JPH0799370B2 - 免疫学的に結合可能な物質の定量方法 - Google Patents
免疫学的に結合可能な物質の定量方法Info
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- JPH0799370B2 JPH0799370B2 JP4292563A JP29256392A JPH0799370B2 JP H0799370 B2 JPH0799370 B2 JP H0799370B2 JP 4292563 A JP4292563 A JP 4292563A JP 29256392 A JP29256392 A JP 29256392A JP H0799370 B2 JPH0799370 B2 JP H0799370B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的に結合可能な
物質の定量方法に関するものである。
物質の定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】免疫学的試験法を構築するためのストレ
プトアビジンとビオチンとの高い結合強さの利用はすで
にいろいろな形態で認められている。不活性物質（ポリ
スチレンビーズ、チューブなど）に固定化したストレプ
トアビジンは、対応するビオチニル化試薬に対して高い
結合能を有する普遍的な固相として使用されている。容
易に再現できる被覆法やストレプトアビジンマトリック
スの優れた安定性のために、この技術では高精度が達成
される。
プトアビジンとビオチンとの高い結合強さの利用はすで
にいろいろな形態で認められている。不活性物質（ポリ
スチレンビーズ、チューブなど）に固定化したストレプ
トアビジンは、対応するビオチニル化試薬に対して高い
結合能を有する普遍的な固相として使用されている。容
易に再現できる被覆法やストレプトアビジンマトリック
スの優れた安定性のために、この技術では高精度が達成
される。
【０００３】上述した高品質のストレプトアビジン固相
にもかかわらず、異質性と干渉の可能性、特に固相に結
合されたストレプトアビジンが膜から分離することによ
って起こる、いわゆる“浸出効果 (leaching effects)
”を完全には排除できない。特に感度のよい試験はこ
れと反応して、性能の有意な減退を示すことがある。捕
獲成分とマーカー成分の土台を形成するただ１つの抗体
を使用する１−ステップサンドイッチアッセイにおいて
は、直接被覆した担体と比較して欠点がとりわけ顕著で
ある。２つの免疫学的試薬のために選択しなければなら
ない化学量論は、試験混合物中で進行する反応にうまく
適合する濃度比である。弱い干渉を補償し得るビオチニ
ル化成分の場合、常に“プラトー域”が存在するわけで
はない。その結果、これらの場合には、安定性や製造の
変動に関する問題が重要なこととして評価されねばなら
ない。
にもかかわらず、異質性と干渉の可能性、特に固相に結
合されたストレプトアビジンが膜から分離することによ
って起こる、いわゆる“浸出効果 (leaching effects)
”を完全には排除できない。特に感度のよい試験はこ
れと反応して、性能の有意な減退を示すことがある。捕
獲成分とマーカー成分の土台を形成するただ１つの抗体
を使用する１−ステップサンドイッチアッセイにおいて
は、直接被覆した担体と比較して欠点がとりわけ顕著で
ある。２つの免疫学的試薬のために選択しなければなら
ない化学量論は、試験混合物中で進行する反応にうまく
適合する濃度比である。弱い干渉を補償し得るビオチニ
ル化成分の場合、常に“プラトー域”が存在するわけで
はない。その結果、これらの場合には、安定性や製造の
変動に関する問題が重要なこととして評価されねばなら
ない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、試験結果がこのような浸出効果によって影響されな
い方法を提供することであった。
は、試験結果がこのような浸出効果によって影響されな
い方法を提供することであった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】この目的は本発明の方法
により達成され、その方法は、第１の結合相手と第２の
結合相手とから成る結合対の固相に固定化された第１の
結合相手を使用する不均一免疫学的試験により被分析体
を定量する方法であって、被分析体を含む試料溶液を該
固相の存在下で（１）上記結合対の第２の結合相手
（ａ）と被分析体に特異的に免疫結合し得る第１の物質
（ｂ）から成る第１の複合体、または（２）上記結合対
の第２の結合相手（ａ）と被分析体に特異的に免疫結合
し得る第１の物質（ｂ）から成る第１の複合体並びに被
分析体に特異的に免疫結合し得る第２の標識物質、と共
にインキュベートし、その後相を分離し、（１）の場合
は、被分析体に特異的に結合し得る第２の標識物質を含
む別の溶液で液相を置換し、それを再度インキュベート
し、その後相を分離し、そして両方の場合に、最後に分
離された固相上のまたは液相中の標識を被分析体の量の
指標として測定することから成り、その際、被分析体に
結合し得ない巨大分子（ａ）と上記結合対の第２の結合
相手（ｂ）から成る第２の複合体を第１の複合体に対し
て過剰量で液相にさらに添加することを特徴としてい
る。
により達成され、その方法は、第１の結合相手と第２の
結合相手とから成る結合対の固相に固定化された第１の
結合相手を使用する不均一免疫学的試験により被分析体
を定量する方法であって、被分析体を含む試料溶液を該
固相の存在下で（１）上記結合対の第２の結合相手
（ａ）と被分析体に特異的に免疫結合し得る第１の物質
（ｂ）から成る第１の複合体、または（２）上記結合対
の第２の結合相手（ａ）と被分析体に特異的に免疫結合
し得る第１の物質（ｂ）から成る第１の複合体並びに被
分析体に特異的に免疫結合し得る第２の標識物質、と共
にインキュベートし、その後相を分離し、（１）の場合
は、被分析体に特異的に結合し得る第２の標識物質を含
む別の溶液で液相を置換し、それを再度インキュベート
し、その後相を分離し、そして両方の場合に、最後に分
離された固相上のまたは液相中の標識を被分析体の量の
指標として測定することから成り、その際、被分析体に
結合し得ない巨大分子（ａ）と上記結合対の第２の結合
相手（ｂ）から成る第２の複合体を第１の複合体に対し
て過剰量で液相にさらに添加することを特徴としてい
る。
【０００６】従って、本発明による方法では、最初に被
分析体と第１の複合体との実際の免疫反応を行い、その
後この工程で形成された被分析体と特異的に免疫結合し
得る物質との複合体を固相に固定化させ、最後に、液相
を固相から分離した後で、新たな液相（その中に含まれ
る第２の被分析体−特異的物質の標識によって被分析体
の検出が可能である）を添加する不均一イムノアッセイ
が適している（１の場合）。しかしながら、最初の液相
が被分析体に特異的に免疫結合し得る第１の物質（ａ）
と固相に結合し得る結合相手（ｂ）から成る複合体並び
に特異的に免疫結合し得る第２の標識物質を含む不均一
法も実施することができる（２の場合）。この方法で
は、液相中の被分析体が、付随的に標識されかつ固相に
結合され、その後液相と共に過剰の標識を除いた後に固
定化状態で直接定量される。
分析体と第１の複合体との実際の免疫反応を行い、その
後この工程で形成された被分析体と特異的に免疫結合し
得る物質との複合体を固相に固定化させ、最後に、液相
を固相から分離した後で、新たな液相（その中に含まれ
る第２の被分析体−特異的物質の標識によって被分析体
の検出が可能である）を添加する不均一イムノアッセイ
が適している（１の場合）。しかしながら、最初の液相
が被分析体に特異的に免疫結合し得る第１の物質（ａ）
と固相に結合し得る結合相手（ｂ）から成る複合体並び
に特異的に免疫結合し得る第２の標識物質を含む不均一
法も実施することができる（２の場合）。この方法で
は、液相中の被分析体が、付随的に標識されかつ固相に
結合され、その後液相と共に過剰の標識を除いた後に固
定化状態で直接定量される。
【０００７】被分析体に結合し得ない巨大分子（ａ）と
固相に結合し得る物質（ｂ）から成る本発明の第２の複
合体を加えることによって、固相から浸出により分離さ
れた固相結合性結合相手が中和され、免疫学的定量の過
程を妨げることがない。驚いたことに、本発明の範囲内
で、非常に改良された検量線が観測され、それ故にかな
り良好な感度が観察され得ることがさらに判明した。最
低標準に対する信号の極めてわずかな増加（１０−２０
ｍＡ）は最高標準に対する約５００ｍＡの吸光度増加と
対照的である。その特有の利点は、それが非常に低い濃
度範囲で区別する能力の最適化と関係していることであ
る。同じ信号精度を有する検量線の勾配の一般的増加は
必然的により低い濃度変動係数へ導く。このことは、固
相から分離された固相結合相手が第２の複合体（好まし
くは固相結合相手のための複数の結合部位を有する）を
介して固相に再び結合されるという事実による。固相結
合相手のための複数の結合部位を有する複合体は、巨大
分子を他方の結合相手と、結合相手の過剰モル量（好ま
しくは５：１−１０：１）で、反応させることにより製
造される。
固相に結合し得る物質（ｂ）から成る本発明の第２の複
合体を加えることによって、固相から浸出により分離さ
れた固相結合性結合相手が中和され、免疫学的定量の過
程を妨げることがない。驚いたことに、本発明の範囲内
で、非常に改良された検量線が観測され、それ故にかな
り良好な感度が観察され得ることがさらに判明した。最
低標準に対する信号の極めてわずかな増加（１０−２０
ｍＡ）は最高標準に対する約５００ｍＡの吸光度増加と
対照的である。その特有の利点は、それが非常に低い濃
度範囲で区別する能力の最適化と関係していることであ
る。同じ信号精度を有する検量線の勾配の一般的増加は
必然的により低い濃度変動係数へ導く。このことは、固
相から分離された固相結合相手が第２の複合体（好まし
くは固相結合相手のための複数の結合部位を有する）を
介して固相に再び結合されるという事実による。固相結
合相手のための複数の結合部位を有する複合体は、巨大
分子を他方の結合相手と、結合相手の過剰モル量（好ま
しくは５：１−１０：１）で、反応させることにより製
造される。
【０００８】さらに、驚いたことに、その信号のレベル
でさえ、変動係数は約５０％減少することが分かり、こ
れはおそらく固相壁のより強い飽和の結果であるだろ
う。本発明方法の範囲内では、好ましくは、抗体または
抗体断片が免疫学的に結合し得る物質として使用され
る。本発明方法の場合、モノクローナル抗体またはその
断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）2 、ＦａｂまたはＦａｂ’
断片）を使用することが望ましい。しかしながら、ポリ
クローナル抗血清も使用できる。
でさえ、変動係数は約５０％減少することが分かり、こ
れはおそらく固相壁のより強い飽和の結果であるだろ
う。本発明方法の範囲内では、好ましくは、抗体または
抗体断片が免疫学的に結合し得る物質として使用され
る。本発明方法の場合、モノクローナル抗体またはその
断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）2 、ＦａｂまたはＦａｂ’
断片）を使用することが望ましい。しかしながら、ポリ
クローナル抗血清も使用できる。
【０００９】本発明の範囲内で用いられる特異的結合対
は好ましくはビオチン／ストレプトアビジンであり、ス
トレプトアビジンは固相に結合させることが好ましく、
ビオチンは均質相中に存在する物質、すなわち特異的に
結合可能な物質および非特異的物質に結合させることが
好ましい。本発明によれば、例えばハプテン／特異的抗
体から成る結合対も使用することができ、その場合ハプ
テンとしてジゴキシンを使用することが好適である。
は好ましくはビオチン／ストレプトアビジンであり、ス
トレプトアビジンは固相に結合させることが好ましく、
ビオチンは均質相中に存在する物質、すなわち特異的に
結合可能な物質および非特異的物質に結合させることが
好ましい。本発明によれば、例えばハプテン／特異的抗
体から成る結合対も使用することができ、その場合ハプ
テンとしてジゴキシンを使用することが好適である。
【００１０】本発明の方法では、固相から分離されたス
トレプトアビジン（被分析体に特異的に結合し得るビオ
チニル化物質の著量を中和する）が原因で起こる液相中
に存在するビオチンの減少を防止することが可能であ
る。本発明のこの手法は、不均一イムノアッセイで最終
的に被分析体が特異的結合対によって固相に結合される
あらゆる免疫学的試験に適用することができる。
トレプトアビジン（被分析体に特異的に結合し得るビオ
チニル化物質の著量を中和する）が原因で起こる液相中
に存在するビオチンの減少を防止することが可能であ
る。本発明のこの手法は、不均一イムノアッセイで最終
的に被分析体が特異的結合対によって固相に結合される
あらゆる免疫学的試験に適用することができる。
【００１１】本発明の範囲内で用いられる巨大分子と結
合対の第２の結合相手との複合体は、所望により糖、リ
ン酸および／またはリピド残基で修飾され得るタンパク
質、例えば非特異的抗体、すなわち試験系のいずれの成
分に対しても特異的結合を示さない抗体（分子量 約15
0000）、またはウシ血清アルブミンのようなアルブミン
（分子量 68000 ）もしくは凝集アルブミン（分子量＞
100 万、EP-A 0 269 092を参照）を巨大分子として含む
複合体が好ましい。別の適当な巨大分子は例えば炭水化
物、リピド、合成ポリマーおよび核酸である。巨大分子
の分子量は好ましくは 50000から 200万までの範囲であ
る。本発明複合体の製造は公知の方法で実施することが
でき、好ましくは活性化した結合相手（例えば、反応性
ビオチン誘導体または反応性ハプテン誘導体、例えばジ
ゴキシン誘導体）を巨大分子上の反応性の基（例えば、
ＮＨ2 またはＳＨ基）と反応させることにより行われ
る。反応性ビオチンおよびハプテン誘導体の製造は JAC
S 100 (1978), 3585-3590 に記載されている。
合対の第２の結合相手との複合体は、所望により糖、リ
ン酸および／またはリピド残基で修飾され得るタンパク
質、例えば非特異的抗体、すなわち試験系のいずれの成
分に対しても特異的結合を示さない抗体（分子量 約15
0000）、またはウシ血清アルブミンのようなアルブミン
（分子量 68000 ）もしくは凝集アルブミン（分子量＞
100 万、EP-A 0 269 092を参照）を巨大分子として含む
複合体が好ましい。別の適当な巨大分子は例えば炭水化
物、リピド、合成ポリマーおよび核酸である。巨大分子
の分子量は好ましくは 50000から 200万までの範囲であ
る。本発明複合体の製造は公知の方法で実施することが
でき、好ましくは活性化した結合相手（例えば、反応性
ビオチン誘導体または反応性ハプテン誘導体、例えばジ
ゴキシン誘導体）を巨大分子上の反応性の基（例えば、
ＮＨ2 またはＳＨ基）と反応させることにより行われ
る。反応性ビオチンおよびハプテン誘導体の製造は JAC
S 100 (1978), 3585-3590 に記載されている。
【００１２】本発明はさらに、固相に固定化された結合
対の第１の結合相手を使用する不均一免疫学的試験によ
り被分析体を定量するための試薬に関し、その試薬は、
上記結合対の第２の結合相手（ａ）と被分析体に特異的
に免疫結合し得る第１の物質（ｂ）から成る第１の複合
体、並びに被分析体に特異的に免疫結合し得る第２の標
識物質を含み、さらにそれが被分析体に結合し得ない巨
大分子（ａ）と上記結合対の第２の結合相手（ｂ）から
成る第２の複合体を含むことを特徴としている。
対の第１の結合相手を使用する不均一免疫学的試験によ
り被分析体を定量するための試薬に関し、その試薬は、
上記結合対の第２の結合相手（ａ）と被分析体に特異的
に免疫結合し得る第１の物質（ｂ）から成る第１の複合
体、並びに被分析体に特異的に免疫結合し得る第２の標
識物質を含み、さらにそれが被分析体に結合し得ない巨
大分子（ａ）と上記結合対の第２の結合相手（ｂ）から
成る第２の複合体を含むことを特徴としている。
【００１３】本発明の試薬に含まれる、被分析体に結合
し得ない巨大分子（ａ）と結合対の第２の結合相手
（ｂ）から成る第２の複合体は、好ましくは固相に固定
化された結合対の第１の結合相手のための複数の結合部
位を有する複合体である。本発明の試薬では、結合対と
してストレプトアビジン／ビオチンを使用することが好
ましい。本発明の試薬に含まれる巨大分子はタンパク質
が好ましく、特に非特異的抗体またはウシ血清アルブミ
ンが好ましい。
し得ない巨大分子（ａ）と結合対の第２の結合相手
（ｂ）から成る第２の複合体は、好ましくは固相に固定
化された結合対の第１の結合相手のための複数の結合部
位を有する複合体である。本発明の試薬では、結合対と
してストレプトアビジン／ビオチンを使用することが好
ましい。本発明の試薬に含まれる巨大分子はタンパク質
が好ましく、特に非特異的抗体またはウシ血清アルブミ
ンが好ましい。
【００１４】さらに、本発明の試薬では、被分析体に結
合し得ない巨大分子（ａ）と結合対の第２の結合相手
（ｂ）から成る第２の複合体が結合対の第１の結合相手
のための結合部位を複数もっていることが望ましい。実
施例で使用されるＭＭ型のクレアチンキナーゼに対する
モノクローナル抗体は、European Collection of Anima
l Cell Cultures (ECACC) (Porton Down, GB-Salisbur
y, Wiltshire SP4 OJG)に寄託番号 ECACC 88091404 と
して寄託された。
合し得ない巨大分子（ａ）と結合対の第２の結合相手
（ｂ）から成る第２の複合体が結合対の第１の結合相手
のための結合部位を複数もっていることが望ましい。実
施例で使用されるＭＭ型のクレアチンキナーゼに対する
モノクローナル抗体は、European Collection of Anima
l Cell Cultures (ECACC) (Porton Down, GB-Salisbur
y, Wiltshire SP4 OJG)に寄託番号 ECACC 88091404 と
して寄託された。
【００１５】
【実施例】以下の実施例は本発明を明示するためのもの
である。略号 ： ＣＫ ＭＭ： ＭＭ型のクレアチンキナーゼ ＢＳＡ： ウシ血清アルブミン ＰＥＧ ４００００： ポリエチレングリコール（Ｍ
Ｗ：４００００） Ｂ−ＩｇＧ： ウシ免疫グロブリンＧ 記載した百分率は重量百分率である。実施例１ 抗体のビオチニル化 ＣＫ ＭＭ (ECACC 88091404) またはＣＡ １２５（Bo
ehringer Mannheim GmbH、カタログ番号 11 22 789）に
対するモノクローナル抗体をＤ−ビオチニル−ε−アミ
ノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
と７：１（ビオチン：ＩｇＧ）の比で JACS 100 (197
8), 3585-3590 に従って反応させる。実施例２ ＢＳＡビオチンを形成するためのウシ血清アルブミンの
ビオチニル化 ビオチニル化のために、ＢＳＡをＤ−ビオチニル−ε−
アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルと１：５または１：１０（ＢＳＡ：ビオチン）の比
で JACS 100 (1978), 3585-3590 に従って反応させる。実施例３ ＣＡ １２５の定量（１−ステップ法） 実施例１により製造したＣＡ １２５に対する１０μｇ
／ｍｌのビオチニル化ＭＡＢ、所望により、ＣＫＭＭに
対する５０μｇ／ｍｌのビオチニル化ＭＡＢもしくは２
０−５０μｇ／ｍｌのビオチニル化ＢＳＡ（実施例
２）、およびペルオキシダーゼとＣＡ １２５に対する
ＭＡＢの複合体（ペルオキシダーゼ活性 約３０Ｕ／ｍ
ｌ）をインキュベーション緩衝液と共に１：１：１：１
００の比で混合して反応溶液を調製する。インキュベーション緩衝液（ｐＨ７．４） ：物質 濃度 リン酸Ｎａ 40 mmol/l 酒石酸二Ｎａ 200 mmol/l プルロニック（商標名）Ｆ６８ 0.6 % フェノール 0.01 % ＢＳＡ 0.2 % ＰＥＧ ４００００ 0.75 % Ｂ−ＩｇＧ 0.1 %洗浄液 ： 蒸留水１Ｌ中のＮａＣｌ 250 mgおよびＣｕ
ＳＯ4 1 mg ストレプトアビジンを被覆したポリスチレンチューブ
（EP-A 0 269 092により製造）内で試料１００μｌを反
応溶液１０００μｌと１８０分間インキュベートする。
液相を吸引し、洗浄液で２回洗う。続いて、基質溶液
（１００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸−クエン酸緩衝液ｐＨ
５．０、１．４７ｍｍｏｌ／ｌの過ホウ酸ナトリウム、
９．１ｍｍｏｌ／ｌの２，２’−アジノ−ジ−〔３−エ
チル−ベンゾチアゾリンスルホン酸（６）〕ジアンモニ
ウム塩）１ｍＬを加え、６０分間インキュベートし、発
色を４２０ｎｍで光度測定する。結果は表ＩからＶＩＩ
に示してある。 表についての説明： ＭＡＢ ＣＫ−Ｂｉ： ＣＫ ＭＭに対するＭ
ＡＢとビオチンの複合体（非特異的複合体） ＭＡＢ ＣＡ １２５−Ｂｉ： ＣＡ １２５に対する
ＭＡＢとビオチンの複合体（被分析体−結合性複合体） ａ−ｅ： ＣＡ １２５標準 約０−５００Ｕ／ｍｌの濃度 それぞれの場合の表中の数値は４２０ｎｍで測定した吸
光度の値（ｍＡ）である（表ＶＩＩ：Ｅ）。
である。略号 ： ＣＫ ＭＭ： ＭＭ型のクレアチンキナーゼ ＢＳＡ： ウシ血清アルブミン ＰＥＧ ４００００： ポリエチレングリコール（Ｍ
Ｗ：４００００） Ｂ−ＩｇＧ： ウシ免疫グロブリンＧ 記載した百分率は重量百分率である。実施例１ 抗体のビオチニル化 ＣＫ ＭＭ (ECACC 88091404) またはＣＡ １２５（Bo
ehringer Mannheim GmbH、カタログ番号 11 22 789）に
対するモノクローナル抗体をＤ−ビオチニル−ε−アミ
ノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
と７：１（ビオチン：ＩｇＧ）の比で JACS 100 (197
8), 3585-3590 に従って反応させる。実施例２ ＢＳＡビオチンを形成するためのウシ血清アルブミンの
ビオチニル化 ビオチニル化のために、ＢＳＡをＤ−ビオチニル−ε−
アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルと１：５または１：１０（ＢＳＡ：ビオチン）の比
で JACS 100 (1978), 3585-3590 に従って反応させる。実施例３ ＣＡ １２５の定量（１−ステップ法） 実施例１により製造したＣＡ １２５に対する１０μｇ
／ｍｌのビオチニル化ＭＡＢ、所望により、ＣＫＭＭに
対する５０μｇ／ｍｌのビオチニル化ＭＡＢもしくは２
０−５０μｇ／ｍｌのビオチニル化ＢＳＡ（実施例
２）、およびペルオキシダーゼとＣＡ １２５に対する
ＭＡＢの複合体（ペルオキシダーゼ活性 約３０Ｕ／ｍ
ｌ）をインキュベーション緩衝液と共に１：１：１：１
００の比で混合して反応溶液を調製する。インキュベーション緩衝液（ｐＨ７．４） ：物質 濃度 リン酸Ｎａ 40 mmol/l 酒石酸二Ｎａ 200 mmol/l プルロニック（商標名）Ｆ６８ 0.6 % フェノール 0.01 % ＢＳＡ 0.2 % ＰＥＧ ４００００ 0.75 % Ｂ−ＩｇＧ 0.1 %洗浄液 ： 蒸留水１Ｌ中のＮａＣｌ 250 mgおよびＣｕ
ＳＯ4 1 mg ストレプトアビジンを被覆したポリスチレンチューブ
（EP-A 0 269 092により製造）内で試料１００μｌを反
応溶液１０００μｌと１８０分間インキュベートする。
液相を吸引し、洗浄液で２回洗う。続いて、基質溶液
（１００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸−クエン酸緩衝液ｐＨ
５．０、１．４７ｍｍｏｌ／ｌの過ホウ酸ナトリウム、
９．１ｍｍｏｌ／ｌの２，２’−アジノ−ジ−〔３−エ
チル−ベンゾチアゾリンスルホン酸（６）〕ジアンモニ
ウム塩）１ｍＬを加え、６０分間インキュベートし、発
色を４２０ｎｍで光度測定する。結果は表ＩからＶＩＩ
に示してある。 表についての説明： ＭＡＢ ＣＫ−Ｂｉ： ＣＫ ＭＭに対するＭ
ＡＢとビオチンの複合体（非特異的複合体） ＭＡＢ ＣＡ １２５−Ｂｉ： ＣＡ １２５に対する
ＭＡＢとビオチンの複合体（被分析体−結合性複合体） ａ−ｅ： ＣＡ １２５標準 約０−５００Ｕ／ｍｌの濃度 それぞれの場合の表中の数値は４２０ｎｍで測定した吸
光度の値（ｍＡ）である（表ＶＩＩ：Ｅ）。
【表１】 表Ｉから、被分析体に結合し得ない複合体ＭＡＢ ＣＫ
−Ｂｉを試験複合体ＭＡＢ ＣＡ１２５−Ｂｉに対して
過剰に加えると、信号強度が複合体ＭＡＢ ＣＫ−Ｂｉ
の不在のときよりも驚くほど顕著に高くなることが分か
る。
−Ｂｉを試験複合体ＭＡＢ ＣＡ１２５−Ｂｉに対して
過剰に加えると、信号強度が複合体ＭＡＢ ＣＫ−Ｂｉ
の不在のときよりも驚くほど顕著に高くなることが分か
る。
【表２】
【表３】 非特異的複合体ＭＡＢ ＣＫ−Ｂｉの存在によってもた
らされる信号強度の増加の効果は、被分析体−特異的複
合体ＭＡＢ ＣＡ１２５−Ｂｉの濃度を変えた場合にも
見られる。この効果はＭＡＢ ＣＫ−Ｂｉが過剰に存在
するときに特に顕著である。
らされる信号強度の増加の効果は、被分析体−特異的複
合体ＭＡＢ ＣＡ１２５−Ｂｉの濃度を変えた場合にも
見られる。この効果はＭＡＢ ＣＫ−Ｂｉが過剰に存在
するときに特に顕著である。
【表４】 被分析体−結合性複合体ＭＡＢ ＣＡ１２５−Ｂｉに対
して５：１の過剰モル量で本発明の非特異的複合体ＭＡ
Ｂ ＣＫ−Ｂｉを添加すると、ＭＡＢ ＣＡ１２５−Ｂ
ｉの濃度に関してより広範な測定プラトーが得られる。
して５：１の過剰モル量で本発明の非特異的複合体ＭＡ
Ｂ ＣＫ−Ｂｉを添加すると、ＭＡＢ ＣＡ１２５−Ｂ
ｉの濃度に関してより広範な測定プラトーが得られる。
【表５】
【００１６】
【表６】 表ＩＶとＶを比較すると、非特異的複合体ＭＡＢ ＣＫ
−Ｂｉの添加により抗原ＣＡ−１２５の測定精度が向上
することが分かる。 ｘ：２０の測定値の平均 ｓ：標準偏差 ＶK ：濃度に基づいた変動係数
−Ｂｉの添加により抗原ＣＡ−１２５の測定精度が向上
することが分かる。 ｘ：２０の測定値の平均 ｓ：標準偏差 ＶK ：濃度に基づいた変動係数
【００１７】
【表７】
【００１８】
【表８】 ＨＳ：ヒト血清 ＤＤ：二重反復測定 ＳＤ：単一測定実施例４ エストラジオールの定量 ストレプトアビジンを被覆したポリスチレンチューブに
試料（ヒト血清）１００μｌを移し、５００μｌのイン
キュベーション緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩
衝液ｐＨ７．０）中の７０ｎｇのビオチニル化抗エスト
ラジオール抗体（D. Catty (ed.), Antibodies, Vol.I,
A practical approach, IRL-Press, Washington, 198
8, 85に記載されるG. Brownらの方法に従って生産した
ポリクローナル抗体; エストラジオール（Boehringer M
annheim GmbH、カタログ番号 11 22789）で免疫する）
を加え、３０分間インキュベートする。
試料（ヒト血清）１００μｌを移し、５００μｌのイン
キュベーション緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩
衝液ｐＨ７．０）中の７０ｎｇのビオチニル化抗エスト
ラジオール抗体（D. Catty (ed.), Antibodies, Vol.I,
A practical approach, IRL-Press, Washington, 198
8, 85に記載されるG. Brownらの方法に従って生産した
ポリクローナル抗体; エストラジオール（Boehringer M
annheim GmbH、カタログ番号 11 22789）で免疫する）
を加え、３０分間インキュベートする。
【００１９】ペルオキシダーゼと抗エストラジオール抗
体の複合体（Boehringer MannheimGmbH、カタログ番号
11 22 789、５００μｌのインキュベーション緩衝液中
のＰＯＤ活性１５０ｍＵ／ｍｌ）の添加後、さらに６０
分間インキュベートする。液相を吸引し、チューブを洗
浄液で数回洗った後、１ｍＬの基質溶液を加え、３０分
間インキュベートし、発色を４２０ｎｍで光度測定す
る。結果は表ＶＩＩＩに示してある。
体の複合体（Boehringer MannheimGmbH、カタログ番号
11 22 789、５００μｌのインキュベーション緩衝液中
のＰＯＤ活性１５０ｍＵ／ｍｌ）の添加後、さらに６０
分間インキュベートする。液相を吸引し、チューブを洗
浄液で数回洗った後、１ｍＬの基質溶液を加え、３０分
間インキュベートし、発色を４２０ｎｍで光度測定す
る。結果は表ＶＩＩＩに示してある。
【００２０】
【表９】 方法１： ３ｎｇビオチン／ｍｌ 方法２： １．５μｇ ＴＢＳＡビオチン（１：１５）
／ｍｌ ｍＡ： ｍＡで表した４２０ｎｍでの吸光度 表ＶＩＩＩは、ビオチン単独の添加がこの試験の精度を
顕著に向上させるのに適していないことを示している。
高分子ＢＳＡ（ＴＢＳＡ、EP-A 0 269 092により製造）
とビオチンの複合体（ＴＢＳＡ−ビオチン）の添加のみ
が精度を向上させる。
／ｍｌ ｍＡ： ｍＡで表した４２０ｎｍでの吸光度 表ＶＩＩＩは、ビオチン単独の添加がこの試験の精度を
顕著に向上させるのに適していないことを示している。
高分子ＢＳＡ（ＴＢＳＡ、EP-A 0 269 092により製造）
とビオチンの複合体（ＴＢＳＡ−ビオチン）の添加のみ
が精度を向上させる。
Claims (10)
- 【請求項１】 第１の結合相手と第２の結合相手とから
成る結合対の固相に固定化された第１の結合相手を使用
する不均一免疫学的試験により被分析体を定量する方法
であって、被分析体を含む試料溶液を該固相の存在下で
（１）上記結合対の第２の結合相手（ａ）と被分析体に
特異的に免疫結合し得る第１の物質（ｂ）から成る第１
の複合体、または（２）上記結合対の第２の結合相手
（ａ）と被分析体に特異的に免疫結合し得る第１の物質
（ｂ）から成る第１の複合体並びに被分析体に特異的に
免疫結合し得る第２の標識物質、と共にインキュベート
し、その後相を分離し、（１）の場合は、被分析体に特
異的に結合し得る第２の標識物質を含む別の溶液で液相
を置換し、それを再度インキュベートし、その後相を分
離し、そして両方の場合に、最後に分離された固相上の
または液相中の標識を被分析体の量の指標として測定す
ることから成り、 被分析体に結合し得ない巨大分子（ａ）と上記結合対の
第２の結合相手（ｂ）から成る第２の複合体を第１の複
合体に対して過剰量で液相にさらに添加することを特徴
とする上記方法。 - 【請求項２】 被分析体に特異的に免疫結合し得る第１
および第２の物質として抗体または抗体断片を使用す
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 同じ型の被分析体結合部位を有する免疫
学的に結合可能な第１および第２の物質を使用する、請
求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 第２の複合体を第１の複合体に対して２
−１０倍過剰に使用する、請求項１−３のいずれか１つ
に記載の方法。 - 【請求項５】 被分析体に結合し得ない巨大分子（ａ）
と結合対の第２の結合相手（ｂ）から成る第２の複合体
が、結合対の第１の結合相手のための複数の結合部位を
有する、請求項１−４のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項６】 第２の複合体が結合対の第１の結合相手
のための５−１０の結合部位を有する、請求項５記載の
方法。 - 【請求項７】 第１の結合相手と第２の結合相手とから
成る結合対の固相に固定化された第１の結合相手を使用
する不均一免疫学的試験により被分析体を定量するため
の試薬であって、（１）上記結合対の第２の結合相手
（ａ）と被分析体に特異的に免疫結合し得る第１の物質
（ｂ）から成る第１の複合体、および（２）被分析体に
特異的に免疫結合し得る第２の標識物質を含み、さらに
（３）被分析体に結合し得ない巨大分子（ａ）と上記結
合対の第２の結合相手（ｂ）から成る第２の複合体を含
むことを特徴とする上記試薬。 - 【請求項８】 特異的に免疫結合し得る第１および第２
の物質が抗体または抗体断片から成る、請求項７記載の
試薬。 - 【請求項９】 特異的に免疫結合し得る第１および第２
の物質が同じ型の被分析体結合部位を有する、請求項７
または８記載の試薬。 - 【請求項１０】 被分析体に結合し得ない巨大分子
（ａ）と結合対の第２の結合相手（ｂ）から成る第２の
複合体が、結合対の第１の結合相手のための複数の結合
部位を有する、請求項７−９のいずれか１つに記載の試
薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4136010:9 | 1991-10-31 | ||
| DE4136010A DE4136010A1 (de) | 1991-10-31 | 1991-10-31 | Verfahren zur bestimmung einer immunologisch bindefaehigen substanz |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05223817A JPH05223817A (ja) | 1993-09-03 |
| JPH0799370B2 true JPH0799370B2 (ja) | 1995-10-25 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP0540037B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0799370B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US20050112586A1 (en) * | 2003-11-24 | 2005-05-26 | Roland Janzen | Method and composition for stabilizing liquid reagents |
| US20110076697A1 (en) * | 2009-04-28 | 2011-03-31 | Innovative Laboratory Technologies, Inc. | Lateral-flow immuno-chromatographic assay devices |
| CN102621302A (zh) * | 2012-03-22 | 2012-08-01 | 四川省新成生物科技有限责任公司 | 线性免疫法检测膜条及其制作工艺 |
| BR112021009419A2 (pt) | 2018-11-16 | 2021-08-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | fase sólida, método de preparação de uma fase sólida, uso, kit para determinar um analito em uma amostra, complexo e métodos para formar um complexo e para determinar um analito em uma amostra |
| CN112129955B (zh) * | 2019-06-25 | 2023-04-07 | 迈克生物股份有限公司 | 睾酮检测试剂盒 |
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|---|---|---|---|---|
| DE3134787A1 (de) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Creatinin-antikoerper |
| IL75020A (en) * | 1984-05-10 | 1988-10-31 | Abbott Lab | Biotin-antibiotin immunoassay for the detection of ligands |
| US4870007A (en) * | 1987-12-18 | 1989-09-26 | Eastman Kodak Company | Immobilized biotinylated receptor in test device, kit and method for determining a ligand |
| US5164299A (en) * | 1990-03-20 | 1992-11-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Use of a mixture of conjugated and unconjugated solid phase binding reagent to enhance the performance of assays |
-
1991
- 1991-10-31 DE DE4136010A patent/DE4136010A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-10-29 US US07/968,139 patent/US5278081A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-30 EP EP92118637A patent/EP0540037B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-30 DE DE59207717T patent/DE59207717D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-30 AT AT92118637T patent/ATE146595T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-10-30 ES ES92118637T patent/ES2097851T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-30 JP JP4292563A patent/JPH0799370B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| US5278081A (en) | 1994-01-11 |
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| ES2097851T3 (es) | 1997-04-16 |
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| EP0540037A2 (de) | 1993-05-05 |
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