PT90296B - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais contra pseudomonas aeruginosa e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais contra pseudomonas aeruginosa e de composicoes farmaceuticas que os contem Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 90 296 rfoufrfntf· BEHRINGWERRE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, v ' com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alemã
EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS
MONOCLONAIS CONTRA PSEUDOMONAS AERUGINOSA E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM
INVENTORES: Dr. Horst Domdey, Matthias Maget e Prof. Dr. Bemd-Ulrich von Specht
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
República Federal Alemã em 19 de Abril de 1988, sob o N° P 38 13 023.8.
INPI. MOD. 113 RF 16732
Descrição referente a patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alema, (inventores: Dr. Horst Domdey, Matthias Maget e Prof· Dr. Bernd—Ulrich von Specht, residentes na Alemanha 0 ci denta1), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAlS CONTRA PSEUDOMONAS
AERUGINOSA E DE COMPOSIÇOES
FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM.
DESCRIÇÃO
A invenção refere—se a um anticorpo monoclonal (mAK) que apresenta reacçao cruzada com todos os 19 serotipos de Pseudomonas aeruginosa até agora conhecidos. Este an ti corpo pode servir como meio de diagnóstico, como ingrediente activo ou como veículo de ingrediente activo.
A pseudomonas aeruginosa ó uma bactéria patogánica, gram—negativa, oportunista. Pode causar doenças mortais, por exemplo pneumonia em doentes com fibrose cística ou septicómia em pacientes com queimaduras ou infecções ósseas ou das vias urinárias. A terapia das doenças causadas pela Pseudomonas aeruginosa por meio de antibióticos é, devido ao seu espectro de resistência, difícil e muitas vezes falhada.
M **
Por isso, a atençao na luta contra as infecções dirigiu-se pa
N
ra a imunoprofilaxia e para a imunoterapia. Obteve—se protecçao contra todos os 19 serotipos de Pseudomonas aeruginosa com uma mistura de proteínas de membrana externas (OMP) purificadas} F} β I (vide Specht et al· (1987) Infection 15» (i08-412)· No trabalho acima mencionado isolaram—se linfócitos de ratos imunizados e fundiram—se} por um processo conhecido, com células de mieloma NS—1 (Kearny et al· (1979)} J. Immunology} 123} 15^8-1550)· A partir de cerca de 5θθ hibridomas obtidos escolheu—se um mAK — em seguida designado por mAK 6A4 — que possui as propriedades vantajosas a seguir enumeradas:
— reacçao forte e unitêria com todos os 19 serotipos de Pseudomonas aeruginosa — teste de ligaçao Clq positivo at — efeito protector em infecções provocadas em ratos com Pseudomonas aeruginosa·
Determinou—se também o cDNA (ver exemplos e Tabelas 1 e 2)· Pode então obter-se um mAK humano, no qual se substituem as zonas genéticas constantes do anticorpo dos ra— tos pelas sequências humanas correspondentes· A expressão des ta sequencia de anticorpos humanizada em células eucarióticas} por exemplo em células CHO ou em leveduras> dé origem ao 15 mAK humano correspondente} que se pode empregar para fins diagnósticos, para a profilaxia e para a terapia· at
A invenção refere—se sucessivamente a:
a) sequências de DNA purificadas e isoladas, que codifiquem para o mAK 6A4 ou para partes deste} incluindo os seus pro m at dutos de transcrição, bem como as combinações respectivas das sequências humanizadas}
b) estruturas de DNA e vectores que contenham total ou parcial mente estas sequências
c) cêl ulas procarióticas e eucarióticas transformadas com esse DNA*
d) polipéptidos ou partes deles exprimidos a partir dessas cê lulas apos transformaçao,
e) respectivas sequências de aminoácidos,
f) meios de diagnóstico, de profilaxia ou de terapêutica, que contenham os pêptidos ou as sequências de aminoácidos mencionadas em e), isoladamente ou em combinação,
g) um processo para a preparaçao por engenharia genética dos polipéptidos mencionados em (d) ou de partes destes,
h) bem como o epítopo ao qual se ligam os anticorpos codifica dos pelas sequências referidas em a).
Os restantes aspectos da invenção encontram— —se referidos nos exemplos seguintes, nas tabelas e nas rei— vindicaçoes da patente.
Exemplo ií Preparaçao do mAK 6A4 la) Purificação das proteínas de membrana externas a utili— zar para a imunização OMP F, H e I de Pseudomonas aeru—
A ginosa serotipo 12
Purificaram—se OMP F, Hg e I, como descrito por T. Mizuro e M. Kageyama no J. Biochem. 84, 179—25θ (1978)» a partir de Pseudomonas aeruginosa serotipo 12. Para tal, colheram—se as células na fase logarítmica tardia, abriram—se por tratamento com ultrassons, e recolheram-se as membranas celulares por centrifugação durante uma hora a 100 000 g. Extraíram—se as membranas celulares sucessivamente com 2% de SDS, 10% de glicerina e 2% de SDS e finalmente com NaCl 0,1 M. A fracçao insolóvel residual contem principalmente OMP F,
OMP H e um pouco de OMP I.
lb) Imunização de ratos Balb/c com OMP F, Hg e I
Para a imunização administrou—se a cada rato
de ΟΜΡ's purificadas (80 jj.1 ) numa suspensão com 20 de Al(OH)^, por via i.p·» ao 1Q dia» repetindo-se com a mesma dose aos dias 14 e 21« Após mais 4 semanas administrou-se a mesma dose e passados mais 3 dias removeram—se os baços· lc) Fusão celular
A*
Para a fusão celular utilizou-se essencialmen te o método de G. Kbhler e C. Milstein, Eur. J. Immunol. G»
Q
511-519 (1976)· Fundiram—se cerca de 1x10 células de baço» preparadas a partir dos baços removidos como indicado em (lb)» com 5x10' células de mieloma NS—1 (Kearny et al·» vide acima» fornecidas comercialmente pela American Type Culture Collecti— on ATCC NO TIB 18), em 2 ml de pliietilenoglicol 1500 a 50% (Serva» Heidelberg). Apés a fusão» misturaram—se as células com 1x10θ/ml de células de baço normais em meio mínimo de Dul becco modificado (MEM), que contém hipoxantina» aminopterina ** e timidina (HAT). A produção de anticorpos testou-se por meio do ensaio ”Enzyme—linked-Immuno-sorbent Assay (ELISA) a seguir descrito e obtiveram-se os clonos de interesse por meio
A* de diluição.
A* ld) Teste ELISA para a identificação de clonos secretores de anticorpos
Por meio de um teste ELISA directo determinou -se se e em que proporçoes os v&rios mAK se ligam ao antigene.
A*
Cobriram—se placas de microtitulaçao da firma Dynatech, Plochingen, de cloreto de polivinilo, com 96 orifícios, com 100 jil de sonicato de Pseudomonas aeruginosa (s«u. , diluição 1:200 com PBS * 4,5 jig/ml) do serotipo 12 e incubou-se durante a noite a 4°C. Lavaram-se depois as placas três vezes e saturaram-se durante 1 hora a 37°C com albumina de so ro bovino diluída em PBS. Apés nova lavagem cobriram—se os orifícios com uma película transparente e guardaram—se as pia cas a -20 C ate a sua posterior utilização.
- 4 Para cada clono a testar pipetaram-se (numa série de diluições logarítmica 1:2* 1:4* 1:8* I:l6* ·.·) 50jil de ascites (como amostra dupla)·
Como controle positivo utilizou-se soro de ra to policlonal de ratos imunizados 4 vezes com proteínas de membrana activadas (1:100, 1:1000* 1:10000). Como controle ne gativo utilizou—se o soro de ratos nao imunizados.
Como meio de diluição utilizou—se PBS (phos— phate buffered saline)(solução salina tamponizada com fosfato). Apos incubaçao das placas durante 1 hora a 37 C e tres lavagens adicionaram-se 50 jil de peroxidase conjugada anti—ra to—F(ab) na diluição de ΐ:5θθ· a ** Ο
Apos nova incubaçao durante 1 hora a 37 C e três lavagens adicionaram—se 50 /il do substracto o—fenilenodiamina (0,2% de ODP, 0,15% de H 0 ). Todos os reagentes para o teste ELISA provieram de um Kit NEI 5θ1 da firma NEN, New England Nuclear, Dreieich.
Apés nova incubaçao durante 3 minutos parou— -se a reacçao com 5θ /il de H^SO^ ^>5 M e determinou—se a extinção a 450 nm com um espectrémetro ELISA MR 58O da firma
Dynatech. Os clonos positivos apresentavam uma extinção ^0,2 0D.
A partir de 7 clonos da éltima escolha escolheu—se o clono que segrega mAK 6A4, para os testes seguintes uma vez que o mAK 6A4 apresenta as vantagens indicadas nas pégs. 2 e 3 e além disso ê fortemente segregado (cerca de 1% da fracção de gama-globulina no líquido de ascites ê constituída por mAK 6A4). 0 mAK 6A4 pertence à classe IgG2a e reage com OMP I.
Preparaçao de sonicato:
Cultivaram—se as bactérias do serotipo 0-12
- 5 ‘?.·ΐ.7ΟΕ?Ι!ΐ1!Ββ«»»Β»β
em caldo Tripticase-Soy. Lavaram—se depois três vezes e res— suspenderam-se em tampao de abertura dódico. Tratou-se a sus— pensão com ultrassons tres vezes durante 5 minutos (com 2 minutos de intervalo). Após nova centrifugação (1 vez com 5θθθ U/minuto/10 minutos) dividiu—se a camada sobrenadante em por— çoes e guardou—se a —20°C até à próxima utilização. A concentração de proteína nas placas cobertas era de 4,5 ^ig/orifício.
Exemplo 2! Isolamento e sequenciação do cDNA de mAK 6A4 codi ficante para as regiões variáveis
2a) Isolamento do cDNA
Separaram—se células de hibridoma 6A4, por centrifugação (10 minutos a 1500 g e 4°C), a partir de líqui do de ascites. A partir delas» de acordo com o método de H.
Domdey et al· , Cell 39» 611-621 (1984)» obteve-se o poli(A)+— RNA. Sintetizou-se o cDNA a partir de 15 de poli(A)+RNA» com um Kit de síntese de cDNA comercial (da firma Amersham).
cDNA de cadeia dupla e extremos planos guameceu-se com extremos oligo—dC de cadeia simples por meio do Kit de clonagem comercial da firma NEN, New England Nuclear, e anulou-se com o plasmideo pBR322 de extremos oligo-dG correspondente. Após transformaçao (Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557—580) das células E. coli K12 estirpe JM 109 adequadas (Yanisch—Per ron C. et al·, (1985) Gene, 33» 103-119)» obtiveram-se cerca de 12000 transformantes que hibridizam com o oligonucleótido 5’-CAAGGCATCCTAGAGTCAC-3’ (i)» marcado nos extremos com J p, para a identificação de clonos que contem cDNA da cadeia pesa da do subgrupo II B. Utilizou—se também para a hibridaçao o fragmento (li) HindIII—BamHI p—desoxinucleótidotrifosfato ”nick—transiaccionado” com 2850 pares de bases (bp), do plasmídeo Cl (W. 0. Weischert et al., (1982) Nuclein Acids Res.
10, 3827—3845)· (i) ê originário da região do alelo IgG2a* no rato (cadeia pesada)· (li) codifica para a região capa cons— tante (cadeia leve). As hibridações efectuaram-se como descri to por D. Woods, Focus 6, 1-2 (1984). Cerca de 4,2% e 1,6%
- 6 dos clonoe reagiram positivamente com as sondas específicas capa e gama* respectivamente·
2b) Sequenciaçao do cDNA
De entre as colónias contendo plasmídeos ante riormente obtidas escolheram—se aquelas que continham provavelmente cDNA* s completos da cadeia leve ou da cadeia pesada· Sequenciaram-se as inserções de DNA dos plasmídeos pUL5 (contendo o cDNA da cadeia leve) e pBH7 (contendo o cDNA da cadeia pesada) de acordo com métodos padrao (F. Sanger et al·* (1977) Proc. Natl. Acad· Sei. USA 74» 5^63—5^67)» modificados como descrito por E. Y. Chen e P. Seeburg, DNA 4, 165-170 (1935)· As sequências de nucleótidos de cada uma das regiões variáveis encontram-se indicadas na Tab. 1 (cadeia leve) e na Tab. 2 (cadeia pesada). Para as regiões constantes, as sequen cias de nucleótidos respectivas — já nao indicadas nas Tabe— las — sao idênticas com as conhecidas da literatura (cadei ga maS Schreier et al·, (19Ô1) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78» 4495-4499» cadeia capa! Ρ. Ή. Hamlyn et al. , (1981) Nucleic Acids Res. 9* 4485—4494). 0 comprimento total das regiões codificantes para a cadeia leve á de 717bp e para a cadeia pesa da á de 1407 bp, representando os primeiros 20 aminoácidos da cadeia leve o Leader-peptid, de modo que a cadeia leve madu ra tem o comprimento de 259 aminoácidos. A cadeia pesada tem um Leader peptid” de 19 aminoácidos, tendo por isso a molócu la madura o comprimento de 450 aminoácidos.
3ο ο Té

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para a preparação de anticorpos monoclonais (mAK) , caracterizado por se integrarem as sequências de DNA de acordo com as tabelas 1 e 2.
    TABELA 1
    -60 .
    -96 ctgcagggggggggggggACAGGCAQTGGGAGCAAGATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTT MetAspSerGlnAlaGlnValLeu
    -36 ATATTGCTGCTGCTATGGGTATCTGGTACGTGTGGGGACATTGTGATGTCACAGTCTCCA -12 HeLeuLeuLeuLeuTrpValSerGlyThrCysGlyAspIleValMetSerGlnSerPro
    9 6 TCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGT 9 SerSerLeuAlaValSerAlaGlyGluLysValThrMetSerCysLysSerSerGlnSer
    156 CTGCTCAACAGTATAACCCGAAAGAACTTCTTGQCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAG 2 9 LeuLeuAsnSerIleThrArgLysAsnPheLeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGln
    216 TCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTC 49 SerProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGluSerGlyValProAspArgPhe
    27 6 ACAGGCAOTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGAC 69 ThrGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlleSerSerValGlnAlaGluAsp
    336 CTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAG 8 9 LeuAlaValTyrTyrCysLysGlnSerTyrAsnLeuArgThrPheGlyGlyGlyThrLys
    396 CTGQAAATCAAACGGQCTGATGCTGCACCAACTGTATCGATCTTCCCACCATQCAGTGAG 109 LeuGluIleLysArgAlaAspAlaAlaProThrValSerTlf?pheProProSerSerGlu
    113
    TABELA 2
    -120 ctgcaggggggggggAAATACGATCAGCATCCTCTCCACAGACACTGAAAACTCTGACTC
    -57 ......
    -60 ACAATGGAAAGGCACTGGATCTTTCTCTTCCTGTTTTCAGTTACTGCAGGTGTCCACTCC -19 MetGluArgHisTrpIlePhelieuPheLeuPheSerValThrAlaGlyValHisâer
    1 CAGGTCCAGCTTCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATG j 1 GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuAlaLysProGlyAlaSerValLysMet
    I 1 1
    61 TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTGCCTACTGSATGCACTQGGTAAAACAGAGG
    21 SerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAlaTyrTrpMotHisTrpValLysGlnArg
    121 CCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAACACTGGTTATACTGAATAC 41 ProGlyGlnGlyLeuGluTrpIleGlyTyrlleAsnProAsnThrGlyTyrThrGluTyr
    181 AATCAGAACTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC 61 AsnGlnAspPheLysAspLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr
  2. 2 41 ATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTATTGTACAAGAAGCTAC 81 MetGlnlieuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCysThrArgSerTyr
    301 TATAACTACGAGGGGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA 101 TyrAsnTyrGluGlyAlaMetAspTyrYrpGlyGlnGlyThrSerValThrValSerSer
    361 GCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGC
    121 AlaLysThrThrAlaProSerValTyrProLeUAlaProValCysGlyAspThrThrGly que codificam para as regiões variáveis dos anticorpos ou para partes delas, numa estrutura de anticorpo apropriada, e se efectuar a sua expressão em sistemas de expressão adequados.
    2 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as regiões constantes ou partes destas serem de origem murina.
  3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por as regiões constantes ou partes destes serem de origem humana.
    ί
  4. 4. Processo para a preparação de meios de diagnóstico, caracterizado por se utilizarem anticorpos monoclonais (mAK) preparados de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3.
  5. 5. Processo para a preparação de composiçoes farmacêuticas, caracterizado por se incorporarem ingredientes activos farmacêuticos com um ou mais mAK' s preparados de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3.
    5. Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado por se incorporarem, como ingredientes activos mAK s quando preparados de acordo comqualquer das reivindicações ι , ? ou 3 com veículos e/ou aditivos farmacológicos habituais adequados.
    í
    A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentaatdo em 19 de Abril de 19S3, sob o número P ' 38 13 023.8.
    Lisboa, 18 de Abril de 1989 acrvc; oficiai, da propiw.dadi; indusiiual
PT90296A 1988-04-19 1989-04-18 Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais contra pseudomonas aeruginosa e de composicoes farmaceuticas que os contem PT90296B (pt)

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