PT78610B

PT78610B - Immunological methods for metastatic cell activity determination

Info

Publication number: PT78610B
Application number: PT78610A
Authority: PT
Original assignee: Tryggvason Karl; Liotta Lance A
Priority date: 1983-05-19
Filing date: 1984-05-18
Publication date: 1986-07-15
Also published as: ES8605904A1; GB8411959D0; FR2546302B1; HU195004B; BE899663A; FR2546302A1; CH668838A5; PT78610A; IT8420998A0; NZ208108A; GB2142030A; NL8401616A; RO92427A; PL247745A1; ZA843539B; DD251208A5; GB2142030B; HUT34261A; SE8402703L; JPS602187A

Description

Descrição da Técnica Anterior

Uma das principais caracteristi. cas de células malignas é invasão e a formação de metásta ses. Por conseguinte, os métodos para rápida detecção e para o controlo dos processos invasores têm valor clínico significativo. A formação de metástases é uma sequência de acontecimentos complexa, na qual as células malignas se separam do tumor primário, invadem o tecido adjacente, pe. netram nos canais linfáticos ou circulatórios, aderem e penetram na parede do vaso num local distante, invadem o tecido e, finalmente, proliferem para iniciar o foco metas, tático.

As células de tumor invasoras têm de penetrar em membranas de suporte em diversos pontos durante o processo de disseminação. As membranas de suporte são matrizes extracelulares, que formam uma folha contínua resistente, a qual separa células epiteliais, endoteliais e parenquimais de tecido conjuntivo intersticial. Estas estruturas são compostas por colagênio (tipo IV) e compo nentes não colagenosos como laminina, proteoglicano, enta

ctina e fibronectina. As membranas de suporte compreendem barreiras significativas para as células de tumor, e, por tanto, a sua degradação é uma fase importante no processo de metástase. Crê-se agora que este processo é facilitado por enzimas proteolíticas. Têm sido descritos níveis eleva dos de protease, por exemplo activadores plasminogéneos, catepsina B e L e enzimas de degradação proteoglicano, em extractos de tecido de tumor e meios de células de tumor cultivadas, e estas enzimas têm sido consideradas sondas prometedoras para medir o potencial invasor de células.

No entanto, não se determinou a correlação entre a liber tação das enzimas e a capacidade invasora de células malig nas. De facto, os activadores plasminogéneos são produzidos por muitas linhas de células que não têm propriedades inva soras. Além disso, visto que as proteases acima mencionadas não degradam colagénio tipo IV, não proporcionam meios su ficientes para as células de tumores atravessarem membranas de suporte.

Os requerentes demonstraram que as células de tumor libertam uma protease neutra, que esp_e cificamente degrada colagénio tipo IV, e elaboraram proces. sos para a purificação desta enzima até homogeneidade a partir de um tumor de ratinho metastático (Liotta et al.,

J. Natl. Câncer Inst., 58? 1427-1451, 1977; Liotta et al., í Proc. Natl. Acad. Sei., 78? 2268-2272, 1978? Saio et al.,

The Journal of Biological Chemistry, 258, pp. 5058-5065, 1985) e a partir de células de tumor humano cultivadas também. Os requerentes mostraram também que a actividade desta enzima, na presente denominada colagenase tipo IV, ) está correlacionada com o potencial metastático de células de tumor (Liotta et al., Nature 284. 67-68, 1980).

Visto que foi demonstrado que o antigénio enzima colagenase tipo IV é utilizável para de. monstrar células malignas com natureza metastática, a enzima

pode ter grande valor de diagnóstico. No entanto, a medi, ção da actividade de colagenase tipo IV não pode ser feita em fluidos biológicos, por exemplo fluidos corporais, ex tractos de tecido ou secções de tecido, devido à grande quantidade de inibidores de protease nessas amostras.

Sumário do Invento

0 objecto do presente invento é proporcionar processos para a detecção células de tumor maligno com actividade celular metastática por meio de determinação imunológica de antigénio enzima colagenase tipo IV em amostras biológicas, por exemplo fluidos cor porais, extractos de tecido, secções de tecido, culturas de orgãos e células, meios de cultura, etc. Outro objecto do presente invento é proporcionar composições, que com preendem antigénio enzima colagenase tipo IV muito purifi cada marcado e não marcado e anticorpos policlonais ou monoclonais marcados ou não marcados do referido antigénio enzima colagenase tipo IV.

Descrição Pormenorizada do Invento

Os processos para a purificação e caracterização do antigénio colagenase tipo IV a partir de células capazes de penetrar em membranas de suporte, especialmente provenientes de células de tumor maligno, de uma premissa obrigatória da realização da presente inven ção. Os requerentes descobriram a colagenase tipo IV e elaboraram processos para a purificação e caracterização deste antigénio (Liotta et al., J. Natl. Câncer Inst..

58, 1427-1451, 1977» Liotta et al., Proc. Natl. Acad. Sei.

76, 2268-2272; Saio et al., The Journal of Biological Chemistry, 258, pp. 5058-5065, 1985); Saio et al.,

J, Biol. Chem., 1983). Para a medição de actividade de co lagenase tipo IV, utiliza-se percolagénio tipo IV marcado radioactivamente como substrato, sendo este substrato pre parado por um processo elaborado pelos inventores (Tryggvasjm et al., Bioçhemistry, 19, 1284-1289, 1980). Esta experiên cia de actividade é necessária para determinar o grau de purificação durante fases separadas do processo de purifi cação. Por este processo, pode determinar-se a actividade enzima em meios de cultura de orgão ou célula isentos de soro.

Pode obter-se enzima colagenase tipo IV a partir de meios de cultura de orgão isenta de soro de tecido de tumor maligno ou meios de células de tumor cultivadas. As peças de tecido ou células são geral mente cultivadas in vitro durante cinco dias e os meios são colhidos diariamente. A proteína meio que contém o an tigénio colagenase tipo IV é precipitada com sulfato de amónio e passada em seguida por várias colunas de cromato grafia conforme descrito nos exemplos esclarecedores apre sentados adiante.

0 antigénio colagenase tipo IV purificado tem um peso molecular de cerca de 70.000, e, quando estudado por electroforese de gel, é constituído por duas cadeias polipeptídicas que têm um peso molecular de 62.000 e 68.000. 0 antigénio enzima colagenase tipo IV tem necessidade de activação proteolítica para desenvolver actividade máxima e tem um pH óptimo de 7,4. 0 antigénio enzima colagenase tipo IV é uma enzima dependente de metal e precisa de cálcio para ter actividade. 0 antigénio enzima é especifico e não degrada colagénio intersticial dos ti pos I, II ou III, outros componentes de membrana de suporte ou caseína.

0 isolamento e purificação do

antigénio enzima colagenese tipo IV torna possível a produ ção de anticorpos especifcos para o referido antigénio enzi ma. A produção destes anticorpos possibilita a elaboração de processos imunológicos sensitivos para detectar activi dade células metastática pela determinação qualitativa ou quantitativa dos antigénios colagenese tipo IV em amostras biológicas, por exemplo fluidos corporais, extractos de tecido, secções de tecido, culturas de células ou orgãos, meios de cultura, etc.

Pode fazer-se a preparação de anti-soros, anticorpos policlonais e monoclonais, por pro cessos já estabelecidos. Para a preparação de anti-soros, injecta-se o antigénio colagenese tipo IV purificado várias vezes subcutaneamente em animais de experiência, por exem

«Ml !

pio coelbos ou cobaias, e, depois de um período de tempo apropriado, extrai-se o soro do(s) animal(is). A presença dos anticorpos específicos no anti-soro é depois determi nada por meio de técnicas, por exemplo a experiência imuno absorvente ligada de enzima (EISLA), a técnica de imunoman cha ocidental e processos de coloração imunológica, que são conhecidos pelos técnicos da especialidade.

í

i

Produziram-se anti-soros para o antigénio colagenese tipo IV murino por processos elabora dos pelos requerentes. Estes anti-soros reagem com o anti i génio de ratinho conforme evidenciado por técnicos de imu nomancha, EISLA e imunofluorescência.

1

Para a preparação de anti-soro convencional, o antigénio enzima colagenese tipo IV tem de ser uma proteína muito pura e homogénea. É extremamente difícil obter quantidades suficientes de antigénio colage. nese tipo IV humano absolutamente puro para produzir anti-soros convencionais em coelhos e cobaias. A fim de resol ver este problema, utilizámos o processo de KShler e

Milstein (N ature, 256, 496, 1975) para preparar anticorpos monoclonais. Uma vantagem deste método é que o antigénio não precisa de ser absolutamente puro, porque os clones de células produtoras de anticorpo especifico (híbridos) podem ser escolhidos em condições in vitro.

Segundo o processo mencionado acima, imunizaram-se ratinhos BALB/C duas vezes subcutânea, mente com 100 vg de colagenese tipo IV muito purificada, isolada a partir de meios de cultura de células fibrossar coma humanas. Passadas seis semanas, os anti-soros foram | experimentados com o processo EISLA. Se os resultados apu rados tivessem sido satisfatórios, os ratinhos foram imuni i zados mais uma vez intravenosamente com uma quantidade apropriada de antigénio colagenase tipo IV. Seguidamente hibridizaram-se e cultivaram-se células de baço provenien tes de dois ratinhos imunizados e células mieloma de ra tinho (NS-1) de acordo com técnica convencional em placas microtituladoras. Em 455 observações, 46 foram positivas para anticorpos determinados pelo processo EISLA. '

í

(

Pelo processo descrito acima, '

!

encontraram-se 10 linhas híbridas apropriadas. Estas 10 linhas híbridas eram muito positivas para células de fi brossarcoma humano maligno e células de carcinoma do seio mas apenas fracamente reagente com fibroblastos de pele i humana normal. Três daquelas 10 linhas de células híbridas í que tiveram os títulos maiores, foram escolhidas para clona' ção in vitro pela técnica de diluição e para a produção de anticorpos monoclonais.

í

I

i

Os anticorpos policlonais e

monoclonais para o antigénio colagenase tipo IV, produzidos isolados e purificados conforme se descreveu anteriormente podem ser marcados com marcas radioactivas, enzimaticas ou

fluorescentes apropriadas por processos convencionais, que

os técnicos da especialidade conhecem.

! i

| Estes referidos anticorpos poli,

clonais e monoclonais e antigénio colagenase tipo IV, mar cados e não marcados, podem ser unidos a portadores sóli dos apropriados e utilizados nos processos imunologicos i

que fazem parte da presente invenção. ί

í

! De acordo com os processos para i

! a detecção de células malignas com actividade celular me

ii _z

! tastatica, a presença do antigénio enzima colagenase tipo j; IV é determinada em amostras biológicas, por exemplo flui ! dos corporais, extractos e cortes de tecido, etc. com pro !; cessos imunológicos convencionais com a ajuda de composi !

ções antigénio enzima colagenase tipo IV marcadas ou não , marcadas, ligadas ou não ligadas e de composições anticor

í po policlonais ou monoclonais, marcadas ou não marcadas,

! ligadas ou não ligadas.

Nos processos imunológicos,

í utilizou-se anti-soro de coelho para determinar a preseu j! ça de antigénio colagenase tipo IV. Conforme foi demonstra

do pelo processo de mancha ocidental, o anti-soro manchou j duas proteínas na região 62 K e 68 K, que corresponde ao

antigénio enzima colagenase tipo IV purificado. Por outro lado, utilizou-se o anti-soro para mancha imunológica de tecidos de seio canceroso e seio normal humanos. Incubaram-se primeiro criosecções dos tecidos com o anti-soro e depois com EITC-conjugado IgG anticoelho. Os resultados mostraram que de 10 amostras de tecido normal, nenhuma deu uma fluorescência positiva, isto é, não continham o antigé nio colagenase tipo IV. Em contrapartida, 25 das 25 amostras de tecido de cancro do seio mostraram fluorescência intensa na região da borda do tumor. Por conseguinte, os processos imunológicos descritos na presente invenção podem detectar a presença de células de tumor maligno em tecidos, e,

visto que a mancha foi observada principalmente na borda do tumor, é evidente que o antigénio colagenese tipo IV é enriquecido em células invasoras.

Utilizaram-se anticorpos para antigénio enzima colagenese tipo IV humano produzidos a partir de clones híbridos de ratinho para a coloração imu nológica de células cultivadas. As células estudadas foram fibrossarcoma humano (HT - 1080), células de carcinoma do seio (MCF-7) e fibroplastos de pele humana normal. As célu las foram cultivadas em placas de microtitulação e incuba das com os anticorpos. As placas foram seguidamente lavadas e incubadas com cavalo biotinilado anti-ratinho IgG/IgM e lavadas. Em seguida, adicionaram-se reagentes avidin-bio tin-peroxidase para colorir os complexos de imunoglobulina de ratinho-imunoglobulinha anti-ratinho unidos às células. Os resultados mostraram que as células HT-1080 e MCF-7 malignas ficaram coloridas, enquanto que não o ficaram os fibroplastos de pele normal. Assim, é evidente que se podem utilizar anticorpos monoclonais para colagenese tipo IV humana, a fim de diferenciar células malignas que contêm o antigénio enzima colagenese tipo IV de células normais que não contêm o referido antigénio enzima.

A presente invenção é descrita de maneira mais pormenorizada nos exemplos que se seguem.

-10-

EXEKPLO 1

Isolamento de antigénio colagenase tipo IV

Para a preparação de colagenase tipo IV de ratinho, cultivam-se primeiro tumores PMT em ratinhos G^7B1/6J» Depois de cerca de duas semanas de cres. cimento, extirpam-se os tumores, picam-se e incubam-se num meio EPMI-1640 livre de soro como culturas de orgãos duran te cindo dias. 0 meio é colhido todos os dias e precipita-se a sua proteína com sulfato de amónio (25-60% de satura ção). Dissolve-se o precipitado no amortecedor de enzima (0,05M Tris-HCl, pH 7£, 0,2M NaCl, 10 mM Ca01₂) e passa-se através de uma coluna de concanavalina-agarose A à qual a maior parte da actividade enzima fica ligada. A actividade ligada é eluída com 1 M X-metil manosídeo e passada numa coluna de colagénio tipo IV. 0 colagénio uni do à coluna é extraído da matriz de membrana de suporte EHS que forma tumor e é purificado e contém cadeias cola génio tipo IV intactas (185 2 e 175 E). A fim de evitar a degradação da colagénio-agarose pela enzima, os amorte. cedores não contêm CaCl₂ durante aquela passagem pela ço luna. A actividade enzima é eluída a partir da coluna com amortecedor de enzima que contém 1M NaCl ou etileno glicol a 50%. A purificação final da enzima obtém-se por crivo molecular, por exemplo, Bio-Gel A 0,5 m, onde migra com um peso molecular aparente de cerca de 160.000. A en zima purificada desta maneira contém duas cadeias polipep. tídeo com pesos moleculares 68 E e 62 E.

A actividade colagenase tipo

IV humana prepara-se da mesma maneira que a enzima murino a partir de meios sem soro e células fibrossarcoma humanas cultivadas (HT-1080). As células são cultivadas em meio de Eagle modificado Dulbeccos (MEMD) que contém confluência fetal a 10% em soro de vitela em garrafas rotativas após

o que se muda o meio para o mesmo meio sem soro. 0 meio é colhido diariamente durante 5 dias.

EXEMPLO 2

Preparação de anti-soro -para colagenase tipo IV de ratinho

Injecta-se o antigénio (100-200 i^g) subcutaneamente em volumes iguais de solução saturada de cloreto de sédio amortecida com fosfato (SAP) e adjuvante completo de Preund e de novo depois de decorri dos quatro semanas com adjuvante incompleto de Preund. Aplicam-se depois injecções de reforço, duas vezes com três semanas de intervalo. Exrfcrai-se sangue três semanas depois do último reforço e experimenta-se o soro para determinar a especialidade e o título por meio de técnicas EISLA, mancha ocidental e imunomancha.

PTOTPLO 5

Preparação e caracterização de anticorpos monoclonais

Imunizaram-se ratinhos BALB/C com 100 pg de enzima HT-1080 parcialmente purificada em adjuvante de Preund completo, e reimunizados duas vezes com 50 FS de antigénio, com intervalos de três semanas.

Os títulos de anti-soros são determinados três semanas depois da última injecção, e, se os títulos forem satis. fatórios (diluição 1:500), determinados por EISLA, apli cam-se 50 qg de antigénio aos animais, por via intravenosa. Quatro dias depois procede-se à hibridação de acordo com Kohler e Milstein (Nature, 256, 496, 1975). Pundem-se çé lulas de baço imunizadas de dois ratinhos, com IíS-1 ou células mieloma correspondentes e as células fundidas são

aplicadas em placas microtítulo abertura 96 e cerca de 2 x 10 células/abertura e utilizam-se células de peritoneu de ratinho (macrój^gos) como células alimentares (6 x 10¾. As células são cultivadas num meio HAT selectivo (DMEM que contém 10""^M hipoxantina, 10“? M aminopeptina, 1,6 x x 10¾ e PGS a 20%) durante 3-4 semanas. Este meio apenas permite que cresçam as células híbridas. As células são experimentadas quanto a produção de anticorpo com EISLA, e, em geral, cerca de 10% das aberturas são positivas. Determina-se também a especificidade dos anticorpos por meio da técnica de mancha ocidental e coloração imunológiea

Aplica-se o método EISLA utili zando placas microtítulo abertura 96. Em cada abertura ço locam-se cerca de 50-100 ng de antigénio e secam-se. ί

Obstruem-se locais de ligação livre por meio de incubação i durante 30 minutos com 50 μΐ de PCS a 1% e lavam-se as aberturas com PBS. Flutuantes híbridos como anti-soros são seguidamente adicionados às aberturas (50 v.1) e incubados. Depois de lavagem com PBS, adicionam-se 50 μΐ de solução IgG anti-ratinho de cavalo biotinilado que contém PGS a 1% e incubam-se durante 30 minutos, seguindo-se uma lava gem com PBS. Depois disso, junta-se o substrato peroxidase (õ-dianisidina 0,01%, H2O2 0,01% em PBS) e a cor castanha que se forma é medida num espectrofotómetro Titertek Multiscan.

Pode aplicar-se a técnica de mancha ocidental para caracterizar melhor os anticorpos porque esta técnica mostra exactamente com quais cadeias polipétidas 0 anticorpo reage. Separa-se primeiro 0 anti génio ou uma mistura de proteínas que contém 0 antigénio numa electroforese de gel poliacrilamida sulfato dodecilo desédio a 10%, após 0 que as proteínas são aplicadas hori zontalmente a uma folha de nitrocelulose utilizando corren te de 0,1 A até ao dia seguinte. A folha é depois colorida

com uma soluçãocorante de heparina-toluidina. As tiras de nitrocelulose que contêm proteína são depois cortadas e a cor é retirada com uma solução (etanol 50%» ácido acé tico 8%, água 42%). Efectua-se a seguir a imunomancha das tiras com o mesmo método utilizado no EISLA. Os anticorpos positivos dão uma oor castanha apenas do antigénio, mas deve observar-se que se o anticorpo for dirigido contra estrutura terciária do antigénio, poderá obter-se um resul tado negativo porque as proteínas são desnaturadas durante a electroforese de gel.

EXEMPLO 4

Imunomancha de colagenese tipo IV

Utilizou-se anti-soro de coelho

para colagenese tipo IV de ratinho purificada, para estudar

a localização da enzima em tecidos humanos de seio normal

e de cancro de seio maligno. Incubaram-se previamente crio

secções (5 ym de espessura) de 10 amostras de tecido de

seio normal e 25 amostras de tecido de cancro de seio, utili

zando POS a 1%, e em seguida, lavaram-se com PBS. Depois

disso incubou-se com as amostras o anti-soro, diluição 1:50

durante 2 horas à temperatura de 2O⁰C, seguindo-se a lavage4

com PBS. As secções foram depois incubadas com soro anti

coelho cabra conjugado PITO à temperatura de 420 até ao dia *

seguinte e lavadas com PBS. Estudou-se em seguida a fluores. cência. Os resultados mostraram que nenhum dos tecidos nor mais ficou manchado, ao passo que todos os 25 tecidos can cerosos apresentaram uma fluorescência néitida. A coloração tinha a maior intensidade na borda anterior de tumores inva sores e eram positivas 10-80% das células de tumor.

Utilizaram-se anticorpos monoclonais contra colagenase tipo IV de célula de sarcoma HT-1080 para

colorir células ΞΤ-1080 cultivadas, células de carcinoma de seio humano (MCT-7) θ fibroplastos de pele humana. As células foram cultivadas sobre tiras de cobertura até sub confluência e fixadas com metanol à temperatura de -2020 durante 10 minutos. As células foram depois submetidas a incubação prévia com FOS a 1% e lavadas com PBS, após o que foram incubadas com os anticorpos de ratinho durante 2 horas à temperatura de 2020 e lavadas. Seguidamente, in cubaram-se as células durante 50 minutos, com IgG anti-ra tinho de cavalo biotinilado, lavaram-se e incubaram-se com um reagente avidina-biotina-peroxidase. Finalmente, incubaram-se as células com o substrato peroxidase. Os an ticorpos deram uma coloração nítida das células HT-1080 e MCF-7 malignas, ao passo que os fibroplastos foram negati. vos.

Ambos os exemplos de imunomancha indicam que os anticorpos para colagenase tipo IV podem detectgr células de tumor mâigno com propriedades invaso. rãs.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a alguns exemplos descritivos diversas modificações e variantes, abrangidas no espieLto e no âmbito da invenção serão evidentes para os técnicos da especialidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

lâ. - Processo para a preparação de enzimas de degradação de colagénio de membranas de su porte", utilizáveis na detecção de células malignas com actividade metastática, caracterizado por se incluir na enzima antigenes de enaLma colagenase tipo IV purificada com um peso molecular de cerca de 70.000 e duas cadeias polipe. ptídicas, com um peso molecular de cerca de 62.000 e 68.000 determinado por electroforese de gel.
2δ. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a enzima ser uma protei nase metálica e o substrato ser colagénio tipo IV.

5^. - Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2 caracterizado por os antigenes de en zima colagenase tipo IV purificada estarem marcados com uma marca apropriada.
4ã. - Processo para a preparação de composições de anticorpos utilizáveis na detecção de células malignas com actividade celular metastática, caraça terizado por se incluir nas referidas composições anticor pos específicos para antigenes de enzima colagenase tipo rv.
5^. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se incluir nas composi ções de anticorpos, anti-soro recolhido a partir de soro sanguíneo de animais, que foram previamente inoculados com antigenes de enzima colagenase tipo IV purificada.
6&. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se incluir nas referidas

,16-

composições de anticorpos, anticorpos monoclonais para os referidos antigenes de enzima colagenase tipo IV.
7â. - Processo de acordo com as reivindicações 4, 5 θ 6? caracterizado por os referidos anticorpos estarem marcados com marcas apropriadas.

I
8^. - Processo de acordo com as i reivindicações 4, 5» 6 e 7 caracterizado por os referidos i anticorpos estarem ligados a veículos sólidos apropriados.
9&. - Método imunológico utilizável j na detecção de células malignas com actividade celular i metastática, caracterizado por compreender a determinação i j de antigenes de enzima colagenase tipo IV em amostras bio j

lógicas por meio de anticorpos para os referidos antigenes de enzima colagenase tipo IV.

reivindicação 9» estarem marcados
10^. - Método de acordo caracterizado por os referidos com marcas apropriadas.

com a anticorpos
11§=. - Método de acordo com as reivindicações 9 θ 10, caracterizado por os referidos anticorpos estarem ligados a um veículo sólido apropriado.
12â. - Método imunológico utilizá vel na detecção de células malignas com actividade celular metastática, caracterizado por compreender a determinação de antigene de enzima colagenase tipo IV por meio de uma experiencia de imunidade competitiva em que se utilizam antigenes do enzima colagenase tipo IV marcados.
13». - Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por os antigenes de enzima colagenase tipo IV estarem ligados a veículos sólidos apro

-17[0

priados
14ã. - Método de marcação imunoljó gico utilizável na detecção de células malignas com activi dade celular metastática por meio de determinação de antige de enzima colagenase tipo IV em amostras biológicas, carac. terizado por compreender os passos seguintes:

ne

(a) incubação de secções ou células de tecidos com um primeiro anticorpo especifico para os referidos antigenes de enzima colagenase tipo IV;

(b) deixar que os referidos primeiros anticorpos se

i

liguem com o referido antigene de enzima; e !

!

I

(c) adição de um segundo anticorpo marcado ao referido primeiro anticorpo, anticorpo marcado este que se ligará com o referido primeiro anticorpo, indicando assim a presen

I

ça de antigene de enzima colagenase na amostra. !
15^â· - Método imunológico utiliza vel para a detecção de células malignas com actividade celular metastática por meio de determinação de antigene de enzima colagenase tipo IV em amostras biológicas, carac terizado por compreender os passos seguintes: ι

(a) incubação de antigene de enzima colagenase tipo IV com um primeiro anticorpo especifico para o referido antigene de enzima colagenase tipo IV em presença da amos, tra a submeter a experiência;

(b) permitir que se faça a reacção pela qual o antigene de enzima colagenase tipo IV da amostra competirá com o antigene de enzima colagenase tipo IV marcado para o anti corpo;

(c) separação do complexo antigene-anticorpo assim

-18formado; e

í

(d) determinação da quantidade de antigene de enzima ; colagenase tipo IV marcado no complexo ou no sobrenadante.
16ã. - Método imunolégico utiliza vel na detecção de células malignas com actividades célulai res metastáticas por meio da determinação de antigene de enzima colagenase tipo IV em amostras biológicas”, carac, terizado por compreender os passos seguintes:

(a) incubação de anticorpos para antigenes de enzima |

colagenase tipo IV com uma amostra; {

I

I

I

(b) deixar que o antigene de enima colagenase tipo IV ' contido na amostra se ligue com o anticorpo;

i

(c) adição de um segundo anticorpo marcado que se |

ligará com um local diferente do referido antigene de I

enzima colagenase tipo IV; e

(d) medição da quantidade de anticorpo marcado não |

capaz de se ligar com o antigene de enzima colagenase ί

tipo IV. i
17&. - Método de purificação, carac terizado por os antigenes de enzima colagenase tipo IV sere purificados por meio de anticorpos para os referidos anti genes de enzima colagenase tipo IV, estando os referidos anticorpos ligados a veículos sólidos apropriados.

AGENTE OFICIAL OA PROPRIEDADE INDUSTRIAI Rua Victor Cordon, 10-A-l.° LISBOA