NL8401616A - Werkwijze voor het aan-tonen van kwaardaardige cellen, enzym- en antilichaam-preparaten die daarbij bruikbaar zijn, alsmede werkwijze voor het zuiveren van collagenase-enzym-antigenen. - Google Patents

Werkwijze voor het aan-tonen van kwaardaardige cellen, enzym- en antilichaam-preparaten die daarbij bruikbaar zijn, alsmede werkwijze voor het zuiveren van collagenase-enzym-antigenen. Download PDF

Info

Publication number
NL8401616A
NL8401616A NL8401616A NL8401616A NL8401616A NL 8401616 A NL8401616 A NL 8401616A NL 8401616 A NL8401616 A NL 8401616A NL 8401616 A NL8401616 A NL 8401616A NL 8401616 A NL8401616 A NL 8401616A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
type
enzyme
antigen
antibody
collagenase
Prior art date
Application number
NL8401616A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Tryggvason Karl
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tryggvason Karl filed Critical Tryggvason Karl
Publication of NL8401616A publication Critical patent/NL8401616A/nl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
    • G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y10S436/813—Cancer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

*
Korte aanduiding: Werkwijze voor het aantonen van kwaadaardige cellen, enzym- en antilichaam-preparaten die daarbij bruikbaar zijn, alsmede werkwijze voor het zuiveren van collagenase-enzym-antigenen
De uitvinding heeft betrekking op werkwijzen voor het aantonen van metastatische celactiviteit door immunologische bepaling van type-IV-collagenase-antigeen door gebruikmaking van polyklonale en monoklonale antilichamen ten opzichte van het genoemde enzym-antigeen. Voorts open-5 baart de uitvinding preparaten, die gemerkt of ongemerkt enzym-antigeen en gemerkte of ongemerkte polyklonale en monoklonale antilichamen ten opzichte van het genoemde enzym-antigeen omvatten.
Eén van de belangrijkste kenmerken van kwaadaardige cellen is invasie en de vorming van metastase. Derhalve zijn methoden voor vroegtijdige 10 ontdekking en beheersing van de invasieve processen van aanzienlijke klinische waarde. De vorming van metastase is een ingewikkelde opeenvolging van gebeurtenissen, waarbij kwaadaardige cellen loslaten van de primaire tumor, het aangrenzende weefsel invaderen, binnendringen in de lymfe- en bloedsomloopkanalen, zich op een verwijderde plaats hechten aan 15 en penetreren door de vaatwand, het weefsel invaderen en tenslotte proli-fereren om de metastase-haard te initiëren.
De invaderende tumorcellen moeten op verscheidene plaatsen door "fundament-membranen" (basement membranes) heendringen tijdens het uit-zaaiingsproces. Fundament-membranen zijn extracellulaire matrices, die 20 een sterk continu vel vormen, dat epitheliale, endotheliale en parenchy-male cellen scheidt van interstitieel bindweefsel. Deze structuren zijn samengesteld uit collageen (type IV) en niet-collageen-componenten, zoals laminine, proteoglycan, entactine en fibronectine. Fundament-membranen vormen beduidende barrières voor de tumorcellen en de degradatie daarvan 25 is derhalve een belangrijke stap in het metastase-proces. Thans wordt 8401616 - 2 - gemeend dat dit proces wordt vergemakkelijkt door proteolytische enzymen. Verhoogde niveaus van proteasen zoals plasminogeen-activatoren, cathep-sine B en D en proteoglycan-degraderende enzymen zijn beschreven zowel in tumorweefselextracten als in media van gekweekte tumorcellen, en deze 5 enzymen zijn beschouwd als veelbelovende sondes voor het meten van het invaderend vermogen van cellen. De correlatie tussen het afgeven van de enzymen en het invaderend vermogen van kwaadaardige cellen is echter niet vastgesteld. In feite worden plasminogeen-activatoren geproduceerd door vele cel-lijnen zonder invaderende eigenschappen. Verder verschaffen de 10 bovengenoemde proteasen, daar zij collageen van type IV niet degraderen, tumorcellen niet voldoende middelen om door fundament-membranen heen te dringen.
De aanvragers hebben aangetoond dat tumorcellen een neutraal protease afgeven, dat specifiek collageen van type IV degradeert en zij 15 hebben methoden ontwikkeld om dit enzym tot homogeniteit te zuiveren uit een metastatische muizetumor (Liotta e.a., J. Natl. Cancer Inst., 58, 1427-1431, 1977; Liotta e.a., Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 2268-2272, 1978; Salo e.a., The Journal of Biological Chemistry, 258, biz. 3058-3063, 1983) en ook uit gekweekte menselijke tumorcellen. De aanvragers 20 hebben ook aangetoond dat de activiteit van dit enzym, hier aangeduid als type-IV-collagenase, correleert met de metastatische vermogen van tumorcellen (Liotta e.a., Nature 284, 67-68, 1980).
Daar aangetoond is dat type-IV-collagenase-enzym-antigeen bruikbaar is voor het aantonen van kwaadaardige cellen van metastatische aard kan 25 het enzym van grote diagnostische waarde zijn. De meting van de type-IV-collagenase-activiteit kan echter niet in biologische vloeistoffen zoals lichaamsvloeistoffen, weefselextracten of weefselsneden worden uitgevoerd omdat in zulke monsters grote hoeveelheden protease-inhibitoren aanwezig zijn.
20 Het doel van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van werk wijzen voor het aantonen van kwaadaardige tumorcellen met metastatische celactiviteit door immunologische bepaling van type-IV-collagenase-enzym-antigeen in biologische monsters, zoals lichaamsvloeistoffen, weefselextracten, weefselsneden, orgaan- en celculturen, kweekmedia, enz. Een 35 verder doel van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van preparaten, omvattende zowel gemerkt als ongemerkt zeer zuiver type-IV-collage-nase-enzym-antigeen en gemerkte of ongemerkte polyklonale en monoklonale antilichamen voor het genoemde type-IV-collagenase-enzym-antigeen.
8401616 - 3 -
Methoden voor het zuiveren en karakteriseren van type-IV-collagenase-antigeen uit cellen die in staat zijn door fundament-membranen heen te dringen, in het bijzonder vanuit kwaadaardige tumorcellen, zijn een verplichte vooronderstelling voor het realiseren van de onderhavige uitvin-5 ding. De aanvragers hebben type-IV-collagenase gevonden en werkwijzen ontwikkeld voor het zuiveren en karakteriseren van dit antigeen (Liotta e.a., J. Natl. Cancer Inst., 58, 1427-1431, 1 977; Liotta e.a., Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 2268-2272, 1978; Salo e.a., The Journal of Biological Chemistry, 258, biz. 3058-3063, 1983; Salo e.a., J. Biol. Chem., 1983).
10 Voor de meting van type-IV-collagenase-activiteit wordt radioactief gemerkt procollageen van type IV als substraat gebruikt, waarbij dit substraat wordt geprepareerd volgens een door de uitvinders ontwikkelde methode (Tryggvason e.a., Biochemistry, 19, 1284-1289, 1980). Deze acti-viteitsbepaling is vereist om de mate van zuivering tijdens afzonderlijke 15 stappen van de zuiveringswerkwijze te bepalen. Door middel van deze methode kan de enzym-activiteit worden bepaald in serum-vrije orgaan- of cel-cultuurmedia.
Het type-IV-collagenase-enzym kan worden verkregen uit serum-vrije orgaancultuurmedia van kwaadaardig tumorweefsel of media van gekweekte 20 tumorcellen. De stukken weefsel of de cellen worden gewoonlijk 5 dagen in vitro gekweekt en de media dagelijks verzameld. Het medium-eiwit dat type-IV-collagenase-antigeen bevat wordt neergeslagen met ammoniumsulfaat en vervolgens door verscheidene chromatografiekolommen gevoerd als beschreven in de onderstaande toelichtende voorbeelden.
25 Het gezuiverde type-IV-collagenase-antigeen heeft een molecuulge- wicht van ongeveer 70.000 en blijkt bij bestudering door middel van gel-elektroforese te bestaan uit twee polypeptideketens met een molecuulge-wicht van 62.000 en 68.000. Het type-IV-collagenase-enzym-antigeen behoeft proteolytische activering voor maximale activiteit en heeft een 30 pH-optimum van 7,4. Het type-IV-collagenase-enzym-antigeen is een metaal-afhankelijk enzym en heeft calcium nodig voor activiteit. Het enzym-antigeen is specifiek en degradeert interstitieel collageen van de typen I, II en III, andere fundament-membraan-componenten of caseïne niet.
Het isoleren en zuiveren van het type-IV-collagenase-enzym-antigeen 35 maakt het mogelijk specifieke antilichamen voor het genoemde enzym-antigeen te produceren. De produktie van deze antilichamen maakt het mogelijk gevoelige immunologische werkwijzen te ontwikkelen voor het aantonen van metastatische celactiviteit door de kwalitatieve of kwantita- 8401616 - 4 - tieve bepaling van de type-IV-collagenase-antigenen in biologische monsters, zoals lichaamsvloeistoffen, weefselextracten, weefselsneden, cel-of orgaanculturen, kweekmedia, enz.
De bereiding van antiserums, polyklonale zowel als monoklonale anti-5 lichamen, kan worden uitgevoerd door reeds gevestigde methoden. Voor de bereiding van antiserums wordt het gezuiverde type-IV-collagenase-antigeen meerdere malen subcutaan geïnjecteerd bij proefdieren, zoals konijnen en cavia's en na een geschikte tijdsduur wordt serum onttrokken van het dier (de dieren). De aanwezigheid van specifieke antilichamen in het antiserum 10 wordt vervolgens getest door technieken zoals de "enzym-gekoppelde immunosorbens-proef" (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), de "immuno-vlekvormings-techniek" (western immunoblotting technique) en "immunologische kleuringsmethoden" (immunological staining methods) die bekend zijn aan deskundigen op dit gebied.
15 Antiserums zijn geproduceerd voor murien type-IV-collagenase-anti- geen door middel van werkwijzen die door de aanvragers zijn ontwikkeld. Deze antiserums reageren met het muize-antigeen als gedemonstreerd door de immuno-vlekvormings-techniek, ELISA en de immunofluorescentie-techniek.
Voor de bereiding van conventioneel antiserum moet het type-IV-20 collagenase-enzym-antigeen een zeer zuiver en homogeen eiwit zijn. Het is uiterst moeilijk voldoende hoeveelheden absoluut zuiver menselijk type- IV-collagenase-antigeen te verkrijgen om conventionele serums te produceren in konijnen en cavia's. Om dit probleem te overwinnen hebben wij de methode van Köhler en Milstein (Nature, 256, 496, 1975) toegepast om 25 monoklonale antilichamen te bereiden. Een voordeel bij deze methode is dat het antigeen niet absoluut zuiver behoeft te zijn, omdat de specifieke antilichaam producerende celklonen (hybriden) onder in vitro omstandigheden kunnen worden gekozen.
Volgens de hierboven vermelde methode worden BALB/C-muizen tweemaal 30 subcutaan geïmmuniseerd met 100 pg zeer zuiver type-IV-collagenase, geïsoleerd uit kweekmedia van menselijke fibrosarcoomcellen. Na zes weken werden de antiserums getest met de ELISA-methode. Indien de verkregen resutaten bevredigend waren werden de muizen nog eens intraveneus geïmmuniseerd met een geschikte hoeveelheid type-IV-collagenase-antigeen.
35 Milt-cellen uit twee geïmmuniseerde muizen en muize-myeloom-cellen (NS-1) werden vervolgens gehybridiseerd en gekweekt volgens conventionele techniek in microtiterplaten. Van de 453 plaatverdiepingen waren er 46 positief op antilichamen als bepaald door de ELISA-methode.
8401616 - 5 -
Door middel van de hierboven beschreven methode werden 10 geschikte hybride-lijnen gevonden. Deze 10 hybride-lijnen waren in hoge mate positief voor kwaadaardige menselijke fibrosarcoom- en borstcarcinoomcellen maar slechts zwak reactief met normale menselijke-huid-fibroplasten. Drie 5 van deze 10 hybridecellijnen, die de hoogste titers hadden werden gekozen om ze in vitro te klonen door middel van de verdunningstechniek en voor de produktie van monoklonale antilichamen.
De polyklonale en monoklonale antilichamen van het geproduceerde type-IV-collagenase-antigeen, geïsoleerd en gezuiverd als hierboven be-10 schreven, kunnen door middel van conventionele methoden worden gemerkt met geschikte radioactieve, enzymatische of fluorescente markeermiddelen, zoals aan de deskundigen duidelijk zal zijn.
De genoemde polyklonale en monoklonale antilichamen en het type-IV-collagenase-antigeen, gemerkt zowel als ongemerkt, kunnen worden gebonden 15 aan geschikte vaste dragers en worden gebruikt in de immunologische werkwijzen die deel uitmaken van de onderhavige uitvinding.
Volgens de werkwijzen voor het aantonen van kwaadaardige tumorcellen met metastatische celactiviteit wordt de aanwezigheid van het type-IV-collagenase-enzym-antigeen bepaald in biologische monsters, zoals 20 lichaamsvloeistoffen, weefselextracten, weefselsneden, enz. met conventionele immunologische werkwijzen met behulp van gemerkte of ongemerkte, gebonden of ongebonden type-IV-collagenase-enzym-antigeen-preparaten alsmede gemerkte of ongemerkte, gebonden of ongebonden, polyklonale en monoklonale antilichaam-preparaten.
25 In de immunologische werkwijzen werd konijneserum gebruikt voor het bepalen van de aanwezigheid van type-IV-collagenase-antigeen. Zoals aangetoond door de vlekvormings-techniek (western blotting technique) kleurde het antiserum twee eiwitten in het 62 K en het 68 K gebied, welke overeenkomen met het gezuiverde type-IV-collagenase-enzym-antigeen.
30 Voorts werd het antiserum gebruikt voor het immunologisch kleuren van menselijke borstkanker- en normale borstweefsels. Cryo-sneden van de weefsels werden eerst geïncubeerd met het antiserum en vervolgens met TITC-geconjugeerd anti-konijn-IgG. De resultaten lieten zien dat geen van de 10 normale weefselmonsters een positieve fluorescentie gaf, d.w.z.
35 deze bevatten geen type-IV-collagenase-enzym-antigeen. Anderzijds vertoonden 25 van de 25 borstkankerweefselmonsters intense fluorescentie in het randgebied van de tumor. Derhalve kan met de immunologische werkwijzen volgens de uitvinding de aanwezigheid van kwaadaardige tumorcellen in 8401616 - 6 - weefsels worden aangetoond en daar de kleuring hoofdzakelijk werd waargenomen aan de rand van de tumor is het duidelijk dat het type-IV-collage-nase-antigeen verrijkt is aan invaderende cellen.
Antilichaam voor menselijk type-IV-collagenase-enzym-antigeen, ge-5 produceerd uit muis-hybride-klonen werden gebruikt voor het immunologisch kleuren van gekweekte cellen. De bestudeerde cellen waren menselijk fibro-sarcoom (HT-1080), borstcarcinoomcellen (MCF-7) en normale menselijke huidfibroplasten. De cellen werden gekweekt op microtiterplaten en geïn-cubeerd met de antilichamen. De platen werden vervolgens gewassen en ge-10 incubeerd met gebiotinyleerd paarde/antimuis-IgG/IgM en gewassen. Daarna werden avidine-biotine-peroxidase-reagentia toegevoegd om de muis-immuno-globuline-antimuis-immunoglobuline-complexen, gebonden aan de cellen, te kleuren. De resultaten lieten zien dat de kwaadaardige HT-1080- en MCF-7-cellen werden gekleurd terwijl de normale huidfibroplasten niet werden 15 gekleurd. Derhalve was het duidelijk dat monoklonale antilichamen voor menselijk type-IV-collagenase kunnen worden gebruikt om kwaadaardige cellen die het type-IV-collagenase-enzym-antigeen bevatten te onderscheiden van normale cellen die het genoemde enzym-antigeen niet bevatten.
De uitvinding wordt meer in detail beschreven in de onderstaande 20 toelichtende voorbeelden.
Voorbeeld I
Isoleren van type-IV-collagenase-antigeen
Voor de bereiding van muis-type-IV-collagenase worden eerst metasta-tische PMT-tumoren gekweekt in C57B1/6J muizen. Na ongeveer 2 weken 25 groeien worden de tumoren uitgesneden, fijngemaakt en geïncubeerd in serum-vrij RPMI-1640-medium als orgaankweken gedurende 5 dagen. Het medium wordt dagelijks verzameld en het eiwit ervan neergeslagen met ammonium-sulfaat (25-60% verzadiging). Het neerslag wordt opgelost in de enzym-buffer (0,05M Tris-HCl, pH 7,4, 0,2 M NaCl, 10 mM CaCl2) en door een 30 concanavaline-A-agarose-kolom gevoerd, aan welke kolom de meeste enzym-activiteit wordt gebonden. De gebonden activiteit wordt geëlueerd met 1 M a-methylmannoside en gevoerd door een type-IV-collageen-agarose-kolom.
Het aan de kolom gekoppelde collageen wordt geëxtraheerd uit de EHS-fundament-membraan-matrix die tumor vormt en gezuiverd en het bevat 35 intacte type-IV-collageenketens (185 K en 175 K). Om degradatie van de collageen-agarose door het enzym te vermijden zijn de buffers vrij van CaCl2 tijdens die kolomdoorvoering. De enzym-activiteit wordt uit de kolom geëlueerd met enzym-buffer die 1 M NaCl of 50% ethyleenglycol 1401616 - 7 - bevat. De uiteindelijke zuivering van het enzym wordt verkregen door moleculair zeef, bijvoorbeeld Bio-Gel A 0,5 m, waarin het migreert met een schijnbaar molecuulgewicht van ongeveer 160.000. Het op deze wijze gezuiverde enzym bevat twee polypeptideketens van molecuulgewicht 68 K en 5 62 K.
De menselijke type-IV-collagenase-activiteit wordt bereid op dezelfde wijze als het muriene enzym uit serum-vrije media van gekweekte menselijke fibrosarcoomcellen (HT-1080). De cellen worden gekweekt in Dulbeccos gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) dat 10% foetale confluentie 10 in kalverserum (FCS) bevat in rolflessen waarna het medium wordt veranderd in hetzelfde serumvrije medium. Het medium wordt dagelijks verzameld gedurende 5 dagen.
Voorbeeld II
Bereiding van antiserum voor muis-type-IV-collagenase 15 Het antigeen (100-200 Ug) wordt subcutaan geïnjecteerd in gelijke volumes met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) èn Freund's volledig adjuvans en opnieuw na vier weken met onvolledig Freund's adjuvans. Aanvullingsinjecties worden vervolgens tweemaal gegeven met tussentijden van 3 weken. Drie weken na de laatste aanvullingsinjectie wordt bloed 20 afgenomen en het serum wordt getest op specificiteit en titer door middel van ELISA, immunovlekvorming (western blotting technique) en immuno-kleuring (immunostaining technique).
Voorbeeld III
Bereiding en karakterisering van monoklonale antilichamen 25 BALB/C-muizen worden geïmmuniseerd met 100 Ug partieel gezuiverd HT- 1080-enzym in volledig Freund's adjuvans en tweemaal geherimmuniseerd met 50 ug antigeen, met tussentijden van 3 weken. De titers van antiserums worden getest 3 weken na de laatste injectie en daar deze bevredigend zijn (verdunning £ 1:500) als bepaald door ELISA krijgen de dieren 30 intraveneus 50 Ug antigeen toegediend. Vier dagen later wordt de hybridisatie uitgevoerd volgens Kohier en Milstein (Nature, 256, 496, 1975). Geïmmuniseerde milt-cellen uit twee muizen worden gefuseerd met NS-1- of overeenkomstige myeloom-cellen en de gefuseerde cellen worden opgebracht op microtiterplaten met 96 holten in een hoeveelheid van ongeveer 2x10^ 35 cellen per holte en muizeperitoneumcellen (macrofagen) worden gebruikt
O
als voercellen (6x10°). De cellen worden gekweekt in een selectief HAT-medium (DMEM dat 1 0-/t M hypoxanthine, 10“^ M aminopeptine, 1,6x10^ M en 20% FCS bevat) gedurende 3-4 weken. Dit medium maakt het alleen de 8401616 - 8 - hybridecellen mogelijk te groeien. De cellen worden met ELISA getest op antilichaamproduktie en gewoonlijk zijn ongeveer 10% van de holten positief. De specificiteit van de antilichamen wordt ook getest door middel van immunovlekvorming (western blotting technique) en immunologische 5 kleuring (immunological staining).
De ELISA-methode wordt uitgevoerd onder toepassing van microtiter-platen met 96 holten. Ongeveer 50-100 ng antigeen wordt in elk van de holten gebracht en gedroogd. Vrije bindingsplaatsen worden geblokkeerd door incubatie gedurende 30 min. met 50 pi 1% FCS en de holten worden 10 gewassen met PBS. Hybride-vloeistoffen als antiserums worden vervolgens toegevoegd aan de holten (50 μΐ) en geïncubeerd. Na wassen met PBS wordt 50 μ 1 gebiotinyleerde paarde/antimuis-IgG-oplossing die 1% FCS bevat toegevoegd en 30 min. geïncubeerd gevolgd door wassing met PBS. Daarna wordt een avidine-biotine-peroxidase-reagens toegevoegd en geïncubeerd. Daarna 15. wordt het peroxidase-substraat (0,01% o-dianisidine, 0,01% H202 in PBS) toegevoegd en wordt de gevormde bruine kleur gemeten in een Titertek Multiscan spectrofotometer.
i De immunovlekvorming (western blotting technique) kan worden toege past om de antilichamen beter te karakteriseren omdat deze precies laat 20 zien met welke polypeptideketens het antilichaam reageert. Het antigeen of een eiwitmengsel dat het antigeen bevat wordt eerst gescheiden door middel van een 10% natriumsulfaat-polyacrylamide-gelelektroforese, waarna de eiwitten horizontaal op een nitrocellulosevel tot vlekvorming worden gebracht (blotted) onder toepassing van een stroom van 0,1 A gedurende 25 een nacht. Het vel wordt vervolgens gekleurd met een heparine-toluïdine-kleuroplossing. De eiwit bevattende nitrocellulosestrips werden vervolgens uitgesneden en de kleur verwijderd met een oplossing (50% ethanol,
8% azijnzuur, 42% water). De immunokleuring van de strips wordt vervolgens uitgevoerd met dezelfde methode als toegepast in de ELISA. Positieve 30 antilichamen geven slechts een bruine kleur van het antigeen, maar opgemerkt dient te worden dat men indien het antilichaam tegen tertiaire structuur van het antigeen gericht is een negatief resultaat kan verkrijgen doordat de eiwitten zijn gedenatureerd tijdens de gelelektroforese. Voorbeeld IV
35 Immunokleuring van type-IV-collagenase
Konïjne-antiserum tegen gezuiverd muize-type-IV-collagenase werd gebruikt om de localisatie van het enzym in normaal borstweefsel en in kwaadaardig borstkankerweefsel bij de mens te bestuderen. Cryo-sneden met 8401616 - 9 - een dikte van 5 pm uit 10 normale borstweefelmonsters en 25 borstkanker-weefselmonsters werden voorgeïncubeerd met 1% FCS en daarna gewassen met PBS. Daarna werd het antiserum, verdunning 1:50, gedurende 2 uur bij 20°C geïncubeerd met de monsters, gevolgd door wassen met PBS. De sneden 5 werden vervolgens een nacht bij 4°C geïncubeerd met FITC-geconjugeerd geite-antikonijn-serum, en gewassen met PBS. Vervolgens werd de fluorescentie bestudeerd. De resultaten lieten zien dat geen van de normale monsters werd gekleurd, terwijl alle 25 kankerweefsels een duidelijke fluorescentie gaven. De kleuring was het sterkst in het front van de 10 invasieve tumoren en tussen de 10 en de 80% van de tumorcellen waren positief.
Monoklonale antilichamen tegen menselijk HT-1080-sarcoomcel-type-IV-collagenase werden gebruikt om gekweekte HT-1080-cellen, menselijke borstcarcinoomcellen (MCF-7) en menselijke huidfibroplasten te kleuren.
15 De cellen werden gekweekt op dekstroken tot subconfluentie en gefixeerd met methanol bij -20°C gedurende 10 min. De cellen werden vervolgens voorgeïncubeerd met 1% FCS en gewassen met PBS waarna ze 2 uur bij 20°C werden geïncubeerd met de muize-antilichamen en gewassen. Daarna werden de cellen 30 min geïncubeerd met gebiotinyleerde paarde/antimuis-IgG, 20 gewassen en geïncubeerd met een avidine-biotine-peroxidase-reagens. Tenslotte werden de cellen geïncubeerd met het peroxidase-substraat. De antilichamen gaven een heldere kleuring van de kwaadaardige HT-1080- en MCF-7-cellen, terwijl de fibroplasten negatief waren.
De beide voorbeelden van immunokleuring geven aan dat men met de 25 antilichamen tegen type-IV-collagenase kwaadaardige tumorcellen met invasieve eigenchappen kan aantonen.
Ofschoon de onderhavige uitvinding is beschreven aan de hand van bepaalde toelichtende voorbeelden dienen deze niet als beperkend voor de beschermingsomvang te worden uitgelegd.
8401616

Claims (9)

  1. 2. Enzym-preparaten volgens conclusie 1, met het kenmerk dat deze gemerkt zijn met geschikte markeermiddelen.
  2. 3. Enzym-preparaten volgens conclusie 1 en 2, met het kenmerk dat deze gehecht zijn aan geschikte vaste dragers.
  3. 4. Antilichaampreparaten, met het kenmerk dat deze polyklonale anti-10 lichamen tegenover de type-IV-collagenase-enzym-antigenen omvatten.
  4. 5. Antilichaampreparaten, met het kenmerk dat deze monoklonale anti-lichamen tegenover de type-IV-collagenase-enzym-antigenen omvatten.
  5. 6. Antilichaampreparaten volgens conclusie 4 en 5, met het kenmerk dat deze gemerkt zijn met geschikte markeermiddelen. 15 7· Antilichaampreparaten volgens conclusie 4, 5 en 6, met het ken merk dat deze gehecht zijn aan geschikte vaste dragers.
  6. 8. Immunologische werkwijzen voor het aantonen van kwaadaardige cellen met metastatische celactiviteit, met het kenmerk dat de type-IV-collagenase-enzym-antigenen worden bepaald in biologische monsters. 20 9· Immunologische werkwijzen volgens conclusie 8, met het kenmerk dat de type-IV-collagenase-enzym-antigenen worden bepaald door competitieve immunochemische bepaling (competitive immunoassay).
  7. 10. Immunologische werkwijzen volgens conclusie 8 en 9, met het kenmerk dat deze de volgende stappen omvatten: 25 (a) weefselsneden of cellen worden geüncubeerd met een eerste anti- lichaam dat specifiek is voor het genoemde type-IV-collagenase-enzym-antigeen; (b) men stelt het genoemde eerste antilichaam in staat zich te binden aan de genoemde enzym-antigenen; 30 (c) een tweede gemerkt antilichaam wordt toegevoegd aan het genoemde eerste antilichaam en het tweede gemerkte antilichaam bindt zich aan het genoemde eerste antilichaam, hetgeen wijst op de aanwezigheid van type- IV-collagenase-enzym-antigeen in het monster. II. Immunologische werkwijzen volgens conclusie 8 en 9, met het ken-35 merk dat deze de volgende stappen omvatten: (a) gemerkt type-IV-collagenase-enzym^-antigeen wordt geïncubeerd met een eerste antilichaam dat specifiek is voor het genoemde type-IV-colla-genase-enzym-antigeen in aanwezigheid van het te testen monster; 8401616 4 -It - (b) men laat de reactie plaatsvinden waardoor het type-IV-collagena-se-enzym-antigeen van het monster in competitie treedt met het gemerkte type-IV-collagenase-enzym-antigeen voor het antilichaam; (c) het gevormde antigeen-antilichaam-complex wordt afgescheiden; 5 (d) de hoeveelheid gemerkt type-IV-collagenase-enzym-antigeen in het complex of in de daarbovenstaande vloeistof wordt bepaald.
  8. 12. Werkwijzen volgens conclusie 8 en 9, met het kenmerk dat deze de volgende stappen omvatten: (a) antilichamen tegenover type-IV-collagenase-enzym-antigeen worden Ί0 gelncubeerd met het monster; (b) men stelt het type-IV-collagenase-enzym-antigeen in het monster in staat zich aan het antilichaam te binden; (c) een tweede antilichaam, dat zich bindt aan een andere plaats van het genoemde type-IV-collagenase-enzym-antigeen, wordt toegevoegd; 15 (d) de hoeveelheid gemerkt antilichaam die niet in staat is zich te binden aan het type-IV-collagenase-enzym-antigeen wordt gemeten.
  9. 13. Zuiveringswerkwijzen, met het kenmerk dat type-IV-collagenase-enzym-antigenen worden gezuiverd met behulp van antilichamen voor de genoemde type-IV-collagenase-enzym-antigenen, waarbij de genoemde anti- 20 lichamen aan geschikte vaste dragers zijn gehecht. 8401616
NL8401616A 1983-05-19 1984-05-18 Werkwijze voor het aan-tonen van kwaardaardige cellen, enzym- en antilichaam-preparaten die daarbij bruikbaar zijn, alsmede werkwijze voor het zuiveren van collagenase-enzym-antigenen. NL8401616A (nl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/496,230 US4677058A (en) 1983-05-19 1983-05-19 Detecting malignant cells with monoclonal antibodies specific to type IV collagenase enzyme
US49623083 1983-05-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL8401616A true NL8401616A (nl) 1984-12-17

Family

ID=23971775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8401616A NL8401616A (nl) 1983-05-19 1984-05-18 Werkwijze voor het aan-tonen van kwaardaardige cellen, enzym- en antilichaam-preparaten die daarbij bruikbaar zijn, alsmede werkwijze voor het zuiveren van collagenase-enzym-antigenen.

Country Status (26)

Country Link
US (1) US4677058A (nl)
JP (1) JPS602187A (nl)
AU (1) AU2808784A (nl)
BE (1) BE899663A (nl)
CA (1) CA1230052A (nl)
CH (1) CH668838A5 (nl)
DD (1) DD251208A5 (nl)
DE (1) DE3418625A1 (nl)
DK (1) DK243184A (nl)
ES (1) ES8605904A1 (nl)
FI (1) FI841897A (nl)
FR (1) FR2546302B1 (nl)
GB (1) GB2142030B (nl)
HU (1) HU195004B (nl)
IL (1) IL71802A0 (nl)
IT (1) IT1175842B (nl)
LU (1) LU85366A1 (nl)
NL (1) NL8401616A (nl)
NO (1) NO841993L (nl)
NZ (1) NZ208108A (nl)
PL (1) PL247745A1 (nl)
PT (1) PT78610B (nl)
RO (1) RO92427A (nl)
SE (1) SE8402703L (nl)
YU (1) YU86984A (nl)
ZA (1) ZA843539B (nl)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6294172B1 (en) 1983-08-12 2001-09-25 Dade Behring Marburg Gmbh Monoclonal antibodies with specificity for membrane-associated antigens
US4859581A (en) * 1986-03-10 1989-08-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Endoglycosidase assay
GB2209526B (en) * 1987-09-04 1992-06-03 Univ Washington Dna clone of human type iv collagenase
US4923818A (en) * 1987-09-04 1990-05-08 Washington University DNA clone of human type IV collagenase
US4876332A (en) * 1987-10-08 1989-10-24 Regents Of The Univeristy Of Minnesota Polypeptides with type IV collagen activity
US5280106A (en) * 1988-05-20 1994-01-18 Liotta Lance A Matrix metalloproteinase peptides: role in diagnosis and therapy
US5030555A (en) * 1988-09-12 1991-07-09 University Of Florida Membrane-strip reagent serodiagnostic apparatus and method
DE3909799A1 (de) 1989-03-24 1990-09-27 Behringwerke Ag Monoklonale antikoerper (mak) gegen tumorassoziierte antigene, ihre herstellung und verwendung
US4992537A (en) * 1989-05-15 1991-02-12 Washington University cDNA encoding 92-kDA type IV collagenase
ATE206129T1 (de) * 1989-10-18 2001-10-15 Us Health Herstellung und verwendung des menschlichen nm23- h2-proteins und dagegen gerichtete antikörper
CA2074507A1 (en) * 1990-01-26 1991-07-27 William G. Stetler-Stevenson Method for quantitatively measuring collagenase
WO1992020820A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Vanderbilt University Method to determine metastatic potential of tumor cells
US5324634A (en) * 1992-03-31 1994-06-28 The Research Foundation Of State University Of New York Diagnostic tests measuring gelatinase/inhibitor complexes for detection of aggressive and metastatic cancer
JP2673929B2 (ja) * 1993-04-12 1997-11-05 富士薬品工業株式会社 ヒト間質型コラゲナーゼと阻害剤との複合体の免疫学的定量法および臨床診断への応用
ATE485888T1 (de) * 2004-08-26 2010-11-15 Life Technologies Corp Elektrobenetzende abgabevorrichtungen und dazugehörige verfahren

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE343949B (nl) * 1966-06-02 1972-03-20 Pharmacia Ab
DE2363854C3 (de) * 1973-12-21 1980-01-03 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Substrat zur Proteinasebestimmung sowie dessen Herstellung
US4201763A (en) * 1975-10-09 1980-05-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Solid phase immunofluorescent assay method
DE3239410A1 (de) * 1981-10-27 1983-05-19 Hybritech Inc., 92121 San Diego, Calif. Monoklonale antikoerper zu tumorassoziiertem antigen, zusammensetzungen, welche diese enthalten und deren anwendung zum tumornachweis
US4424278A (en) * 1981-11-16 1984-01-03 Research Corporation Cancer detection procedure using an acyl carrier protein
US4443367A (en) * 1982-04-08 1984-04-17 Monsanto Company Peptide and peptolide substrates for mammalian collagenase

Also Published As

Publication number Publication date
ES8605904A1 (es) 1986-04-01
GB8411959D0 (en) 1984-06-13
FR2546302B1 (fr) 1988-03-04
HU195004B (en) 1988-03-28
BE899663A (fr) 1984-08-31
FR2546302A1 (fr) 1984-11-23
CH668838A5 (de) 1989-01-31
PT78610B (en) 1986-07-15
PT78610A (en) 1984-06-01
IT8420998A0 (it) 1984-05-18
NZ208108A (en) 1988-04-29
GB2142030A (en) 1985-01-09
RO92427A (ro) 1987-09-30
PL247745A1 (en) 1985-08-27
ZA843539B (en) 1985-07-31
DD251208A5 (de) 1987-11-04
GB2142030B (en) 1987-02-04
HUT34261A (en) 1985-02-28
SE8402703L (sv) 1984-11-20
JPS602187A (ja) 1985-01-08
AU2808784A (en) 1984-11-22
NO841993L (no) 1984-11-20
IT8420998A1 (it) 1985-11-18
US4677058A (en) 1987-06-30
FI841897A (fi) 1984-11-20
IL71802A0 (en) 1984-09-30
IT1175842B (it) 1987-07-15
ES532597A0 (es) 1986-04-01
YU86984A (en) 1991-01-28
CA1230052A (en) 1987-12-08
DK243184D0 (da) 1984-05-17
DE3418625A1 (de) 1984-11-22
FI841897A0 (fi) 1984-05-11
DK243184A (da) 1984-11-20
SE8402703D0 (sv) 1984-05-18
LU85366A1 (fr) 1984-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4894326A (en) Monoclonal antibody defining oncofetal structure of fibronectin
US4935343A (en) Monoclonal antibodies for interleukin-1β
NL8401616A (nl) Werkwijze voor het aan-tonen van kwaardaardige cellen, enzym- en antilichaam-preparaten die daarbij bruikbaar zijn, alsmede werkwijze voor het zuiveren van collagenase-enzym-antigenen.
Gordon et al. An enzyme-linked immunosorbent assay for cancer procoagulant and its potential as a new tumor marker
KR100202773B1 (ko) 프로트롬빈 활성화 펩타이드 및 그것의 분해생성물에 대한 모노클론 항체 및 면역 분석법
JP2959837B2 (ja) 癌関連ハプトグロビン
EP2884277B1 (en) Method and immunoassay reagent for measuring PIVKA-II
CA1251729A (en) In vitro diagnostic methods using monoclonal antibodies against connective tissue proteins
US5420012A (en) Method for the detection of reactive conditions
US7833726B2 (en) Antibody for assaying ADAMTS13 activity and method for assaying the activity
US5243029A (en) Oncofetal structure of fibronectin
US4816400A (en) Basement membrane collagen degrading enzyme and method of purifying same
KR960002740B1 (ko) 안티-트롬빈-결합물질 모노클로날 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 모노클로날 항체를 이용한 트롬빈-결합물질의 정제법 및 측정법
US4808528A (en) Antibody composition for the detection of malignant cells with metastatic cell activity
US5039611A (en) Monoclonal antibodies to superficial papillary bladder tumor cells
US4916055A (en) Detection of human cancer with a monoclonal antibody specific for antigen gp650
JP2864219B2 (ja) 遊離の活性型マトリックスメタロプロテアーゼ類の分別定量法
EP0248147A2 (en) Method of determining the presence of cancer cells
Donati et al. Monoclonal antibodies to human kidney gamma-glutamyltransferase
Hand et al. Absolute values of ras p21 defined by direct binding liquid competition radioimmunoassays
Kobayashi et al. Identification and characterization of a Kunitz‐type protease inhibitor in ascites fluid from patients with ovarian carcinoma
KR20010077769A (ko) 사람 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임들에대한 항체와 면역학적 제제 및 심장질환 진단키트
JPH11507014A (ja) 標識として用いる酵素の反応生成物に向けられた抗体を使用する免疫学的検定
EP0328372A2 (en) Method for determining antigen
WO2005058964A1 (ja) 修飾化バロシン含有タンパク質に対する抗体

Legal Events

Date Code Title Description
A85 Still pending on 85-01-01
CNR Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection)

Free format text: ORION-YHTYMAE OY. LANCE ALLEN LIOTTA EN -

CNR Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection)

Free format text: ORION-YHTYMAE OY TE ESPOO

BV The patent application has lapsed