JPS602187A - 免疫学的方法による転移性細胞活性の測定法 - Google Patents
免疫学的方法による転移性細胞活性の測定法Info
- Publication number
- JPS602187A JPS602187A JP59101622A JP10162284A JPS602187A JP S602187 A JPS602187 A JP S602187A JP 59101622 A JP59101622 A JP 59101622A JP 10162284 A JP10162284 A JP 10162284A JP S602187 A JPS602187 A JP S602187A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- collagenase
- type
- collagenase enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
- G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/813—Cancer
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ナールあるいはポリクロナール抗体を用いてその細胞の
■型コラグナーゼの免疫学的測定をすることにより証明
する転移性細胞活性の測定法に関する。また本発明によ
れば、標識づけされたあるいは標識づけされていない前
記酵素抗原に対するポリクローナルあるいはモノクロー
ナル抗体からなる組成物に関する。
■型コラグナーゼの免疫学的測定をすることにより証明
する転移性細胞活性の測定法に関する。また本発明によ
れば、標識づけされたあるいは標識づけされていない前
記酵素抗原に対するポリクローナルあるいはモノクロー
ナル抗体からなる組成物に関する。
悪性細胞の一つの主要な特性は浸潤と転移体の形成であ
る。したがって浸潤過程の早期発見と予防は臨床上重要
な意味をもつ。転移の成立は複雑であり、もとの腫瘍を
離れ近接した組織に浸潤しリンパ系あるいは循環系経路
に浸透し、そこから離れた組織の管壁に付着したままそ
の管壁を透過して管壁粗織に浸潤し、最終的にそこで増
殖して転移コ〇二一をつくる。
る。したがって浸潤過程の早期発見と予防は臨床上重要
な意味をもつ。転移の成立は複雑であり、もとの腫瘍を
離れ近接した組織に浸潤しリンパ系あるいは循環系経路
に浸透し、そこから離れた組織の管壁に付着したままそ
の管壁を透過して管壁粗織に浸潤し、最終的にそこで増
殖して転移コ〇二一をつくる。
その転移中の腫瘍細胞はその内転移過程で数カ所で基底
膜を穿通しなくてはならない。基底膜は細胞外マトリッ
クスで、それはタフで連続したシートを形成し、またそ
れは上皮と内皮柔組織を間質結合組織から分離している
。これらの構造はコラーゲン（■型）成分と糖タンパク
質（ｐｒｏｔｅｏｇ １ｙｃａ１１）、ラミニン、フィ
ブロネクチン、エンタフチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）など
の非コラーゲン成分からなっている。基底膜は腫瘍細胞
に対して強力な障壁となり、またそれ６え転移過程にお
いて基底膜の分解は重要な段階である。この過程は現在
ではタンパク分解酵素により促進されると考えられてい
る。フラズミノーゲン活性化因子、カテプシンＢとＤの
ようなタンパク分解酵素や糖タンパク分解酵素の増大が
、腫瘍細胞組織抽出物や培養腫瘍細胞の培養液中に見出
される。そしてこれらの酵素は細胞の浸潤力測定検査の
確実な指標とみなされている。しかしながら、それらの
酵素が分泌されることと悪性細胞の浸潤性との関係につ
いては確立されていない。事実、プラスミノゲン活性化
因子は浸潤性をもたない多くの細胞種によっても生産さ
れる。さらに前記のタンパク分解酵素■型コラーゲンを
分解しないので腫瘍細胞が基底膜を穿通するのに充分な
手段とはならない。
膜を穿通しなくてはならない。基底膜は細胞外マトリッ
クスで、それはタフで連続したシートを形成し、またそ
れは上皮と内皮柔組織を間質結合組織から分離している
。これらの構造はコラーゲン（■型）成分と糖タンパク
質（ｐｒｏｔｅｏｇ １ｙｃａ１１）、ラミニン、フィ
ブロネクチン、エンタフチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）など
の非コラーゲン成分からなっている。基底膜は腫瘍細胞
に対して強力な障壁となり、またそれ６え転移過程にお
いて基底膜の分解は重要な段階である。この過程は現在
ではタンパク分解酵素により促進されると考えられてい
る。フラズミノーゲン活性化因子、カテプシンＢとＤの
ようなタンパク分解酵素や糖タンパク分解酵素の増大が
、腫瘍細胞組織抽出物や培養腫瘍細胞の培養液中に見出
される。そしてこれらの酵素は細胞の浸潤力測定検査の
確実な指標とみなされている。しかしながら、それらの
酵素が分泌されることと悪性細胞の浸潤性との関係につ
いては確立されていない。事実、プラスミノゲン活性化
因子は浸潤性をもたない多くの細胞種によっても生産さ
れる。さらに前記のタンパク分解酵素■型コラーゲンを
分解しないので腫瘍細胞が基底膜を穿通するのに充分な
手段とはならない。
本発明者らは腫瘍細胞が中性プロテアーゼを分泌するこ
とを証明し、そしてそのプロテアーゼが■型コラーゲン
を特異的に分解し、そしてその酵素をネズミの腫瘍細胞
から（Ｌｉｏｔｔａ ｅｔａｔ、、 Ｎａｔｌ、 ｃａ
ｎｃｅ、ｒ Ｉｎ５ｔ、、５８．１４２７〜１４３１゜
１９７７： Ｌｉｏｔｔａ ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
とを証明し、そしてそのプロテアーゼが■型コラーゲン
を特異的に分解し、そしてその酵素をネズミの腫瘍細胞
から（Ｌｉｏｔｔａ ｅｔａｔ、、 Ｎａｔｌ、 ｃａ
ｎｃｅ、ｒ Ｉｎ５ｔ、、５８．１４２７〜１４３１゜
１９７７： Ｌｉｏｔｔａ ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、７６．２２６８〜２２７２，１９７８；５ａ
ｌｏ ｅｔ ａｌ、、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８．３０
５８〜３０６３、１９８３．）と同様に人間の培養腫瘍
細胞からも単離精製する方法を開発した。
ｌｏ ｅｔ ａｌ、、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８．３０
５８〜３０６３、１９８３．）と同様に人間の培養腫瘍
細胞からも単離精製する方法を開発した。
本発明者らはその酵素（以下、■型コラゲナーゼという
）の活性が腫瘍ｍ胞浸潤力と関係することを示した（Ｌ
ｉｏｔｔａ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ ２８４，６７
〜６８．１９８０）。
）の活性が腫瘍ｍ胞浸潤力と関係することを示した（Ｌ
ｉｏｔｔａ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ ２８４，６７
〜６８．１９８０）。
このように■型コラゲナーゼ酵素抗原は大きな臨床的価
値をもつ。しかしながら■型コラゲナーゼ活性の測定、
は、体液などの生体液、組織抽出液中あるいは組織切片
ではそのような試料中に含まれる多量のプロテアーゼ阻
害因子のために達成されない。
値をもつ。しかしながら■型コラゲナーゼ活性の測定、
は、体液などの生体液、組織抽出液中あるいは組織切片
ではそのような試料中に含まれる多量のプロテアーゼ阻
害因子のために達成されない。
本発明の目的は、体液、組織抽出液、臓器や細胞の培養
液や培養物などの生物試料中の■型コラゲナーゼ酵素抗
原を免疫学的に測定することにより、転移性細胞活性を
有する悪性腫瘍細胞を検出する方法を提供するとにある
。
液や培養物などの生物試料中の■型コラゲナーゼ酵素抗
原を免疫学的に測定することにより、転移性細胞活性を
有する悪性腫瘍細胞を検出する方法を提供するとにある
。
本発明の別の目的は、標識づけされたもしくは標識づけ
されていない高純度の■型コラゲナーゼ酵素抗原および
前記のＩＶ型コラゲナーゼ酵素抗原に対する標識づけさ
れたもしくは標識づけされていないポリクローナルまた
はモノクローナル抗体からなる組成物を提供することに
ある。
されていない高純度の■型コラゲナーゼ酵素抗原および
前記のＩＶ型コラゲナーゼ酵素抗原に対する標識づけさ
れたもしくは標識づけされていないポリクローナルまた
はモノクローナル抗体からなる組成物を提供することに
ある。
基底膜穿通性の細胞からの■型コラゲナーゼ酵素抗原の
精製と測定は、本発明の実現にとって絶対的な重要性が
ある。本発明者らはＩＶ型コラゲナーゼを発見し、また
この抗原の精製と特徴づけを行なった（Ｌｉｏｔｔａ
ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、ＮａＨ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ
、、５８．１４７２〜１４３１，１９７７；Ｌｉｏｔｔ
ａ ｅｔ ａｔ、。
精製と測定は、本発明の実現にとって絶対的な重要性が
ある。本発明者らはＩＶ型コラゲナーゼを発見し、また
この抗原の精製と特徴づけを行なった（Ｌｉｏｔｔａ
ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、ＮａＨ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ
、、５８．１４７２〜１４３１，１９７７；Ｌｉｏｔｔ
ａ ｅｔ ａｔ、。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、７６．２
２６８〜２２７２．１９７８；５ａｌｏ ｅｔ ａｔ、
、’ｒｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８．３０５８〜３０６３
，１９８３；５ａｌｏ ｅｔ ａｌ、。
２６８〜２２７２．１９７８；５ａｌｏ ｅｔ ａｔ、
、’ｒｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８．３０５８〜３０６３
，１９８３；５ａｌｏ ｅｔ ａｌ、。
Ｊ、Ｂｔｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 １９８３） 、 ＩＶ型
コラゲナーゼ活性の測定のために、放射性同位体で標識
した■型コラーゲンが基質として用いられる。なおこの
基質は本発明者らの開発した方法にしたがって・調整さ
れル（ＴｒｙｌＪｇｖａｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９．１２８４〜１２８９．１９
８０）。この活性分析は、精製過程の多段階における精
製度を知るために必要である。この方法により、血清を
含まない器官あるいは細胞培養液中のコラゲナーゼ活性
を測ることができる。
コラゲナーゼ活性の測定のために、放射性同位体で標識
した■型コラーゲンが基質として用いられる。なおこの
基質は本発明者らの開発した方法にしたがって・調整さ
れル（ＴｒｙｌＪｇｖａｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９．１２８４〜１２８９．１９
８０）。この活性分析は、精製過程の多段階における精
製度を知るために必要である。この方法により、血清を
含まない器官あるいは細胞培養液中のコラゲナーゼ活性
を測ることができる。
■型コラゲナーゼ酵素は血清なしの悪性腫瘍組織の培養
液あるいは培養悪性細胞の培養液よりえることができる
。組織片あるいは細胞は普通５日間試験管培養し培養液
を日ごとに集める。
液あるいは培養悪性細胞の培養液よりえることができる
。組織片あるいは細胞は普通５日間試験管培養し培養液
を日ごとに集める。
■型コラゲナーゼを含むタンパク画分を硫安で沈澱させ
、そして以下に例示した実施例におけるように数段のク
ロマトグラフィーカラムを通す。
、そして以下に例示した実施例におけるように数段のク
ロマトグラフィーカラムを通す。
精製した■型コラゲナーゼ抗原は分子量約７０．０００
でゲル電気泳動法で調べたとき分子量６２ 、０００と
６８，０００の２つのポリペプチド鎖を含む。
でゲル電気泳動法で調べたとき分子量６２ 、０００と
６８，０００の２つのポリペプチド鎖を含む。
■型コラゲナーゼ酵素抗原は最大活性をうるためにタン
パク分解性の活性化を必要とし、最適りＨは７．４であ
る。■型コラゲナーゼ酵素抗原は、金属（イオン）依存
性でカルシウムをその活性のために必要とする。その酵
素抗原は特異的で腫瘍組織”中のコラーゲン、■型、■
型または■型、あるいは他の基底膜成分あるいはカゼイ
ンは分解しない。
パク分解性の活性化を必要とし、最適りＨは７．４であ
る。■型コラゲナーゼ酵素抗原は、金属（イオン）依存
性でカルシウムをその活性のために必要とする。その酵
素抗原は特異的で腫瘍組織”中のコラーゲン、■型、■
型または■型、あるいは他の基底膜成分あるいはカゼイ
ンは分解しない。
■型コラゲナーゼ酵素抗原の分離と精製により、前記の
酵素抗原に対する特異的抗体の生産が可能になる。これ
らの抗体の精製は、体液、組織抽出液組織片、細胞ある
いは器官培養物、培養液などの生体試料中での■型コラ
ゲナーゼの定性的定量的測定による転移性細胞活性の高
感度な免疫学的検出法の開発を可能にする。
酵素抗原に対する特異的抗体の生産が可能になる。これ
らの抗体の精製は、体液、組織抽出液組織片、細胞ある
いは器官培養物、培養液などの生体試料中での■型コラ
ゲナーゼの定性的定量的測定による転移性細胞活性の高
感度な免疫学的検出法の開発を可能にする。
抗血清のモノクローナル抗体と同様、ポリクロ−ナル抗
体の調整を、すでに確立している方法で行なうことがで
きる。抗血清の調整はウサギあるいはギニアビッグのよ
うな実験動物に、数回にわたって精製した■型コラゲナ
ーゼを皮下に注射し、そして適当な器官がすぎたあとそ
の動物から血清をぬきとればよい。当業者によく知られ
ている酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンイムノブ
ロッティング法や免疫染色法などの技術により特異的抗
体がそのぬきとった抗血清中に存在することを試験する
。
体の調整を、すでに確立している方法で行なうことがで
きる。抗血清の調整はウサギあるいはギニアビッグのよ
うな実験動物に、数回にわたって精製した■型コラゲナ
ーゼを皮下に注射し、そして適当な器官がすぎたあとそ
の動物から血清をぬきとればよい。当業者によく知られ
ている酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンイムノブ
ロッティング法や免疫染色法などの技術により特異的抗
体がそのぬきとった抗血清中に存在することを試験する
。
抗血清はマウス■型コラゲナーゼ抗原に対して本発明者
らが開発した方法により生産されている。これらの抗血
清はイムノブロッティング、ＥＬＩＳＡそして免疫ケイ
先決により示されるように、マウスの抗原と反応する。
らが開発した方法により生産されている。これらの抗血
清はイムノブロッティング、ＥＬＩＳＡそして免疫ケイ
先決により示されるように、マウスの抗原と反応する。
従来の抗血清の調整をするためには、■型コラゲナーゼ
酵素抗原は高度に精製されておりかつ単一のタンパク質
でなければならない。ウサギやギニアピッッグを用いて
従来の抗血清を生産するために、充分量かつ絶対的に純
粋なヒトの■型コラゲナーゼ抗原をうろことはきわめて
むづかしい。この問題を克服するべく我々はモノクロー
ナル抗体を調整するためにケーラー（にｏｅｈｌｅｒ）
とミルスティン（Ｈｉ １ｓｔｅｉｎ） （Ｎａｔｕｒ
ｅ。
酵素抗原は高度に精製されておりかつ単一のタンパク質
でなければならない。ウサギやギニアピッッグを用いて
従来の抗血清を生産するために、充分量かつ絶対的に純
粋なヒトの■型コラゲナーゼ抗原をうろことはきわめて
むづかしい。この問題を克服するべく我々はモノクロー
ナル抗体を調整するためにケーラー（にｏｅｈｌｅｒ）
とミルスティン（Ｈｉ １ｓｔｅｉｎ） （Ｎａｔｕｒ
ｅ。
２５６．４７６．１９７５）の方法を用いている。この
方法の利点は、抗原が絶対的に純粋である必要はない。
方法の利点は、抗原が絶対的に純粋である必要はない。
なぜなら、試験管条件下で特異的抗体をつくる細胞のク
ローン（ハイブリッド）を選抜するからである。
ローン（ハイブリッド）を選抜するからである。
前記ケーラーとミルスティンの方法にしたがって、１０
０μ９のヒトの線維芽腫瘍の細胞の培養液より分離して
高度に精製した■型コラゲナーゼを２回にわたってＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスに皮下注射し免疫化した。６週間後抗血
清をＥＬＩＳＡ法により試験した。えられた結果が満足
のいくものであれば適当量の■型コラゲナーゼ抗原をそ
のマウスに与え、もう一度免疫化した。２匹の免疫化し
たマウスよりえた膵臓とマウスのミエローマ細胞（Ｎ８
−１）とを融合させ、そして常法によりミクロカルチャ
ートレイ上で培養した。４５３穴のうち４６穴が、ＥＬ
ＩＳＡ法により抗体に対して陽性であった。
０μ９のヒトの線維芽腫瘍の細胞の培養液より分離して
高度に精製した■型コラゲナーゼを２回にわたってＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスに皮下注射し免疫化した。６週間後抗血
清をＥＬＩＳＡ法により試験した。えられた結果が満足
のいくものであれば適当量の■型コラゲナーゼ抗原をそ
のマウスに与え、もう一度免疫化した。２匹の免疫化し
たマウスよりえた膵臓とマウスのミエローマ細胞（Ｎ８
−１）とを融合させ、そして常法によりミクロカルチャ
ートレイ上で培養した。４５３穴のうち４６穴が、ＥＬ
ＩＳＡ法により抗体に対して陽性であった。
この方法により、１０個の適当な雑種細胞系統がみつか
った。これらの１０個の雑種系統は悪性のヒトの線雑芽
腫瘍と悪性の肺肉腫５ｔｔｖｉに高度に陽性である一方
、普通ヒトの皮膚の細胞とはわずかにしか反応しなかっ
た。これら１０個の雑種系統のうちから３個のもつとも
高い力価をもつ系統を、希釈法により試験管中でクロー
ニングするためおよびモノクローナル抗体産生のため選
抜した。このようにして産生、分離そして精製される■
型コラゲナーゼ抗原に対するポリクローナルやモノクロ
ーナル抗体は、適当な放射性同位体、酵素あるいはケイ
光標識などの当業者によく知られた方法で標識化するこ
とができる。
った。これらの１０個の雑種系統は悪性のヒトの線雑芽
腫瘍と悪性の肺肉腫５ｔｔｖｉに高度に陽性である一方
、普通ヒトの皮膚の細胞とはわずかにしか反応しなかっ
た。これら１０個の雑種系統のうちから３個のもつとも
高い力価をもつ系統を、希釈法により試験管中でクロー
ニングするためおよびモノクローナル抗体産生のため選
抜した。このようにして産生、分離そして精製される■
型コラゲナーゼ抗原に対するポリクローナルやモノクロ
ーナル抗体は、適当な放射性同位体、酵素あるいはケイ
光標識などの当業者によく知られた方法で標識化するこ
とができる。
これらのポリクローナルやモノクローナル抗体そして■
型コラゲナーゼ抗原、そしてさらにそれらは標識化ある
いは標識化せずに適当な固体担体につけることができ、
また本発明の一部を形成する免疫学的方法にも用いられ
る。
型コラゲナーゼ抗原、そしてさらにそれらは標識化ある
いは標識化せずに適当な固体担体につけることができ、
また本発明の一部を形成する免疫学的方法にも用いられ
る。
本発明における転移性細胞活性をもった悪性細胞の検出
法によれば、標識つきあるいは標識なし、結合あるいは
非結合、ポリクローナルあるいはモノクローナル抗体組
成物および標識つきあるいは標識なし、結合あるいは非
結合のＩＶ型コラゲナーゼ酵素抗原組成物の補助により
、従来の免疫学的手法を用いて、■型コラゲナーゼ酵素
抗原の組織抽出液、組織切片などの生物試料中における
存在が測定される。
法によれば、標識つきあるいは標識なし、結合あるいは
非結合、ポリクローナルあるいはモノクローナル抗体組
成物および標識つきあるいは標識なし、結合あるいは非
結合のＩＶ型コラゲナーゼ酵素抗原組成物の補助により
、従来の免疫学的手法を用いて、■型コラゲナーゼ酵素
抗原の組織抽出液、組織切片などの生物試料中における
存在が測定される。
その免疫学的方法において、ウサギの抗血清が■型コラ
ゲナーゼ抗原の分析に用いられた。
ゲナーゼ抗原の分析に用いられた。
ウェスタンイムノブロッティングによる証明によると抗
血清は分子量６２Ｋ（６２，０００）と６８Ｋ（６８，
０００）の領域を染色した。その領域は精製した■型コ
ラゲナーゼ酵素抗原に対応する。さらにその抗血清はヒ
ト肺ガンと正常肺組織の免疫学的染色に使われた。組織
の凍結切片ははじめにウサギ抗血清とインキュベートさ
れ、次いでＦＩＴＣ−共役の抗ラビットＩｇＧとインキ
ュベートされた。１０個の正常組織試料からはどれから
もケイ光は検出されなかった。すなわちそれらは■型コ
ラゲナーゼ抗原を含んでいなかった。
血清は分子量６２Ｋ（６２，０００）と６８Ｋ（６８，
０００）の領域を染色した。その領域は精製した■型コ
ラゲナーゼ酵素抗原に対応する。さらにその抗血清はヒ
ト肺ガンと正常肺組織の免疫学的染色に使われた。組織
の凍結切片ははじめにウサギ抗血清とインキュベートさ
れ、次いでＦＩＴＣ−共役の抗ラビットＩｇＧとインキ
ュベートされた。１０個の正常組織試料からはどれから
もケイ光は検出されなかった。すなわちそれらは■型コ
ラゲナーゼ抗原を含んでいなかった。
一方２５個の肺ガン組織試料では２５個すべてが腫瘍の
境界領域において強いケイ光を発した。従って本発明に
おける免疫学的方法は、組織中における悪性細胞の存在
を検出することができ、また染色領域は必ず腫瘍の境界
領域にあったので、■型コラゲナーゼ抗原が浸潤細胞に
多いことは明らかである。
境界領域において強いケイ光を発した。従って本発明に
おける免疫学的方法は、組織中における悪性細胞の存在
を検出することができ、また染色領域は必ず腫瘍の境界
領域にあったので、■型コラゲナーゼ抗原が浸潤細胞に
多いことは明らかである。
マウス雑種クローンより産生されたＩＶ型コラゲナーゼ
酵素抗原に対する抗体は、培養細胞の免疫学的染色に用
いられた。用いた細胞は、ヒトの線維肉腫（ＨＴ−１０
８０） 、肺肉腫ｍｌ胞（ｔ４ｃＦ−７）とヒト正常皮
膚線維芽細胞であった。細胞を微量力価検定用プレート
上で培養したあと、抗体と反応させた。そのプレートを
洗い、ビオチン化した馬の抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭとイ
ンキュベートし、洗った。そのあとアビジン−ビオチン
−パーオキシダーゼ試薬を細胞についたマウス免疫グロ
ブリン−抗マウス免疫グロブリンコンプレックスに着色
するために加えた。結果は、悪性ＨＴ−１０８０とＨＣ
Ｆ−７細胞は染色されたが、正常の皮膚１１ｉ１１［芽
細胞は染色されなかった。このようにヒトＩＶ型コラゲ
ナーゼに対するモノクローナル抗体は■型コラゲナーゼ
酵素抗原を含む悪性細胞と前記酵素抗原を含まない正常
細胞とを区別するために用いることができる。
酵素抗原に対する抗体は、培養細胞の免疫学的染色に用
いられた。用いた細胞は、ヒトの線維肉腫（ＨＴ−１０
８０） 、肺肉腫ｍｌ胞（ｔ４ｃＦ−７）とヒト正常皮
膚線維芽細胞であった。細胞を微量力価検定用プレート
上で培養したあと、抗体と反応させた。そのプレートを
洗い、ビオチン化した馬の抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭとイ
ンキュベートし、洗った。そのあとアビジン−ビオチン
−パーオキシダーゼ試薬を細胞についたマウス免疫グロ
ブリン−抗マウス免疫グロブリンコンプレックスに着色
するために加えた。結果は、悪性ＨＴ−１０８０とＨＣ
Ｆ−７細胞は染色されたが、正常の皮膚１１ｉ１１［芽
細胞は染色されなかった。このようにヒトＩＶ型コラゲ
ナーゼに対するモノクローナル抗体は■型コラゲナーゼ
酵素抗原を含む悪性細胞と前記酵素抗原を含まない正常
細胞とを区別するために用いることができる。
つぎに実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はか
かる実施例のみに限定されるものではない。
かる実施例のみに限定されるものではない。
実施例１
［ＩＶ型コラゲナーゼ抗原の単離］
マウスの■型コラゲナーゼの調製のために転移性ＰＩＴ
腫瘍をＣ５７１３１／６Ｊマウス中に増殖させる。約２
週間の増殖のあとその増殖した腫瘍を摘出し細断し血清
なしのＲＰＨＩ−１６４０培地中で器管培養として５日
間培養する。その培地を日毎集め硫安（２５〜６０％飽
和）でタンパク質を沈澱させる。その沈澱を酵素用緩衝
液（０，０５ＨＴｒｉｓ−ＨＣｄ 、 ｐＨ７，４，０
，２ＨＮａ Ｃ６’ｔ、 １０８ Ｃａ Ｃ１！ ２
）にとかし、はとんどの酵素活性が吸着されるコンカナ
バリンＡアガロースカラムに通す。その結合活性体を１
Ｈα−メチルマンノサイドで溶出しＩＶ型コラーゲンア
ガロースカラムに通す。カラムに結合させるコラーゲン
は腫瘍の増殖するＥＨ８基底膜マトリックスから抽出し
精製する。
腫瘍をＣ５７１３１／６Ｊマウス中に増殖させる。約２
週間の増殖のあとその増殖した腫瘍を摘出し細断し血清
なしのＲＰＨＩ−１６４０培地中で器管培養として５日
間培養する。その培地を日毎集め硫安（２５〜６０％飽
和）でタンパク質を沈澱させる。その沈澱を酵素用緩衝
液（０，０５ＨＴｒｉｓ−ＨＣｄ 、 ｐＨ７，４，０
，２ＨＮａ Ｃ６’ｔ、 １０８ Ｃａ Ｃ１！ ２
）にとかし、はとんどの酵素活性が吸着されるコンカナ
バリンＡアガロースカラムに通す。その結合活性体を１
Ｈα−メチルマンノサイドで溶出しＩＶ型コラーゲンア
ガロースカラムに通す。カラムに結合させるコラーゲン
は腫瘍の増殖するＥＨ８基底膜マトリックスから抽出し
精製する。
またそのコラーゲンは完全な■型コラーゲン鎖（分子量
１８５にと１７５Ｋ）を含む。酵素によるコラーゲン−
アガロースの分解をさけるため、カラムに流す緩衝液か
らＣａＣ／ｚを除いておく。結合した酵素活性は１Ｈの
Ｎａ Ｃ６または５０％のエチレングリコールを含む緩
衝液でカラムから溶出する。その■型コラゲナーゼの最
終的な精製は、たとえばバイオ−ゲルＡ （Ｂｉｏ−Ｇ
ｅｌ Ａ）０．５ｍのような分子ふるいにより行なわれ
る。その分子ふるいの中で■型コラゲナーゼは約ｉｅｏ
、ｏｏｏの分子量として移動する。このようにして精製
した酵素は分子量６８にと６２にの２本のベプタイド鎖
をもつ。
１８５にと１７５Ｋ）を含む。酵素によるコラーゲン−
アガロースの分解をさけるため、カラムに流す緩衝液か
らＣａＣ／ｚを除いておく。結合した酵素活性は１Ｈの
Ｎａ Ｃ６または５０％のエチレングリコールを含む緩
衝液でカラムから溶出する。その■型コラゲナーゼの最
終的な精製は、たとえばバイオ−ゲルＡ （Ｂｉｏ−Ｇ
ｅｌ Ａ）０．５ｍのような分子ふるいにより行なわれ
る。その分子ふるいの中で■型コラゲナーゼは約ｉｅｏ
、ｏｏｏの分子量として移動する。このようにして精製
した酵素は分子量６８にと６２にの２本のベプタイド鎖
をもつ。
ヒトの■型コラゲナーゼ活性は血清なし・の培地で培養
したヒト線維芽肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）からマウス
の場合と同じようにして調製される。
したヒト線維芽肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）からマウス
の場合と同じようにして調製される。
その線維芽肉腫細胞は１０％仔牛血清中に胎児のコンフ
リユエンシー（ｃｏｎｆ Ｉｕｅｎｃｙ）を含むデュル
ベコス（Ｄｕ ｌ ｂｅｃｃｏｓ ）によるイーグルの
改変培地（ＯＭＥＮ）中でローラーボトルを使って培養
し、ついで血清をぬいた培地に移して培養される。培養
液は日毎に５日間にわたって集める。
リユエンシー（ｃｏｎｆ Ｉｕｅｎｃｙ）を含むデュル
ベコス（Ｄｕ ｌ ｂｅｃｃｏｓ ）によるイーグルの
改変培地（ＯＭＥＮ）中でローラーボトルを使って培養
し、ついで血清をぬいた培地に移して培養される。培養
液は日毎に５日間にわたって集める。
実施例２
［マウス■型コラゲナーゼに対する抗血清の調製］
抗原（１００〜２００μｇ）をリン酸緩衝された生理食
塩水（ＰＢＳ）と７０インド（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全ア
ジュバントの等量混合液を用いてマウスの皮下に注射す
る。そして４週間後に今度は７０インドの不完全アジュ
バントを用いて抗体をもう一度注射する。そのあと追加
注射を３週間ごとに２回行なう。最後の追加注射のあと
３週間して血液をぬき、その血清を特異性と力価につい
てＥＬＩＳＡ 、ウェスタンブロッティング、そして免
疫染色法により検査する。
塩水（ＰＢＳ）と７０インド（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全ア
ジュバントの等量混合液を用いてマウスの皮下に注射す
る。そして４週間後に今度は７０インドの不完全アジュ
バントを用いて抗体をもう一度注射する。そのあと追加
注射を３週間ごとに２回行なう。最後の追加注射のあと
３週間して血液をぬき、その血清を特異性と力価につい
てＥＬＩＳＡ 、ウェスタンブロッティング、そして免
疫染色法により検査する。
実施例３
［モノクローナル抗体の調製と分析コ
完全７０インドアジュバント中の部分精製した旧−１０
８０酵素１００μ９を用いてＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫
化する。そして３週間の間をおき、５０μ９の抗原を用
いて２回にわたりさらに免疫化する。抗血清の力価を最
後の注射から３週間後にＥＬＩＳＡにより分析検査した
とき、結果墨満足であれば（希釈≦１：５００）、その
動物に５０μｑの抗原をさらに静脈注射する。ケーラー
とミルスティン（ｔｌａｔｕｒｅ 、２５６．６９６．
１９７５）による方法で４日後に雑種化を行なう。
８０酵素１００μ９を用いてＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫
化する。そして３週間の間をおき、５０μ９の抗原を用
いて２回にわたりさらに免疫化する。抗血清の力価を最
後の注射から３週間後にＥＬＩＳＡにより分析検査した
とき、結果墨満足であれば（希釈≦１：５００）、その
動物に５０μｑの抗原をさらに静脈注射する。ケーラー
とミルスティン（ｔｌａｔｕｒｅ 、２５６．６９６．
１９７５）による方法で４日後に雑種化を行なう。
２匹のマウスよりとった免疫化したｎｍｍ胞をＭＳ−１
あるいは対応するミエローマ細胞と融合させ、融合した
細胞は９６個の穴をもつ微量力価検定板に１つの穴当り
約２ Ｘ １０５細胞を植え、マウスのマクロファージ
をフィーダーセルとした（ ６ Ｘ １０３個）。ｉ胞
は■＾■の選択培地（１０−４Ｍヒボクサンチン、１０
−７８アミノペチン、１．６Ｘ１０５ Ｍと２０％ＦＣ
８を含む叶ＥＨ）中で３〜４週間培養する。この培地は
ハイブリッド細胞だけを成育させる。ＥＬＩＳＡ法によ
り細胞の抗体産生を検定する。通常的１０％の穴が陽性
である。
あるいは対応するミエローマ細胞と融合させ、融合した
細胞は９６個の穴をもつ微量力価検定板に１つの穴当り
約２ Ｘ １０５細胞を植え、マウスのマクロファージ
をフィーダーセルとした（ ６ Ｘ １０３個）。ｉ胞
は■＾■の選択培地（１０−４Ｍヒボクサンチン、１０
−７８アミノペチン、１．６Ｘ１０５ Ｍと２０％ＦＣ
８を含む叶ＥＨ）中で３〜４週間培養する。この培地は
ハイブリッド細胞だけを成育させる。ＥＬＩＳＡ法によ
り細胞の抗体産生を検定する。通常的１０％の穴が陽性
である。
抗体の特異性はウェスタンブロッティング法と免疫染色
法で調べる。
法で調べる。
９６穴の微量力価検定プレートを用いてＥＬＩＳＡ法を
行なう。約５０〜１００μ９の抗原を各穴に入れて乾燥
させる。５０μ、００１％ＦＣ８で３０分間インキュベ
ートし、抗原のフリーの結合座位を４１さいたのち、そ
の穴をＰＢＳで洗う。次に抗血清としてハイブリッドの
上清を各穴（５０μｊりに加えてインキュベートする。
行なう。約５０〜１００μ９の抗原を各穴に入れて乾燥
させる。５０μ、００１％ＦＣ８で３０分間インキュベ
ートし、抗原のフリーの結合座位を４１さいたのち、そ
の穴をＰＢＳで洗う。次に抗血清としてハイブリッドの
上清を各穴（５０μｊりに加えてインキュベートする。
ＰＢＳにより洗ったのち、５０μｍのビオチン化した馬
の抗マウスＩｇＧの１％ＦＣ８を含む溶液を加え３０分
間インキュベートしたのち、ＰＢＳで洗う。そのあとア
ビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ試薬を加えてイン
キュベートする。さらにそのあとそのパーオキシダーゼ
の基質（ｏ、ｏｉ％０−ダイアニシン、０．０１％Ｈ２
０，を含むＰＢＳ）を加え、生じたかつ色をティタテツ
クマルチスキャン分光光度計で測る。
の抗マウスＩｇＧの１％ＦＣ８を含む溶液を加え３０分
間インキュベートしたのち、ＰＢＳで洗う。そのあとア
ビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ試薬を加えてイン
キュベートする。さらにそのあとそのパーオキシダーゼ
の基質（ｏ、ｏｉ％０−ダイアニシン、０．０１％Ｈ２
０，を含むＰＢＳ）を加え、生じたかつ色をティタテツ
クマルチスキャン分光光度計で測る。
ウェスタンブロッティング法は、抗体が正確にどのポリ
ペプチド鎖と反応したかを示すので、よりすぐれた抗体
の分析法である。抗原また（ま抗原を含むタンパク質混
合物は、はじめに１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分離したのち、ニトロセ
ルロース股上に水平に塗抹し、０．１への電流で１夜間
展開する。次にそのニトロセルロース膜をヘパリントル
イジンブルーの染色液で染色する。タンパク質を含むニ
トロセルロース膜片を切り出し、エタノール５０％と酢
酸８％と水４２％よりなる溶液で脱染色する。ＥＬＩＳ
Ａ法で用いたと同様）方法でそのニトロセルロース切片
の免疫染色を行なう。活性抗原はその抗体に対してのみ
力翫っ色に発色するが、しかしもし抗体が抗原の３次構
造に対してつくられているなら、ゲル電気泳動中に抗原
タンパクが変性しているので、結果が陰性となることが
あることに注意しなげればならない。
ペプチド鎖と反応したかを示すので、よりすぐれた抗体
の分析法である。抗原また（ま抗原を含むタンパク質混
合物は、はじめに１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分離したのち、ニトロセ
ルロース股上に水平に塗抹し、０．１への電流で１夜間
展開する。次にそのニトロセルロース膜をヘパリントル
イジンブルーの染色液で染色する。タンパク質を含むニ
トロセルロース膜片を切り出し、エタノール５０％と酢
酸８％と水４２％よりなる溶液で脱染色する。ＥＬＩＳ
Ａ法で用いたと同様）方法でそのニトロセルロース切片
の免疫染色を行なう。活性抗原はその抗体に対してのみ
力翫っ色に発色するが、しかしもし抗体が抗原の３次構
造に対してつくられているなら、ゲル電気泳動中に抗原
タンパクが変性しているので、結果が陰性となることが
あることに注意しなげればならない。
実施例４
［■型コラゲナーゼの免疫染色コ
マウスの精製したＷ型コラゲナーゼに対するウサギの抗
血清をヒトの正常肺組織および悪性肺ガン組織中での■
型コラゲナーゼの分布を明らかにした。１０個の正常肺
組織および２５個の肺ガン組織の試料の凍結切片（５μ
■厚）を１％ＦＣ８であらかじめインキュベートしたあ
とＰＢＳで洗った。そのあと１：５０希釈の抗血清を前
記試料とインキュベートし、ＰＢＳで洗った。さらにそ
れらの切片をＦＩＴＣ−共役の山羊の抗ウサギ血清とと
もに４℃で１夜間放置したのちＰＢＳで洗った。切片の
ケイ光を調べたところ、どの正常組織試料も染色されず
、一方ガン組織試料２５例すべてに明瞭なケイ光が観察
された。ケイ光染色は浸潤腫瘍部の周縁前面がもつとも
強かった。また腫瘍組織中の１０〜８０％の細胞が染色
された。
血清をヒトの正常肺組織および悪性肺ガン組織中での■
型コラゲナーゼの分布を明らかにした。１０個の正常肺
組織および２５個の肺ガン組織の試料の凍結切片（５μ
■厚）を１％ＦＣ８であらかじめインキュベートしたあ
とＰＢＳで洗った。そのあと１：５０希釈の抗血清を前
記試料とインキュベートし、ＰＢＳで洗った。さらにそ
れらの切片をＦＩＴＣ−共役の山羊の抗ウサギ血清とと
もに４℃で１夜間放置したのちＰＢＳで洗った。切片の
ケイ光を調べたところ、どの正常組織試料も染色されず
、一方ガン組織試料２５例すべてに明瞭なケイ光が観察
された。ケイ光染色は浸潤腫瘍部の周縁前面がもつとも
強かった。また腫瘍組織中の１０〜８０％の細胞が染色
された。
ヒトＨＴ−１０８０肉種Ｉ８胞の■型コラゲナーゼに対
するモノクローナル抗体を、培養したＨＴ−１０８０細
胞、ヒト悪性肺肉腫（ＭＣＦ−７）およびヒト皮膚線維
芽細胞の染色に用いた。それらの細胞はカバーグラス上
に細胞が限界まで増える手前まで培養し、そしてメタノ
ールで一２０℃にて１０分間で固定した。それらの細胞
は次にあらかじめ１％ＦＣ３でインキュベートしたあと
ＰＢＳで洗った。ついでマウスの抗体と２時間インキュ
ベートしたあと洗った。その後ビオチン化した馬の抗マ
ウスＩｇＧと３０分間インキュベートしたのち洗い、さ
らにアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ試薬でイン
キュベートした。最後に、それらの細胞試料をパーオキ
シダーゼの基質とインキュベートした。その抗体は、悪
性のＨＴ−１０８０とＨＣＦ−７細胞を明瞭に染色し、
一方線維芽細胞においては陰性であった。
するモノクローナル抗体を、培養したＨＴ−１０８０細
胞、ヒト悪性肺肉腫（ＭＣＦ−７）およびヒト皮膚線維
芽細胞の染色に用いた。それらの細胞はカバーグラス上
に細胞が限界まで増える手前まで培養し、そしてメタノ
ールで一２０℃にて１０分間で固定した。それらの細胞
は次にあらかじめ１％ＦＣ３でインキュベートしたあと
ＰＢＳで洗った。ついでマウスの抗体と２時間インキュ
ベートしたあと洗った。その後ビオチン化した馬の抗マ
ウスＩｇＧと３０分間インキュベートしたのち洗い、さ
らにアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ試薬でイン
キュベートした。最後に、それらの細胞試料をパーオキ
シダーゼの基質とインキュベートした。その抗体は、悪
性のＨＴ−１０８０とＨＣＦ−７細胞を明瞭に染色し、
一方線維芽細胞においては陰性であった。
この免疫染色の例から明らかなごとく、■型コラゲナー
ゼに対する抗体は浸潤性をもった悪性腫瘍細胞を検知す
ることができる。
ゼに対する抗体は浸潤性をもった悪性腫瘍細胞を検知す
ることができる。
アメリカ合衆国２０８１７メリーラ
ンド州ベセスダ・ソノマ・ロー
ド５６２１
■出 願 人 ランス・アレン・リオツタアメリカ合衆
国２０８１７メリーラ ンド州ベセスダ・ソノマ・ロー ド５６２１
国２０８１７メリーラ ンド州ベセスダ・ソノマ・ロー ド５６２１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 転移性活性を有する腫瘍細胞の検出に有用な基底膜
コラーゲン分解酵素。 ２ 酵素がメタルプロプアーゼであり、基質が■型コラ
ーゲンである特許請求の範囲第１項記載の基底膜分解酵
素。 ３ ゲル電気泳動法により測定した分子量が約６２．０
００および６８，０００である２つのポリペプチド鎖よ
りなる分子量約７０，０００の精製された■型コラゲナ
ーゼ酵素抗原を含む特許請求の範囲第１項記載の基底膜
分解酵素。 ４ 精製された■型コラゲナーゼ酵素抗原が適当な標識
で標識づけされている特許請求の範囲第１項、第２項ま
たは第３項記載の基底膜分解酵素。 ５ ■型コラゲナーゼ酵素抗原に対して特異的な抗体よ
りなる転移性細胞活性を有する腫瘍細胞の検出に有用な
抗体組成物。 ６ 精製された■型コラゲナーゼ酵素抗原があらかじめ
接種された動物の血清から採集される抗血清を含む特許
請求の範囲第５項記載の抗体組成物。 ７ ■型コラゲナーゼ酵素抗原に対するモノクローナル
抗体を含む特許請求の範囲第５項記載の抗体組成物。 ８ 抗体が適当な標識で標識づけ□されている特許請求
の範囲第５項、第６項または第７項記載の抗体組成物。 ９ 抗体が適当な固体担体に結合されている特許請求の
範囲第５項、第６項、第７項または第８項記載の抗体組
成物。 １０ ■型コラゲナーゼ酵素抗原に対する抗体の助けに
より、生物学的試料中の■型コラゲナーゼ酵素抗原を測
定することからなる転移性細胞活性を有する腫瘍細胞の
検出に有用な免疫学的方法。 １１ 抗体が適当な標識で標識づけされている特許請求
の範囲第１０項記載の方法。 １２ 抗体が適当な固体担体に結合されている特許請求
の範囲第１０項記載の方法。 １３ 標識づけされたＩＶ型フロラゲナーゼ酵素抗原該
抗原に対する抗体とを用いる競合的イムノアッセイの助
けにより、ＩＶＶコラゲナーゼ酵素抗原を測定すること
からなる転移性細胞活性を有する腫瘍細胞の検出に有用
な免疫学的方法。 １４ ＩＶ型コラゲナーげ酵素抗原が適当な固体担体に
結合されている特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５ （ａ）組織切片または細胞を■型コラゲナーゼ酵
素抗原に対して特異的な第１の抗体とインキュベートし
、 （ｂ）該酵素抗原に第１の抗体を結合させ、ついで （Ｃ）第１の抗体に結合して生物的試料中に■型コラゲ
ナーゼ酵素抗原の存在を示す標識づけされた第２の抗体
を第１の抗体に加えることからなる生物的試料中のＩＶ
Ｖコラゲナーゼ酵素抗原の測定により、転移性１ｌｌｐ
ＩＡ活性を有する腫瘍細胞の検出に有用な免疫染色法。 １Ｇ （ａ）生物的被験試料の存在下に、標識づけされ
たＩＶＶコラゲナーゼ酵素抗原を該抗原に対して特異的
な第１の抗体とインキュベートし、 （ｂ）反応を進め、第１の抗体に対して試料中の■型コ
ラゲナーゼ酵素抗原と標識づけされた■型コラゲナーゼ
酵素抗原とを競合させ、（Ｃ）形成された抗原−抗体コ
ンプレックスを分離し、ついで （ｄ）該コンプレックス中または上澄液中の標識づけさ
れた■型コラゲナーゼ酵素抗原の量を測定する ことからなる生物的試料中のＩＶＶコラゲナーゼ酵素抗
原の測定により、転移性細胞活性を有する腫瘍細胞の検
出に有用な免疫学的方法。 １７ （ａ）生物的試料と共にＩＶＶコラゲナーゼ酵素
抗原に対する抗体をインキュベートし、（ｂ）試料中の
ＩＶＶコラゲナーゼ酵素抗原を抗体に結合させ、 （Ｃ）該ＩＶＶコラゲナーゼ酵素抗原の異なるサイトに
結合する第２の標識づけされた抗体を加え、ついで （ｄ） ＩＶＶコラゲナーゼ酵素抗原に結合することの
できなかった標識づけされた抗体の量を測定する ことからなる生物的試料中のＩＶＶコラゲナーゼ酵素抗
原の測定により、転移性細胞活性を有する腫瘍細胞の検
出に有用な免疫学的方法。 １８ ＩＶＶコラゲナーゼ酵素抗原に対する抗体を適当
な固体担体に固定し、該抗体の助けにより精製すること
を特徴とするＩＶＶコラゲナーゼ酵素抗原の精製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/496,230 US4677058A (en) | 1983-05-19 | 1983-05-19 | Detecting malignant cells with monoclonal antibodies specific to type IV collagenase enzyme |
| US496230 | 1983-05-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS602187A true JPS602187A (ja) | 1985-01-08 |
Family
ID=23971775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59101622A Pending JPS602187A (ja) | 1983-05-19 | 1984-05-18 | 免疫学的方法による転移性細胞活性の測定法 |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4677058A (ja) |
| JP (1) | JPS602187A (ja) |
| AU (1) | AU2808784A (ja) |
| BE (1) | BE899663A (ja) |
| CA (1) | CA1230052A (ja) |
| CH (1) | CH668838A5 (ja) |
| DD (1) | DD251208A5 (ja) |
| DE (1) | DE3418625A1 (ja) |
| DK (1) | DK243184A (ja) |
| ES (1) | ES8605904A1 (ja) |
| FI (1) | FI841897A (ja) |
| FR (1) | FR2546302B1 (ja) |
| GB (1) | GB2142030B (ja) |
| HU (1) | HU195004B (ja) |
| IL (1) | IL71802A0 (ja) |
| IT (1) | IT1175842B (ja) |
| LU (1) | LU85366A1 (ja) |
| NL (1) | NL8401616A (ja) |
| NO (1) | NO841993L (ja) |
| NZ (1) | NZ208108A (ja) |
| PL (1) | PL247745A1 (ja) |
| PT (1) | PT78610B (ja) |
| RO (1) | RO92427A (ja) |
| SE (1) | SE8402703L (ja) |
| YU (1) | YU86984A (ja) |
| ZA (1) | ZA843539B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06300757A (ja) * | 1993-04-12 | 1994-10-28 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト間質型コラゲナーゼと阻害剤との複合体の免疫学的定量法および臨床診断への応用 |
| JPH0734014B2 (ja) * | 1990-01-26 | 1995-04-12 | アメリカ合衆国 | コラーゲナーゼを定量的に測定するための方法 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6294172B1 (en) | 1983-08-12 | 2001-09-25 | Dade Behring Marburg Gmbh | Monoclonal antibodies with specificity for membrane-associated antigens |
| US4859581A (en) * | 1986-03-10 | 1989-08-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Endoglycosidase assay |
| GB2209526B (en) * | 1987-09-04 | 1992-06-03 | Univ Washington | Dna clone of human type iv collagenase |
| US4923818A (en) * | 1987-09-04 | 1990-05-08 | Washington University | DNA clone of human type IV collagenase |
| US4876332A (en) * | 1987-10-08 | 1989-10-24 | Regents Of The Univeristy Of Minnesota | Polypeptides with type IV collagen activity |
| US5280106A (en) * | 1988-05-20 | 1994-01-18 | Liotta Lance A | Matrix metalloproteinase peptides: role in diagnosis and therapy |
| US5030555A (en) * | 1988-09-12 | 1991-07-09 | University Of Florida | Membrane-strip reagent serodiagnostic apparatus and method |
| DE3909799A1 (de) | 1989-03-24 | 1990-09-27 | Behringwerke Ag | Monoklonale antikoerper (mak) gegen tumorassoziierte antigene, ihre herstellung und verwendung |
| US4992537A (en) * | 1989-05-15 | 1991-02-12 | Washington University | cDNA encoding 92-kDA type IV collagenase |
| ATE206129T1 (de) * | 1989-10-18 | 2001-10-15 | Us Health | Herstellung und verwendung des menschlichen nm23- h2-proteins und dagegen gerichtete antikörper |
| WO1992020820A1 (en) * | 1991-05-15 | 1992-11-26 | Vanderbilt University | Method to determine metastatic potential of tumor cells |
| US5324634A (en) * | 1992-03-31 | 1994-06-28 | The Research Foundation Of State University Of New York | Diagnostic tests measuring gelatinase/inhibitor complexes for detection of aggressive and metastatic cancer |
| ATE485888T1 (de) * | 2004-08-26 | 2010-11-15 | Life Technologies Corp | Elektrobenetzende abgabevorrichtungen und dazugehörige verfahren |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE343949B (ja) * | 1966-06-02 | 1972-03-20 | Pharmacia Ab | |
| DE2363854C3 (de) * | 1973-12-21 | 1980-01-03 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Substrat zur Proteinasebestimmung sowie dessen Herstellung |
| US4201763A (en) * | 1975-10-09 | 1980-05-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Solid phase immunofluorescent assay method |
| DE3239410A1 (de) * | 1981-10-27 | 1983-05-19 | Hybritech Inc., 92121 San Diego, Calif. | Monoklonale antikoerper zu tumorassoziiertem antigen, zusammensetzungen, welche diese enthalten und deren anwendung zum tumornachweis |
| US4424278A (en) * | 1981-11-16 | 1984-01-03 | Research Corporation | Cancer detection procedure using an acyl carrier protein |
| US4443367A (en) * | 1982-04-08 | 1984-04-17 | Monsanto Company | Peptide and peptolide substrates for mammalian collagenase |
-
1983
- 1983-05-19 US US06/496,230 patent/US4677058A/en not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-05-09 NZ NZ208108A patent/NZ208108A/en unknown
- 1984-05-10 IL IL71802A patent/IL71802A0/xx unknown
- 1984-05-10 ZA ZA843539A patent/ZA843539B/xx unknown
- 1984-05-10 GB GB08411959A patent/GB2142030B/en not_active Expired
- 1984-05-11 CA CA000454194A patent/CA1230052A/en not_active Expired
- 1984-05-11 FI FI841897A patent/FI841897A/fi not_active Application Discontinuation
- 1984-05-15 BE BE0/212938A patent/BE899663A/fr not_active IP Right Cessation
- 1984-05-16 AU AU28087/84A patent/AU2808784A/en not_active Abandoned
- 1984-05-17 DK DK243184A patent/DK243184A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-05-17 LU LU85366A patent/LU85366A1/fr unknown
- 1984-05-17 RO RO84114584A patent/RO92427A/ro unknown
- 1984-05-18 DE DE19843418625 patent/DE3418625A1/de not_active Withdrawn
- 1984-05-18 DD DD84263171A patent/DD251208A5/de unknown
- 1984-05-18 NL NL8401616A patent/NL8401616A/nl not_active Application Discontinuation
- 1984-05-18 PT PT78610A patent/PT78610B/pt unknown
- 1984-05-18 SE SE8402703A patent/SE8402703L/xx not_active Application Discontinuation
- 1984-05-18 HU HU841936A patent/HU195004B/hu unknown
- 1984-05-18 JP JP59101622A patent/JPS602187A/ja active Pending
- 1984-05-18 NO NO841993A patent/NO841993L/no unknown
- 1984-05-18 PL PL24774584A patent/PL247745A1/xx unknown
- 1984-05-18 CH CH2471/84A patent/CH668838A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-05-18 FR FR8407747A patent/FR2546302B1/fr not_active Expired
- 1984-05-18 ES ES532597A patent/ES8605904A1/es not_active Expired
- 1984-05-18 YU YU00869/84A patent/YU86984A/xx unknown
- 1984-05-18 IT IT20998/84A patent/IT1175842B/it active
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| .J.BIOL.CHEM=1983 * |
| J.BIOL.CHEM=1980 * |
| JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1983 * |
| PROC.NATL.ACAD.SCI.=1979US * |
| PROC.NATL.ACAD.SCI=1976US * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0734014B2 (ja) * | 1990-01-26 | 1995-04-12 | アメリカ合衆国 | コラーゲナーゼを定量的に測定するための方法 |
| JPH06300757A (ja) * | 1993-04-12 | 1994-10-28 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト間質型コラゲナーゼと阻害剤との複合体の免疫学的定量法および臨床診断への応用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES8605904A1 (es) | 1986-04-01 |
| GB8411959D0 (en) | 1984-06-13 |
| FR2546302B1 (fr) | 1988-03-04 |
| HU195004B (en) | 1988-03-28 |
| BE899663A (fr) | 1984-08-31 |
| FR2546302A1 (fr) | 1984-11-23 |
| CH668838A5 (de) | 1989-01-31 |
| PT78610B (en) | 1986-07-15 |
| PT78610A (en) | 1984-06-01 |
| IT8420998A0 (it) | 1984-05-18 |
| NZ208108A (en) | 1988-04-29 |
| GB2142030A (en) | 1985-01-09 |
| NL8401616A (nl) | 1984-12-17 |
| RO92427A (ro) | 1987-09-30 |
| PL247745A1 (en) | 1985-08-27 |
| ZA843539B (en) | 1985-07-31 |
| DD251208A5 (de) | 1987-11-04 |
| GB2142030B (en) | 1987-02-04 |
| HUT34261A (en) | 1985-02-28 |
| SE8402703L (sv) | 1984-11-20 |
| AU2808784A (en) | 1984-11-22 |
| NO841993L (no) | 1984-11-20 |
| IT8420998A1 (it) | 1985-11-18 |
| US4677058A (en) | 1987-06-30 |
| FI841897A (fi) | 1984-11-20 |
| IL71802A0 (en) | 1984-09-30 |
| IT1175842B (it) | 1987-07-15 |
| ES532597A0 (es) | 1986-04-01 |
| YU86984A (en) | 1991-01-28 |
| CA1230052A (en) | 1987-12-08 |
| DK243184D0 (da) | 1984-05-17 |
| DE3418625A1 (de) | 1984-11-22 |
| FI841897A0 (fi) | 1984-05-11 |
| DK243184A (da) | 1984-11-20 |
| SE8402703D0 (sv) | 1984-05-18 |
| LU85366A1 (fr) | 1984-11-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS602187A (ja) | 免疫学的方法による転移性細胞活性の測定法 | |
| JP2012082210A (ja) | Ａｄａｍｔｓ１３活性検定用抗体及び活性検定方法 | |
| US20060073520A1 (en) | Specific antibody directed to active hepatocyte growth factor activator and method for using the same | |
| US4816400A (en) | Basement membrane collagen degrading enzyme and method of purifying same | |
| CA2606721A1 (en) | Detection of carbohydrate biomarkers | |
| US4808528A (en) | Antibody composition for the detection of malignant cells with metastatic cell activity | |
| JPH05304953A (ja) | 抗トロンビン結合性物質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ | |
| CN103842503A (zh) | 上皮性卵巢癌标志物检测用抗体和上皮性卵巢癌判定方法 | |
| Wacher et al. | Development of a novel substrate capture immunoassay for the detection of a neutral metalloproteinase capable of degrading basement membrane (type IV) collagen | |
| WO1998029560A1 (fr) | Anticorps monoclonal contre la collagenase 3 et procede de dosage immunologique utilisant cet anticorps | |
| JP4533995B2 (ja) | 抗ａｄａｍｔｓ１３モノクローナル抗体 | |
| JPH08226918A (ja) | 遊離の活性型マトリックスメタロプロテアーゼ類の分別定量法 | |
| JP2712018B2 (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JP5840274B2 (ja) | ストロムライシン１と特異的に反応するモノクローナル抗体 | |
| JPH11318449A (ja) | ストロメライシン―２（ｍｍｐ―１０）に対する抗体 | |
| JPH10512369A (ja) | 癌診断薬としてのａ蛋白質 | |
| JP2005154389A (ja) | Ｃｄ４４の形態を識別する抗体 | |
| JP2010241744A (ja) | ウシアディポネクチンに対する抗体及びウシアディポネクチンの測定方法 | |
| JP2000065829A (ja) | スタニオカルシンに対する抗体 | |
| JPH0785085B2 (ja) | フイブロネクチン測定試薬 | |
| JP2001302691A (ja) | ヒトｋｇｆに対する抗体 | |
| JPH0493659A (ja) | ヒトα↓１―アンチキモトリプシンの測定方法 | |
| JPH08500107A (ja) | 癌関連ｓｃｍ認識因子の免疫化学的検定 |