JPH03267759A - 固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法 - Google Patents
固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法Info
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、免疫学的凝集反応によってサンプル中に存
在する抗原または抗体を測定するための方法に関する。
在する抗原または抗体を測定するための方法に関する。
免疫学的な凝集反応に基づき、サンプル中に存在する抗
原または抗体を検出するための方法として、粒子凝集法
が従来より知られている。この方法においては、被測定
物質と特異的に結合する抗体または抗原が表面に固定化
されている特定のマーカー粒子が用いられる。このマー
カー粒子を測定容器内のサンプルと混合して、サンプル
中に含まれる抗原または抗体との間で免疫反応を行わせ
た後、測定容器の所定の壁面（例えば底面）に集める。
原または抗体を検出するための方法として、粒子凝集法
が従来より知られている。この方法においては、被測定
物質と特異的に結合する抗体または抗原が表面に固定化
されている特定のマーカー粒子が用いられる。このマー
カー粒子を測定容器内のサンプルと混合して、サンプル
中に含まれる抗原または抗体との間で免疫反応を行わせ
た後、測定容器の所定の壁面（例えば底面）に集める。
こうして容器壁面に集められたマーカー粒子は、サンプ
ル中の被測定物質との間で免疫反応が生じた場合と生じ
なかった場合とでは分布パターンが異なる。したがって
、容器壁面に集められたマーカー粒子の分布パターンか
ら陽性または陰性を判定することができる。
ル中の被測定物質との間で免疫反応が生じた場合と生じ
なかった場合とでは分布パターンが異なる。したがって
、容器壁面に集められたマーカー粒子の分布パターンか
ら陽性または陰性を判定することができる。
これとは別に、Ｖｌｅｎｅｒ、＾、Ｓ、およびＭｅｒｍ
ａｎ。
ａｎ。
Ｎ、Ｈ，により混合凝集法が報告されている（」。
ｌｓｍｕｎｏｌ、、３Ｂ、２５５ （１９３９） ）
、この方法はその後発展し、血液型の判定が可能とされ
るまでに確立されている（Ｃｏｏｓｂｓ、Ｒ，Ｒ，Ａ、
およびＢｅｄｆｏｒｄ、Ｄ、、ＶｏｘＳａｎｇ 、 ５
、ｉｌｌ （１９５５） ； Ｃｏｏｍｂｓ、Ｒ
，Ｒ，Ａ、 ら、Ｌａｎｃｅｔ、 ｉ、４８１ （１
９５Ｂ） ） 、各種血液型の判定に応用したものとし
て、例えばＵＳＰ ４．６（ｌＬ２４＆号、ＵＳＰ ４
，２７５．０５３号およびＬＩＳＰ ４，３２８．ＩＨ
号が挙げられる。
、この方法はその後発展し、血液型の判定が可能とされ
るまでに確立されている（Ｃｏｏｓｂｓ、Ｒ，Ｒ，Ａ、
およびＢｅｄｆｏｒｄ、Ｄ、、ＶｏｘＳａｎｇ 、 ５
、ｉｌｌ （１９５５） ； Ｃｏｏｍｂｓ、Ｒ
，Ｒ，Ａ、 ら、Ｌａｎｃｅｔ、 ｉ、４８１ （１
９５Ｂ） ） 、各種血液型の判定に応用したものとし
て、例えばＵＳＰ ４．６（ｌＬ２４＆号、ＵＳＰ ４
，２７５．０５３号およびＬＩＳＰ ４，３２８．ＩＨ
号が挙げられる。
また、被測定物質と特異的に結合する抗体等を反応容器
の内壁に予め固定しておく方法も知られている（ ＭＰ
ＨＡ法）。この方法においては、被測定物質に特異的に
結合する物質（抗体等）を反応容器の内壁に予め固定化
しておく。そして、この抗体等に被測定物質を特異的に
結合させた後、マーカー粒子を添加する。このマーカー
粒子は、容器内壁に固定化された抗体等に結合した被測
定物質と反応して凝集パターンを形成する。このような
ＭＰＨＡ法は、例えばＬＩＳＰ ４，２９７，１０４号
等に記載されている。
の内壁に予め固定しておく方法も知られている（ ＭＰ
ＨＡ法）。この方法においては、被測定物質に特異的に
結合する物質（抗体等）を反応容器の内壁に予め固定化
しておく。そして、この抗体等に被測定物質を特異的に
結合させた後、マーカー粒子を添加する。このマーカー
粒子は、容器内壁に固定化された抗体等に結合した被測
定物質と反応して凝集パターンを形成する。このような
ＭＰＨＡ法は、例えばＬＩＳＰ ４，２９７，１０４号
等に記載されている。
ところで、凝集パターンの形成は、その多くがマーカー
粒子の自然沈降によるものであり、パターン形成が完了
するまでに多大な時間を要する。
粒子の自然沈降によるものであり、パターン形成が完了
するまでに多大な時間を要する。
この問題点を解決するべく、発明者らは、磁性粒子を用
いて磁力によって短時間でパターンの形成を行なう方法
を提唱している（特願平１−［１４８１９、未公開）。
いて磁力によって短時間でパターンの形成を行なう方法
を提唱している（特願平１−［１４８１９、未公開）。
上記従来の粒子凝集法および混合凝集法においては、サ
ンプル中に含まれるマーカー粒子以外の沈降性粒子が沈
降するため、判定精度が低下してしまう。したがって、
良好な判定を行なうためには、この自然沈降性粒子を除
去するためにサンプルを洗浄する等の操作を必要とし、
操作が繁雑になっていた。
ンプル中に含まれるマーカー粒子以外の沈降性粒子が沈
降するため、判定精度が低下してしまう。したがって、
良好な判定を行なうためには、この自然沈降性粒子を除
去するためにサンプルを洗浄する等の操作を必要とし、
操作が繁雑になっていた。
また、前記ＭＰＨＡ法においては、被測定物質と特異的
に結合する物質を容器内壁に結合させる方法として、物
理吸着によって直接容器内壁に結合させる方法が広く一
般に行われている。
に結合する物質を容器内壁に結合させる方法として、物
理吸着によって直接容器内壁に結合させる方法が広く一
般に行われている。
しかしながら、この方法では、正常なパターンが形成さ
れない場合がある。例えば、容器内壁に直接ＨＢｓを物
理吸着させてサンプル中の抗ＨＢｓ抗体の測定を行なお
うとしても、陽性パターンと陰性パターンとを明確に区
別することが困難である。
れない場合がある。例えば、容器内壁に直接ＨＢｓを物
理吸着させてサンプル中の抗ＨＢｓ抗体の測定を行なお
うとしても、陽性パターンと陰性パターンとを明確に区
別することが困難である。
また、前記物質を直接容器内壁に吸着させる場合には、
吸着能の高い容器を選択する必要がある。
吸着能の高い容器を選択する必要がある。
さらに、吸着させようとする物質によって吸着の起こり
易さが異なり、物質によって容器の材質を選択する必要
がある。
易さが異なり、物質によって容器の材質を選択する必要
がある。
一方、化学吸着によって物質を直接容器内壁に結合させ
る化学的結合法においては、容器内壁に結合させるため
に、吸着させようとする抗原または抗体の化学結合基を
用いる。したがって、抗原または抗体の反応性を損なう
ことがあり、どのような物質に対しても行なえるという
ものではない。
る化学的結合法においては、容器内壁に結合させるため
に、吸着させようとする抗原または抗体の化学結合基を
用いる。したがって、抗原または抗体の反応性を損なう
ことがあり、どのような物質に対しても行なえるという
ものではない。
したがって、この発明の第一の課題は、被測定物質以外
の沈降性物質を含むサンプルについても、その影響を受
けずに高精度の測定を迅速に行なうことが可能な免疫学
的測定法を提供することにある。
の沈降性物質を含むサンプルについても、その影響を受
けずに高精度の測定を迅速に行なうことが可能な免疫学
的測定法を提供することにある。
また、この発明の第二の課題は、被測定物質と特異的に
結合する物質を容器内壁に結合させるＭＰＨＡ法におい
て、容器内壁の性状を変えず、吸着させようとする物質
の反応性を損なわず、および吸着させようとする物質の
種類によって容器の材質を変更する必要もなく容器内壁
に物質を固相することができる、高感度で安定性の高い
免疫学的測定方法を提供することにある。
結合する物質を容器内壁に結合させるＭＰＨＡ法におい
て、容器内壁の性状を変えず、吸着させようとする物質
の反応性を損なわず、および吸着させようとする物質の
種類によって容器の材質を変更する必要もなく容器内壁
に物質を固相することができる、高感度で安定性の高い
免疫学的測定方法を提供することにある。
この発明の免疫学的測定方法は、
被測定物質と特異的に結合する物質を結合した固定化赤
血球を内壁に固相化した粒子凝集判定容器を調製する工
程と、 前記粒子凝集判定容器にサンプル溶液を注入する工程と
、 前記粒子凝集判定容器から未反応の物質を除去する工程
と、 被測定物質と結合する物質を結合した磁性マーカーを前
記粒子凝集判定容器内に注入する工程と、前記粒子凝集
判定容器に磁界を作用させて磁性マーカー粒子の沈降を
促進する工程と、前記粒子凝集判定容器の内壁に沈降し
た磁性マーカー粒子の分布状態に基づいて、前記サンプ
ル溶液中に含有される被測定物質を測定する工程とを具
備する。
血球を内壁に固相化した粒子凝集判定容器を調製する工
程と、 前記粒子凝集判定容器にサンプル溶液を注入する工程と
、 前記粒子凝集判定容器から未反応の物質を除去する工程
と、 被測定物質と結合する物質を結合した磁性マーカーを前
記粒子凝集判定容器内に注入する工程と、前記粒子凝集
判定容器に磁界を作用させて磁性マーカー粒子の沈降を
促進する工程と、前記粒子凝集判定容器の内壁に沈降し
た磁性マーカー粒子の分布状態に基づいて、前記サンプ
ル溶液中に含有される被測定物質を測定する工程とを具
備する。
以下、この発明の方法を詳細に説明する。
この発明において測定すべき物質は、例えばライスル、
細菌もしくは種々のタンパク質等の抗原物質、およびこ
れら抗原物質に対する抗体等である。これら被測定物質
は可溶性物質であってもよく、また不溶性物質であって
もよい。
細菌もしくは種々のタンパク質等の抗原物質、およびこ
れら抗原物質に対する抗体等である。これら被測定物質
は可溶性物質であってもよく、また不溶性物質であって
もよい。
この発明において用いられる磁性マーカー粒子は、測定
すべき物質に特異的に結合する物質（以下、感作物質Ｂ
という）、例えば特定の抗体または抗原を、磁性体を含
有する公知の磁性粒子の表面に固定化することにより調
製することができる。
すべき物質に特異的に結合する物質（以下、感作物質Ｂ
という）、例えば特定の抗体または抗原を、磁性体を含
有する公知の磁性粒子の表面に固定化することにより調
製することができる。
このような磁性粒子としては、市販のｒ ＤＹＮＡＢＥ
ＡＳＭ−４５０Ｊ ＣＤＹＮＡＬ社の商品名） 磁性
ラテックスビーズｒ ｅｓｔａｐｏｒ Ｊ （ＲＨＯ
ＮＥ−ＰＯＵＬＥＮＣ社製の商品名）を用いることがで
きる。また、特開昭５９−１９５１６１号広報に開示さ
れた磁性体を含むゼラチン粒子を用いてもよい。さらに
、鉄分等の強磁性体を取り込ませた赤血球等の細胞を用
いてもよい。これら磁性粒子の表面に前記感作物質Ｂ（
特定の抗体または抗原）を固定化する方法としては、種
々の公知の方法を用いることができる。
ＡＳＭ−４５０Ｊ ＣＤＹＮＡＬ社の商品名） 磁性
ラテックスビーズｒ ｅｓｔａｐｏｒ Ｊ （ＲＨＯ
ＮＥ−ＰＯＵＬＥＮＣ社製の商品名）を用いることがで
きる。また、特開昭５９−１９５１６１号広報に開示さ
れた磁性体を含むゼラチン粒子を用いてもよい。さらに
、鉄分等の強磁性体を取り込ませた赤血球等の細胞を用
いてもよい。これら磁性粒子の表面に前記感作物質Ｂ（
特定の抗体または抗原）を固定化する方法としては、種
々の公知の方法を用いることができる。
この発明において用いられる粒子凝集判定容器は、沈降
性粒子が容器壁面に沿って所定方向に移動するとき、こ
の沈降性粒子を所定の領域に収束させるような傾斜壁面
、例えば半球状または円錐状の壁面を有するものが好ま
しい。このような傾斜は、容器の側面にあってもよいが
、底面にあることが好ましい。好ましい粒子凝集判定容
器としては、例えば半球状または円錐状の底面を有する
試験管またはマイクロプレートを挙げることができる。
性粒子が容器壁面に沿って所定方向に移動するとき、こ
の沈降性粒子を所定の領域に収束させるような傾斜壁面
、例えば半球状または円錐状の壁面を有するものが好ま
しい。このような傾斜は、容器の側面にあってもよいが
、底面にあることが好ましい。好ましい粒子凝集判定容
器としては、例えば半球状または円錐状の底面を有する
試験管またはマイクロプレートを挙げることができる。
次に、被測定物質と特異的に結合する物質（以下感作物
質Ａという）を結合した固定化赤血球を内壁に固相化し
た粒子凝集判定容器の作成例を図面を参照して説明する
。
質Ａという）を結合した固定化赤血球を内壁に固相化し
た粒子凝集判定容器の作成例を図面を参照して説明する
。
第１ａ図ないし第１Ｃ図は、粒子凝集判定容器の作成方
法を模式的に示す図である。
法を模式的に示す図である。
まず、第１ａ図に示すように、粒子凝集判定容器１の内
面に、ヒト、ヒツジ、ニワトリ等の赤血球を特異的もし
くは非特異的に結合し得る物質２を固相化する。このよ
うな物質としては、例えば、静電気結合することができ
るポリ −Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリエチレン
イミン、各種レクチン、抗赤血球抗体等が挙げられる。
面に、ヒト、ヒツジ、ニワトリ等の赤血球を特異的もし
くは非特異的に結合し得る物質２を固相化する。このよ
うな物質としては、例えば、静電気結合することができ
るポリ −Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリエチレン
イミン、各種レクチン、抗赤血球抗体等が挙げられる。
その後、第１ｂ図に示すように、この容器中に赤血球３
の浮遊液を加えて容器内面に赤血球３を固相化する。赤
血球３の固相化は、赤血球浮遊液を添加後静置すること
により充分行なわれるが、弱い遠心をかけることにより
さらに時間を短縮することが可能である。
の浮遊液を加えて容器内面に赤血球３を固相化する。赤
血球３の固相化は、赤血球浮遊液を添加後静置すること
により充分行なわれるが、弱い遠心をかけることにより
さらに時間を短縮することが可能である。
次に、容器内壁に固相化された赤血球３を固定化試薬を
用いて固定する。固定化試薬としては、従来細胞の固定
に用いられている試薬を利用することができ、特に、グ
ルタルアルデヒド、ホルマリン等を好ましく利用するこ
とができる。
用いて固定する。固定化試薬としては、従来細胞の固定
に用いられている試薬を利用することができ、特に、グ
ルタルアルデヒド、ホルマリン等を好ましく利用するこ
とができる。
次いで、この固定化赤血球の表面を従来行われている方
法でタンニン酸処理し、タンパク質と結合し易くする。
法でタンニン酸処理し、タンパク質と結合し易くする。
その後、感作物質Ａ４を含有する溶液を容器内に入れ、
感作物質Ａ４を固定化赤血球表面に結合させる。
感作物質Ａ４を固定化赤血球表面に結合させる。
また、最初に、感作物質Ａを固定化赤血球に結合させ、
その後、この固定化赤血球を容器内壁に固相化する方法
によっても調製することが可能である。この場合には、
まず、赤血球を固定し、表面にタンニン酸処理を施した
後、感作物質Ａを含有する溶液と混合して感作物質Ａを
赤血球表面に結合させる。これとは別に、固定化赤血球
捕捉物質を容器内壁に固相化しておく。最後に、この容
器内に前記固定化赤血球を加えることにより固定化赤血
球を容器内壁に固相化する。
その後、この固定化赤血球を容器内壁に固相化する方法
によっても調製することが可能である。この場合には、
まず、赤血球を固定し、表面にタンニン酸処理を施した
後、感作物質Ａを含有する溶液と混合して感作物質Ａを
赤血球表面に結合させる。これとは別に、固定化赤血球
捕捉物質を容器内壁に固相化しておく。最後に、この容
器内に前記固定化赤血球を加えることにより固定化赤血
球を容器内壁に固相化する。
容器内壁に予め固相化される固定化赤血球捕捉物質は、
感作物質Ａ以外の部位で固定化赤血球と結合することが
可能なものである。第２図に示すように、固定化赤血球
５が感作物質Ａ４で容器内壁に結合した場合には、この
赤血球は、被測定物質に対する反応性が損なわれてしま
う。また、固定化赤血球と固定化赤血球捕捉物質との結
合は、特異的な結合であっても、非特異的な結合であっ
てもよい。特異的な結合を形成する物質としては、感作
物質Ａとは反応せず、固定化赤血球と特異的に反応する
抗原もしくは抗体、レクチン等を挙げることができる。
感作物質Ａ以外の部位で固定化赤血球と結合することが
可能なものである。第２図に示すように、固定化赤血球
５が感作物質Ａ４で容器内壁に結合した場合には、この
赤血球は、被測定物質に対する反応性が損なわれてしま
う。また、固定化赤血球と固定化赤血球捕捉物質との結
合は、特異的な結合であっても、非特異的な結合であっ
てもよい。特異的な結合を形成する物質としては、感作
物質Ａとは反応せず、固定化赤血球と特異的に反応する
抗原もしくは抗体、レクチン等を挙げることができる。
また、非特異的な結合を形成する物質としては、静電結
合によって固定化赤血球を結合するポリエチレンイミン
、ポリ −Ｌ−リジン等を挙げることができる。
合によって固定化赤血球を結合するポリエチレンイミン
、ポリ −Ｌ−リジン等を挙げることができる。
感作物質Ａを結合した固定化赤血球を粒子凝集判定容器
内壁に固相化した後、この容器にサンプル溶液を注入す
る。第３ａ図に示すように、サンプル溶液中に被測定物
質６が含まれる場合には、固定化赤血球３の表面に結合
した感作物質Ａ４と被測定物質６とが結合する。
内壁に固相化した後、この容器にサンプル溶液を注入す
る。第３ａ図に示すように、サンプル溶液中に被測定物
質６が含まれる場合には、固定化赤血球３の表面に結合
した感作物質Ａ４と被測定物質６とが結合する。
感作物質Ａと被測定物質とを反応させた後、未反応物質
を容器１から除去する。これは、通常、容器１を洗浄す
ることにより行われる。
を容器１から除去する。これは、通常、容器１を洗浄す
ることにより行われる。
容器１から未反応物質を除去した後、第３ｂ図に示すよ
うに、前記磁性マーカー粒子７を容器中に注入し、磁石
９が形成する磁界を作用させて磁性マーカー粒子７の沈
降を促進する。前述のように、この磁性マーカー粒子７
には、被測定物質と特異的に反応する感作物質Ｂ８が結
合している。したがって、沈降した磁性マーカー粒子７
は、第３ｃ図に示すように、固定化赤血球を介して容器
内壁に固定されている被測定物質６に結合する。すなわ
ち、固定化赤血球が固相化されている容器内壁にほぼ一
様に分布する。この結果、磁性マーカー粒子が示す分布
パターンはｍＡａ図に示すように、容器内壁に広く拡が
ったものとなる。
うに、前記磁性マーカー粒子７を容器中に注入し、磁石
９が形成する磁界を作用させて磁性マーカー粒子７の沈
降を促進する。前述のように、この磁性マーカー粒子７
には、被測定物質と特異的に反応する感作物質Ｂ８が結
合している。したがって、沈降した磁性マーカー粒子７
は、第３ｃ図に示すように、固定化赤血球を介して容器
内壁に固定されている被測定物質６に結合する。すなわ
ち、固定化赤血球が固相化されている容器内壁にほぼ一
様に分布する。この結果、磁性マーカー粒子が示す分布
パターンはｍＡａ図に示すように、容器内壁に広く拡が
ったものとなる。
サンプル溶液中に被測定物質が含まれていない場合には
、第３ｄ図に示すように、続いて添加された磁性マーカ
ー粒子と反応する物質は容器内には存在しない。したが
って、磁性マーカー粒子は反応することなく容器の内壁
を転がり落ち、第３ｅ図に示すように、容器の最底部に
集まる。この結果、磁性マーカー粒子が示す分布パター
ンは、第４ｂ図に示すように、容器の中心に粒子が集ま
ったものとなる。
、第３ｄ図に示すように、続いて添加された磁性マーカ
ー粒子と反応する物質は容器内には存在しない。したが
って、磁性マーカー粒子は反応することなく容器の内壁
を転がり落ち、第３ｅ図に示すように、容器の最底部に
集まる。この結果、磁性マーカー粒子が示す分布パター
ンは、第４ｂ図に示すように、容器の中心に粒子が集ま
ったものとなる。
上述のように、この発明の方法においては、磁性マーカ
ー粒子の沈降を磁石等の磁界の作用により促進させてい
る。このため、測定時間を大幅に短縮することが可能で
ある。ここで用いられる磁石は特に限定されるものでは
なく、永久磁石であっても電磁石であってもよい。また
、磁石の強さは、被測定物質等に応じて適宜選択するこ
とができる。
ー粒子の沈降を磁石等の磁界の作用により促進させてい
る。このため、測定時間を大幅に短縮することが可能で
ある。ここで用いられる磁石は特に限定されるものでは
なく、永久磁石であっても電磁石であってもよい。また
、磁石の強さは、被測定物質等に応じて適宜選択するこ
とができる。
実施例１
血清中の抗ＨＢｓ抗体の検出
Ａ、固定血球プレートの作成
小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）
に溶解して１０ｕｇ／ｄの濃度にした溶液を、Ｕ底プレ
ート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ）に分注し、ＶＧ
Ａをプレートの内壁に吸着させた。次いで、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロッキングを行ないＶＧ
Ａ吸着プレートを作成した。次に、Ｏ型血球サージスク
リーン（０ｒｔｈｏ社製）の０．７％ＰＢＳ浮遊液を調
製し、上記νＧ＾吸着プレートに分注した。室温で１０
分間静置して血球をプレートのウェル内壁に結合させた
後、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、この血球結合プレ
ートに、グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｓａ社製）の２．
５％ＰＢＳ溶液を分注し、室温で１時間静置して血球を
固定した。その後、ウェルをＰＢＳで洗浄することによ
り、グルタルアルデヒドを除去した。最後に、タンニン
酸（半井テスク社製）をＰＢＳに溶解して１０■／ｗＪ
とした溶液を各ウェルに５０ρづつ分注し、室温で１時
間インキュベートして固定化赤血球のタンニン酸処理を
行なった。
に溶解して１０ｕｇ／ｄの濃度にした溶液を、Ｕ底プレ
ート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ）に分注し、ＶＧ
Ａをプレートの内壁に吸着させた。次いで、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロッキングを行ないＶＧ
Ａ吸着プレートを作成した。次に、Ｏ型血球サージスク
リーン（０ｒｔｈｏ社製）の０．７％ＰＢＳ浮遊液を調
製し、上記νＧ＾吸着プレートに分注した。室温で１０
分間静置して血球をプレートのウェル内壁に結合させた
後、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、この血球結合プレ
ートに、グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｓａ社製）の２．
５％ＰＢＳ溶液を分注し、室温で１時間静置して血球を
固定した。その後、ウェルをＰＢＳで洗浄することによ
り、グルタルアルデヒドを除去した。最後に、タンニン
酸（半井テスク社製）をＰＢＳに溶解して１０■／ｗＪ
とした溶液を各ウェルに５０ρづつ分注し、室温で１時
間インキュベートして固定化赤血球のタンニン酸処理を
行なった。
Ｂ、抗原の感作
まず、酵母組換えＨＢｓ抗原（ｙＨＢｓ）をＰＢＳで１
０ｕｇ／−に希釈した。この希釈液をタンニン酸処理を
施した上記固定血球プレートに各ウェル当り２５〃づつ
分注し、室温で１時間インキュベートしてｙＨＢｓの感
作を行なった。ウェルを洗浄した後、０．３％ＢＳ＾／
ＰＢＳ溶液を分注してブロッキングした。さらにウェ
ルを洗浄した後、水をきり、風乾してｙＨＢＳ感作プレ
ートとした。
０ｕｇ／−に希釈した。この希釈液をタンニン酸処理を
施した上記固定血球プレートに各ウェル当り２５〃づつ
分注し、室温で１時間インキュベートしてｙＨＢｓの感
作を行なった。ウェルを洗浄した後、０．３％ＢＳ＾／
ＰＢＳ溶液を分注してブロッキングした。さらにウェ
ルを洗浄した後、水をきり、風乾してｙＨＢＳ感作プレ
ートとした。
Ｃ６抗ヒトＩｇＧ感作磁性粒子の調製
５４／１の抗ヒト ＩｇＧ （Ｃａｐｐｅ１社製、ポリ
クローナル抗体）を用いて、粒径約６ｔｔｍの磁性体封
入ゼラチン粒子に抗ヒト ＩｇＧを感作した。その後、
ＢＳＡｆｉブロッキングして抗ヒト ＩｇＧ感作磁性粒
子とした。
クローナル抗体）を用いて、粒径約６ｔｔｍの磁性体封
入ゼラチン粒子に抗ヒト ＩｇＧを感作した。その後、
ＢＳＡｆｉブロッキングして抗ヒト ＩｇＧ感作磁性粒
子とした。
Ｄ、血清中のＨＢｓ抗体の検出
０．３％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて、ＨＢｓ抗体陽性サ
ンプルおよび陰性サンプルの希釈系列をそれぞれ調製し
た。これらの希釈液をｙＨＢｓ感作プレートに分注し、
３７℃で１０分間インキュベートした後、ＰＢＳで６回
洗浄した。次いで、上記抗ヒト ＩｇＧ感作磁性粒子を
各ウェルに２５ρづつ分注し、３分間磁石で吸引してパ
ターンを形成した。
ンプルおよび陰性サンプルの希釈系列をそれぞれ調製し
た。これらの希釈液をｙＨＢｓ感作プレートに分注し、
３７℃で１０分間インキュベートした後、ＰＢＳで６回
洗浄した。次いで、上記抗ヒト ＩｇＧ感作磁性粒子を
各ウェルに２５ρづつ分注し、３分間磁石で吸引してパ
ターンを形成した。
得られた結果を第４ａ図および第４ｂ図に示す。第４ａ
図は陽性サンプルから得られたパターン、第４ｂ図は陰
性サンプルから得られたパターンであり、希釈倍率が２
−６まではほぼ同様のパターンを示した。図に示すよう
に、短時間で、ＨＢｓ抗体の存在を明確に判定すること
ができる。
図は陽性サンプルから得られたパターン、第４ｂ図は陰
性サンプルから得られたパターンであり、希釈倍率が２
−６まではほぼ同様のパターンを示した。図に示すよう
に、短時間で、ＨＢｓ抗体の存在を明確に判定すること
ができる。
実施例２
血清中のＩｇＧの検出
抗ヒト ＩｇＧ （Ｃａｐｐｅ１社製）をＰＢＳテ希釈
しテｌ。
しテｌ。
ｚ／ｗＪの濃度の希釈液を調製し、この希釈液を、実施
例１と同様の方法で作成したタンニン酸処理済みの固定
血球プレートに各ウェル当り２５１ＬＩＩづつ分注した
。これを室温で１時間インキュベートすることにより抗
ヒト ＩｇＧの感作を行なった。抗ヒト１ｇＧを感作し
た後、ウェルを洗浄し、０．３％ＢＳＡ／ ＰＢＳ溶液
を分注してブロッキングした。
例１と同様の方法で作成したタンニン酸処理済みの固定
血球プレートに各ウェル当り２５１ＬＩＩづつ分注した
。これを室温で１時間インキュベートすることにより抗
ヒト ＩｇＧの感作を行なった。抗ヒト１ｇＧを感作し
た後、ウェルを洗浄し、０．３％ＢＳＡ／ ＰＢＳ溶液
を分注してブロッキングした。
その後、さらにウェルを洗浄して風乾し、抗ヒトＩｇＧ
感作プレートとした。
感作プレートとした。
０．３％ＢＳＡ含有ＰＢＳで市販プール血清（商品名「
スイトロールＮＪ、日永製薬社製）の希釈系列を調製し
、上記抗ヒト ＩｇＧ感作プレートに分注した。分注後
、３７℃で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで６回洗
浄した。その後、抗ヒト ＩｇＧ感作磁性体封入粒子を
各ウェルに２５ｄづつ分注し、３分間磁石で吸引してパ
ターンを形成した。
スイトロールＮＪ、日永製薬社製）の希釈系列を調製し
、上記抗ヒト ＩｇＧ感作プレートに分注した。分注後
、３７℃で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで６回洗
浄した。その後、抗ヒト ＩｇＧ感作磁性体封入粒子を
各ウェルに２５ｄづつ分注し、３分間磁石で吸引してパ
ターンを形成した。
得られた結果を下記第１表および第５ａ図ないし第５ｃ
図に示す。第５ａ図はスイトロールの希釈倍率が２−１
の場合、第５ｂ図は２−１６の場合、および第５ｃ図は
スイトロールを添加しない場合のパターンをそれぞれ示
す。
図に示す。第５ａ図はスイトロールの希釈倍率が２−１
の場合、第５ｂ図は２−１６の場合、および第５ｃ図は
スイトロールを添加しない場合のパターンをそれぞれ示
す。
第 １ 表
これらの表および図から明らかなように、スイトロール
の希釈倍率に応じて形成されるパターンの形状が異なり
、血清中の ＩｇＧを短時間で検出することができた。
の希釈倍率に応じて形成されるパターンの形状が異なり
、血清中の ＩｇＧを短時間で検出することができた。
比較例
血清中の抗ＨＢｓ抗体の検出
実施例１と同様の抗ＨＢｓ抗体の検出を、抗原を直接マ
イク、ロブレートに結合させる従来の方法で行なった。
イク、ロブレートに結合させる従来の方法で行なった。
酵母組換えＨＢｓ抗原（ｙｔ（Ｂｓ）をＰＢＳで１０ｔ
ｔｇ／ｗｄｌに希釈してＵ底プレート（Ｎｕｎｃ社製Ｍ
ａｘｌｓｏｒｐ）に各ウェル当り２５ｄづつ分注し、室
温で１時間インキュベートしてｙＨＢｓをウェル内壁に
吸着させた。
ｔｇ／ｗｄｌに希釈してＵ底プレート（Ｎｕｎｃ社製Ｍ
ａｘｌｓｏｒｐ）に各ウェル当り２５ｄづつ分注し、室
温で１時間インキュベートしてｙＨＢｓをウェル内壁に
吸着させた。
次いで、ウェルを洗浄した後、ｏ９３％ＢＳＡ／ ＰＢ
Ｓ溶液を分注してブロッキングを行なった。ブロッキン
グの後、ウェルを洗浄して水を切り、風乾してｙＨＢｓ
プレートとした。
Ｓ溶液を分注してブロッキングを行なった。ブロッキン
グの後、ウェルを洗浄して水を切り、風乾してｙＨＢｓ
プレートとした。
次イテ、０．３％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用イテ、ＨＢｓ抗
体陽性サンプルおよび陰性サンプルの希釈系列を調製し
た。それぞれの希釈液を上記ｙＨＢｓプレートに分注し
、３０℃で１０分間インキュベートした。
体陽性サンプルおよび陰性サンプルの希釈系列を調製し
た。それぞれの希釈液を上記ｙＨＢｓプレートに分注し
、３０℃で１０分間インキュベートした。
その後、ＰＢＳで６回洗浄した。
次に、粒径約６１の磁性体封入ゼラチンビーズを５ａｇ
／−の抗ヒト ＩｇＧを用いて感作し、抗ヒトＩｇＧ感
作磁性粒子を調製した。この感作磁性粒子を上記プレー
トに各ウェル当り２！ｌ）づつ分注し、磁石で３分間吸
引した。
／−の抗ヒト ＩｇＧを用いて感作し、抗ヒトＩｇＧ感
作磁性粒子を調製した。この感作磁性粒子を上記プレー
トに各ウェル当り２！ｌ）づつ分注し、磁石で３分間吸
引した。
しかしながら、この場合には、陽性および陰性を明確に
区別し得るパターンは形成されなかった。
区別し得るパターンは形成されなかった。
以上のように、この発明の免疫学的測定方法においては
、磁性マーカー粒子を用い、かつ磁界を作用させて磁性
マーカー粒子の沈降を促進しているので、従来の粒子凝
集法に比較して非常に短時間でマーカー粒子の分布パタ
ーンを形成することができる。すなわち、判定に要する
時間を大幅に短縮することが可能である。また、沈降が
促進されるのが磁性マーカー粒子のみであるため、他の
沈降性粒子が沈殿する前に磁性マーカー粒子のパターン
を形成することができる。したがって、被測定物質以外
の自然沈降性物質を予め除去することなく高感度かつ高
精度の測定を行うことが可能である。
、磁性マーカー粒子を用い、かつ磁界を作用させて磁性
マーカー粒子の沈降を促進しているので、従来の粒子凝
集法に比較して非常に短時間でマーカー粒子の分布パタ
ーンを形成することができる。すなわち、判定に要する
時間を大幅に短縮することが可能である。また、沈降が
促進されるのが磁性マーカー粒子のみであるため、他の
沈降性粒子が沈殿する前に磁性マーカー粒子のパターン
を形成することができる。したがって、被測定物質以外
の自然沈降性物質を予め除去することなく高感度かつ高
精度の測定を行うことが可能である。
さらに、この発明の免疫学的測定方法においては、まず
、容器内壁に固定化赤血球を固相化し、次いで、この赤
血球表面に被測定物質と特異的に反応する物質を結合し
ており、被測定物質と特異的に反応する物質は直接容器
内壁には結合していない。このため、容器内壁の性状を
変えることがなく、被測定物質と特異的に反応する物質
の反応性を損なうことがなく、かつこの物質の種類Ｊ：
応じて容器の材質を変更する必要がない。
、容器内壁に固定化赤血球を固相化し、次いで、この赤
血球表面に被測定物質と特異的に反応する物質を結合し
ており、被測定物質と特異的に反応する物質は直接容器
内壁には結合していない。このため、容器内壁の性状を
変えることがなく、被測定物質と特異的に反応する物質
の反応性を損なうことがなく、かつこの物質の種類Ｊ：
応じて容器の材質を変更する必要がない。
第１ａ図ないし第１ｃ図は、この発明の免疫学的測定方
法に用いられる粒子凝集判定容器の作成方法を模式的に
示す図、 第２図は、この発明の免疫学的測定方法に用いられる粒
子凝集判定容器の作成時において、反応性が損なわれる
場合を模式的に示す図、第３ａ図ないし第３ｅ図は、こ
の発明の免疫学的測定方法における工程を模式的に示す
図、第４ａ図および第４ｂ図は、この発明の一実施例に
おける結果を示す図、 第５ａ図ないし第５ｃ図は、この発明の他の実施例にお
ける結果を示す図である。
法に用いられる粒子凝集判定容器の作成方法を模式的に
示す図、 第２図は、この発明の免疫学的測定方法に用いられる粒
子凝集判定容器の作成時において、反応性が損なわれる
場合を模式的に示す図、第３ａ図ないし第３ｅ図は、こ
の発明の免疫学的測定方法における工程を模式的に示す
図、第４ａ図および第４ｂ図は、この発明の一実施例に
おける結果を示す図、 第５ａ図ないし第５ｃ図は、この発明の他の実施例にお
ける結果を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 被測定物質と特異的に結合する物質を結合した固定化赤
血球を内壁に固相化した粒子凝集判定容器を調製する工
程と、 前記粒子凝集判定容器にサンプル溶液を注入する工程と
、 前記粒子凝集判定容器から未反応の物質を除去する工程
と、 被測定物質と結合する物質を結合した磁性マーカーを前
記粒子凝集判定容器内に注入する工程と、前記粒子凝集
判定容器に磁界を作用させて磁性マーカー粒子の沈降を
促進する工程と、 前記粒子凝集判定容器の内壁に沈降した磁性マーカー粒
子の分布状態に基づいて、前記サンプル溶液中に含有さ
れる被測定物質を測定する工程とを具備する固定化赤血
球上における免疫学的測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2064422A JPH0827285B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | 固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2064422A JPH0827285B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | 固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03267759A true JPH03267759A (ja) | 1991-11-28 |
| JPH0827285B2 JPH0827285B2 (ja) | 1996-03-21 |
Family
ID=13257826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2064422A Expired - Lifetime JPH0827285B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | 固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0827285B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05297001A (ja) * | 1992-04-15 | 1993-11-12 | Fujirebio Inc | 磁性粒子を用いた自動免疫測定方法及び装置 |
-
1990
- 1990-03-16 JP JP2064422A patent/JPH0827285B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05297001A (ja) * | 1992-04-15 | 1993-11-12 | Fujirebio Inc | 磁性粒子を用いた自動免疫測定方法及び装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0827285B2 (ja) | 1996-03-21 |
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