pureza ainda mais elevada. O ensaio in vitro foi realizado em células CD34+ purificadas, conforme descrito por Iscove et al. (J. Cell. Physiol. 83_, 309 (1974)), com as modificações a seguir enunciadas. 0 meio. de cultura foi obtido na "Gibco BRL" (estojo de proliferação de células progenitoras de medula óssea; Grand Island, NY) . Para se preparar em duplicado amostras de 1 ml sobre placas de cultura de tecidos de 35 mm x 100 mm, preparou-se um excesso de 3 ml em tubos de poliestireno estéreis de 17 x 100. Em cada tubo introduziu-se 2,5 ml de meio de crescimento de células progenitoras, 0,1 ml de células CD34+ (recolocadas em suspensão à razão de 90 000 células/ ml), 0,015 ml de factor de células progenitoras (20 \iqí ml) e uma combinação de amostra e de meio de diluição de células progenitoras, de modo a ser igual a 0,385 ml. Os tubos foram agitados vigorosamente num 51 vórtice e a seguir deixados em repouso para permitir a subida de bolhas de gás. Depois distribuiu-se os seus conteúdos por aliquotas utilizando uma seringa de 3 ml equipada com uma agulha de calibre 17x1-1/2. Mantiveram-se as placas a incubar a 37°C numa incubadora de cultura de tecidos humidificada em atmosfera com 10% de CO2. As colónias eritróides foram classificadas (pela cor variando entre laranja e vermelho) ao fim de 21 dias. Não foram observadas colónias eritróides nas placas a que faltava a EPO ou o AcM 71. A EPOrHu (30 mUnidades/placa) deu origem a mais.de 400 colónias por placa. O AcM 71 também produziu colónias eritróides. Observou-se actividade máxima a 2-6 μς/ιηΐ.' Este resultado significa que o AcM 71 estimula a formação de colónias eritróides.
Testou-se também a actividade do AcM 71 purificado para se pesquisar a sua capacidade para formar colónias eritróides, utilizando meio isento de soro descrito no pedido de patente de invenção norte americano em parceria n° 08/079,719 que é aqui incorporado por referência com as modificações enumeradas a seguir. Efectuou-se a preparação dos tubos de ensaio sem se utilizar moléculas da matriz extracelular, hidrocortisona e os factores de crescimento FCE, FCF e FCDP. Conforme descrito acima, preparou-se uma quantidade de 3 ml de amostra para produzir em duplicado amostras de 1 ml sobre as placas. Introduziu-se em cada tubo 0, 030 ml de cada uma das solução mãe 100 x (2-mercaptoetanol, nucleósidos, colesterol, piruvato de sódio, transferrina-Hu, lipidos, insulina-Hu), 0,4 ml de ASB desionizada (15%), 0,015 ml de FSP (em inglês SCF) (20 μg/ml), 0,1 ml de células CD34+ (recolocadas em suspensão à razão de 300 000 células/ml), 1,080 ml de metilcelulose (2,3%) e uma combinação de amostra e de MDMI de modo a igualar 1,195 ml, em que a quantidade de amostra não foi superior a 150 μΐ. A seguir efectuou-se a incubação das 52 placas conforme acima descrito e fez-se a avaliação das colónias ao fim de 21 dias. Foram observadas colónias eritróides quando foram feitas crescer na presença de EPO, ou AcM 71, mas não nas condições em que faltavam estes dois factores. A figura 7 ilustra um exemplo dos tipos de colónias eritróides observadas. As colónias incubadas com 25 mUnidades de EPOrHu pareceram semelhantes às que cresceram com o ACM 71 purificado na concentração de 2,1 pg/ml. As doses mais elevadas de EPOrHU originaram colónias maiores. A figura 8 ilustra uma curva de tipo dose-resposta. Observa-se um máximo de actividade do AcM 71 para doses compreendidas entre 1 e 5 μρ/πιΐ. Doses mais baixas e doses mais elevadas originaram menos colónias eritróides. Um anticorpo monoclonal de contraprova criado contra Her2/neu não produziu nenhumas colónias para doses neste intervalo. Este resultado significa que o AcM 71 irá estimular a formação de colónias eritróides a partir de precursores eritróides e que não é necessário acrescentar nenhum soro. Assim, o AcM 71 pode estimular a diferenciação de precursores eritróides, dando origem a células eritróides.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em termos das concretizações preferidas entende-se que os peritos no estado da técnica podem conceber variações e modificações. Assim, sendo, pretende-se que as reivindicações em anexo abranjam todas essas variações equivalentes possíveis que estejam contidas no âmbito da invenção, tal como reivindicada. 53
LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Amgen Inc.
(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: ANTICORPOS QUE ACTIVAM UM RECEPTOR DA ERITROPOIETINA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 3
(iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA (A) ENDEREÇO: Amgen Inc. (B) RUA: 1840 Dehavilland Drive (C )CIDADE: Thousand Oaks (D) ESTADO: Califórnia
(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL : 91320-1789 (iv) FORMA A SER LIDA POR COMPUTADOR:
(A) TIPO DE MEIO: DISKETTE
(B) COMPUTADOR: IBM PC compatível (C )SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/HS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DO PEDIDO: (C )CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE: (A) NOME: Winter Robert B. (B) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: A-307 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: CTCCAAGCTT GCCGTCACCA TGGACCACCT CGGGGCGTCC CT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:
CAGGTCTAGA TTACTAGGGA TCCAGGTCGC TAGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN 55 (xí) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:
AGGTCGACTA CTAGTAGTCA GTTGAGA LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Amgen Inc. (íi) TÍTULO DA INVENÇÃO: Anticorpos que activam um receptor da eritropoietina (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 13
(iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA (A) ENDEREÇO: Amgen Inc. (B) RUA: 1840 Dehavilland Drive (C )CIDADE: Thousand Oaks (D) ESTADO: Califórnia
(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL : 91320 (v) FORMA A SER LIDA POR COMPUTADOR:
(A) TIPO DE MEIO: DISKETTE (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível
(C )SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/HS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DO PEDIDO: (C )CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE: (A) NOME: Winter Robert B. (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: A-307 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C ) TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: CTCCAAGCTT GCCGTCACCA TGGACCACCT CGGGGCGTCC CT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:
CAGGTCTAGA TTACTAGGGA TCCAGGTCGC TAGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN 57
(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: AGGTCGACTA CTAGTAGTCA GTTGAGA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:
Pro Pro Pro Asn Leu 5 Pro Asp Pro Lys Phe 10 Glu Ser Lys Ala Ala Leu 15 Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu Glu Leu Cys Phe Thr Glu 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: . (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:
Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Vai Cys Phe Trp Glu 5 10 15 58
Glu Ala (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:
Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Vai Gly Pro Gly Asn 1 5 10 15
Ser Phe (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:
Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr Gin Leu Glu Asp Glu Pro Trp lys 15 10 15
Leu Cys Arg Leu His Gin Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Vai 20 25 30 59 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:
Ala 1 Arg Gly Ala Vai 5 Arg Phe Trp Cys Ser 10 Leu Pro Thr Ala Asp 15 Ser Ser Phe Vai Pro Leu Glu Leu Arg Vai Thr Ala Ala 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:
Leu 1 Arg Vai Thr Ala 5 Ala Ser Gly Ala Pro 10 Arg Tyr His Arg Vai Ila 15 His Ile Asn Glu Vai Vai Leu Leu Asp Ala Pro Vai Gly Leu 20 25 30 60 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:
Asp 1 Ala Pro Vai Gly 5 Leu Vai Ala Arg Leu 10 Ala Asp Glu Ser Vai Vai Leu Arg Vai Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:
Pro 1 Glu Thr Pro Met 5 Thr Ser His Ile Arg 10 Tyr Glu Vai Asp 15 Ala Gly Asn Gly Ala Gly Ser Vai Gin Arg Vai Glu Ile Leu 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: 61 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:
Gin 1 Arg Vai Glu Ile 5 Leu Glu Gly Arg Thr 10 Glu Cys Vai Leu Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Vai Arg Ala Arg 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (l) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C )TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13:
Phe Ala Vai Arg Ala Arg Met Glu Ala Pro Ser Phe Gly Gly Phe Thr 1 5 10 15 Ser Ala Trp Ser Glu Pro Vai ser Leu Leu Thr Pro Ser Asp Leu Asp 20 25 30
Lisboa, 15 de Maio de 2007
Claims (19)
1 Reivindicações 1. Anticorpo ou um seu fragmento bivalente que activa um receptor de eritropoietina, em que o anticorpo ou seu fragmento bivalente liga-se a um péptido constituído pelos resíduos de aminoácidos 49 a 78, inclusivé, de um receptor de eritropoietina humana.
2. Anticorpo ou um seu fragmento bivalente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento bivalente.
3. Anticorpo ou um seu fragmento bivalente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um anticorpo humanizado ou um seu fragmento bivalente.
4. Anticorpo ou um seu fragmento bivalente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser uro anticorpo humano ou um seu fragmento bivalente.
5. Anticorpo ou um seu fragmento bivalente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por possuir um marcador detectável.
6. Método para detectar numa amostra biológica um receptor de eritropoietina susceptível de ser activado, compreendendo esse método os passos seguintes: a) fazer contactar a amostra com o anticorpo, ou o seu fragmento bivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, b) detectar a activação do receptor pelo anticorpo, ou o seu fragmento bivalente para assim se determinar a presença de um receptor de eritropoietina susceptível de vir a ser activado. 2
7. Estojo para detectar numa amostra biológica um receptor de eritropoietina susceptivel de ser activado compreendendo o anticorpo, ou um seu fragmento bivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
8. Uso de um anticorpo, ou dum seu fragmento bivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para modular a actividade endógena de um receptor de eritropoietina num mamífero.
9. Anticorpo ou um seu fragmento bivalente de acordo com a reivindicação 8, em que a modulação da actividade do receptor da eritropoietina regula a proliferação ou diferenciação das células progenitoras eritróides.
10. Uso de um anticorpo ou um seu fragmento bivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para tratar a anemia num paciente.
11. Composição farmacêutica que incorpora uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo ou um seu fragmento bivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 num adjuvante aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o anticorpo, ou um seu fragmento bivalente ser um anticorpo monoclonal, ou um seu fragmento bivalente.
13. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o anticorpo, ou um seu fragmento bivalente ser um anticorpo humanizado, ou um seu fragmento bivalente. 3
14. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o anticorpo, ou um seu fragmento bivalente ser um anticorpo humano, ou um seu fragmento bivalente.
15. Uso do anticorpo ou do seu fragmento bivalente de acordo com qualquer com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para a preparação de um medicamento para modular a actividade endógena de um receptor de eritropoietina num paciente.
16. Uso de acordo com a reivindicação 15, em que a modulação regula a proliferação ou diferenciação das células progenitoras eritróides.
17. Uso de um anticorpo ou um seu fragmento bivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 na preparação de um medicamento para tratar a anemia num paciente.
18. Método in vitro para modular a actividade endógena de um receptor de eritropoietina numa célula compreendendo a administração do anticorpo ou de um seu fragmento bivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 numa quantidade eficaz para modular a actividade do receptor.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a modulação da actividade do receptor de eritropoietina regular a proliferação ou diferenciação da célula. Lisboa, 15 de Maio de 2007
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