DK159176B - Diagnostisk partikel til immunoagglutinering, diagnostisk middel og fremgangsmaade til fremstilling af partiklen - Google Patents

Diagnostisk partikel til immunoagglutinering, diagnostisk middel og fremgangsmaade til fremstilling af partiklen Download PDF

Info

Publication number
DK159176B
DK159176B DK391884A DK391884A DK159176B DK 159176 B DK159176 B DK 159176B DK 391884 A DK391884 A DK 391884A DK 391884 A DK391884 A DK 391884A DK 159176 B DK159176 B DK 159176B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
avidin
antibody
particles
bound
molecules
Prior art date
Application number
DK391884A
Other languages
English (en)
Other versions
DK391884D0 (da
DK159176C (da
DK391884A (da
Inventor
Robert Rosenstein
Original Assignee
Becton Dickinson Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24143893&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DK159176(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Becton Dickinson Co filed Critical Becton Dickinson Co
Publication of DK391884D0 publication Critical patent/DK391884D0/da
Publication of DK391884A publication Critical patent/DK391884A/da
Publication of DK159176B publication Critical patent/DK159176B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK159176C publication Critical patent/DK159176C/da

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/823—Immunogenic carrier or carrier per se
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25875—Gaseous sample or with change of physical state

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

i
DK 159176 B
Den foreliggende opfindelse angår diagnostiske partikler til immunoagglutinering, en fremgangsmåde til fremstilling af partiklerne og et middel indeholdende partiklerne.
Antistoffer er store proteinagtige molekyler, som produceres af dyr som reaktion på tilstedeværelse af et fremmed stof med det formål at neutralisere dette stof. Et antistofmolekyle kan være. meget specifikt og genkende kun et bestemt sted af et særligt molekyle, som er antigenet til antistoffet.
På grund af deres høje specificitet er antistoffer meget nyttige til at fastslå tilstedeværelse eller fravær af forskellige antigene stoffer, og flere prøvemetoder, såsom radioimmun-bestemmelse, er blevet udviklet for at drage fordel af antistoffernes specificitet. Ret nylig er der udviklet monoklo-nale antistoffer, som giver en praktisk metode til at sikre, at en antistoffraktion kun indeholder en enkelt type antistofmolekyle . Monoklonale antistoffer kan anvendes i stedet for de sædvanlige antistoffraktioner til de fleste diagnostiske prøver og giver større nøjagtighed og pålidelighed end prøver, der anvender sædvanlige antistoffraktioner.
En særlig type prøve, der er blevet udviklet, og som er særligt nyttig til påvisning af tilstedeværelse af store antigener, der har flere antistof-genkendelsessteder (antigene determinanter) , er en agglutineringsprøve. Antistofmolekyler bindes til ganske små partikler dannet af en polymer, og det partikel-bundne antistof suspenderes i et flydende medium. I nærværelse af antigenet fastgøres det partikelbundne antistof til genkendelsesstederne på antigenet. Hvis antistofmolekyler på mere end én partikel fastgøres til samme antigen-molekyle, bliver 2
DK 159176 B
partiklerne tværbundne, og når mange partikler tværbinder, agglutinerer de og udfælder af opløsningen. Agglutinering og udfældning af de suspenderede partikler iagttages let med det blotte øje og giver en meget simpel og meget sikker prøve for, at et bestemt antigen er til stede.
En for tiden anvendt metode til at fastgøre antistoffer til polymerpartikler er beskrevet i R.S.Molday, W.J.Dreyer, A.Rem-baum & S.P.S.Yen, "New Immunolatex Spheres: Visual Makers of Antigens on Lymphocytes for Scanning Electron Microscopy", J.Cell Biol. (1975) 64, side 75 - 88. Latexpartikler, der er derivatiseret med carboxylat, bringes til at reagere med antistoffet i nærværelse af et carbodiimid, således at amino-grupper på antistoffet kobles til carboxylgrupperne på peptidet. Denne fremgangsmåde er nyttig til at binde forholdsvis små antistof- eller immunoglobulinmolekyler, såsom IgG, men virker ikke på acceptabel måde til binding af større antistofmolekyler, såsom IgM. Endvidere giver denne metode ingen måde til at regulere mængden af antistof, som bindes til partiklen. Hvis for store mængder antistof bindes til partiklerne, kan partiklerne være tilbøjelige til at agglutinere for hurtigt, d.v.s. før indføringen af antigenet.
En anden metode til at binde antistoffer til latexpartikler er ved adsorption af antistoffer til overfladen af latexpartikler, som beskrevet i Carel J.Van Oss og J.M.Singer: "The Binding of Immune Globulins and Other Proteins by Polystyrene Latex Particles", J.Reticuloendothelial-Soc. (1966) 3, side 29-40. Et godt resultat af denne fremgangsmåde afhænger i vidt omfang af det særlige parti latex, idet forskellige partier har højst forskellige adsorptionsegenskaber og stabiliteter. På grund af uforudsigeligheden af resultaterne anvendes denne fremgangsmåde stort set til større antistofmolekyler, såsom IgM.
3
DK 159176 B
Det er opfindelsens formål at tilvejebringe latexpartikler ned bundet antistof, der kan fremstilles mere reproducerbart, uanset typen af antistof og uanset adsorptionsegenskaberne af det særlige parti latexpartikler. Det ville endvidere være ønskeligt at regulere antallet af antistofmolekyler, som bindes til partiklerne, for at sikre, at for tidlig agglutinering ikke vil forekomme på grund af, at partiklerne har for mange bundne antistofmolekyler, og alligevel sikre, at der er tilstrækkeligt mange bundne antistofmolekyler til at agglu-tinere partiklerne hurtigt i nærværelse af antigenet.
Dette opnås med opfindelsen, som angiver en diagnostisk partikel indeholdende en med carboxylat derivatiseret polymer kerne med en diameter på mellem ca. 0,2 og ca. 1,0 mikron, flere avidinmolekyldéle bundet gennem amidbindinger til kernen, flere biotinmolekyldele kompleksbundet til avidinmolekyl-delene og flere åntistofmolekyler bundet gennem amidbindinger til en betydelig del af biotinmolekyldelene. En blanding af biotin og biotinyleret antistof i et forudbestemt molforhold bringes til at reagere med det latexbundne avidin og binder antistofmolekyler til en udvalgt del af avidin-bindings-stederne. Antallet af antistofmolekyler fastgjort gennem avidin-biotin-broer til latexen reguleres for at sikre, at partiklerne forbliver i suspension, indtil de tværbinder og agglutinerer i nærværelse af et antigen til antistoffet.
De diagnostiske partikler er suspenderet i flydende medium til dannelse af 4
DK 159176 B
et latexmateriale, der er nyttigt til at diagnosticere tilstedeværelse af et antigen, og for hvilket det bundne antistof er specifikt. De diagnostiske partikler suspenderet i det flydende medium agglutinerer ved tværbinding gennem antigenmolekyler, som har multiple antigene determinanter, der genkendes af antistoffet, og de tværbundne diagnostiske partikler udfælder af det flydende medium.
For at danne de diagnostiske partikler bliver latexkernepartik-ler, som er derivatiseret med carboxylat, fastgjort til avidin gennem en amidbinding mellem overflade-carboxylgrupperne på den polymere kernepartikel og primære aminogrupper på avidinen. Et antistof af interesse fastgøres til biotin gennem en amidbinding, der er dannet af carboxylgruppen af biotinsyre og en amingruppe af antistoffet. Avidin har en meget stærk affinitet til biotin, og den antistofbundne biotinmolekyldel danner let kompleks med en avidinmolekyldel bundet til kernepartiklen.
For at sikre, at de diagnostiske partikler vil blive stabile som latexsuspension indtil-agglutineringsprøven, skal antallet af antistofmolekyIdele bundet til hver kernepartikel reguleres. For at forhindre overskud af biotinyleret antistof fra avidinmolekyldelene bundet til kernepartiklerne bringes en blanding af fri biotinsyre og biotinyleret antistof i et forudbestemt molforhold til at reagere med den kernepartikel-bundne avidin, således at biotinsyren optager en del af bindingsstederne på avidinen, som ellers kunne blive optaget af det biotinylerede antistof.
5
DK 159176 B
Udtrykket "latex" anvendes i den foreliggende beskrivelse bredt til at indbefatte stabile dispersioner af partikler af polymert materiale. Egnede latexer indbefatter suspensioner af ganske små polystyren- og polyacrylamidpartikler.
For at sikre, at der kan dannes en stabil suspension af den diagnostiske partikel, som vil udfælde inden for en rimelig tid, når den udsættes for antigen, skal de som udgangsmateriale anvendte polymere kernepartikler være mellem ca. 0,2 og ca.
1,0 mikron i diameter.
De polymere kernepartikler bliver derivatiseret med carboxylat for at få blotlagte carboxylgrupper på deres overflader til fastgørelse af avidin. Polyacrylamidpartikler kan derivati-seres ved fremgangsmåden ifølge John K.Inman, "Covalent Linkage of Functional Groups, Ligands and Proteins to Polyacrylamide Beads" i Methods in Enzymology, bind XXXIV (red.
William B.Jakoby & Meir Wilchek, Academic Press, N.Y. 1974), side 30 - 58. Egnede med carboxylat derivatiserede latex-partikler er industrielt tilgængelige, f.eks. carboxylat-latex forhandlet af Polysciences. Det viser sig, at partikler carboxyleret til mellem 0,1 og ca. 0,5 milliækvivalenter pr. gram er mest egnede. Denne grad af carboxylering giver flere overflade-carboxylgrupper, end der til slut anvendes til at binde avidin og, derefter, biotinyleret antistof.
Mindre gode resultater opnås imidlertid med partikler, der er carboxyleret i mindre grad. Det anses derfor ikke for ønskeligt at begrænse mængden af antistof bundet på hver partikel gennem antallet af carboxylmolekyldele. på de polymere kernepartikler .
Den høje affinitet af avidin til biotinsyre er velkendt, og kombinationen af avidin og biotin har vist sig at give et meget effektivt middel til at binde regulerede mængder antistof til latexen. Biotin (hexahydro-2-oxo-lH-thieno[3,4j-imidazol-4-pentansyre) er en vækstfaktor, som findes i meget små mængder i enhver levende celle og viser sig at binde ho- 6
DK 159176 B
vedsagelig til proteiner og polypeptider. Avidin er et glycoprotein, der indeholder fire i hovedsagen identiske peptid-underenheder, der hver har en tilknyttet kulhydrat-molekyldel. Hver underenhed af avidin har et enkelt biotinbindingssted. Den kombinerede molekylvægt af underenhederne er ca. 66.000. Avidin isoleres mest almindeligt af rå æggehvide, men findes sandsynligvis i genitalområdet hos alle dyr. Avidin produceres også af visse bakterier, såsom Streptomyces avidinii, og avidin som anvendt til den foreliggende opfindelse skal forstås som omfattende både dyrisk avidin og bakteriel avidin, såsom streptavidin. Den høje affinitet af avidin til biotin er blevet påvist ved evnen hos store mængder avidin til at frembringe biotinmangel hos rotter og kyllinger.
Fordi kernepartiklerne har et større antal overflade-carboj^l-grupper, end der til slut skal bindes til antistofmolekyler, bringes avidin til at reagere med kernepartiklerne i mindre mængder end den støkiometriske koncentration, som ville binde til alle kerneoverfladens carboxylgrupper. Det foretrækkes imidlertid ikke at regulere antallet af biotinylerede antistof molekyler, som derefter bindes til kernerne, ved at begrænse antallet af avidinmolekyler, som er bundet til kernerne, til det minimum, som ville kræves til støkiometrisk at kompleksbinde til det ønskede antal biotinylerede antistof-molekyler. Det har vist sig, at de bedste resultater opnås, når avidin bringes til at reagere med latexpartiklerne, således at der fås mellem ca. 1010 og ca. 10^ molekyler 2 avidin pr. cm anslået kernepartikel-overfladeareal, og til -3 -2 dette formål bringes mellem ca. 1,2 x 10 og ca. 1,2 x 10 g avidin til at reagere pr. g styrenkernepartikler, og mellem -3 -2 ca. 1,2 x 10 og ca. 1,2 x 10 g avidin bringes til at reagere pr. g polyacrylamidkernepartikler.
7
DK 159176 B
Antistoffet vælges efter det antigen, som skal påvises.
Enhver af de kendte typer immunoglobuliner kan bindes til latexkernepartikler ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, herunder IgG, IgA og IgM. Et almindeligt krav er, at antistoffet skal være specifikt for et antigen, der har mindst to antigene determinanter, således at antigenet kan binde til antistoffer på forskellige diagnostiske partikler og derved tværbinde partiklerne. Mange store antigener, der har interesse, såsom gruppen kulhydrat-antigen af gruppe A Streptococcus, har multiple, i hovedsagen identiske, antigene determinanter. Hvis det særlige antigen ikke har duplikerede antigene determinanter, kan det have rumligt adskilte særlige antigene determinanter, i hvilket tilfælde en blanding af to eller flere antistoffer, der hver er reaktionsdygtige med en af determinanterne, kan bindes til latexkernepartiklerne og muliggøre tværbinding mellem diagnostiske partikler gennem de særlige antigene determinanter.
Det foretrækkes, at monoklonale antistoffer anvendes til at påvise antigener, hvis sådanne er tilgængelige. Monoklonale antistoffer, der består af identiske antistofmolekyler, er meget mere specifikke end på sædvanlig måde fremstillede antistoffraktioner og giver meget større reproducerbarhed mellem partier af diagnostiske partikler. "Monoklonale antistoffer" anvendes i den foreliggende beskrivelse om antistoffer udviklet af hybridomaer og antistoffer produceret ved anden celle-udødeliggørelsesteknik, f.eks. ved infektion med visse virus. Opfindelsen skal imidlertid omfatte diagnostiske partikler, der inkorporerer sædvanlige antistoffraktioner, især til påvisning af antigener, for hvilke der for tiden ikke haves noget monoklonalt antistof.
8
DK 159176 B
Dannelsen af amidbindingen mellem carboxylgrupperne på latex-kernepartiklerne og en amingruppe i avidinen lettes fortrinsvis gennem et mellemprodukt dannet ved reaktion af et carbo-diimid, såsom l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, med carboxylgrupperne på latexpartiklerne. Efter at carboxyl-grupperne er blevet aktiveret gennem reaktion med carbodi-imidet, indføres avidinen, hvorefter primære aminogrupper på avidinen erstatter carbodiimidet bundet til carbonylet. Disse reaktioner vises i nedenstående ligning 1: ^)-(c-Oh)x -> -(c-carbodiimid)χ > + carbodiimid Q-(S-avidin) χ
En foretrukken metode til dannelse af amidbindingen mellem carboxylgruppen i biotin og en aminogruppe i antistofmolekylet er ved først at danne en ester mellem N-hydroxyimid, såsom N-hydroxysuccinimid og biotin, og derefter bringe N-hydroxyimid-biotinet til at reagere med immunoglobulinet, hvorefter en aminogruppe i aminoglobulinet erstatter N-hydroxy-imidet bundet til carbonylet. Denne reaktion udføres ved svagt alkaliske betingelser, fortrinsvis ved en pH-værdi mellem ca. 7,5 og ca. 9,0. Disse reaktioner repræsenteres i nedenstående ligning 2: A, )—i lC"A ' (CH«) .-C-OH ^- Å 4 0 (biotin) M o )— °* NS ,-C-O-N “ bxotin-C-N-Ig
A
9
DK 159176 B
Da avidin bringes til at reagere i mindre end støkiometriske mængder, forbliver der ubundne overflade-carboxylgrupper tilbage på latexkernepartiklerne. Disse ubundne carboxylgrup-per neutraliseres fortrinsvis, f.eks. med en amin, såsom ethano lamin.
Det har vist sig, at diagnostiske partikler har større stabilitet, hvis ikke-immunogene proteinagtige materialer, såsom okseserumalbumin (BSA), efter neutralisation adsorberes på overfladerne af de avidinbundne latexkernepartikler.
Kontrol med mængden af antistof på overfladen af den diagnostiske partikel, som opnås ved at blande fri biotinsyre med biotinyleret antistof, således at de konkurrerer om de tilgængelige avidin-bindingssteder, anses for et vigtigt træk ved opfindelsen. For få antistofmolekyler kan muligvis ikke give agglutinering med en passende hastighed, hvorimod for mange antistofmolekyler kan resultere i for hurtig udfældning.
11 1 almindelighed foretrækkes det, at mellem 2 x 10 og ca.
12 2 2 x 10 antistofmolekyler er bundet pr. cm anslået overfladeareal af latexkernepartiklerne, omend dette kan variere noget, afhængende af, om antistoffet er lille, f.eks. IgG, eller stort, f.eks. IgM. Molforholdet mellem biotinsyre og biotinyleret antistof afhænger af antallet af avidin-bindingssteder. Det må også tages i betragtning, at fri biotinsyre reagerer noget hurtigere med avidinen end det antistofbundne avidin. Tilvejebringelse af en ønsket mængde antistof på de diagnostiske partikler kræver i almindelighed, at en blanding af biotinsyre og biotinyleret antistof i et molforhold mellem 1:1 og ca. 10:1 bringes til at reagere med partikler, der har avidin i de ovenfor nævnte foretrukne mængder bundet til kernepartiklerne. Reaktionen mellem en blanding af biotinyleret antistof og biotinsyre med kernepartikel-bundet avidin repræsenteres i nedenstående ligning 3: 10
DK 159176 B
(° λ -/λ v x—>, Vc-avidin:: :biotiiy Q<W..SSbrQ; \C-avidin:: :biotin-Ig/
Det flydende medium, hvori de diagnostiske partikler suspenderes, er i almindelighed vandigt, således som det passer til de naturlige omgivelser af antistofmolekyler. En svagt basisk pH-værdi, f.eks. mellem ca. 7,5 og ca. 8,5, bidrager til stabilitet af de diagnostiske partikler. Antimikrobielle midler, såsom NaN^, kan også sættes til mediet. I almindelighed indeholder latexsuspensioner til brug i agglutinationsprøver mellem ca. 5 og ca. 10 g partikler pr. liter suspension.
Opfindelsen beskrives nu i større detaljer gennem eksempler.
EKSEMPEL.
4,0 ml carboxylatlatex med 2,5 vægt% fast stof, fremskaffet fra Polysciences Inc., Warrington, Pennsylvania, vaskes tre gange med destilleret vand, og efter den sidste vask gensuspenderes partiklerne i 4,0 ml destilleret vand. 1,0 ml 0,05 M KI^PO^, pH 4,5, tilsættes. Suspensionen anbringes på en magnetisk omrører og holdes ved 22°C, og 5 ml af en.opløsning af 2 vægt% l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (fra Sigma Chemi-mical Co., St. Louis, Missouri) tilsættes og får lov at reagere med latexen i 3 1/2 time. Den med carbodiimid aktiverede carboxylatlatex vaskes så én gang i saltvand og gensuspenderes i 5 ml saltvand.
1,2 mg avidin (alle fremgangsmåder udføres dobbelt, én gang un- r 11
DK 159176 B
der anvendelse af æggehvide-avidin og én gang under anvendelse af streptavidin) opløses i 5 ml 0,2 M borat, pH 8,5, og de 5 ml latexsuspension tilsættes. Den carbodiimid-aktiverede carboxylatlatex og avidin får lov at reagere i 20 timer ved 22°C. For at neutralisere overflade-carboxylgrupper, der ikke er bundet til avidin, tilsættes 5 mM ethanolamin, og derpå tilsættes BSA til en koncentration på 2 vægt%. Avidin-latexen vaskes og optages i 0,1 M glycin-saltvand, pH 8,2, indeholdende 0,2% NaN^, 0,2% BSA og 0,05% ”Tween"-2Q og lagres ved 4°C.
Antistoffer bindes til biotin som følger: A) 1 mg polyvalent kanin-IgG (anti-gruppe A, streptokokantigen) i 1,0 ml 0,2 M NaHCO^ bringes til at reagere med 50 jul af en opløsning' af d-biotin-N-hydroxysuccinimid-ester i DMSO (1,0 mg/ml). Reaktionen får lov at forløbe i 4 timer ved 22°C, og reaktionsblandingen dialyseres så ved 4°C i 18 timer over for et 500-dobbelt overskud af 0,91 M tris-saltvand, stødpude, pH 8,0, indeholdende 0,2% NaN^.
B) 1,0 mg muse-monoklonalt IgG^ (anti-gruppe A, streptokokantigen) i 1,0 ml 0,2 M NaHCO^ bringes til at reagere med 8 jul af en opløsning af d-biotin-N-hydroxysuccinimid-ester i DMSO (1,0 mg/ml). Reaktionen får lov at forløbe i 4 timer ved 22°C, og reaktionsblandingen dialyseres så ved 4°C i 18 timer over for et 500-dobbelt overskud af 0,01 M tris-saltvand, stødpude, pH 8,0, indeholdende 0,2% NaN^.
C) 1,0 mg muse-monoklonalt IgM (anti-N-meningitis B-kapsel-polysaccharid) i 1,0 ml 0,2 M NaHCO^ bringes til at reagere med 8 - 10 jul af en opløsning af d-biotin-N-hydroxysuccinimid-ester i DMSO (1,0 mg/ml) i 4 timer ved 22°C, og reaktions-blandingen dialyseres så over for et 500-dobbelt overskud af 0,01 M tris-saltvand,stødpude, pH 8,0, indeholdende 0,2% NaN^.
12
DK 159176 B
Hver af de ovenfor dannede biotinylerede antistoffer bindes til avidin-latex-partiklerne. 1,0 ml avidin-latex pellete- res, og den overliggende væske fjernes. Pillen optages i _3 1,0 ml biotinyleret antistof indeholdende 5 μ1 10 M biotinsyre, og blandingen omrøres i en time ved 22°C for at bringe biotin og biotinyleret antistof til at reagere. Efter -3 en time tilsættes andre 5 /il 10 M biotinsyre for at blokere potentielt ikke optagne biotin-bindingssteder på avidin-molekyldelene.
De diagnostiske partikler centrifugeres, vaskes og suspenderes i en mængde af 0,6% fast stof i 0,1 M glycin-saltvand, stødpude, pH 8,2, indeholdende 0,2% NaN^, 0,2% BSA og 0,05% "Tween"-20.
Til 15 ml af den diagnostiske partikelsuspension af polyvalent kanin-IgG sættes 50 ml indeholdende 0,1 >ug af gruppe A streptokok-antigen. Agglutinering af suspensionen iagttages efter 4 minutter.
Til 15 ml af den diagnostiske partikelsuspension dannet af muse-monoklonalt IgG^-antistof sættes 50 ml indeholdende 0,1 /ig af gruppe A streptokok-antigen. Agglutinering af suspensionen bemærkes efter 10 minutter.
Til 15 ml af den diagnostiske partikelsuspension dannet af muse-monoklonalt IgM-antistof sættes 50 ml indeholdende 0,1 μg N-meningitis B-polysaccharid-antigen. Agglutinering af suspensionen iagttages efter 10 minutter.
Suspensioner af diagnostiske partikler fremstillet ifølge opfindelsen er stabile, hvis de lagres under køling i perioder på flere måneder. De diagnostiske partikler er yderst følsomme ,og under anvendelse af mikroteknik kan suspensionerne anvendes til at påvise så lidt som nanogram-mængder af antigen.
13
DK 159176 B
Flere fordele ved den foreliggende opfindelse er nu lette at forstå. Opfindelsen giver mulighed for binding af alle typer iromunoglobuliner, herunder IgM. Mængden af antistof fastgjort til latexen afhænger ikke af adsorptionsegenskaberne af et specielt parti latex. Selv om graden af carboxylering fortrinsvis ligger inden for et vist interval, bestemmes mængden af bundet antistof på lignende måde uafhængigt af den nøjagtige grad af carboxylering af kernepartiklerne, d.v.s. af den mindre end støkiometriske mængde avidin bundet til carboxy1-grupperne, og derefter af det udvalgte molforhold mellem biotinsyre og biotinyleret antistof. Reproducerbarheden af fremgangsmåden forøges derfor betydeligt i forhold til tidligere kendte metoder til binding af latexpartikler til antistof, især med hensyn til IgM, der tidligere måtte bindes til latexen ved hjælp af den meget variable adsorptionsteknik.
Opfindelsen er beskrevet gennem visse foretrukne udførelsesformer, men ændringer, der er indlysende for fagfolk, kan foretages, uden at der afviges fra opfindelsens ide. Omend det ikke foretrækkes, kan f.eks. mængden af antistof bundet til partiklerne foretages gennem regulering af antallet af avidin-molekyler bundet til latexpartiklerne, efterfulgt af mætning af biotin-bindingsstederne med biotinylerede antistofmolekyler. De diagnostiske partikelsuspensioner kræver i almindelighed, at antigenet er stort og har mindst to antigene determinantsteder, men det ligger også inden for opfindelsens rammer, at et lille antigent aktivt molekyle eller en hapten kan agglu-tinere partiklerne, hvis partiklerne blév suspenderet i et flydende medium, som indeholdt et kemikalium, der ville bindes til to eller flere af haptenmolekylerne.

Claims (23)

1. Diagnostisk partikel til immunoagglutinering, kendetegnet ved, at partiklen indeholder en med carboxylat derivatiseret polymer kerne med en diameter på mellem ca. 0,2 og ca. 1,0 raikron, flere avidinmolekyIdele bundet gennem amidbindinger til kernen, flere biotinmolekyIdele kompleksbundet til avidinmolekyIdelene og flere antistofmolekyler bundet gennem amidbindinger til en betydelig del af biotinmolekyldelene.
2. Diagnostisk middel til immunoagglutinering, kendetegnet ved, at det indeholder partikler ifølge krav 1.
3. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at partikelkernerne er dannet af en polymer valgt af gruppen bestående af polyacrylamid og polystyren.
4. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at partiklerne har mellem ca. 10^ og ca. 10^ avidinmolekyler 2 pr. cm overfladeareal af kernerne.
5. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at 11 12 partiklerne har mellem ca. 2 x 10 og ca. 2 x 10 antistof- 2 molekyler pr. cm overfladeareal af kernerne. DK 159176B
6. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at de diagnostiske partikler har neutraliserende molekyldele fastgjort til de kerneoverflade-carboxylgrupper, som ikke er bundet med amidbindinger til avidin.
7. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at de diagnostiske partikler også indeholder ikke-immunogent, proteinagtigt materiale adsorberet på overfladerne af kernerne.
8. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at antistofmolekylerne er monoklonale antistofmolekyler.
9. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at kernerne er carboxylerede til mellem ca. 0,1 og ca. 0,5 milli-ækvivalenter pr. gram "kernepartikler.
10. Fremgangsmåde til fremstillim af diagnostiske partikler ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der tilvejebringes med carboxy-lat derivatiserede polymere kernepartikler med en diameter på mellem ca. 0,2 og ca. 1,0 mikron, avidin-molekyler bindes til kernepartiklerne gennem amidbindinger, biotin-molekyler bindes til antistofmolekyler gennem amidbindinger, og det kernepartikel-bundne avidin kompleksbindes med det antistofmolekyl-bundne biotin.
11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at der tilvej ebringes kernepartikler, som er carboxyleret til mellem ca.0,1 og ca. 0,5 milliækvivalenter pr. gram polymer.
12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at den polymere er valgt af gruppen bestående af polystyren og polyacrylamid.
13. Fremgangsmåde-ifølge krav 12, kendetegnet ved, _3 at den polymere er polystyren, og at mellem ca.1,2 x 10 og _2 ca. 1,2 x 10 gram avidin er bundet pr. gram kernepartikler. DK 159176 B
14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, _3 at den polymere er polyacrylamid, og at mellem ca. 1,2 x 10 -2 og ca. 1,2 x 10 gram avidin er bundet pr. gram kernepartik ler.
15. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at avidinen er valgt af gruppen bestående af æggehvide-avidin og streptavidin.
16. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved neutralisering af overflade-carboxylgrupper på kernepartiklerne, der ikke er bundet til avidin.
17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved adsorbering af et ikké-immunogent, proteinagtigt materiale på overfladen af kernepartiklerne efter binding af avidin og neutralisering af carboxylgrupper.
18. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at mængden af immunoglobulin-molekyler reguleres ved at kompleksbinde det til kernepartikler bundne avidin med en blanding af fri biotinsyre og antistofbundet biotin.
19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at mængden af antistofmolekyler reguleres til at give mellem 11 12 2 ca. 2 x 10 og ca. 2 x 10 antistofmolekyler pr. cm kerne- partikel-overfladeareal.
20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at molforholdet mellem biotinsyren og det antistofbundne biotin er mellem ca. 1:1 og ca. 10:1.
21. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at antistoffet er et monoklonalt antistof. DK 159176 B
22. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at bindingen af avidinen til kernepartiklerne omfatter reaktion af kernepartiklerne med et carbodiimid til dannelse af et mellemprodukt og reaktion af mellemproduktet med avidin.
23. Fremgangsmåde ifølge krav 22, kendetegnet ved, at bindingen af biotinet til antistoffet omfatter reaktion af antistoffet med et N-hydroxyimid til dannelse af et estermellemprodukt og reaktion af antistoffet med dette estermellemprodukt .
DK391884A 1983-09-30 1984-08-15 Diagnostisk partikel til immunoagglutinering, diagnostisk middel og fremgangsmaade til fremstilling af partiklen DK159176C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53773783 1983-09-30
US06/537,737 US4582810A (en) 1983-09-30 1983-09-30 Immuno-agglutination particle suspensions

Publications (4)

Publication Number Publication Date
DK391884D0 DK391884D0 (da) 1984-08-15
DK391884A DK391884A (da) 1985-03-31
DK159176B true DK159176B (da) 1990-09-10
DK159176C DK159176C (da) 1991-03-11

Family

ID=24143893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK391884A DK159176C (da) 1983-09-30 1984-08-15 Diagnostisk partikel til immunoagglutinering, diagnostisk middel og fremgangsmaade til fremstilling af partiklen

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4582810A (da)
EP (1) EP0138297B1 (da)
JP (1) JPS6080766A (da)
AU (1) AU563639B2 (da)
CA (1) CA1222450A (da)
DE (1) DE3479443D1 (da)
DK (1) DK159176C (da)
FI (1) FI78788C (da)
MY (1) MY100973A (da)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985003356A1 (en) * 1984-01-27 1985-08-01 Molecular Biosystems, Inc. Assay for immobilized reporter groups
US4618576A (en) * 1984-02-27 1986-10-21 Becton Dickinson And Company Diagnostic test for Streptococcus A
US4920061A (en) * 1984-03-02 1990-04-24 The University Of Texas System Biological magnetic colloids
FR2571498B1 (fr) * 1984-10-04 1988-04-08 Immunotech Sa Procede de separation de cellules utilisant des anticorps et des billes de faible densite
US5246829A (en) * 1984-10-04 1993-09-21 Immunotech Products for separation applicable to cells in the immunopurification field
US5061237A (en) * 1985-07-02 1991-10-29 Cytomed Medizintechnik Gmbh Method of purifying whole blood
EP0214392B1 (de) * 1985-07-02 1990-05-23 Omni Medical Limited Medizinisches Gerät, insbesondere Filter, Kanüle, Katheter oder Implantat
EP0256117A1 (en) * 1986-02-06 1988-02-24 Microbiological Associates, Inc. Latex agglutination using avidin/biotin system
FR2601455B1 (fr) * 1986-07-11 1989-08-04 Stallergenes Lab Nouveaux reactifs biologiques en phase solide et leur procede d'obtention
DE3637253A1 (de) * 1986-11-03 1988-05-05 Behringwerke Ag Latex-agglutinations-verfahren zum nachweis von anti-streptokokken-desoxyribonuclease b
US4791067A (en) * 1987-06-25 1988-12-13 Fisher Scientific Co. Agglutination immunoassay for hapten involving monoclonal antibody of IgA class reagent
US5132242A (en) * 1987-07-15 1992-07-21 Cheung Sau W Fluorescent microspheres and methods of using them
JPH07107537B2 (ja) * 1987-08-03 1995-11-15 イーストマン コダック カンパニー アビジン−及びビオチン−固定試薬，分析要素並びにその使用法
CA1305664C (en) * 1987-08-06 1992-07-28 Stephen James Lovell System and process for a visible assay for analyte
US4859612A (en) * 1987-10-07 1989-08-22 Hygeia Sciences, Inc. Metal sol capture immunoassay procedure, kit for use therewith and captured metal containing composite
DK641487A (da) 1987-12-07 1989-06-08 Gluetech Aps Fremgangsmaade til modificering af polymeroverflader
CA1312277C (en) * 1987-12-18 1993-01-05 Richard C. Sutton Avidin- and biotin-immobilized reagents, analytical elements and methods of use
US4870007A (en) * 1987-12-18 1989-09-26 Eastman Kodak Company Immobilized biotinylated receptor in test device, kit and method for determining a ligand
US4914040A (en) * 1988-03-03 1990-04-03 Boehringer Mannheim Gmbh Reagent and method for determination of a polyvalent substance using an immunoaggregate
US4952519A (en) * 1988-05-02 1990-08-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Protein immobilization with poly(ethyleneimine) derivatized with a hydroprobic group
IE64286B1 (en) * 1988-05-25 1995-07-26 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the determination of an immunologically detectable substance and a suitable vessel therefor
US5362624A (en) * 1988-05-25 1994-11-08 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the determination of an immunologically detectable substance and a suitable reaction vessel therefor
US5389523A (en) * 1988-05-31 1995-02-14 The United States Of Americas, As Represented By The Secretary Of Commerce Liposome immunoanalysis by flow injection assay
DE3822750A1 (de) * 1988-07-05 1990-01-11 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz
DE3829245A1 (de) * 1988-08-29 1990-03-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz
US6235488B1 (en) 1988-09-29 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Surface preparation for chemical-specific binding
US5888728A (en) 1988-10-17 1999-03-30 Molecular Devices Corporation Hapten derivatized capture membrane and diagnostic assays using such membrane
WO1990004786A1 (en) 1988-10-17 1990-05-03 Molecular Devices Corporation Hapten derivatized capture membrane and diagnostic assays using such membrane
FR2638099B1 (fr) * 1988-10-20 1991-01-25 Immunotech Sa Immunoadsorbant a faible taux de relargage et son procede d'obtention
DE3915135A1 (de) * 1989-05-09 1990-11-15 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum nachweis spezifisch bindefaehiger substanzen in koerperfluessigkeiten
US5026785A (en) * 1989-05-12 1991-06-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Avidin and streptavidin modified water-soluble polymers such as polyacrylamide, and the use thereof in the construction of soluble multivalent macromolecular conjugates
US5252466A (en) * 1989-05-19 1993-10-12 Biotechnology Research And Development Corporation Fusion proteins having a site for in vivo post-translation modification and methods of making and purifying them
EP0416730B1 (en) * 1989-09-08 1996-05-22 Hewlett-Packard Company Substrate preparation for chemical-species-specific binding
DE69007006T2 (de) * 1989-09-29 1994-08-25 Rohm & Haas Ligand enthaltendes Medium für chromatographische Trennung, Verfahren zur dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Isolierung von synthetischen oder natürlichen Molekülen von einer Fluidmischung.
US5252743A (en) * 1989-11-13 1993-10-12 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
CA2031659A1 (en) * 1990-01-26 1991-07-27 John B. Findlay Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods
US5180828A (en) * 1990-02-09 1993-01-19 Molecular Devices Corporation Chromophoric reagents for incorporation of biotin or other haptens into macromolecules
US5155166A (en) * 1990-06-18 1992-10-13 Eastman Kodak Company Use of 1-(1-pyrrolidinylcarbonyl)pyridinium salts to attach compounds to carboxylated particles and a kit containing same
US6274325B1 (en) * 1990-06-25 2001-08-14 Boehringer Mannheim Gmbh Method for carrying out a homogeneous-immunoassay based on agglutination
US5556748A (en) * 1991-07-30 1996-09-17 Xenopore Corporation Methods of sandwich hybridization for the quantitative analysis of oligonucleotides
DE4140142A1 (de) * 1991-12-05 1993-06-09 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim, De Multivalentes dextranreagenz zum einsatz in praezipitationstests
WO1994015216A1 (en) * 1992-12-23 1994-07-07 Niyazmatov Agzamdzhan Akhtamov Process for obtaining a diagnostic reagent for detecting antigens and antibodies of infectious and other illnesses
AU687033B2 (en) * 1993-09-13 1998-02-19 Ciba Corning Diagnostics Corp. Undercoating of solid phase surfaces and direct coating method
US5747352A (en) * 1994-05-23 1998-05-05 Beckman Instruments, Inc. Reagents and methods for the rapid and quantitative assay of pharmacological agents
FR2724461B1 (fr) * 1994-09-09 1996-12-20 Prolabo Sa Microsphere de latex biotinylee, procede de preparation d'une telle microsphere et utilisation en tant qu'agent de detection biologique
US5981296A (en) * 1997-02-18 1999-11-09 Dade Behring Inc. Stabilization of particle reagents
CN101446586A (zh) * 2000-12-11 2009-06-03 株式会社三菱化学药得论 免疫分析试剂和分析方法
CN100354430C (zh) * 2001-09-06 2007-12-12 基因描绘系统有限公司 一种检测样品中靶细胞或病毒的方法
US7163998B2 (en) * 2003-09-09 2007-01-16 Eastman Kodak Company Stabilized polymer beads and method of preparation
US7194308B2 (en) 2003-11-12 2007-03-20 Cardiac Pacemakers, Inc. System and method for monitoring or reporting battery status of implantable medical device
WO2005062048A1 (de) 2003-12-01 2005-07-07 Dade Behring Marburg Gmbh Homogenes nachweisverfahren
GB2420976B (en) * 2004-11-19 2006-12-20 Zvi Finkelstein Therapeutic implant
US9057046B2 (en) * 2005-09-26 2015-06-16 Rapid Micro Biosystems, Inc. Cassette containing growth medium
AU2009296662B2 (en) 2008-09-24 2016-08-11 First Light Diagnostics, Inc. Kits and devices for detecting analytes
US9745546B2 (en) 2011-11-07 2017-08-29 Rapid Micro Biosystems, Inc. Cassette for sterility testing
CA3171698A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Rapid Micro Biosystems, Inc. Cell culturing device
EP3274724A1 (en) 2015-03-25 2018-01-31 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method for measuring the protease activity of factor d of the alternative complement pathway
EP3274468B1 (en) 2015-03-25 2019-02-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method for measuring the protease activity of c3 and c5 convertase of the alternative complement pathway
WO2020099533A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Streptavidin-coated solid phases with a member of a binding pair

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3857931A (en) * 1971-02-01 1974-12-31 Hoffmann La Roche Latex polymer reagents for diagnostic tests
JPS5443572B2 (da) * 1974-07-08 1979-12-20
BE821053A (fr) * 1974-08-01 1975-04-14 Produit pour diagnostic par determination immunochimique
CA1083508A (fr) * 1975-11-13 1980-08-12 Jacques Grange Supports porteurs de chaines laterales, procedes d'obtention de ces supports, procedes de fixation de composes organiques comportant un residu glucidique sur lesdits supports, produits et reactifs resultant de ladite fixation chimique
JPS5510590A (en) * 1978-05-04 1980-01-25 Wellcome Found Enzyme immunity quantity analysis
GB2027031A (en) * 1978-08-02 1980-02-13 Hoffmann La Roche Diagnostic Reagent Comprising a Proteinaceous Material Bonded to a Latex
US4228237A (en) * 1978-09-21 1980-10-14 Calbiochem-Behring Corp. Methods for the detection and determination of ligands
US4276206A (en) * 1979-01-18 1981-06-30 Scripps Clinic & Research Foundation Immunochemical conjugates: method and composition
US4220565A (en) * 1979-01-18 1980-09-02 Scripps Clinic & Research Foundation Immunochemical conjugates: method and composition
US4282287A (en) * 1980-01-24 1981-08-04 Giese Roger W Biochemical avidin-biotin multiple-layer system
JPS56115727A (en) * 1980-02-19 1981-09-11 Kuraray Co Ltd Carrier for immobilizing physiologically active substance
DE3264269D1 (en) * 1981-07-17 1985-07-25 Toray Industries Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor
US4434150A (en) * 1981-10-19 1984-02-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Immunological reagents employing polymeric backbone possessing reactive functional groups
CA1240937A (en) * 1982-07-26 1988-08-23 Gordon R. Dreesman Monoclonal igm antibodies and method of preparation

Also Published As

Publication number Publication date
FI842889A0 (fi) 1984-07-18
CA1222450A (en) 1987-06-02
DK391884D0 (da) 1984-08-15
EP0138297A1 (en) 1985-04-24
AU563639B2 (en) 1987-07-16
FI842889A (fi) 1985-03-31
DK159176C (da) 1991-03-11
DE3479443D1 (en) 1989-09-21
EP0138297B1 (en) 1989-08-16
DK391884A (da) 1985-03-31
AU2843384A (en) 1985-04-04
JPS6080766A (ja) 1985-05-08
MY100973A (en) 1991-06-15
US4582810A (en) 1986-04-15
FI78788C (fi) 1989-09-11
FI78788B (fi) 1989-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK159176B (da) Diagnostisk partikel til immunoagglutinering, diagnostisk middel og fremgangsmaade til fremstilling af partiklen
US4847199A (en) Agglutination immunoassay and kit for determination of a multivalent immune species using a buffered salt wash solution
EP0281327B1 (en) Immunoreactive reagent, method of preparation and its use to determine an immunoreactive species
EP0064318B1 (en) A method and a kit for the assay of antibodies to soluble antigens
AU648625B2 (en) Test method and reagent kit therefor
CA2133097A1 (en) Immunoassays employing generic anti-hapten antibodies and materials for use therein
CA1291030C (en) Immunoreactive reagent, method of preparation and its use to determine an immunoreactive species
AU619019B2 (en) An article for performing immunological assays utilizing organic dyes and methods for producing and utilizing same
CA1288339C (en) Agglutination reagent and method of preparing same
WO1987004794A1 (en) Latex agglutination using avidin/biotin system
EP0280560B1 (en) Membrane structure coated with low pI protein and methods of making and using
CA1234044A (en) Specific binding assay reagent
AU625344B2 (en) Chlamydia half-sandwich immunoassay
US5843794A (en) Technique for the prevention of false positive reactions in immunological testing due to C1 and C1q components of the complement and method for screening for rheumatic factor
JP2009069070A (ja) 標的物質の検出方法及び検出用キット
JPS63231265A (ja) 凝集反応試薬及びその製造方法
Sompuram Purification of immunoglobulins, their bonding onto latex particles and the development of latex agglutination test for mouse immunoglobulin-G for monoclonal antibody assessment
JPH03267759A (ja) 固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法
WO1993019369A1 (en) Technique for prevention of false reactions in immunological testing
JPH06148188A (ja) 免疫学的再検査方法