PT94869B - Processo de preparacao de uma composicao terapeutica a base de moleculas de anticorpos anti-cd14 - Google Patents

Description

PATENTE DE INVENÇÃO

Νβ 94 869

NOME: 5CRIPP5 CLINIC AND RESE-.RCH FOUNDATION, norte-americana, com sede em 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla, Califórnia 92037, Estados Unidos da América, e RCCKEFELLER UNIVERSITY, norte-americana, com sede em 1230 York fivenue, New York, Neu York 10021, Estados Unidos da América

EPíGRAFE: Processo de preparação de uma composição terapêutica à base de moléculas de anticorpo anti-CD14

INVENTORES: Richard Ulevitch, Peter Tobias, Samuel D. Wrioht e Oohn C. Fathison

Reivindicação do direito de prioridade (ao abrigo do artigo 4β da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883):

Estados Unidos da América em 1 de Agosto de 1989 sob o n9.

387.S17.

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PATENTE NQ. 94 869

Processo de preparação de uma composição terapêutica à base de moléculas de anticorpo anti-CD14 para que

SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION e ROCKEFELLER UNIVERSITY, pretendem obter privilégio de invenção em Portugal RESUMO presente invento refere-se ao processo de preparação de uma composição terapêutica, sob a forma de dose unitária, caracterizado por compreender associar moléculas de anticorpo anti-CD14 com um excipiente farmaceuticamente aceitável, sendo as referidas moléculas de anticorpo capazes de inibir a ligação de complexos LPS-LBP a CD14.

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-2MEMÚRIA DESCRITIVA

Campo Técnico presente invento refere-se a processos e composições para a prevenção ou tratamento da sépsis. Mais particularmente, o presente invento refere-se a moléculas que se ligam ao antigénio de diferenciação do monócito CD14 ou aos complexos LPS-LBP, inibindo assim a ligação de complexos LPS-LBP por células que exprimem CD14.

Antecedentes sépsis é uma situação mórbida induzida por uma toxina, cuja introdução infecção ou por ou acumulação é habitualmente provocada por traumatismo. Os sintomas iniciais da sépsis incluem, tipicamente, arrepios de frio, sudação profusa, febre irregularmente renitente, prostação e semelhantes, seguidos de febre persistente, hipotensão levando ao choque, leucopénia, coagulação intravascular disseminada, dificuldade respiratória do adulto e falência múltiplos.

neutropénia, sindrome de de orgãos

Têm-se encontrado toxinas indutoras da sépsis associadas a bactérias, virus, plantas e vermes patogénicos. Entre as toxinas bacterianas bem descritas, estão as endotoxinas ou lipopolisacáridos (LPS) das bactérias gram-negativas. Estas moléculas são glicolipidos que omnipresente na membrana externa de todas as bactérias gram-negativas. Embora a estrutura quimica da maior parte das moléculas de LPS seja complexa e diversa, um factor comum é a região lipídica A do LPS [Rietschel, E. Th. e col., em Handbook of Endotoxins, 1:187-214 eds R.A. Proctor e E. Th. Rietschel, Elsevier, Amesterdão (1984)]; o reconhecimento de um lipido A em sistemas biológicos inicia muitas se não todas, as alterações patofisiológicas da sépsis. Como a estrutura lipídica A está altainente conservada em todos os tipos de organismos grarn-negativos, alterações patofisiológicas comuns caracterizam a sépsis a gram-negativos.

Os conceitos actuais suportam a alegação de que a resposta principal do hospedeiro ao LPS (incluindo o homem) envolve o

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-3reconhecimento do LPS pelas células da linhagem monócito/macrófago, seguido pela rápida elaboração de uma variedade de produtos de células, incluindo o grupo geral conhecido como citoquinas. Outros tipos de células que se crêem que participem na sépsis e em particular na resposta ao LPS, são leucócitos polimorfonucleares e células endoteliais; cada um destes tipos de células são também capazes de responder ao LPS com a elaboração de potentes substâncias inflamatórias.

Crê-se que o LPS é uma causa primária da morte de seres humanos durante sépsis a gram-negativos, particularmente quando os sintomas incluem sindrome da dificuldade respiratória do adulto (ARDS) (van Deventer e col., Lancet, 1:605 (1988); Ziegler e col., 3. Infect. Dis., 136:19-28 (1987). Por exemplo, tem sido recentemente referida como um mediador primário do choque séptico, uma citoquina particular, o factor de necrose tumoral alfa/cachectina (TNF). Beutler e col., N. Eng. J. Med., 316:379 (1987). A injecção intravenosa de entotoxina de LPS de bactérias em animais experimentais e no Homem, produz uma libertação de TNF, transiente e rápida. Beutler e col., J. Immunol., 135:3972 (1985). Mathison e col., J. Clin. Invest. 81: 1925 (1988). As provas de que o TNF é um mediador crítico no choque séptico, provêm principalmente de experiências nas quais o pretratamento de animais com anticorpos anti-TNF reduz a letalidade. Beutler e col., Sciences, 229:869, (1985). Mathison e col., J. Clin. Invest. 81: 1925 (1988). Estas referências sugerem que a interrupção da secreção de TNF, provocada por LPS ou por outros factores, melhoraria os sintomas da sépsis, frequentemente letais.

Após introdução do LPS no sangue, ele pode ligar-se a uma proteína denominada proteína de ligação lipo-polissacárida (LBP). A LBP é uma glicoproteina de 60 kD, presente em concentrações inferiores a 100 ng/ml no soro de animais e do Homem, saudáveis. Durante a fase aguda, a LBP é sintetizada pelos hepatócitos e atinge concentrações de 30-50 ug/ml no soro. A LBP pode ser purificada a partir de soro humano e de coelho em fase aguda.

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-4Tobias e col., J. Exp. Med.. 164-777-793 (1986). A LBP reconhece a região lipidica A do LPS e forma complexos de elevada afinidade, estequiométricos, 1:1, tanto com a forma rugosa como com a forma lisa de LPS. Tobias e col., J. Biol. Chem.. 264:10867-10871 (1989). A LBP apresenta homologia da sequência do terminal N com a proteína de ligação a LPS, conhecida como factor de aumento da permeabilidade bactericida (BPI). Tobias e col., J. Biol. Chem., 263:13479-13481, (1988). A BPI está armazenada nos grânulos específicos de PMN [Weiss, e col., Blood, 69:652-659, (1987)] e mata as bactérias gram-negativas por ligação ao LPS e por rompimento da barreira de permeabilidade. Weisse e col., J. Immunol.. 132:3109-3115, (1984). Em contraste com o BPI, a LBP não é directamente citotóxica para as bactérias gram-negativas. [Tobias, e col., J. Biol. Chem., 263:13479-13481, (1988)] e a sua função biológica exacta tem permanecido obscura.

Ainda a titulo de antecedente, as células da linhagem monócito/macrófago desempenham várias incluindo a fagocitose de microrganismos, antigénico e a sua apresentação numa forma que é estimulante para as células T helper. Provavelmente, estão, também, envolvidas funções imunitárias, a absorção de material e segregam alguns Os antigénios de granulóci tos monoclonais na vigilância imunológica contra tumores componentes do complemento e citoquinas. membrana de superfície desempenham um papel critico na regulação destas actividades. Vários antigénios de superfície monócito/ /macrófago têm sido identificados e os seus pesos moleculares determinados. Um destes antigénios, o CD14, é uma glicoproteína de 55 kD expressa por monócitos, macrófagos e activados. É reconhecida por vários anticorpos (mAbs), incluindo M02, MY4, 3C10 e LEUM3. Embora ainda não tenha sido atribuída nenhuma função biológica à CD14, a sua expressão restringida às células maduras, sugere uma importante função efectora. A sequência de nucleótidos do gene que codifica o antigénio de diferenciação da superfície da célula monocítica, CD14, foi determinada e a sequência de resíduos de aminoácidos do CD14 foi deduzida a partir daquela. (Ferrero e col., Nucleic Acíds Research Vol. 16:4173 (1988).

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-5Breve sumário do invento presente invento surgiu a partir da verificação de que um dos reguladores primários da produção e libertação de citoquinas é o receptor de CD14, particularmente em células da linhagem monócito/macrófago. Visto que a secreção de citoquina desempenha um papel importante na produção dos sintomas da sépsis, o presente invento contempla um processo e agentes para inibirem a secreção de citoquinas, particularmente de TNF.

Em consequência, numa concretização, o presente invento contempla a administração, preferivelmente intravenosa, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD14, de um anticorpo anti-LBP, de um análogo peptidico de LBP ou uma sua subcombinação ou combinação, a um paciente em risco ou sofrendo os sintomas de sépsis. O processo pode ser praticado sozinho ou em combinação com a administração substancialmente simultânea de outras modalidades terapêuticas que se sabe evitarem ou melhorarem os sintomas da sépsis, incluindo o tratamento com um ou mais de entre antibióticos, esteróides, anticorpo anti-TNF, antagonistas de TNF e semelhantes.

São ainda contempladas pelo presente invento composições terapêuticas, tipicamente na forma de dose unitária, úteis na prevenção ou melhoria dos sintomas da sépsis. As composições compreendem um veiculo farmaceuticamente aceitável contendo um ou mais de entre anticorpo anti-CD14, anticorpo anti-LBP e análogo peptidico de LRP, que actuem como antagonistas de LBP, como ingrediente activo. Nas concretizações preferidas, a composição terapêutica deste invento contém ainda, como ingrediente activo, um agente conhecido por evitar ou melhorar os sintomas da sépsis, tal como um antibiótico, esteróide, anticorpo anti-TNF, antagonista de TNF, CD14 solúvel e semelhantes, sozinhos, em sub-combinação ou em combinação.

Breve descrição dos desenhos

Nas figuras que formam parte da descrição deste invento:

a figura 1 mostra que a LBP melhora a interacção de ELP5 com Fu. Incubaram-se monocamsdas de FO com E ou ELPS^⁰ na

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-6presença de diferentes dos.es de LBP e registou-se o indice de fixação. Uma proteína da fase aguda, controlo, a proteína de ligação à manose (MBP) (5 qg/ml) não provocou melhoria na ligação de ELPS^lc> (índice de fixação 4,9). Os resultados representam 4 experiências separadas.

A figura 2 mostra que a ligação de ELPS a MO, dependente de LBP, depende da densidade do LPS na membrana do E. Preparou-se ELPS variando as doses de LPS, seguida de incubação com monocamadas de MO na presença ou ausência de 5 pg/ml de LBP. Os resultados são representativos de 4 experiências separadas.

A figura 3 mostra que o MO não reconhece a LBP na ausência de LPS. Incubaram-se E revestidos com biotina e apenas com estreptavidina (EBAV) com LBP biotinilado, para produzir ELBP. Tanto o ELBP como o EBAV foram incubados com doses seriadas de LPS durante 20 minutos, a 37°C, lavados e a ligação às monocamadas de MO medidas.

a fagocitose

A figura 4 mostra que a LBP melhora mediada por Ec. Incubaram-se monocamadas de MO cultura) durante 45 min. com E, ELBP ou EC3bi na várias diluições de IgG anti-E, A fagocitose determinada tal como descrito em Materiais e Métodos -se ELBP por adição de 1 ug/ml de LBP para ELPS^° (5 dias de presença de dos E foi

Obtiveram(0,3 pg de

LPS/3 x 10^E) durante a incubação com MO. A fixação destes E na ausência de IgG anti-E foi a seguinte: E, indice de fixação (AI)-O; EC3bi; AI-417; ELBP, AI-404. Os resultados são represen:ativos seis experiências separadas.

A figura 5 mostra a secreção de peróxido de hidrogénio durante a disseminação de MO nas superfícies revestidas com ligante. Adicionou-se, aos depósitos de microtitulação revestidos, 3xl0^M0 (32 dia de cultura) e mediu-se regularmente a libertação de peróxido de hidrogénio. Ocorreu uma produção vigorosa de peróxido durante a disseminação de complexos imunes (HSA-anti-HSA, círculos a cheio) ou em resposta ao agonista solúvel, PMA (losango a cheio). Observou-se uma produção de peróxido baixa, mas reprodutível, durante a interacção com as

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-7superficies revestidas com LPS (triângulos vazios). Contudo a disseminação nas superfícies revestidas com LBP (quadrados vazios) não levou a libertação e o revestimento com LBP de superfícies revestidas com LPS (losangos vazios) evitou a produção de perõxido induzida por LPS. A LBP não prejudicou a produção ou medição do perõxido, uma vez que os MO nos depósitos revestidos com LBP apresentaram uma libertação de perõxido normal, em resposta a PMA.

A figura 6 mostra a inibição da ligação do complexo LPS-LBP, pelos anticorpos monoclonais anti-CD14. Incubaram-se monocamadas de MO humanos durante 15 min. a 0°C, com as concentrações de anticorpos monoclonais indicadas. Adicionaram-se eritrócitos revestidos sequencialmente com LPS e LBP e mediu-se a fixação. Os resultados são representativos de três experiências de resposta à dose, separadas e de dez experiências realizadas a uma concentração de anticorpo fixa. As elevadas concentrações de um grande painel de mAbs dirigidos contra outros determinantes dos macrófagos não tiveram efeito na ligação de ELBP.

A figura 7 mostra que os mAbs anti-CD14 ligados à superfície baixam a modulação da ligação de complexos LBP-LPS. Estabeleceram-se monocamadas de macrófagos humanos sobre substratos revestidos com 25 wg/ml dos anticorpos monoclonais indicados. As células foram lavadas, adicionou-se ELPSl° e mediu-se a fixação.

A figura 3 mostra que a LBP nativa é necessária para o LPS induzir a produção de TNF. Desafiaram-se macrófagos de exsudado peritoneal de coelho (PEM), com LPS na presença das concentrações indicadas de LBP nativa (LBP), LBP aquecida (desnaturada), albumina do soro bovino (BSA) ou de soro de vitela fetal (ECS). A quantidade de TNF produzida pelo PEM desafiado foi então medida.

A figura 9 mostra a susceptibi1idade da LBP à digestão triptica, na presença ou ausência de um ligando ao qual se liga (i.e. Re595 LPS). Os marcadores de peso molecular (Pharmacia, Pi s < ataway, N.J.; N<?. de catálogo 17-0446-01; fosforilase Ba 94

-8ki lodal tons (kD), albumina de soro bovino a 67 kD, oval burni na a 43 kD, anidrase carbónica a 30 kD, inibidor da tripsina de soja a 20,1 kD e alfa-lactalbumina a 14,4 kD) aparecem em faixas adjacentes às que contêm LBP. Os resultados sugerem que a ligação de LBP a LPS resulta na alteração da configuração da LBP, que pode ser atribuída à sua capacidade de ligar o CD14 apenas quando presente como parte do complexo LPS-LBP.

Descrição detalhada do invento

A. Definições

Resíduo de aminoácidos: os resíduos de aminoácidos aqui descritos são preferidos na forma isomérica L. Contudo, os resíduos na forma isomérica D podem substituir qualquer resíduo de aminoácido L, desde que o polipéptido retenha a desejada propriedade funcional de ligação à imunoglobulina. NH2 refere-se ao grupo amino livre, presente no terminal amino de um polipéptido. COOH refere-se ao terminal carboxi, presente no terminal carboxilo de um polipéptido. Mantendo a nomenclatura normalizada para os polipéptidos, J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969), as abreviaturas dos resíduos de aminoácido são mostradas na tabela de correspondência seguinte:

TABELA DE CORRESPONDÊNCIA SÍMBOLO__AMINOÁCIDO

1-Letra	3-Letras
Y	Tyr	tirosi na
G	Gly	glici na
F	Phe	fenilalani na
M	Met	metioni na
A	Ala	alani na
S	Ser	serina
I	Ile	isoleuci na
L	Leu	leuci na
T	Thr	treoni na
V	Vai	vaiina
P	Pro	prolina
K	Lys	lisina
H	His	histidina

» ..ly*·

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0	Gin	glutamina
E	Glu	ácido glutãmico
W	Tr y	tr iptofano
R	Arg	arginina
D	Asp	ácido aspártico
N	Asn	asparagi na
C	Cys	cisteí na

Deve-se realçar que todas as sequências de resíduo de aminoácidos são aqui representadas por fórmulas cuja orientação da esquerda para a direita tem o sentido convencionado do terminal amino para o terminal carboxilo. Além disso, deve-se ainda notar que um traço no inicio ou no fim da sequência de resíduos de aminoácido indica uma ligação peptidica com outra sequência de um ou mais resíduos de aminoácido.

termo anticorpo, nas suas várias formas gramaticais, refere-se a uma composição contendo moléculas de imunoglobulinas e/ou porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulinas, i.e. moléculas que contêm o sitio de combinação do anticorpo, ou paratopo. Numa concretização preferida, os anticorpos usados foram purificados por afinidade.

Um sítio de combinação de anticorpo é a porção estrutural de uma molécula de anticorpo, que compreende as regiões variáveis e hipervariáveis de cadeia leve e pesada que se ligam especificamente ao antigénio.

A frase molécula de anticorpo, como aqui usada nas suas várias formas gramaticais, contempla tanto uma molécula de imunoglobulina intacta, como uma porção imunologicamente activa de uma molécula de imunoglobulina.

São moléculas de anticorpo típicas, as moléculas de imunoglobulina intactas, as moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e as porções de moléculas de imunoglobulinas que contêm o paratopo, incluindo as porções conhecidas na arte por Fab, Fab’, F(ab’)2 e F(v), as quais são porções preferidas par a uso nos processos terapêuticos aqui descritos.

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-10As porções Fab e F(ab’)? de moléculas de anticorpo são preparadas por reacção proteolitica de papaína e pepsina, respectivamente, com moléculas de anticorpo substancialmente intactas, por métodos bem conhecidos. Ver p.e. a patente dos E.U. nQ. 4 342 566 de Theofilopoulos e col. (as divulgações da arte aqui citadas são incorporadas a titulo de referência). As porções Fab’ das moléculas de anticorpo são também bem conhecidas e são produzidas a partir de porções F(ab’)2 por redução das ligações dissulfureto, que ligam as duas porções de cadeia pesada, p.e. com mercapto-etanol, seguida por alquilação do mercaptano proteico, resultante, com um reagente, tal como a iodoacetamida. Prefere-se um anticorpo contendo moléculas de anticorpo intactas, e é aqui utilizado como ilustrativo.

A frase anticorpo monoclonal, nas suas várias formas gramaticais, refere-se a um anticorpo tendo apenas uma espécie de sítio de combinação de anticorpo capaz de imunorreagir com um antigénio particular. Assim, tipicamente, um anticorpo monoclonal apresenta uma única afinidade de ligação em relação a qualquer antigénio com o qual imunorreaja. Um anticorpo monoclonal pode, portanto, conter uma molécula de anticorpo possuindo uma pluralidade de sítios de combinação do anticorpo, sendo cada um imunoespecífico para um antigénio diferente, p.e. um anticorpo monoclonal bi-específico (quimérico).

A frase substancialmente simultâneos, é aqui usada para significar dentro de um período de tempo suficiente para produzir resultados concorrentes, p.e. a lise bacteriana, como resultado da administração de um antibiótico, e a melhoria ou prevenção dos sintomas da sépsis que podem ocorrer, como resultado daquela lise, devido à administração de um anticorpo anti-CD14, anticorpo anti-LBP, análogo peptídico de LBP, ou uma sua combinação ou sub-combinação, como aqui descrito.

A frase farmaceuticamente aceitável refere-se a entidades moleculares e a composições que são fisiologicamente toleráveis e que não produzem, tipicamente, uma reacção alérgica ou outra similar, desfavorável, tal como indisposição gástrica, tonturas e

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-11semelhantes, quando administradas a um ser humano.

B. Métodos terapêuticos presente invento contempla métodos de tratamento e/ou de prevenção de um ou mais dos sintomas da sépsis, particularmente dos associados com um aumento transiente do nível de TNF no sangue, tal como febre, hipotensão, neutropenia, leucopenia, trombocitopenia, choque e falência de órgãos múltiplos. Os pacientes em necessidade de tal tratamento incluem os que estão em risco ou que sofrem de toxemia, tal como endotoxemia resultante de infecção bacteriana a gram-negativos, envenenamento por serpente, falência hepática e semelhantes. Adicionalmente, alguns pacientes com uma infecção bacteriana a gram-positivos, virai ou fúngica, apresentam sintomas de sépsis e podem beneficiar do processo terapêutico deste invento. São pacientes particularmente aptos para beneficiar do presente invento, aqueles que sofrem de uma infecção por E. coli, Haemophillus influenza B, Neisseria meningitides, stafilococci ou pneumococci. Os pacientes em risco de sépsis incluem os que sofrem de queimaduras, feridas por bala, falência renal ou hepática devido a abuso ou envenamento por produtos químicos e semelhantes.

Deste modo, numa concretização, o presente invento contempla um método de melhorar um ou mais dos sintomas da sépsis por administração a um paciente, em necessidade de tal terapia, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD14.

A frase quantidade terapeuticamente eficaz é aqui usada para significar uma quantidade suficiente para evitar, e preferivelmente reduzir, um aumento clinicamente significativo do nivel de TNF no plasma, em pelo menos 30%, mais preferivelmente em pelo menos 50% e. muito preferivelmente em pelo menos 90%. As quantidades terapeuticamente eficazes preferidas, dos agentes aqui usados como ingredientes activos, incluem as descritas na Secção C. Constitui um aumento clinicamente significativo do nivel de TNF no plasma, um aumento de pelo menos 25 pg/ml. Os métodos para determinar os níveis de TNF no plasma são bem conhecidos na arte, sendo métodos particularmente preferidos os

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-12aqui descritos.

Deve-se notar que se estima que os níveis de TNF nos seres humanos saudáveis normais ou nos animais de laboratório, não excede cerca de 10 pg/ml, um valor que está no limite de detecção do TNF por parte dos ensaios mais sensíveis. Michie e col., New Eng. . J. Med, 318:1481-1486 (1988); Mathison e col., J. Clin, Invest. 81:1925 (1988) e Waage e col., Lancet, 1:355-357 (1987). Os níveis de TNF mostraram subir, após exposição a LPS, 10 a 20 vezes, atê niveis de até 400 pg/ml (vide supra). Recentemente, tem-se mostrado haver uma boa correlação entre os níveis de TNF no soro e o resultado fatal de uma infecção por bactérias meningocócitas contendo LPS, gram-negativas. Waage e col., Lancet, 1:355-357 (1987). Adicionalmente, notaram-se aumentos similares de TNF em modelos de sépsis animal, com primatas sub-humanos, e estas alterações estão directamente correlacionadas com a letalidade. Tracey et al., Nature, 330:662-664 (1987).

Noutra concretização o processo compreende a administração a um paciente, em necessidade de tratamento ou em risco de sépsis, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD14, preferivelmente de uma quantidade suficiente para inibir a secreção de TNF induzida por LPS, in vivo, pelas células, tal como células da linhagem monócito/macrófago, preferivelmente macrófagos derivados de monócitos.

Preferivelmente, o anticorpo anti-CD14 usado num processo terapêutico deste invento, é um anticorpo policlonal purificado por afinidade. Mais preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo monocionaí (mAb). Adicionalmente, é preferível que as moléculas de anticorpo anti-CD14 aqui usadas, estejam na forma de porções Fab, Fab’, F(ab’)2, ou F(v) de moléculas de anticorpo inteiras.

São anticorpos monoclonais preferidos, úteis na prática do presente invento, os capazes de serem produzidos por um hibridoma tal como o 60b descrito em Asbman e col., Blood, 69:886-892, 1987, e mais preferivelmente por 3C10 (número de depósito TIB22B no American Type Culture Collection, Rockville, MD), descrito em

Vi col . , ÇL·___Exp. Med.

158:126-145, 1983,

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-13semelhantes. Embora os mAbs 60b e 3C10 possam ser produzidos por cultura de hibridomas, o invento não está a eles limitado. É, também, contemplado o uso de mAbs produzidos por um ãcido nucleico que exprime uma imunoglobulina anti-CD14, cionado a partir de um hibridoma tal como o 60b ou o 3C10. Isto é, o ãcido nucleico que exprime as moléculas de anticorpo anti-CD14, segregadas pelo hibridoma 3C10 ou semelhante, podem ser transferidas para outra linha de células para produzir um transformante. 0 transformante é diferente genotipicamente do hibridoma original, mas também é capaz de produzir moléculas de anticorpo anti-CD14, incluindo fragmentos imunologicamente activos de moléculas de anticorpo completas, correspondentes às segregadas pelo hibridoma. Ver, p.e. a Patente dos E.U. ηθ. 4 642 334 de Reading; a publicação do PCT ηθ. W0 890099 de Robinson e col.; os pedidos de Patente Europeia ηθ. 0239400 de Winter e col. e ηθ. 0125023 de Cabilly e col . .

Os anticorpos monoclonais, preferidos, exibem uma imunorreactividade para a CD14 que é similar à dos produzidos pelos hibridomas acima descritos. Quando usado aqui, o termo imunorreactividade, nas suas várias formas gramaticais, refere-se à concentração de antigénio necessária para conseguir uma inibição de 50¾ da imunorreacção entre uma dada quantidade de um anticorpo e uma dada quantidade de antigénio C-D14. Isto é, a imunorreactividade é a concentração de antigénio necessária para conseguir um valor B/Bq de 0,5, onde Bq é a quantidade máxima de anticorpo ligado, na ausência de antigénio competidor, e B é a quantidade de anticorpo ligado na presença de antigénio competidor, tendo Bq e B sido ajustados a partir de um fundo. Ver Robard, Clin. Chem. , 20:1255-1270 (1974).

Noutra concretização, um processo terapêutico do presente invento compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-LBP, preferivelmente de um anticorpo policlonal purificado por afinidade e, mais preferivelmente, de um mAb_ Além disso, é preferível que as moléculas de anticorpo anti-LBP. aqui usadas, estejam na forma de porções Eab, Fab’, F(ab’)2, ou F(v) das moléculas de anticorpo completas.

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-14Preferivelmente, a quantidade de anticorpo anti-LBP administrada é suficiente para reduzir em pelo menos 30%, preferivelmente em pelo menos 80%, um aumento clinicamente significativo, induzido pelo complexo LBP-LPS, do nível de TNF no sangue de um paciente apresentando pelo menos um dos sintomas da sépsis. Como previamente debatido, ?s pacientes capazes de beneficiar deste processo incluem os que sofrem de endotoxemia em resultado de uma infecção bacteriana a gram-negativos. Os processos para isolar a LBP e induzir anticorpos anti-LBP são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Tobias e col., J. Exp. Med.. 164:777-793, (1986). Os processos para determinar e optimizar a capacidade de um anticorpo anti-LBP em inibir a ligação de complexos LBP-LPS a CD14 e, em consequência, inibirem a secreção de TNF induzida por LBP, são bem conhecidos na arte. Por exemplo, um anticorpo anti-LBP pode substituir o anticorpo anti-CD14, no ensaio descrito no exemplo 16.

Os anticorpos presente invento, análogo peptídico polipéptido capaz complexos LPS-LBP derivados de monóci são os apresentados anti-LBP preferidos, úteis na prática do reagem cruzada e imunologicamente com um de LBP. Um análogo peptídico de LBP é um de inibir competitivamente a ligação de ã CD14, i/prçssa na superfície de macrófagos tos. Os análogos peptidicos de LBP preferidos na tabela 1.

Desi gnação

C16Y

Y16C Kl 60

Tabela 1

Sequência de resíduos de aminoácidos

CNRLNRAPQPDELY

YTTPEPSELDDEDFRC

KRVDADADPRQYADTC

Os processos para produzir anticorpos policlonais anti-polipéptido são bem conhecidos na arte. Ver Patente dos E.U. n9. 4 493 795 de Nestor e col.. Um anticorpo monoclonal, tipicamente contendo as porções F3b e/ou F(ab’)2 de moléculas de anticorpo úteis, podem ser’ preparados usando a tecnologia do hibridoma descrita em Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, editores, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1988), que é

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-15aqui incorporado como referência, Resumidamente, para formar o hibridoma a partir do qual a composição de anticorpo monoclonal é produzida, funde-se uma linha de mieloma ou de outras células auto-perpetuadas, com linfócitos obtidos a partir do baço de um mamífero hiper-irnunizado com CD14 ou uma sua porção de ligação a LBP, ou a LBP ou uma sua porção de ligação a CD14.

Prefere-se que a linha de células de mieloma seja da mesma espécie da dos linfócitos. Tipicamente, o mamífero preferido é um ratinho da estirpe 129 G1X⁺. Mielomas de ratinho, adequados para uso no presente invento, incluem as linhas de células sensíveis à hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), P3X63-Ag8.653 e Sp2/o-Agl4, que estão disponíveis no American Type Culture Collection, Rockvile, MD, sob as designações respectivas de CRL 1580 e CRL 1581 .

Os esplenocitos são, tipicamente, fundidos com células de mieloma, usando polietileno-glicol (PEG) 6000. Os híbridos fundidos são seleccionados em relação ã sua sensibilidade à HAT. Os hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal, útil na prática do presente invento são identificados pela sua capacidade de imunorreagirem com a CD14 ou com a LBP e pela sua capacidade o'e inibirem a secreção de TNF induzida por LPS, usando o processo descrito no exemplo 16.

Um anticorpo monoclonal útil na prática do presente invento pode ser produzido iniciando uma cultura de hibridoma monoclonal, compreendendo um meio nutriente que contém um hibridoma que segrega moléculas de anticorpo com a especificidade antigénica apropriada. A cultura é mantida sob condições e por um período de tempo suficientes para que o hibridoma segregue, para o meio, as moléculas de anticorpo. 0 meio contendo anticorpo é seguidamente recolhido. As moléculas de anticorpo podem ser ainda isoladas por técnicas bem conhecidas.

Os meios úteis na preparação destas composições são bem conhecidos na arte e estão disponíveis comercialmente e incluem meios de cultura sintéticos, ratinhos consanguíneos e semelhantes. Um meio sintético tipico é o meio essencial mínimo de

Dulbecco (DMFM; Dulbecco e col., Virol,, 8:396 (1959)) suplementado com 4,5 g/1 de glucose, 20 mm de glutamina e 20¾ de soro de vitela fetal. Uma estirpe de ratinhos consanguíneos tipica é a Balb/c.

Os processos para produzir anticorpos monoclonais anti-polipéptido são também bem conhecidos na arte. Ver Niman e col.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:4949-4953 (1983). Tipicamente, utiliza-se um ou mais análogos peptídicos da LBP, quer sozinhos quer conjugados com um veículo imunogénico, tal como o imunogénio do procedimento anteriormente descrito para produzir anticorpos monoclonais anti-CD14. Os hibridomas são seleccionados em relação à sua capacidade de produzir um anticorpo que imunorreage com o dos mAbs análogo peptídico de LBP e com LBP. Confirma-se a capacidade/ que apresentam a reactividade cruzada imunológica, adequada, para inibir a ligação do complexo LPS-LBP à CD14 utilizando o ensaio do exemplo 16.

Noutra concretização, um processo terapêutico do presente invento envolve a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo peptídico de LBP, preferivelmente um análogo possuindo a sequência apresentada na Tabela 1.

Os pacientes exibindo sintomas de sépsis, ou em risco de sépsis, podem beneficiar da administração de modalidades terapêuticas conhecidas na arte para evitar ou melhorar estes sintomas. Assim, o presente invento contempla a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD14, de um anticorpo anti-LBP, de um análogo peptídico de LBP, de uma sua combinação ou subcombinação, de modo substancialmente simultâneo à administração terapêutica de uma modalidade conhecida por evitar ou tratar os sintomas da sépsis. Por exemplo, a intervenção sobre o papel do TNF na sépsis, quer directa quer i ndirec tamente, tal como através do uso de um anticorpo anti-TNF e/ou de um antagonista de TNF, pode evitar ou melhorar os sintomas da sépsis. £ particularmente preferido o uso de um anticorpo anti-TNF como ingrediente activo, tal como um anticorpo monoclonal possuindo especificidade imunológica para o TNF,

359

SCPE 185.0 POP

-17correspondendo ao descrito por [Tracey e col., Nature, 330:662-664 (1987)].

De modo semelhante, um processo terapêutico deste invento pode ainda incluir o tratamento substancialmente simultâneo com um esteróide, tal como um cortisol, hidrocortisona e semelhantes.

Um paciente apresentando os sintomas da sépsis é usualmente tratado com um antibiótico, tipicamente um aminoglicósido tal como a gentamicina ou uma beta-lactama tal como uma penicilina, cefalosporina e semelhantes. Deste modo, um processo terapêutico preferido inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD14, de um anticorpo anti-LBP, de um análogo peptidico de LBP, suas combinações ou subcombinações, como anteriormente descrito, de modo substancialmente simultâneo com a administração de uma quantidade bactericida de um antibiótico. A frase quantidade bactericida é aqui empregue para significar uma quantidade suficiente para conseguir uma concentração no sangue que mate as bactérias, num paciente a receber tratamento. A quantidade bactericida de antibióticos geralmente reconhecida como segura para administração a seres humanos é uma quantidade bem conhecida na arte e varia, como é também bem conhecido, com o antibiótico e com o tipo de infecção bacteriana a tratar.

Em concretizações preferidas, a administração de um anticorpo anti-CD14, de um anticorpo anti-LBP, de um análogo peptidico de LBP ou de uma sua combinação, como aqui descrito, cerca de 48 horas, preferivelmente em cerca de 12-36 mais preferivelmente, em cerca de 2-8 horas e mais preferivelmente de modo substancialmente concorrente com a administração de um antibiótico.

ocorre em horas e.

Os antibióticos úteis na prática do presente invento incluem os antibióticos, agentes antibacterianos e antissépticos possuindo formulações descritas no Physici3ns’ Desk Reference, Huff, B.B. ed., Medicai Economics. Company, Inc., Oradell, N.J. (1909). Noutra concretização, o presente invento contempla a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de CD14,

359

SCRF 185.C POR

-18prefererivelmente de unia sua porção solúvel que liga complexos LPS-LBP, isolada ou em subcombinação ou combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TNF, de um anticorpo anti-LBP e de um antibiótico. 0 ADNc que codifica a CD14 e a sua sequência de resíduos de aminoácido deduzida são bem conhecidos na arte. Ver Goyert e col., Science, 239:497-500 (1988), Ferrero e col., Nuc. Acids Res., 16:4173 (1988) e Brazil e col., Eur . J. Immunol., 16:1583-1589, (1986).

C. Composições terapêuticas presente invento contempla ainda composições terapêuticas úteis na prática dos processos terapêuticos do presente invento. Uma tal composição terapêutica inclui, em mistura, um excipiente (veiculo) anticorpo de um análogo farmaceuticamente aceitável e um ou mais anti-CD14, de um anticorpo anti-LBP, de um peptidico de LBP, como aqui descritos, como ingrediente activo. Em concretizações preferidas a composição compreende um mAb anti-CD14 capaz de inibir a ligação de complexos LPS-LBP à CD14. Um mAb preferido é o 60b e, mais preferivelmente, o 3C.10.

Noutra concretização preferida, as composições compreendem um anticorpo anti-LBP, preferivelmente um mAb, que inibe a ligação de complexos LPS-LBP à 0dl4. São particularmente preferidas as composições nas quais o anticorpo anti-LBP imunorreage com um análogo peptidico de LBP, com a sequência apresentada na Tabela 1.

Uma composição preferida compreende um análogo peptidico de LBP que actua como antagonista dos complexos LPS-LBP na ligação à CD14. Os análogos peptídicos de LBP, preferidos para uso nas composições deste invento, são os que têm a sequência apresentada na Tabela 1.

As composições terapêuticas preferidas incluem ainda uma quantidade eficaz de um ou mais dos seguintes ingredientes activos: um antibiótico, um esteróide, e um anticorpo anti-TNF e um antagonista de TNF. São dadas a seguir formulações típicas·'

SCRF 185.0 POR

-19For muiação A

Ingrediente Dose (mg/ml ) gentamicina (sulfato) 40

Anti-CD14 (mAb 3C10) 10 bissulfito de sódio USP 3,2

EDTA de dissõdio USP 0,1 água para infecção q.b.p.p. 1,0 ml

Formulação B

Ingrediente Dose (mg/ml) anticorpo anti-TNF 10 anti-CD14 (mAb 3010) 10 bissulfito de sódio USP 3,2

EDTA de dissódio USP 0,1 água para infecção q.b.p.p. 1,0 ml

Formulação C

Ingrediente Dose (mg/ml) gentamicina (sulfato) 40 anticorpo anti-TNF 10 anti-CD14 (mAb 3010) 10 bissulfito de sódio USP 3,2

EDTA de dissódio USP 0,1 água para infecção q.b.p.p. 1,0 ml

Noutra concretização, o presente invento contempla uma composição terapêutica, útil no tratamento da sépsis, compreendendo uma CD14 ou uma sua porção solúvel, de ligação da LBP, num veiculo farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, a composição inclui ainda uma concentração terapeuticamente eficaz de um ou mais de um anticorpo anti-TNF, de um anticorpo anti-LBP e de um antibiótico.

terapêuticas

A preparação das composições/que contêm polipéptidos ou moléculas de anticorpo, como ingredientes activos, é bem conhecida na arte. Tipicamente, tais composições são preparadas como formas injectáveis, quer como suspensões ou soluções liquidas,

35*7

SCRF 185.0 POR

-20podendc» também ser preparadas, contudo, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão num liquido antes da injecção. A preparação pode também ser emulsionada. 0 ingrediente terapêutico activo é, frequentemente, misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. São excipientes adequados, por exemplo, a água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou semelhantes, e suas combinações. Adicionalmente, se desejado, a composição pode conter quantidades minor de substâncias auxiliares tais como agentes humectantes ou emulsionantes, agentes tamponantes do pH, que melhoram a eficácia do ingrediente activo.

Um polipéptido ou anticorpo pode ser formulado na composição terapêutica na forma de sal farmaceuticamente aceitável, neutralizado. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres do polipéptido ou da molécula de anticorpo) e os que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico ou fosfórico, ou corn ácidos orgânicos tais como os ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados a partir dos grupos carboxilo livres podem, também, ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, os hidróxidos de sódio, de potássio, de amónio, de cálcio ou férrico, e de bases orgânicas tais como a isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína e semelhantes.

As composições terapêuticas, contendo polipéptido ou anticorpo, são administradas, convencionalmente, intravenosamente, tal como por exemplo por injecção de uma dose unitária. 0 termo dose unitária quando usado em referência a uma composição terapêutica dc presente: invento, refere-se a unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagens unitárias para seres humanos, contendo cada unidade uma quantidade predetermi nada de material activo, calculada de modo a produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o diluente requerido; i.e. veiculo ou transpor tador .

As composiçoes são administradas de forma compatível com a

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SCRF 185.0 POR

-21formulação de dosagem e numa quantidade. eficaz terapeuticamente. ft quantidade a ser administrada depende do sujeito a tratar, da capacidade do sistema imunológico do sujeito utilizar o ingrediente activo e do grau de neutralização ou de inibição, desejado, da capacidade de ligação à CD14 ou ao complexo LPS-LBP. As quantidades ex.actas de ingrediente activo que devem ser administradas, dependem do julgamento do clinico, e são particulares para cada indivíduo. São, contudo, gamas de dosagens adequadas as da ordem de 0,1 a 20, preferivelmente de cerca de 0,5 a 10 e, mais preferivelmente, de uma a várias miligramas de ingrediente activo por quilograma de peso corporal do indivíduo, por dia, e em dependência da via de administração. Os regimes adequados para a administração inicial e injecções de reforço são, também, variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial, seguida por doses repetidas a intervalos de uma ou mais horas, de injecções subsequentes ou de outra via de administração. Alternativamente, é também contemplada a infusão intravenosa continua, em quantidade suficiente para manter concentrações, no sangue, de dez nanomolar a dez micromolar.

Como usado nanograma, pg pl significa significa litro.

Exemp1 os aqui, pg significa picograma, ng significa significa micrograma, mg significa miligrama, microlitro, ml significa mililitro, 1

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar, mas não a limitar, o presente invento.

Os exemplos 1-11 ilustram estudos que provam que as células humanas da linhagem monócito/macrófago se ligam a complexos LPS-LBP via o receptor da superfície da célula, o qual é móvel no plano da membrana.

exemplo 12 mostra que os anticorpos anti-CD14 podem inibir especificamente a ligação de complexos LPS-LBP à CD14.

Os exemplos 13-15 demonstram que a CD14 se liga especificamente a complexos LPS-LBP, e que aquela secreção induz a secreção de TNF pelos M0.

359

SCRF 185.0 PO?

exemplo 16 demonstra que os mAbs anti-CD14 inibem o complexo LPS-LBP induzido pela secreção de TNF no sangue humano.

exemplo 17 proporciona um sumário e discussão dos resultados dos exemplos 1-16.

1. Reagentes

A LBP foi purificada a partir de soro de coelho em fase aguda (Tobias, e col., J. Exp. Med., 164:777-793 (1986)) e apresentou-se homogéneo em geles corados com prata. A LBP anti-coelho foi desenvolvida em cabras. A MBP foi obtida através do Dr . R.A.B. Ezekowitz (Boston, MA). 0 factor bactericida/aumentador da permeabilidade (BPI) foi obtido através do Dr. J. Gabay (New York, NY). 0 LPS da Salmonella minnesota (Re595 ou tipo na List Biological (Campbell, CA). Os (mAbs) IB4 contra CD18, e 3G8, contra selvagem) foi obtido anticorpos monoclonais

FcyRIII (CD16), foram descritos em Wright, e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:5699-5703, (19S3). O mAb 543 contra CRI foi obtido através do Dr. R. Schreiber (St. Louis, MO); e os mAb 22 e

IV.3,

Fange (HSA) era do Dr. M. pirogéni os

PBS sem contra FcyRI e FcyRII, foram obtidos através (Hanover, NH). A albumina de soro humano sem ia Armour Pharmaceuticals, e o DGVB⁺⁺ pirogénios eram da Whitaker MA Bioproducts. A NHS-biotina, sulfo-NHS-biotina e estraptavidina eram da Pierce Chemical.

2. Superfícies

As superfícies de plástico para cultura de tecidos foram revestidas por incubação com 25 ug/ml de proteina (anticorpo, LBP ou HSA) ou 1 (ug/ml) por micrograma/mi1i1itro de LPS durante 1 hora (h) a 20 graus C. Para formar imunocomplexos, as superfícies revestidas com HSA foram incubadas com anti-soro anti-HSA (1:50) durante 30 minutos (min) adicionais. Nalguns casos, as superfícies revestidas com LPS foram subsequentemente tratadas com 10 pg/ml de LBP durante 30 min a 20°C. Para ensaios de produção de peróxido de hidrogénio, todas as superfícies revestidas foram expostas a 1 miligrama por mililitro (mg/ml) de HSA durante 1 h antes da adição de fagócitos. As superfícies revestidas foram íuidadosamente lavadas com PBS isento de pirogénios, antes dos

357

SCRF 185.0 POR iS.ci 1 OS ,

- Células

Os macrófagos derivados de monócitos (MO) foram obtidos por cultura de monócitos humanos, purificados, em tabuleiros dr Teflon durante 3-10 dias, como descrito em Wright, e col., 3. Exp. Med., 156:1149-1164, (1982). As monocamadas de monócitos frescos, foram obtidas permitindo que células tnononucleares do sangue periférico aderissem ao plástico revestido com proteína, durante 45 min. a 37°C.. 0 PMN foi purificado a partir de sangue fresco pelo processo de English e col., J, Immunol. Methods, 5:249, (1974). As células T, purificadas por formação de rosetas, foram obtidas através de 3. Ming (Rockefeller U.). As monocamadas de células endoteliais da veia umbilical humana (Lo, e col-, J. Exp. Med., 169:1779-1793, (1989) foram obtidas através do Dr.

S.K. Lo (Rockefeller U.).

Os eritrocitos de carneiro (E) foram revestidos com IgG (igGE) ou com IgM (IgME) como descrito por Wright, e col., 3, Exp. Med., 156:1149-1164, (1982).

Depositou-se C3bi sobre a IgME por incubação de 2-10 x 10⁸ IgME em 1 ml de soro humano deficiente em C5, a 10¾ (Sigma) durante 30 minutos a 37°C. Os eritrocitos foram, em seguida, lavados e incubados durante 10 minutos a 0°C num tampão contendo tetra-acetato de etilenodiamina (EDTA) 2,5 mM. 0 C3biE resultante não apresentava qualquer C3b, tal como determinado por rosetagem resistente a EDTA, com M0.

Revestiram-se os E com LPS, tal como descrito por Wright, e col., 3. Exp. Med., 164:1876-18S8, (1986).A quantidade de LPS usada na preparação foi variada, de modo a produzir ELPS^i (1-10 ug/4 x 10⁷E) ou ELPS¹⁰ (0,2 - 1 pg/4 x 10⁷E). Revestiu-se o ELPS^lc com LPB por incubação de volumes iguais de ELPS¹⁰ (10⁸/ml) e LBP (10 pg/ml) durante 20 min. a 37°C. Os ELPS revestidos com LBP, resultantes (E revestidos com ligando), foram lavados e imediatamente utilizados.

Para alguns estudos os E foram também metido alternativo. Em primeiro lugar, os E revestidos por um foram biotinilados

35^Q

SCRF 185.0 POF

-24incubação de 5 x 10®E c

0(1) *50 pg de sulfo-NHS-biotina, durante 20 minutos a 5°C. em carbonato de sódio O,1M, pH 9,2, ε a LBP foi biotinilada por incubação de 50 pg de LBP com 5 pg de sulfo-NHS-biotina e dialisadas contra PBS. A proteína biotinilada foi em seguida ligada a E biotinilado através de uma ponte de estreptavidina. Incubaram-se ÍO^E biotinilados (EB) com 10 pg de estreptavidina durante 30 min. a 20 C, de modo a dar eritrócitos revestidos com avidina (EBAV). As experiências preliminares, usando estreptavidina f1uoresceinada, mostraram que os EBAV eram uniforme e intensamente fluorescentes, não se observando qualquer aglutinação. Incubaram-se 2,5 x 10? EBAV lavados com 2,5 pg de LBP biotinilada, durante 30 min. a 20°C de modo a dar EBAV-LBP.

Cultivou-se Salmonella typhimurium LT2 Sal E na presença ou ausência de galactose de modo a dar células com um LPS completo ou truncado, respectivamente. Wright, e col., J. Exp. Med,, 164:1876-1888, (1986). As culturas com crescimento exponencial foram lavadas, marcadas com fluoresceína e ajustadas a 2 χ 10θ/ /microlitro (pl) em PBS, como previarnente descrito. Wright, e col., J. Exp. Med., 16/1:1876-1888, (1986).

4. Ensaios

Mediu-se a aglutinação de eritrócitos revestidos com LPS (exemplo 3) agitando 10^* ELPS^i em 10 pl de LBP diluída, durante 30 min. a 21 C numa placa de microteste, de fundo redondo. A aglutinação foi lida a partir da situação de repouso.

A ligação dos E revestidos com ligando (exemplo 3) aos M0 Exp. Med., foi medida tal como descrito por Wright, e col., J. 156:1149-1164, (1982). Resumidamente, revestiram-se placas de proteínas 5 pl de mg/ml culturas de tecidos Terasaki com HSA ou com outras (exemplo 2) e criaram-se monocamadas de M0 incubando células (0,5 x lO^/ml) em PBS contendo glucose a 3 mM, 0,5 de HSA e 0,3 p/ml de aprotinina (Sigma), durante 45 min. a 37 C. Adicionaram-se às monocamadas os E revestidos com ligando (exemplo 3) e as proteínas indicadas. Os E foram deixados assentar, por 10 min. a 0 C e em seguida a placa foi aquecida a 37 C por 15 min. . Os. E não fixados, foram removidos por lavagem e

359

SCRF 185.0 POR

25registou-se a fixação por microscopia com contraste de fase. A ligação da Salmonella fluoresceinada foi avaliada, por um método similar, empregando uma incubação de 15 min. a 37 C, tal como descrito por Wright, e col., J. Exp. Med.. 164:1876-1888, (1986). Os resultados são apresentados como indice de fixação, o número de E ou de bactérias por 100 MO. A fagocitose dos E revestidos com ligando foi medida por meio de métodos similares (Wright, et al., J, Exp. Med., 156:1149-1164, (1982)) com a excepção da incubação dos MO com os E ter durado 45 min. a 37 C e de os E não ingeridos terem sido ligados por breve exposição a meio hipotónico antes do registo das; cavidades.

5. A LBP liga-se ao LPS inserido em membranas de eritrocitos

A adição de uma quantidade tão pequena como 0,5 ug/ml de LBP ao ELPS^i provocou aglutinação. Dado que o LPS se distribui na membrana do E por meio de interacções hidrofóbicas com fosfolípidos, esta observação sugere que a LBP reconhece a porção hidrofíljca, exposta, do lipido A, e que a LBP tem capacidade para formar multímeros. Os ELPS não se aglutinaram fortemente e podiam ser rompidos por pipetagem suave.

6. A LBP aumenta a ligação de ELPS e da Salmonella a macróf agos

As bactérias grarn-negativas e os eritrocitos revestidos com LPS ligaram-se aos MO através de uma interacção dos LPS com elementos do complexo de CD18 de receptores em leucócitos.

J, Exp. Med., 164:1876-1388, (1986). de perturbar aquela interacção foi,

A capacipor tanto,

Wright, e col. dade, da LBP.

estudada. Cs estudos iniciais empregaram E preparados com altos níveis de LPS. Estes ELPS^i ligam-se avidamente aos MO, e a adição de LBP melhora ligeiramente a ligação. Para examinar a natureza desta melhoria, preparam-se E com baixos níveis de LPS. Incubaram-se monocamadas de MO com ELPS^-°, na presença ou ausência de 5 microgramas (ug) por mililitro (ml) de LBP. Os FLPS^iO foram escassamente, ligados pelos MO, mas a adição de LBP provocou uma melhoria dramática da ligação (figura 1). A ligação melhorada era dependente da dose com um efeito máximo a 1 ug/ml de LBP- A especificidads deste efeito é indicada pela observação

359

OCRE 185-9 POR

-26de que outro reagente de fase aguda, a proteína de ligação ã manose, não afectou a ligação de ELPS^⁰ a MO (figura 1) a concentrações tão elevadas como 100 ug/ml; outra proteína de ligação a LPS, a BPI, não afectou a ligação a concentrações tão elevadas corno 10 ug/ml; e o anti-soro anti-LBP policlonal (1:200) pr ovocou uma redução de 20 vezes na rosetagem de ELPS^·⁰ provocada por LBP.

A capacidade da LBP para melhorar a interacção de ELPS com também era dependente da quantidade de LPS na membrana dos (figura 2). A LBP podia, efectivamente, mediar a E preparados com quantidades de LPS 20-100 vezes

M0 eritróci tos ligação de menores do que a quantidade necessária para suspender uma interacção directa entre ELPS e M0.

As estirpes de bactérias gram-negativas que expressam um LPS truncado (estirpes rugosas) são avidamente ligadas pelos M0, mas as estirpes lisas, com um LPS completo, ligam-se escassamente. Wright, e col., J. Exp. Med.. 164:1876-1888, (1986). Devido à LBP ligar iguaimente bem o LPS liso e o rugoso [Tobias, e col., J. Biol. Chem., 264:10867-10S71, (1989)] examinou-se a capacidade da LBP opsonizar a SalmonelIa lisa. Tal como ilustrado pelos dados apresentados na Tabela II, a adição de LBP causou uma melhoria dramática na ligação da SalmonelIa lisa aos M0.

Tabela II

A LBP melhora a ligação da Salmonella a M0^

Índice de fixação

5. Typhimurium_I i sa S. typhimurium rugosa

-LBP 273 1,096

-;L8P 1,661 2,109 uAs preparações das formas rugosa s lisa de S. typhimurium LT2 foram obtidas fazendo crescer mutantes GalE desta estirpe, na presença ou ausência de galactose, como descrito por Wright, e col., J, Exp.___Med. , 164:1876-1888, (1986). A ligação das bactérias às monocamadas de. macrõfagos foi então medida na presença ou ausência de 2,5 pg/ml de LBP. A adição de LBP provocou um aumento na ligação de bactérias lisas, a M0, de 5,9 ± —I

-2771 35P

SCRF 185.0 POR ± 1,9 (n-4) vezes.

A tabela II ilustra o facto de a adição de LBP também melhorar a ligação d3 Salmonel1 a rugosa, mas o efeito mostrou-se menos pronunciado do que o verificado com S. typhimurium lisa, devido à ligação ávida da bactéria não opsonizada. Assim, a LBP melhora a iriteracção de bactérias intactas e vivas com MO.

7. Os MO reconhecem complexos de LBP com LPS

No exemplo 6, a LBP foi adicionada aos MO e ao ELPS. Para determinar se a LBP se liga a MO ou a ELPS, as células foram incubadas separadamente (tratadas) com LBP, lavadas e, em

seguida, combinadas. Os dos na tabela III.	resultados	deste estudo estão	apresenta
	Tabela	III
0 pretratamento	dos ELPS,	mas não dos MO, com	LBP
rnelh	Oí’ rd 3 SUâ	i nteracção1
índice de fixação
Condições	Estudo 1	Estudo 2	Estudo 3
sem LBP	z	17	4
ELPS10 pretratado	S20	715	942
MO pretratado	5	21	16
LPB co-incubado,	629	520	796

ELPS¹⁰ e MO

A ligação de ELPS¹⁰ (0,2 u.g/4 x IO³ E) a monocamadas de MO foi medida como descrito no exemplo 4. Os ELPS¹⁰ ou MO foram pretratados a 37 C, com 5 ug/ml, durante 20 min, e lavados antes do ensaio. Alternativamente, adicionaram-se 5 pg/ml de LBP durante j ensaio de fixação.

O pretratamento de ELPS¹⁰ com LBP melhorou fortemente a ligação aos MO (tabela III), com uma curva de resposta à dose idêntica à observada apresentados). Este modo estávf:

c orn nas experiências dé co-incubação (dados não resultado sugere que a LBP se associa, de

ELPS e que a LBP ligada à superfície é reconhecida pelos MO. Por outro lado, o pretratamento dos MO não afectou a ligação subsequente de ELPS (tabela III).

POR

359 SCRF 185.0

A LBP, ns superfície dos ELPS, é complexada com o LPS. Para determinar se os MO se ligam ã LBP na ausência de LPS, a LBP foi biotinilada e fixada a eritrócitos; revestidos com estreptavidina. Os EBAV-LBP resultantes não se ligaram aos MO (figura 3), mas a adição de LPS provocou uma forte fixação dos ELPS aos MO. 0 LPS mostrou melhorar a aderência de EBAV-LBP por ligação a LBP, uma vez que a quantidade de LPS, necessária para provocar a fixação de ELBP, era 50 vezes inferior à necessária para provocar a fixação de LBP sem E (figura 3). Adicionalmente, a ELBP tratada com LPS ligou-se avidamente aos MO deficientes em CD18, mas não ligou ELPS. Assim, a LPB tem de ser complexada com LPS de modo a ser reconhecida pelos MO.

8. A LBP é reconhecida por um receptor móvel confinado aos fagócitos mononucleares

Os ELPS tratados com LBP ligam-se, virtualmente, a 100¾ dos monócitos e dos MO, sugerindo que a aetividade de ligação está presente em todos os elementos destas populações. Para determinar se a LBP interactua com outros tipos de células, incubaram-se monocarnadas de PMN, de células T e de células endoteliais da veia umbilical, com ELPS-¹·⁰ tratados com LBP. Não se observou ligação. Similarmente, nunca se observou que os linfócitos, que ocasionalmente infectam as preparações de MO, se ligassem a E revestidos com LBP. Assim, a capacidade para ligar partículas revestidas com LBP parece ser uma propriedade confinada aos fagócitos mononuclear es .

A existência de um receptor especifico para a LBP foi demonstrada, permitindo que os MO se disseminassem em superfícies revestidas com complexos de LPS e de LBP. A tabela IV ilustra o facto de a LBP ligada à superfície, baixar fortemente a modulação da ligação dos ELPS tratados com LBP, mas que não tem efeito sobre a ligação dc IgGE ou de EC3bi.

359

SCRF 185.0 POR

-29Tabela IV

Os receptores da LBP são móveis no plano da membrana^

Superfície	ELPS10LBP	ELPShi	EC3bi	ElgG
HSA	833	507	915	621
HSA anti-HSA	795	455	1,051	45
IB4	846	149	200	253
LPS-LBP	147	628	1,161	762

Ias superfícies de plástico foram revestidas com HSA (500 ng/ml), mAb IB4 (25 pg/ml) ou LPS (1 wg/ml) durante 2 h, a 21 C, e lavadas cuidadosamente. Quando indicado, adicionou-se e incubou-se, durante 30 min., a 20 C, anti-HSA (diluição 1=40 em antisoro anti-HSA de coelho) ou LBP (5 pg/ml). Deixou-se que os M0 se disseminassem sobre as superfícies revestidas e lavadas, durante 45 min, a 37 C, e após uma lavagem adicional, adicionaram-se os eritrócitos revestidos com ligando. Os ELPShi foram preparados com 3 pg de LPS/4 x 10^ de E. Os ELPS^-° foram preparados com 0,3 pg de LPS/4 x 10? de E, em seguida tratados com 5 pg/ml de LBP, tal como descrito no exemplo 3. Os dados apresentados são representativos de quatro experiências separadas.

Os resultados acima indicam que a LBP é reconhecida por um molécula que é móvel no plano da membrana, e sugere que este receptor é diferente de CR3 e de FcR.

9. A LBP não interage com CR3 ou com FcR

Em virtude de se saber que o LPS é reconhecido por CR3 e por outros elementos do complexo CD18 (LFA-1 e pl50,95) (Wright, e col., J, Exp. Med.. 164:1876-1888 (1986)), parece ser possível que a LBP melhore a ligação de ELPS, ao facilitar a interacção de uma pequena quantidade de LPS com estes receptores. Várias observações, contudo, excluem esta possibilidade. Os resultados apresentados na tabela V indicam que a LBP provocou uma forte ligação do ELPS a monócitos isolados de dois pacientes com uma deficiência congénita em CD18. As células deficientes em CD18 exibiram uma ligação desprezável a ELPShi ou a EC3bi em ensaios paralelos.

SCPE 285.0 POR

-30Tabel

LBP medeia a ligação de El.PS¹·⁰ a monócitos de pacientes deficientes em CD18¹

Sujei to

EC3bi

Controlo 1 129

Controlo 2

162

Paciente 1 Paciente 2 índice de fixação

LPS'1 1	ELPS10	ELPS10 +LBP
O	31	282
185	z. /	437
17	15	394	4
5	14	529	16

^As monocamadas de monócitos de dois pacientes deficientes em CD18 (os leucócitos deficientes em CD18 respondem, in vitro, a LPS) e de controlos de dois adultos normais, foram incubadas, com EC3bi, ELPS^hi (3 pg/4 χ 10⁸ de E), ELPS^lc> (1 ptg/4 χ 10⁸ de E), e mediu-se o índice de fixação. Guando indicado, foram adicionados, com o ELPS^lc', 2,5 pg/ml de LPB.

Provas adicionais contra a participação das moléculas de CD18 no reconhecimento de ELPS¹⁰ tratado com LBP, provêm de experiências nas quais as moléculas de CD18 foram depleccionadas da superfície apical dos MO, deixando-os disseminarem-se sobre superfícies revestidas com mAbs anti-CD18. Os mAbs IB4 baixam a modulação das moléculas de CDIS, como se mostra pela ligação diminuída de EC3bi e de ELPS^!)i, mas os ELPS¹⁰ tratados com LBP ligaram-se normalmente a estas células (tabela TV). Finalmente, a deplecção de Ca⁺⁺ e de Mg⁺⁴ bloqueia completamente a ligação do C3bi e de LPS ao complexo de CDIS [Wright e col., J Exp. Med., 156:1149-1164 (1982) e Wright e col., J, Exp. Med., 164:1876-1888 (1°86)], mas a ligação de ELPS¹⁰ tratados com LBP foi equivalente, em tampões contendo EDTA.

A participação dos receptores Fc no reconhecimento de LBP também foi excluída. Testou-se, pela ligação de IgGE, que a diseeminação de células sobre uma superfície revestida com i munocomp] e*c> baixava fortemente a modulação de receptores Ec.

359

SCRF 185.0 POP

-31Contudo.

(tabela

1igação

a ligação de ELPS-^° revestidos com LBP não foi afectada IV). Estudos semelhantes mostraram que 3 proteína de ã manose, ligada à superfície, e os mAbs, ligados à superfície, contra FcRI, FcRII, FcRITT e CRI não tinham efeito sobre a ligação da LBP a MO. Estes resultados sugerem que a LBP não é reconhecida pelos receptores da proteína de ligação à manose ou de FcR, CR3 ou CRI.

10. Os receptores de LBP melhoram a fagocitose mediada por

Fç

A adição de IgG anti-E fez com que os ELPS¹⁰ revestidos com LBP fossem avidamente fagocitados pelos MO (figura 4). A dose de IgG anti-E, necessária para metade da fagocitose máxima, era 5 vezes inferior à necessária para induzir a fagocitose de E não revestidos (figura 4). Assim, a LBP parece actuar sinergisticamente com a IgG para induzir uma resposta fagocitica. Acompanhando artigos anteriores [Ehlenberger, e col., J. Exp. Med,,

145:357-371 melho-'ου a melhoramento foi simil (1977)], a deposição de C3bi sobre os E também fagocitose mediada por IgG, e a extensão deste ao provocado pela LBP (figura 4).

Examinou-se isoladamente a fagocitose mediada por LBP. Embora os

ELPS revestidos com LBP formassem rosetas exuberantes com os MO, nenhum dos E ligados foi fagocitado pelos MO estimulados por PMA ou por fibronectina, restantes (figura 4). Estudos paralelos mostraram uma fagocitose dos EC3bi fortemente estimulada por PMA e pela fibronectina. Uma explicação possível para a ausência de fagocitose mediada por LBP, é a elevada mobilidade lateral dos LPS sobre a superfície de um eritrócito. Os LPS podem tapar o polo do E fixado ao MO, deixando à volta do E uma quantidade insuficiente de ligando para conduzir um pseudopode. em avanço. Para evitar tal tapamento, ligou-se LBP biotinilada a proteínas de F biotiniladas, tal como descrito anteriormente em relação a

J a;;

4. De igual modo, nenhum dos E ligados deste modo foram quer pelos E revestidos restantes, quer por MO por PMA (indice de fagocitose = 0). Estudos paralelos mostraram que eles eram rapidamente fagocitados pela biotinilada de um mAb anti-CD18 (IB4) (índice de fagoci tados, b i esti mui ado

359

SCPF 185 5 POR

-32fagocitose = 482). Sscim, cs receptoi es de LEP não podem, por si próprios, iniciar a fagocitoíe de um eritrócito revestido.

11. Os receptores de LBP não iniciam uma explosão oxidativa

Para determinar se a interacção de LBP com o seu receptor inicia unia resposta citotóxica por parte dos MO, mediu-se a produção de peróxido de hidrogénio durante a interacção dos MO ccm superfícies revestidas.

A libertação de peróxido de hidrogénio, durante a disseminação dos MO sobre as superfícies revestidas, foi medida de acordo com o descrito por Harpe, e col., J. Immunol. Methods, 78: :323-336, (1985). Resumidamente, adicionaram-se 3-4 x 10^ MO (dia 3 ou 4) a cavidades de cultura de tecidos revestidas com proteína, contendo as cavidades peroxidase de rábano e 2,4 nmoles de escopoletina. A placa foi incubada a 37 C e, a intervalos, mediu-se o consumo de escopoletina, utilizando um dispositivo de leitura da fluorescência de placas, automático. Os resultados foram encontrados fazendo a média de cavidades em triplicado e representaram-se como nmoles de peróxido produzido por cavidade. A adição de um estimulante de controlo, PMA (100 ng/ml), resultou em rápida evolução do peróxido, a qual era idêntica, em velocidade e extensão, para todas as superfícies revestidas testadas.

as de a

A figura 5 mostra que a ligação dos MO às superfícies revestidas com LPS provoca uma pequena libertação de peróxido (12¾ da estimulada por imunocomplexos ou por PMA). Contudo, superfícies revestidas com LBP não provocaram uma libertação peróxido acima da linha de fundo. Mais ainda, a adição de LBP superfícies revestidas com LPS bloqueou a libertação provocada por LPS, confirmando assim, nesta experiência, que a LBP interage efectivamente com a LPS. Experiências paralelas mostraram que a disseminação de MO sobre superfícies revestidas com LBP ou com LPS+LBP provocava um abaixamento na modulação da ligação de 5LPS}° tratado com LBP, confirmando assim que tinha ocorrido ligação dos. receptores de LBP. Deste modo os receptores de LBP aram ser incapazes de despoletar uma explosão oxidativa.

íncstr

35?

SCRF 185.0 POR

-331 2. Inibição da llgaçã·:; dc complexo LPS-LBP aos MO pelos anticorpos ariti-CD14

Examinou-se a capacidade de três mAbs anti-CD14 inibirem a ligação de complexos LPS-LBP aos MO. Incubaram-se monocamadas de MO humanos a 0 C, durante 15 minutos, com mAb 3C10, 60b ou 26ic a concentrações de 0 pg/ml, 0,15 p.g/ml , 0,5 pg/ml, 1,5 pg/ml , 5 pg/ml, e 15 pg/ml. A capacidade das monocamadas ligarem ELPSl° tratado com LBP (exemplo 3) foi testada como descrito no exemplo 4.

estudo

Os resultados deste/, apresentados na figura 6, indicam que os mAbs 3C10 e 60b produzem um índice de fixação que diminui com o aumento da concentração de mAb usada, enquanto que o mAb 26ic, que reconhece um epítopo diferente do que é reconhecido pelos oAbs 3C10 e 60b, não conseguir reduzir o índice abaixo dos níveis atingidos pela concentração do mAb de controlo (0 p.g/ml), i.e. não inibiu a ligação. Deste modo, os mAbs 3C10 e 60b têm capacidade para inibir a ligação dos M0 a complexos de LPS-LBP. A cspec i f ic idade. da inibição é indicada pela observação de que os mAbs contra ODllb, CD18, CD16 e HLA não inibiram a ligação (dados não apresentados).

-LBP aos	M0	. Os anticorj
cultura	de	tecidos, an
Isto foi	conseguido mis
tração	de	25 pg/ml
durante	60	minutos, a 2í
1 i gados.	o a	placa, o-d
f i xar am	ãs	superfícies

ou Lr 02

Em contraste;, a figura 7 mostra que os mAbs 26ic, 3C10 e 60b foram capazes de baixar a modulação da ligação de complexos LPSOs anticorpos monoclonais foram fixados a placas de es de se estabelecer a monocamada de M0. urando os mAbs numa placa, a uma concenle proteína, mantendo os mAbs na placa ) C, e, em seguida, enxaguando os mAbs não -s da sementeira com os M0. 0ε M0 que se evestidas com mAb anti-CD14, mas não com mAbs, mostraram uma ligação de eritrócitos, revestidos, aos complexos LPS-LBP, diminuída. Assim, a CD14, que é redistribuída à superfície basal dos macrófagos fixados, é necessária para a ligação dos complexos LPS-LBP. Este resultacL infirma a conclusão da figura 6, de que a CD14 serve como receptor dos complexos LPS-LBP.

13. A CD14 liga especificamente complexos_LPS- LBP

Examinou-se a capacidade da CD14 purificada de. ligar especificamente os complexos LPS-LBP. A CD14 foi imobilizada sobre as superfícies, revestindo-as primeiro com mAb anti-CD14, e em seguida con: um extracto de monócitos em Triton X-200. Suspenderam-se 10® monócitos em Triton a 1¾ em PBS, incubou-se durante 15 em seguida removeu-se o material CD14, foi insolúvel por centrifugação. O extracto, que contém aplicado às superfícies revestidas com anticorpos. Este procedimento teve como resultado superfícies revestidas com CD14. Em cavidades de controlo, contendo anticorpos contra antigénios diferentes de CD14, este procedimento teve como resultado superfícies revestidas com proteínas diferentes de CD14. Após lavagem cuidadosa, os eritrócitos revestidos com complexos LPS-LBP foram adicionados, às cavidades revestidas e a fixação dos eritrócitos (ELPS^°) foi registada por meio de fotografia. A CD14 adsorvida na superfície, através do mAb 26ic, um anticorpo de CD14 que não bloqueia o sítio de ligação dos sítios de ligação de LPS-LBP, ligou fortemente os eritrócitos revestidos. As superfícies revestidas com outros antigénios não apresentaram esta actividade. Deste modo, a molécula de CD14 purificada possui a capacidade de ligar complexos LPS-LBP. Esta observação comprova que a CD14 serve como receptor dos complexos LPS-LBP.

14. Qs complexos LPS-LBP induzem nos MO a secreção de TNF Examinou-se a capacidade do LPS induzir, em presença de LBP,

LBP tratada termicamente, albumina de soro bovino (BSA) ou de soro de vitela fetal (ECS), a secreção de TNE em macrófagos do exsudado peritoneal (PEM).

De modo a produzir PEM de. coelho, deu-se uma injecção intraperitoneal, a coelhos NEW (2-2,5 kg), de óleo mineral 35 (Drakeol

Pennreco

But 2er

PA) contendo 10 iig de preparação das paredes celulares de BCG (BCG Cell Walls, R-200, Ribi Immunochem Research, Inc. Ha ri 3 t o n, MT). Três dias mais tarde, administrou-se uma injecção i.v., em bólus, de 120 mg de pentobarbital de sódio (Western Medicai Supply, Inc., Arcadia, C.A), seguida por lavagem asséptica do peritones com 500 ml de RPMI-1640 gelado, suplemen71 35°

SCRF 185 0 POR

P3 de bovino foram r i t:

uror?

tado com L-glutamina 2 mM, piruvalo de Na 1 mM, 50 U/50 penicilina/estreptomicina por ml, HEPES 10 mM, soro de fetal a 2% e 5 U/ml de heparina. As células recolhidas centrifugadas (1000 x G, 10 minutos, 4 C) e ressuspensas no meio acima sem EBS (meio isento de soro). Após uma rotação adicional e ressuspensão em meio sem soro, as células foram contadas, usando placas um hemocitometro e postas em/ em balões de 150 cm³ a uma densidade de 8-10 x 10? macrófagos/balão. Após 2 h a 37 C, CO2 a 5%, removeram-se as células não aderentes dos balões, por lavagem vigorosa e reenchimento com 20 ml de meio sem soro. Quando examinadas, empregando as preparações citocentrifugadas, coradas, de Wright, as células de exsudado peritoneal, induzidas por óleo mineral, continham aproximadamente 60% de macrófagos, 35% de neutrófilos e 5% de linfócitos. Após colocação em placas e lavagem, as células aderentes consistiam em >90% de macrófagos. Os PEM de coelho assim produzidos foram tratados com LPS isolado de Salmonella minesotta Re595 (100 pg/ml) na presença e na ausência das proteínas acima referidas, durante 12 horas, e o sobrenadante sem células foi testado em relação a TNF, tal como descrito anteriormente, empregando uma modificação do ensaio com L929 de Ruff e col., Lymphoki nes, 2: 235:242, (1981) como descrito em Mathison e col., J. Cl i n. Invest., 81: 1925 (1988).

Resumidamente, mantiveram-se células L929 (CCL 1, American Type Culture Collection, Rockville, MD) em RPMI 1640 suplementado com Hepes 10 mM e soro de bovino fetal a 10% (Hyclone, Rehatuin F.S., Reheis Chemical Co., Phoenix, AZ). Fez-se passar rapidamente pelas culturas confluentes (3-4 x 10? células/balão de 75 cm), tripsina a 0,5% (TRL3, Worthington Biochemical Corporation, eehclo', N J) en· solução salina fisiológica contendo EDTA 5 mM e 0 mM, ρ·Κ 7,4, ressuspenderam-se em meio fresco contendo actinomicina D (1 ug/ml) e adicionaram-se a placas de 96 cavidades células/cavidade). Após duas horas em cultura, às cavidades, amostras diluídas seriadamente e ;5-7 X 10⁴ idi c i onar am-sc nc ubar am- s-e d c a v a 1 i a ç ã o as placas durante a noite (CO2 a 5%, 37 C). Depois microscópica, decantou-se o meio e as cavidades com uma solução de violeta de cristal a 0,2%,

SCPF 135.0 POR f orniai i r.a a 10?' e fosfato 0,01 M, pH 7-7,5 durante 5 min., lavadas c uidadosament.e com água e secas. 0 grau de 1 ise foi quantificado espectrofotometricamente (550 nm) usando um leitor de placas Fio Tek, modelo EL310, (Bio-Tek Instruments, Inc., Burlington, VT) como interFace com um computador IBM-PC. Os resultados do ensaio foram expressos como U/ml, sendo uma unidade (U) definida como a quantidade de TNF resultante da lise de 50¾ das células.

Como rotina, preparararn-se 8-12 placas por ensaio. Cada placa incluía dois padrões de laboratório, o meio condicionado de células RAW 264,7 tratadas com LPS de Re595 (6 x 10^ U/ml) e o meio condicionado de PEM de coelho tratado com LPS de Re595 (1,3 x 10^ U/ml). Por outro lado, estes padrões foram calibrados contra TNF humano recombinante (Cetus Corporation, Emeryville, CA, 2 x 10^ U/mg) e os resultados do ensaio foram aferidos tendo isto em conta. As amostras foram ensaiadas em quadruplicado, tendo-se observado um coeficiente de variação (DP/média) de 0,12 + 0,03 (DP). Utilizando este ensaio pôde-se detectar quantidades ‘so pequenas. como 10 pg/ml de TNF derivado de macrófagos de coelho (actividade especifica 1 x 10^ U/mg). Contudo, em virtude de concentrações de soro superiores a 10¾ provocarem arredondamento não especifico e perda de aderência por parte das células L929, o limite inferior de detecção cie TNF de coelho, no soro, foi de 20 U/ml (correspondentes a 0,2 ng TNF/ml).

Os resultados deste estudo, apresentados na figura 8, demonstram que o TNF é produzido apenas se estiverem presentes LPS e LBP activo. 0 LPS de Re595 é proveniente duma estirpe rugosa de SalmonelIa; obtêm-se resultados idênticos se se usar LPS proveniente de organismos de estirpes lisas, tal como o LPS de E. coli 0111: 84 obser .'ados.

o que no .<± a generalidade dos efeitos aqui

15. A ligação de L°S a LBP protege a LBP de clivagem por acçao o a t r ί ρ s i n a

Prepararam-se amostras contendo LBP a uma concentração final de 0 mg 'n.l num tampão contendo HEPES 50 mM, EDTA 10 mM, pH 7,4.

35R

BCPF 185.0 POP

Misturou-se com ums amostra de LPS até uma concentração final de 0,125 mg/rn). Misturou-se com a segunda amostra dextrana-sulfato até uma concentração final de 0,125 mg/ml. Subsequentemente, misturou-se tripsina com todas as três amostras até uma concentração final de 2 pg/ml. Removeram-se aliquotas das amostras tratadas com tripsina a intervalos de tempo de 5, 25, 60 e 120 minutos, mantendo-se a temperatura a 37 C. Em seguida, analisaram-se as aliquotas por electroforese em dodecilsulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SPS-PAGE) usando 12¾ de geies. Os resultados deste estudo, apresentados na figura 9, indicam que a ligação do LPS pela LEP protege a LBP da degradação enzimãtica. 0 LPS pode proteger a LBP quer induzindo uma alteração conformaeional na LBP, que evita a clivagem, quer por impedimento estéreo do acesso ao sítio de clivagem.

16. Os anticorpos monoclonais anti-CD14 inibem a produção de

TNF induzido pelo complexo LPS-LBP, em sangue humano completo

A capacidade dos mftbs anti-CP14 para inibirem a secreção de TNF pelos M0, em sangue humano, foi examinada usando o ensaio de actividade citotóxica, induzida por TNF, de Espevik e col., J. Immunol. Meth.. 95: 99-105, (1986). Resumidamente, preparou-se sangue humano completo anticoagulado com heparina e incubou-se com mAb 3C10, 60b ou IB4, a uma concentração final de 1 ug/ml, durante 30 minutos, a 37 C. Subsequentemente, incubaram-se as células com LPS de Re595, a uma concentração final de 0, 0,01,

0,1 ou 1,0 ng/ml, a 37 C, durante 12 horas, num incubador com C0o a 10¾ humidificado. Em seguida, recolheu-se o plasma de cada amostra e examinou-se em relação à presença de TNF.

Nestes estudos não foi necessário adicionar LBP adicional, uma vez que o saudáveis é Med. 164:777 (1^Q85). Com (Tobias e col consti tutivos níveis constitutivos oe LBP no sangue de estimado em 100-250 ng/ml. Tobias e col., (1986) e Tobias e col., Infect. Immun. base, nas estimativas da afinidade do LPS , J. Biol. Chem. 264:10867-10871 (1989), os níveis de LBP são mais do que suficientes para ligarem sujeitos

50:73-76 pela LBP í o d·'

... d i c i ·. ·. i. id·. .

359

5CPF 185.0 POR

38As células do clone 13 de WErL· , ^foram obtidas a partir de T. Ezpevik da Universidade deTrondheim, Norway, e cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 (Gibco), contendo ECS a 10%, glutamina 0,1 mM, e 30 pg/ml óe gentamicina. As células foram semeadas em placas de microtitulação a uma concentração de 2 x 10⁴ células por cavidade, em 100 rn i cr ol i tr os (pl) de meio de cultura RPMI 1640. Em seguida, misturaram-se amostras de 5 a 50 microlitros (pl) de sobrenadante da cultura de M0, com o meio de crescimento de células do clone 13 de WEHI, e incubaram-se durante 20 h a 37 C. Subsequentemente, adicionam-se 10 microlitros de MTT tetrazólio (M-2128 Sigma Chemical Company, St. Louis, M0) a uma concentração de 5 mg/ml em PSS, a cada cavidade da placa de microtitulação, e as placas foram ainda incubadas durante 4 horas, a 37 C. Depois de aspirar das cavidades 100 microlitros do sobrenadante, adicionou-se a cada cavidade 100 microlitros de isopropanol com HCl 0,04 N. Após dissolução dos cristais azuis escuros do formazano, as placas foram lidas num leitor de placas de microtitulação, usando um comprimento de onda de teste de 570 nm, e um comprimento de onda de referência de 630 nm.

A percentagem de células alvo mortas foi determinada como se segue % = 100 - densidade óptica nas cavidades com CE/TNF x 100 densidade óptica nas cavidades de controlo

A percentagem de células mortas obtida nas culturas experimentais, foi em seguida comparada com a percentagem obtida de várias diluições conhecidas de TNF, para determinar a concentração de TN^r, correspondente, em cada cultura experimental. 0s; resultados deste estudo são apresentados na tabela VI.

4^-*

359

SCRF 185.0 POR

-40enquanto que o anticorpo monoclonal anti-CD18, IB4, não inibiu signi f i cati vamente. a produção de TNF. Realizaram-se experiências, similares com LPS isolado da forma lisa da bactéria E. coli 0111:B4, que mostraram a generalidade dos efeitos das preparações de LPS com teores de hidratos de carbono variáveis, contendo contudo as estruturas A lipidicas conservadas.

A especificidade da actividade citotóxica de TNF, encontrada no sangue completo, foi determinada empregando anticorpo policlonal IgS de TNF anti-humano de cabra tal como descrito por Mathison e col., J. Cli n. Invest., 81: 1925 (1988). Este anticorpo neutralizou completamente toda a actividade citotóxica encontrada em amostras de sangue completo tratado com LPS.

17. Discussão dos resultados dos exemplos 1-16 que foi exposto anteriormente demonstra que a LBP funciona como uma opsonina, uma vez que liga as bactérias e facilita a sua ligação e fagocitose pelos macrófagos. Crê-se que embora a

LBP	ligue o LPS atr.	avés de	um domínio	que	é homólogo ao	domínio
de	ligação a LPS de	BPI, a	fixação da	LBP	às células é	mediada
por	um domínio úrico	da LBP.

LBP >uperficie de ρ».. *v-ulas revestidas com reconhecida por um receptor específico, o CD14, o qual, nos MO, é móvel no plano da membrana. As partículas revestidas com LBP ligam-se a células que expressam CD14, tais como os MO, mas não a outras células sanguíneas. A actividade de ligação na superfície apical dos MO é diminuída pela disseminação de células sobre substratos revestidos com complexos LPS-LEP. 0 receptor da LBP, CD14, é diferente de outros receptores opsónicos, uma vez que os anticorpoí reduzi r am ligados à 1igação de superfície, contra CRI, CR3 e ;artículas revestidas com LBP.

FcR, nao

Na qualidade de. opsonina, a LBP promove a clearance dos agentes infecciosos indutores de sépsis, tais como as bactérias gr am-nega t i vas . Contudo, durante, a sépsis, pode ocorrer bacteriólise, quer através da acção de mecanismo liticos endógenos, incluindo o complemento, e por enzimas de degradação, quer após traίamentos com antibiótkvs. A lise leva à libertação sistémica

359

SC.RF 185.0 POR

do LPS provocando aumentos nos níveis sanguíneos de LPS. Uma vez que se estima que estes níveis estão entre 1 e 1000 pg de LPS/ml, há LPS presente em quantidade suficiente para formar complexos LPS-LBP de elevada afinidade. [Sturk e col., em Detection of Bacterial Endotoxins with the Limulus Amebocyte Lystate. Test. eds. Watson, S. W. Allan R. Liss, NY 1987:371-385.] van Deventer, S.J.H. Lancet 1:605-608 (1988), e col.. Os complexos LPS-LBP ligam a CD14 nas células da linhagem macrófago/monócito e iniciam uma síntese e libertação rápidas da monoquina, TNF, e contribuem assim significativamente, para o desenvolvimento do sindrome de sépsis com todos os seus componentes.

A opsonina clássica, a IgG, facilita a ligação de partículas revestidas com IgG, o seu engolimento fagocitico, e a libertação de compostos tóxicos tais como o peróxido de hidrogénio. A outra opsonina clássica, a C3, facilita principalmente a ligação de partículas revestidas com C3. A fagocitose por MO não estimulados, observa-se apenas se as partículas revestidas com C3 também comportarem IgG (Ehlenberger, e col., J. Exp. Med., 145:357-371, (1977)), e a evolução de peróxido de hidrogénio não se. inicia. Wright, e col., J. Exp. Med. . 158:2016-1023, (1983).

A actividade opsónica da LBP parece-se mais com a da C3. As partículas revestidas com LBP são avidamente ligadas pelos M0, mas a ligação não inicia fagocitose ou libertação de peróxido de hidrogénio (figura 5). A LBP também actua de modo semelhante à C3, por aumentar a fagocitose de partículas revestidas com pequenas quantidades de IgG (figura 4). O efeito opsónico da LBP difere do da C3 apenas num aspecto. Embora as proteínas do complemento possam iniciar a fagocitose se os M0 forem tratados com um estímulo auxiliar, tal como PMA (Wright, ε col., J. Exp. Med. , 156:1149-1164, (1982)) ou fibronectina (Wright, e col., J. Exp. Med., 158:1338-1343, (1983), a LBP não medeia a fagocitose, mesmo em tais células optimamente estimuladas.

Ao actuar como uma opsonina, a LBP limita a disseminação das bactérias gram-negativas num animal. 0 aparecimento de LBP, durante a fase aguda, torna-a muito adequada para combater a

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-42infecção, e crê-se, em consequência, que a LBP representa um mecanismo de defesa contra agentes infecciosos tais como bactérias gram-negativas.

A especificação anterior, incluindo as concretizações especificas e os exemplos, pretendem ser exemplificativa do presente invento e não deve ser tomada como limitativa. Numerosas outras variações e modificações podem ser efectuadas sem que haja afastamento do verdadeiro espirito e âmbito do invento.

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Claims (5)

1. REIVINDICAÇBES

   1 - Processo de preparação de uma composição terapêutica, sob a forma de dose unitária, caracterizado por compreender associar moléculas de anticorpo anti-CD14 com um excipiente farmaceuticamente aceitável, sendo as referidas moléculas de anticorpo capazes de inibir a ligação de complexos LPS-LBP a CD14.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se associar ainda uma dose unitária de moléculas de anticorpo anti-TNF.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se associar ainda uma quantidade bactericida de um antibiótico .
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se associar ainda uma quantidade bactericida de um antibiótico .
5. 5 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se associarem, como ingredientes activos, em concentrações adequadas para administração a seres humanos para o tratamento da sépsis, moléculas de anticorpo anti-CD14, capazes de inibir a ligação de complexos LPS-LBP a CD14, e um ou mais de um antibiótico e de moléculas de anticorpo anti-TNF.

   Lisboa, 3, _Λ rççQ

   Por SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION e ROCKEFELLER UNIVERSITY