JPS6080766A - 免疫凝集用粒子懸濁液 - Google Patents

免疫凝集用粒子懸濁液

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JPS6080766A
JPS6080766A JP59143189A JP14318984A JPS6080766A JP S6080766 A JPS6080766 A JP S6080766A JP 59143189 A JP59143189 A JP 59143189A JP 14318984 A JP14318984 A JP 14318984A JP S6080766 A JPS6080766 A JP S6080766A
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JP59143189A
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ロバート・ローゼンスタイン
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Becton Dickinson and Co
Original Assignee
Becton Dickinson and Co
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Publication date
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特定の抗原性物質の存在を検知するために抗体
を使用する試験、よシ詳細には抗体がそれに対し反応性
を示す特定の抗原の存在下で凝集する、固体状支持体粒
子に結合した改良された抗体分子懸濁液に関する。
抗体は異種物質の存在に反応してその物質を中和する目
的で動物が産生ずる大型の蛋白性分子である。抗体分子
は高度に特異的でアリ、この抗体に対する抗原である特
定の分子の特定部位のみを識別する。抗体はその高度の
特異性のため各種抗原性物質の存否を確認する際にきわ
めて有用であり、抗体の特異性を利用した多数の試験法
（たとえばラジオイムノアッセイ）が開発された。比較
的近年、単クローン性抗体が開発され、抗体画分が単一
の型の抗体のみを含むことを保証する実用的な方法が得
られた。単クローン性抗体は大部分の診断試験Ｖこおい
て通常の抗体画分の代わりに用いることができ、通常の
抗体画分を用いる試験法よシも大きな精度および信頼性
を与える。
複数の抗体識別部位（抗原決定基）をもつ大型抗原の存
在を検知するために特に有用な、これまでに開発された
特定の型の一試験法は、凝集試験である。抗体分子はポ
リマー製の微小粒子に結合しており、この粒子結合抗体
が液状媒質に懸濁されている。この粒子結合抗体は抗原
の存在下で抗原上の識別部位に付着する。２個以上の粒
子上の抗体分子が同一抗原分子に付着すると、これらの
粒子が架橋し、多数の粒子が架橋するのに伴ってこれら
は凝集し、懸濁液から沈殿する。懸濁した粒子の凝集お
よび沈殿は肉眼で容易に観察でき、特定の抗原が存在す
ることのきわめて簡単なかつきわめて確実な試験法が得
られる。
抗体をポリマー粒子に付着させるための現在用いられて
いる一方法はｉｔ　、　ｓ　、モルディ、Ｗ、Ｊ、ドレ
ーヤー、Ａ、レムバウムおよびｓ、ｐ、ｓ、エンの”新
しいイムノラテックス球：走査′颯子顕微鏡用のリンパ
球上抗原の可視マーカー”＜Ｊ、ｃｅｔｔＥｉｏｌ、　
（１９７５）　６４．７５〜８８頁フに記載されている
。カルボキシ誘導化されたラテックス粒子をカルボジイ
ミドの存在下で抗体と反応させ、抗体上のアミノ基をペ
プチド上のカルボキシル基とカップリングさせる。この
方法は比較的小型の抗体（すなわちＩｇＧなどの免疫グ
ロブリン分子）を結合させるために有用であるが比較的
大きな抗体分子（たとえばＩ（ＩＭ）を結合させるため
に受容できる様式では作用しない。さらに、この方法は
粒子に結合する抗体の量を制御するための方法を提供す
るものではない。過剰量の抗体が粒子に結合すると、粒
子は早期に（すなわち抗原を導入する前に）凝集する傾
向を示す場合がある。
抗体をラテックス粒子に結付させるための他の方法は、
カレルＪ、ファン・オスおよびＪ、Ｍ、シンガー：”ポ
リスチレンラテックス粒子による免疫グロブリンおよび
他の蛋白質の結合”　＜Ｊ、Ｒｅｔ−１ｃｒｂｌｏｅｎ
ｄｏｔんｇｌｉａｌ　Ｓｏｃ、＋　１９６６、３、２９
−４０頁）に記載されているように、抗体をラテックス
粒子の表面に吸着させることによるものである。この方
法の成否はラテックスの個々のロットに大幅に依存し、
異なるロットはきわめて異なる吸着性および安定性をも
つのである。結果を予測しにくいためこの方法は主とし
て比較的大型の抗体分子、たとえばＩｇＭに用いられる
。
抗体の型に関係なく、またラテックス粒子の個々のロッ
トの吸着性に関係なく、より大きな古現性をもって製造
できる、抗体と結合したラテックス粒子を提供すること
が望ましいであろう。さらに、抗体分子が過剰に結合し
た粒子による早期凝集が起こらないことを保証し、また
さらに抗原の存在下で迅速に粒子を凝集させるのに十分
な結合抗体分子が存在する仁とを保証するために、粒子
に結合する抗体分子の数を制御することが望ましい。
本発明は、アビジン−ビオチン架橋により抗体分子に結
合したカルボキシ誘導化されたラテックス粒子の懸濁液
からなる診断用組成物を提供する。
表面に多数の遊離カルボキシル基をもつラテックス粒子
を、カルボジイミド中間体の使用によりアビジンに結合
させる。ビオチンは抗体に共有結合させる。ろらかしめ
定められたモル比のビオチンおよびビオチニル化抗体の
混合物をラテックスに結合したアビジンと反応させ、抗
体成分を選ばれた割合のアビジン結合部位に結合させる
。粒子が抗体に対する抗原の存在下で架橋し、凝集する
まで粒子が懸濁状態に保たれるのを保証するため、アビ
ジン−ビオチン架橋を介してラテックスに結合する抗体
分子の数を制御する。
本発明によれば、抗体がアビジン−ビオチン架橋を介し
てカルボキシ誘導化されたラテックス粒子に結合した診
断用粒子が提供される。この診断用粒子は、カルボキシ
誘導化されたポリマーコアー粒子、アミド結合により該
コアー粒子に結合したアビジン成分、該アビジン成分に
結付したビオチン成分、およびアミド結合により該ビオ
チン成分に結合した抗体（免疫グロブリン）分子からな
る。この診断用粒子を液状媒質に懸濁して、結合抗体が
特異性を示す抗原の存在を診断するのに有用なラテック
ス組成物を調製する１、液状媒質に懸濁された診断用粒
子は、抗体により識別される伏ることにより凝集し、架
橋した診断用粒子は液状媒質から沈殿する。
診断用粒子を調製するためには、カルボキシ誘導化され
たラテックスコアー粒子を、該ポリマーコアー粒子の表
面カルボキシル基とアビジン上の第一アミノ基との間に
形成されるアミド結合を介してアビジンに結合させる。
関係する抗体を、ビオチン酸のカルボキシル基と抗体の
アミノ基により形成されるアミド結合によりビオチンに
結合させる。アビジンはビオチンに対しきわめて強力な
親和性をもち、抗体と結合したビオチン成分はコアー粒
子に結合したアビジン成分に連速に結合する。診断用粒
子が凝集試験を行う壕でラテックス懸濁液として安定で
あることを保証するために、各コアー粒子に結合する抗
体成分の数を制御する。
過剰のビオチニル化抗体がコアー粒子に結合したアビジ
ン成分に結合するのを防ぐため、あらかじめ定められた
モル比の遊離ビオチン酸およびビオチニル化抗体の混合
物をコアー粒子結付したアビジンと反応させて、ビオチ
ン酸がアビジン上の給仕部位のビオチニル化抗体によシ
占領される部分の一部分を占有するようにする。
ここで”ラテックス″という語は高分子材料粒子の安定
な分散液を含めて広義に用いられる。適切なラテックス
には微小なポリスチレンおよびポリアクリルアミドの粒
子の懸濁液が含筐れる。抗原に対し暴露された際に妥当
な時間内に沈殿する安定な診断用粒子懸濁液が形成され
るためには、出発ポリマーコアー粒子を直径約０．２〜
約１．０ミクロンとすべきである。
ポリマーコアー粒子はその表面にアビジン付着のための
露出したカルボキシル基を与えるためにカルボキシ誘導
化される。ポリアクリルアミド粒子はジョーンに、イン
マン法１ポリアクリルアミドビーズへの官能基、リガン
ドおよび蛋白質の共有結合’　（［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｊ、Ｖｏｌ。
ＸＸＸＩＶ、ウィリアムＢ、ヤコビ−およびメイア・ウ
ルチェク編、アカデミツク・プレス社、ニューヨーク、
１９７４年、３０〜５８頁］により誘導化することがで
きる。適切なカルボキシ誘導化ラテツークス粒子は市販
されている（たとえばポリサイエンシズ社により販売さ
れているカルボキシレートラテックス）。０，１〜約０
．５ミリ当量／ｇまでカルボキシル化された粒子が最も
適切でちることが認められた。この程度のカルボキシル
化によれば、アビジンを納会させたのち最終的にビオチ
ニル化抗体を結合させるために用いられるものよりも多
量の表面カルボキシル基が得られる。しかしこれよりも
低い程度にカルボキシル化された粒子を用いた場合、よ
り劣る結果が得られる。従って、各粒子に結合する抗体
の量をポリマーコアー粒子上のカルボキシル成分の数に
よって制限することは望１しくないと思われる。
ビオチン酸に対するアビジンの親和性が扁いことは周知
でるり、アビジンとビオチンの組合せは制御された量の
抗体をラテックスに結合させるた）ｉｏにきわめて有効
な手段を提供することが認められた。ビオチン（ヘキサ
ヒドロ−２−オキソ−ＩＨ−チェノ［３，４］イミダゾ
ール−４−ペンタン酸）はすべての生細胞にごく微量存
在する生長因子でラシ、主として蛋白質またはポリペプ
チドに結合した状態で見出される。アビジンは本質的に
等しいペプチドサブユニットＢｉを含む糖蛋白質でアシ
、これらはそれぞれ付着した炭水化物成分を含む。アと
ジンの各サブユニッｌｌ’ｌＨ［）ヒオチン結合部位を
もつ。サブユニットの分子量は合わせて約６６．０００
である。アビジンは最も一般的には生の卵白から単離さ
れるが、恐らくすべての動物の生殖管に見出されるであ
ろう。アビジンは特定の細菌、たとえばストレプトミセ
ス・アビジニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ、ｅｓ　ａｖｉ
ｄｉｎｉｉ　）によっても産生され、ここで用いられる
アビジンは動物性アビジンおよび細菌性アビジンくこと
えばストレプトアビジン）を意味するものと解すべきで
ある。ビオチンに対するアビジンの高い親和性は、大量
のアビジンがラットおよびニワトリにおいてビオチン欠
乏症を生じる作用匝より証明されている。
コアー粒子は最終的に抗体分子全結合することが予定さ
れるよりも多数の表面カルボキシル基を含むので、アビ
ジンはコアー表面の全カルボキシル基に結合すると思わ
れる化学量論的濃度よりも少ない量でコアー粒子と反応
させる。しかし、その後コアーに結合するビオチニル化
抗体の数を、コアーに結合するアビジン分子数を希望す
る数のビオチニル化抗体分子に化学量論的に結合するの
に必要な最小量に制限することによって制御するのは好
１しくなｉ０アビジンとラテックス粒子を反応させて推
定コアー粒子表面積ｔｃｍ”につき約１０１°〜約１０
１３分子のアビジンとした場合に最良の結果が得られる
ことが認められた。このためには約１．２Ｘ１０”〜約
１．２　Ｘ　１０−”　ｇのアビジンをスチレンコアー
粒子１ｇにつき反応させ、約１．２Ｘ　１０−”〜約１
．２　ｘ　１０−”ｉのアビジンをポリアクリルアミド
コアー粒子１ｇにつき反応させる。
抗体は検出すべき抗原に従って選はれる。既知の型の免
疫グロブリンはいずれも本発明方法によりラテックスコ
アー粒子と結合させることができ、ＩｔｉＧＸＩｙＡお
よびＩ（ＩＭもこれに含１れる。一般的要件は、抗体が
少なくとも２個の抗原決定基をもつ抗原に対して特異的
であり、従って抗原が別々の診断用粒子上の抗体と結合
し、これにより粒子を架橋させうろことである。多くの
重要な大型抗原たとえば４群ストレプトコツカス属の炭
水化物系のグループ抗原が複数の実質的に等しい抗原決
定基をもつ。個々の抗原が複数の同一抗原決定因子をも
たない場合であっても、抗原上の離れた位置に異なる抗
原決定基をもつ可能性もおり、この場合、２種以上の抗
体（それぞれが決定基のうちの１種と反応しうる）の混
合物をラテックスコアー粒子と結合させ、そのような特
別な抗原決定基を介して診断用粒子間で架橋させてもよ
い。
入手可能ならば単一クローン性抗体を用いて抗原を検出
することが好ましい。同一抗体分子からなる単クローン
性抗体は一般に得られる抗体画分よりもいっそう特異性
が大きく、診断用粒子のロット間でより大きな再現性を
与える。ここで用いる１単一クロ一ン性抗体″とは、ハ
イブリドーマ（雑種細胞）により産生される抗体、およ
び他の細胞不滅処置（ｉｒｗｎｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏ
ｎ）法、たとえば特定のウィルスの感染法により無限増
殖性を与えられた細胞により産生される抗体を意味する
。しかし本発明は、特に単クローン性抗体が現在のとこ
ろ得られない抗原を検出するためには、一般の抗体画分
を含む診断用粒子上も包含するものでるる。
ラテックスコアー粒子上のカルボキシル基とアビジンの
アミノ基の間のアミド結合の形成は、カルボジイミド類
たとえば１−エチル−３−（ａ−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドとラテックス粒子上のカルボキシル
基との反応により形成される中間体を介して行うことが
好ましい。カルボキシル基をカルボジイミド類との反応
により活性化したのちアビジンを導入すると、アビジン
上の第一アミノ基がカルボニルに連結したカルボジイミ
ド類と置換する。これらの反応は下記の式１式％ ビオチンのカルボキシル基と抗体分子のアミノ基の間で
アミド結合を形成するための好ましい方法は、まずＮ−
ヒドロキシイミド類（たとえはＮ−ヒドロキシスクシン
イミド）とビオチンの間でエステルを形成させ、次いで
Ｎ−ヒドロキシイミド−ビオチンを免役グロブリンと反
応させ、免疫グロブリンのアミノ基をカルボニル基に結
合したＮ−ヒドロキシイミドと置換することによる。こ
の反応はわずかにアルカリ性の条件下で、好ましくは約
７．５〜約９．０のｐＨで行われる。これらの反応は下
記の式２に表わされる。
（ビチオンン ｒ） アビジンは化学量論内型よりも少量反応させるので、結
合していない表面カルボキシル基がラテックスコアー粒
子上に残存する。これらの未結合カルボキシル基をたと
えばアミン（たとえはエタノールアミン）で中和するこ
とが好ましい。
中和ののち非免疫原性の蛋白性物質、たとえばウシ血清
アルブミン＜ＢＳＡ＞ｌｃアビジン結合ラテックス粒子
の表面に吸着させると診断用粒子がより大きな安定性を
もつ仁とが見出された。
遊離ビオチン酸をビオチニル化抗体と混和してこれらを
過剰のアビジン納付部位に関して競合させることによる
診断用粒子表面上の抗体量の制御は、本発明の重要な観
点でらると考えられる。抗体分子の量が少なすぎると適
切な速度で凝集しない場合があり、一方抗体分子が多す
ぎると早期沈殿が生じる場合がるる。一般にラテックス
コアー粒子の推定赤面８１ｔ１　ｃｍ　’につき２Ｘ１
０”〜約２Ｘ１０”個の抗体分子が結合していることが
好ましい。ただしこれは抗体が小さいか（たとえば１（
ＩＧ）または大きいか（たとえばＩＱＭ）によって若干
変わるでるろう。ビオチン敵対ビオチニル化抗体のモル
比は、アビジン納付部位の数に基づく。
遊離ビオチン酸は抗体と結合したビオチンの場合よりも
若干速かにアビジンと反応することも考慮に入れなけれ
ばならない。希望する量の抗体を診断用粒子上に施すた
めには、一般にモル比約１：１〜約１０：ｌのビオチン
酸とビオチニル化抗体の混合物を、コアー稚子に結合し
た前記の好ましい量のアビジンを有する粒子と反応させ
る必要がある。ビオチニル化抗体およびビオチン酸の混
合物とコアー粒子に結合したアビジンとの反応は下記の
式３で衣わされる。
ビオチン−Ｉσ 診断用粒子を懸濁させる液体媒質は、抗体分子の自然環
境と調和するように、一般に水性である。
わずかに塩基性のｐＨまたとえば約７．５〜約８．５が
診断用粒子の安定性に寄与する。抗微生物系、たとえば
Ｎａｐ、も媒質に添加することができる。
一般に凝集試験に用いるラテックス懸濁液は懸濁液ｌｌ
につきＦ１５〜約１０ｐの粒子全官有する。
本発明を実施例によってより詳細に記述する。
実施例 固形分２．５３量％のカルボキシレート−ラテックス（
ホＩＪす（エンス社より入手、ペンシルベニア州フリン
ト７）４．０−を蒸留水で３回洗浄し、最終洗浄ののち
粒子を蒸留水４．０−に再懸濁した。
０−０５　Ｍ−ＫＨｔＰ　Ｏａ　（ｐＨ４−５）　１．
０−を添加した。
この懸濁液をマグネチツクスターラーに乗せ、２２℃に
保持し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（シグマ・ケミカル社より入手、ミ
ズーリ州セントルイス）の２重電％の溶液５ｄを添加し
、ラテックスと共に３．５時間反応させた。次いでカル
ボジイミド活性化シたカルボキシレート−ラテックスを
塩溶液で１回洗浄し、塩溶液５ｒｎｔに再懸濁した。
アビジン１．２〜（操作はすべて二重反覆試験により行
われ、１回は卵白アビジンを用い、１回はストレプトア
ビジンを用いて行われたンを０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，５）　５　ｍｌに溶解し、ラテックス懸濁液５−
を添加した。上記のカルボジイミド活性化したカルボキ
シレート−ラテックスおよびアビジンを２２℃で２００
時間反応せた。アビジンと結合していない表面カルボキ
シル基金中和するために、エタノールアミン５ｍＭを添
加し、次いでＢＳＡを２重量％の濃度になる１で添加し
た。このアビジン−ラテックスを洗浄して、Ｎａｐ。
０．２％、ＢＳＡｏ、２％およびツウイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）−２００，０５％を官有する０、１Ｍグリシン緩衝
塩溶＠（ｐＨ８，２１に入れ、４℃で保存した。
抗体を以下によりビオチンに結合させた。
Ａ）　０．２Ｍ−ＮａＨＣＯｓｌ−０−中の多価ウサギ
ＩＱＧ（ＡＩＦストレプトコッカス抗原に対する抗体）
１ダをＤＭＳＯ中のｄ−ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルのｍＷ　（１，ｏ　ｍ９／ｍｔ）５
０μｌと反応させた。反応を２２℃で４時間進行させ、
仄いて反応混合物を５００倍量の０．９１Ｍトリス−緩
衝塩溶液（ｐＨｓ、ｏ、Ｎ　ａＮｓ　Ｏ−２％を官有）
に対して４℃で１８時間透析した。
Ｂ）　０．２　Ｍ−ＮｃＬＨＣＣ）ｓ　１．０　ｍ／！
中のマウス単クローｙ１ｇＧｓ＜Ａｎストレプトコッカ
ス抗原に対する抗体）１．０〜をＤＭＳＯ中のｄ−ビオ
チン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩ）ａ液
（１，０Ｒｇ／ｍ／）８μノと反応させた。反応を２２
℃で４時間進行させ、次いで反応混合物を５００倍量の
０．０ＩＡｆ）リス緩衝塩溶液（ｐＨ８−０、Ｎ　ａＮ
ｓＯ０２％を官有）に対して４℃で１８時間透析した。
Ｃ）　０−２　Ｍ−ＮａＨＣＯｓ　１−Ｏｔｄ中のマウ
ス単クローンＩＱＭ（Ｎ髄膜炎Ｂ被膜多糖類に対する抗
体）１．０Ｉｎ９をＤＭＳＯ中のｄ−ビオチア−、＃−
ヒドロキシスクシンイミドエステルの溶６　（１，０Ｉ
ｎ９／ｗ／）８〜１０μノと２２℃で４時間反応させ、
次いで反応混合物全５００倍量の０．ＯＬＭ　トＩＩス
緩衝塩溶液（ｐＨ８，０、Ｎａｐｓ　Ｏ，２Ｘを官有）
に対して透析した。
上記で調製した各ビオチニル化抗体葡アビジンーラテッ
クス粒子に付着させた。アビジン−ラテックス１．０４
を遠心分離のような手段でペレット化し、上清を除去し
た。ペレットを１０−３Ｍピオチン酸５μｌを官有する
ビオチニル化抗体１．〇−に入れ、混合物を２２℃で１
時間撹拌してビオチンおよびビオチニル化抗体を反応さ
せた。１時間後に２回目の１０”Ｍビオチン酸５μｌを
添加して、アビジン部分上の占有されていない潜在的ビ
オチン結合部位を遮蔽した。
上記の診断用粒子を遠心し、洗浄してＮａｐｓＯ０２％
、ＢＳＡｏ、２％およびツウイーン−２００，０５％を
富有する０、１Ｍグリシン緩衝塩溶液（ｐＨ８，２）に
０．６％固形分で懸濁させた。
多価ウサギＩＱＧから調製した診断用粒子懸濁液１５ｔ
ｄＫＡＷストレプトコツカス抗原０．１μｇを含有する
液５０−を添加した。４分後に懸濁液の凝集が認められ
た。
マウス単クローンＩ　ＱＧ、抗体から調製された診断用
粒子懸濁液１５−に４群ストレプトコッカス抗原０．１
μｇを含有する液５０−を添加した。
１０分後に懸濁液の凝集が認められた。
マウス単りローンＩＵＭ抗体から調製された診断用粒子
懸濁液１５ｔｎｔにＮ髄膜炎Ｂ多糖類抗原０．１μｙを
含有する［５０１ｎｔを添加した。１０分後に懸濁液の
凝集が認められた。
本発明に従って調製された診断用粒子懸濁液は冷所に保
存した場合数か月間安定で必る。この診断用粒子はきわ
めて感度が良く、微量分析法を採用してこの懸濁液をナ
ノグラム程度の少量の抗原を検出するのに用いることが
できる。
本発明の幾つかのオリ点をここでより十分に認識するこ
とができる。本発明によればＩＱＭを含むあらゆる型の
免疫グロブリンを付着させることができる。ラテックス
に付着する抗体の量はラテックスの個々のロフトの吸着
特性により左右されない。またカルボキシル化の程度は
一定の範囲内にるることが好ましいが、付着する抗体の
量はコアー粒子の厳密なカルボキシル化度とは無関係に
、すなわちカルボキシル基に結付した化学量論的値より
も少量のアビジンによって、次いでビオ−チン酸とビオ
チニル化抗体の選ばれたモル比によって決まる。製造の
再現性は先行技術によるラテックス粒子−抗体結合法と
比較して著しく高められ、特に従来、吸着を変動性の大
きい技術で行わざるを得なかったＩＱＭの結合の再現性
が者しく高められた。
本発明を特定の好筐しい実施態様に関して記述したが、
肖業者に明らかな変更を本発明範囲から逸脱することな
く行うことができる。たとえば好１しくはないが、粒子
に結合する抗体の量はラテックスコアー粒子に結合する
アビジン分子の数を制御し、次いでビオチン鞘付部位を
ビオチニル化抗体分子で飽和させることにより得られる
。診断用粒子懸濁液は一般に抗原が大型であって少なく
とも２個の抗原決定基部位をもつことを必要とするが、
抗原活性をもつ小型の分子またはハブテンの場合でも２
個以上のハブテン分子を結合させる化学物質を貧有する
液状媒質に粒子を懸濁することによって粒子を凝集させ
ることが５１ｎＱでおる。
％ｎ出願人　ベタトン・デイツキンソン・アンド・カン
ノ櫂ニー （外５名）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）直径約０．２〜約１．０ミクロンのカルボキシ誘
    導化されたポリマーコアー、 アミド結合によシ該コアーに結合した多数のアビジン成
    分、 該アビジン成分に結合した多数のビオチン成分、および アミド結合により有意の割合の該ビオチン成分に結合し
    た多数の抗体分子、 からなる診断用粒子。 （２）それぞれ、直径約０．２〜約１．０ミクロンのカ
    ルボキシ誘導化されたポリマーコアー、アミド結合によ
    り該コアーに結合した多数のアビジン成分、該アビジン
    成分に結合した多数のビオチン成分１およびアミド結合
    により有意の割合のｒＪヒオチ／成分に結合した多数の
    抗体分子からなる多数の粒子、ならびに該粒子を懸濁し
    た水性媒質からなる診断用組成物。 （３）粒子のコアーがポリアクリルアミドおよびポリス
    チレンよシなる群から選ばれるポリマーから形成されて
    いる、特許請求の範囲第２項記載の組成物。 （４）粒子がコアー表面積１ｃＷＬｔにつき約１０１０
    〜約１０′３個のアビジン分子を有する、特許請求の範
    囲第２項記載の組成物。 （５）粒子がコアー表面積１ｃ１ｒＬ２につき約２Ｘｌ
    □ｓｔ〜約２Ｘ１０”個の抗体分子を有する、特許請求
    の範囲第２項記載の組成物。 （６）診断用粒子がアミド結合にょクアビジンと結合し
    ていなりコアー表面カルボキシル基に付着した中和成分
    を有する、特許請求の範囲第２項記載の組成物。 （７）診断用粒子がコアー表面に吸着された非免疫原性
    の蛋白性物質をも含む、特許請求の範囲第２項記載の組
    成物。 （８）　抗体分子が単クローン性抗体分子である、特許
    請求の範囲第２項記載の組成物。 （９）　コアーがコアー粒子１．１ｉ［につき約０．１
    〜約０．５ミリ当量筐でカルボキシル化されている、特
    許請求の範囲第２項記載の組成物。 叫　直径約０．２〜約１．０ミクロンのカルボキシ誘導
    化されたポリマーコアー粒子を使用し、アビジン分子を
    コアー粒子にアミド結合により結合させ、 ビオチン分子を抗体分子にアミド結合により結合させ、
    そして コアー粒子に結合したアビジンを抗体分子に結合したビ
    オチンと結合させる、 ことよりなる、診断用粒子の製造方法。 （６）ポリマー１ｇにつき約Ｏ９１〜約０．５ミリ当量
    までカルボキシル化されているコアー粒子を特徴する特
    許請求の範囲第１０項記載の方法。 □□□ポリマーがポリスチレンおよびポリアクリルアミ
    ドよジなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１０項記
    載の方法。 （至）ポリマーがポリスチレンであり、コアー粒子１ｙ
    につき約１．２Ｘ１０−３〜約１．２８１０−’　ｉ　
    （７）７ビジンを結合させる、特許請求の範囲第１２項
    記載の方法。 （ロ）ポリマーがポリアクリルアミドでアリ、コアー粒
    子１ｇ＜つき約１．２’Ｘ１ｏ−３〜約１．２Ｘ１０″
    ′２ｙのアビジンを結合させる、特許請求の範囲第１２
    項記載の方法。 （ト）アビジンが卵白アビジンおよびストレプトアビジ
    ンよりなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１０項記
    載の方法。 （至）アビジンに結合していないコアー粒子の表面カル
    ボキシル基を中和することを含む、特許請求の範囲第１
    ０項記載の方法。 αη　アビジン結合およびカルボキシル基中和ののちコ
    アー粒子表面上に非免疫原性の蛋白性物質を吸着させる
    ことを含む、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 （ト）コアー粒子に結合したアビジンを遊離ビオチン酸
    および抗体に結合したビオチンの混合物と結合させるこ
    とにより免疫グロブリン分子の童を特徴する特許請求の
    範囲第１０項記載の方法。 四　抗体分子の量を制御して、コアー粒子表面積１ｃｍ
    ”につき約２Ｘ１０”〜約２Ｘ１０１を個の抗体分子と
    なす、特許請求の範囲第１８項記載の方法。 （２０ビオチン酸と抗体に結合したビオチンとのモル比
    が約１：１〜約１０：１でろる、特許請求の範囲第１９
    項記載の方法。 （２υ抗体が単クローン性抗体である、特許請求の範囲
    第１０項記載の方法。 Ｑオ　コアー粒子へのアビジンの結合が、コアー粒子を
    カルボジイミド類と反応させて中間体とな゛し、そして
    該中間体をアビジンと反応させることよりなる、特許請
    求の範囲第１０項記載の方法。 （ハ）抗体へのビオチンの結合が、ビオチンをＮ−ヒド
    ロキシイミド類と反応させてエステル中間体を形成させ
    、そして抗体を該エステル中間体と反応させることより
    なる、特許請求の範囲第２２項記載の方法。 （ハ）診断用粒子を液状媒質に懸濁して安定な懸濁液を
    形成させることを含む、特許請求の範囲第１０項記載の
    方法。
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