HU195004B - Method for detecting metastatic activity of cell - Google Patents

Method for detecting metastatic activity of cell Download PDF

Info

Publication number
HU195004B
HU195004B HU841936A HU193684A HU195004B HU 195004 B HU195004 B HU 195004B HU 841936 A HU841936 A HU 841936A HU 193684 A HU193684 A HU 193684A HU 195004 B HU195004 B HU 195004B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antigen
type
collagenase
antibody
cells
Prior art date
Application number
HU841936A
Other languages
German (de)
English (en)
Other versions
HUT34261A (en
Inventor
Karl Tryggvason
Lance A Liotta
Original Assignee
Orion Yhtymae Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orion Yhtymae Oy filed Critical Orion Yhtymae Oy
Publication of HUT34261A publication Critical patent/HUT34261A/hu
Publication of HU195004B publication Critical patent/HU195004B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
    • G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y10S436/813—Cancer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás a metasztatikus sejtaktivitás kimutatására IV. típusú kollagénéi antigén immunológiai meghatározásával a fenti enzim antigén poliklonális és monoklonális antitesteinek felhasználásával. A 5 találmány további tárgya jelzett vagy jelzetlen antigént és a fenti antigén jelzett vagy jelzetlen poliklonális és monoklonális antitesteit tartalmazó készítmény.
A rosszindulatú daganatos sejtek egyik fő 10 jellemzője, hogy gyorsan terjednek és az elsődleges daganatos góc elsodródott sejtjeiből máshol új, másodlagos daganat alakul ki (metasztázia).
Ennek megfelelően a terjedést folyamatok 15 korai kimutatására és ellenőrzésére szolgáló eljárásoknak igen nagy a klinikai jelentőségük.
A metasztázia kialakulása egymást kővető események komplexuma, amikor is a rosszin- 20 dulatú sejtek elszakadnak az elsődleges tumorról, elözönlik a szomszédos szövetet, behatolnak a nyirok- vagy keringési csatornákba, egy távolabbi helyen a véredény falához kapcsolódnak és áthatolnak rajta, elözönlik 25 a szövetet, és végül elszaporodnak és létrehozzák a metasztatikus fókuszt.
A betörő rákos sejteknek számos helyen át keli hatolniuk az alapmembránokon a terjedési folyamat alatt. Az alapmembrán olyan 30 extracelluláris állomány, amely folytonos, ellenálló réteget képez, elválasztva az epiteliális, endoteliális és parenchimális sejteket a sejtközi kötőszövettől. Ezek a membránok IV. típusú· kollagénből és nem kollagén kompo- 35 nensekből, például lamininből, proteoglikanból, entaktinból és fibronektinből állnak. Az alapmembránok komoly akadályt jelentenek a rákos sejtek számára, ezért a lebomlásuk fontos lépcsőt jelent a metasztázis folyamán. 40 Feltételezhető, hogy ezt a folyamatot a proteolitikus enzimek elősegítik. A proteázokról, például a plazminogen aktivátorokról, a katepszin B és D-röl és proteoglikan lebontó enzimekről leírták, hogy mind a rákos sző- 45 vetek extraktumában, mind a tenyésztett rákos sejtek tápközegében egyaránt megnővekedett mennyiségben vannak jelen, és ezeknek az enzimeknek a révén szándékozták a sejtek elterjedési potenciálját mérni. Azon- 50 bán az enzimek felszabadulása és a rosszindulatú sejtek elterjedést készsége közötti korrelációt nem sikerült igazolni. Valójában sokféle, elterjedési készséggel nem rendelkező sejtvonal termel plazminogén aktivátoro- 55 kát. Továbbá, mivel a fentiekben említett proteázok nem bontják a IV. típusú kollagént, nem teremtenek megfelelő lehetőséget a rákos sejtek számára az alapmembránokon való áthaladásra. 60
Kísérleteink során felismertük, hogy a rákos sejtek semleges proteázt termelnek, amely specifikusan bontja le a IV. típusú kollagént; és eljárásokat is kidolgoztunk ennek az enzimnek metasztatikus egér tumorból és 65 2 tenyésztett emberi rákos sejtekből, homogén állapotban való előállítására (Liotta és társai. J. Natl. Cancer Inst., 58, 1427—1431, 1977; Liotta és társai, Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 2268—2272, 1978; Salo és társai, The Journal of Biological Chemistry, 258, 3058—3063, 1983). Azt is kimutattuk, hogy ennek az enzimnek az aktivitása, amelyet a továbbiakban IV. típusú kollagenáznak nevezünk, a rákos sejtek metasztatikus potenciáljával korrelációban áll (Liotta és társai, Natúré, 284, 67—68, 1980).
Mivel bebizonyítottuk, hogy a IV. típusú kollagenáz enzim antigén megfelelő a metasztatikus természetű rosszindulatú sejtek kimutatására, az enzimnek nagy diagnosztikai jelentősége lehet. Azonban a IV. kollagenáz aktivitás mérése nem végezhető el biológiai folyadékokban, például testfolyadékokban, szövetextraktumokban vagy szövetmetszetekben, mivel az ilyen minták nagy menynyiségű proteáz inhibitort tartalmaznak.
A találmány tárgya eljárás rosszindulatú, metasztatikus sejtaktivitással rendelkező tumorsejtek kimutatására a IV. típusú kollagenáz enzim antigén immunológiai meghatározásával biológiai mintákban, például testfolyadékokban, szövetextraktumokban, szövetmetszetekben, szerv- és sejtkultúrákban és tenyészközegekben. A találmány további tárgyát olyan készítmények képezik, amelyek jelzett és jelzetlen, nagymértékben tisztított
IV. típusú kollagenáz enzim antigént és jelzett vagy jelzetten, IV. típusú kollagenáz enzim antigén elleni poliklonális és monoklonális antitesteket tartalmaznak.
A találmány megvalósításához nélkülözhetetlen, hogy eljárásokat dolgozzunk ki az alapmembránon áthatolni képes, különösen tumorsejtekben megtalálható IV. típusú kollagenáz enzim antigén tisztítására és azonosítására. Felfedeztük a IV. típusú kollagenáz antigént és módszereket dolgoztunk ki ennek az antigénnek a tisztítására és azonosítására (Ljotta és társai, J. Natl. Cancer, Inst. 58, 1427—1431; Liotta és társai, Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 2268—2272; Salo és társai, The Journal of Biological Chemistry, 258, 3058—63, 1983; Salo és társai, J. Bio. Chem. 1983). A IV. típusú kollagenáz aktivitás mérésére rádioaktivitással jelzett IV. típusú prokollagént használtunk szubsztrátként, amelyet korábban kidolgozott módszerünk szerint állítottunk elő (Tryggvason és társai, Biochemistry, 19, 1284—89, 1980). Ez az aktivitásvizsgálat szükséges ahhoz, hogy meghatározzuk a tisztítási eljárás különböző lépcsőiben a tisztasági fokot. Ezzel a módszerrel az enzimaktivitás szérummentes szervvagy sejttenyészet tápközegében meghatározható.
A IV. típusú kollagenáz enzimet rosszindulatú tumorszövet szérummentes szervtenyészetének tápközegéből vagy tenyésztett tumor sejtek tápközegéből nyerhetjük. A szö-2195004 vetdarabokat vagy sejteket általában in vitro 5 napig tenyésztjük, és a tápközeget naponta összegyűjtjük. A IV. típusú kollagenáz antigént tartalmazó tápkőzeg proteintjét ainmónium-szulfáttal csapjuk ki, és több egymást követő kromatográfiás oszlopra visszük fel, mint azt a kiviteli példákban leírjuk.
A tisztított IV. típusú kollagenáz enzim móltőmege 70000 körüli érték, gélelektroforézissel vizsgálva két, 62 000, 111. 68000 móltőmegű polipeptid-láncból áll. A IV. típusú kollagenáz enzimet proteolitikusan aktiválni kell a maximális aktivitás elérése céljából, és pH optimuma 7,4. A IV. típusú kollagenáz enzim aktivitásának kifejtéséhez kalcium jelenléte szükséges. Az enzim specifikus, és nem bontja az I., II. vagy III. típusú kötőszövet kollagéneket, más alapmembrán komponenseket vagy kazeint.
A IV. típusú kollagenáz enzim antigén elkülönítésével és tisztításával lehetőség nyílik a fenti enzim antigén specifikus antitestjeinek előállítására. Az ilyen antitestek előállítása lehetőséget termet a metasztatikus sejtaktivitás érzékeny immunológiai módszerekkel való mérésére a biológiai mintákban, például a testfolyadékokban, szövetextraktumokban, szövetmetszetekben, sejt- vagy szervtenyészetekben, tenyészközegekben a IV. típusú kollagenáz antigének kvalitatív vagy kvantitatív meghatározásával.
Az antiszérumok, a poliklonális és monoklonális antitestek előállítására már korábban ismert módszereket használhatunk. Az antiszérum előállításra tisztított IV. típusú kollagenáz antigént többször szubkután injektáljuk kísérleti állatokba, például nyulakba vagy tengerimalacokba, és megfelelő idő elteltével a szérumot kivonjuk az állat (ok)bői. Az antiszérumban jelenlévő specifikus antitestek jelenlétét ismert módszerekkel, például enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA), a Western immunoelkenési technikával és immunológiai foltvizsgálatokkal határozhatjuk meg. Ezek a módszerek az adott területen jártas szakember számára jól ismertek.
A murintípusú IV. kollagenáz antigén antiszérumának előállítására az általunk kidolgozott módszert alkalmazhatjuk. Az antiszérum reagál az egér antigénjével, mint azt az immunoelkenési, ELISA és immunofluoreszcens vizsgálatok mutatják.
A hagyományos antiszérum előállítására a
IV. típusú kollagenáz antigénnek nagytisztaságú és homogén proteinnek kell lennie. Különlegesen nehéz megfelelő mennyiségű, abszolút tiszta, humán IV. típusú kollagenáz antigént előállítani hagyományos antiszérum nyulakban vagy tengerimalacokban való előállítása céljából. A probléma megoldására Köhler és Milstein (Natúré, 256, 496, 1975) módszerét alkalmaztuk inonoklonális antitestek előállítására. Az eljárás előnye, hogy az antigénnek nem kell teljesen tisztának lennie, mivel a specifikus antitestet termelő sejt kiónokat (hibrideket) in vitro körülmények között választhatjuk ki.
A fentiekben ismertetett módszer szerint BALB/C egereket kétszer szubkután immunizáltunk 100 pg nagy tisztaságú IV. típusú kollagenázzal, melyet emberi fibroszarkómás sejtek tápközegéből nyertünk. Hat hét elteltével az antiszérumot az ELISA mó'dszer segítségével vizsgáltuk. Ha a kapott eredmények kielégítőek voltak, az egereket mégegyszer intravénásán immunizáltuk IV. típusú kollagenáz antigén megfelelő mennyiségével. Ezután két immunizált egér lépsejtjeit és egér mieloma sejteket (NS—1) hibridizáltunk és a hagyományos módszerrel mikrotiter lapokon tenyésztettünk. A 453 mintából 46 mutatott az antitestre nézve pozitív reakciót az ELISA módszerrel vizsgálva.
A fentiekben ismertetett módszerrel 10 megfelelő hibrid vonalat kaptunk. Ez a 10 hibrid vonal nagymértékben pozitív volt rosszindulatú emberi fibroszarkóma és mell karcinoma sejtekre nézve, de csak gyengén reagáltak normális emberi bőr fibroblasztokkal. A 10-ből a 3 legnagyobb titerértékkel rendelkező hibrid sejtvonalat választottuk ki hígítási technikával végzett in vitro klónozásra, és monoklonális antitestek előállítására.
A fentiekben ismertetett módon előállított, elkülönített és tisztított IV. típusú kollagenáz antigén monoklonális és poliklonális antitestjeit megfelelő radioaktív, enzimatikus vagy fluoreszcens jelekkel szokványos módon jelölhetjük meg, amely módszerek az adott területen jártas szakember számára ismertek.
Ezeket a IV. típusú kollagenáz antigén elleni, poliklonális és monoklonális, jelzett és jelzetlen antitesteket megfelelő szilárd hordozókhoz köthetjük, és a találmány szerinti eljárásokban alkalmazhatjuk.
A rosszindulatú, metasztatikus sejtaktivitással rendelkező sejtek kimutatására szolgáló módszereink szerint a IV. típusú kollagenáz enzim antigén jelenlétét biológiai mintákban, például testfolyadékokban, szövetextraktumokban és -metszetekben, stb. hagyományos immunológiai módszerekkel határozzuk meg jelzett vagy jelzetlen, kötött vagy megkötetlen IV. típusú kollagenáz enzim antigén készítmények, valamint jelzett vagy jelzetlen, kötött vagy megkötetlen, poliklonális vagy monoklonális antitest készítmények segítségével.
Az immunológiai módszerekben nyúl antiszérumot használtunk a IV. típusú kollagenáz antigén jelenlétének meghatározására. Mint azt a Western elkenéses vizsgálat kimutatta, az antiszérum két proteint fest meg a 62 K és a 68 K területen, amely a tisztított IV. típusú kollagenáz enzim antigénnek felel meg. Továbbá az antiszérumot az emberi mellrák és normális mellszövetek immunológiai festésére is használtuk. A szövetek krioszekcióit először az antiszérummal, majd 3
-3195004
FITC-val (fluoreszecín-izotiocianát, Sigma gyártmány) konjugált anti-nyúl IgG-vel inkubáltuk. Az eredmények azt mutatták, hogy 10 normális szövetmintából egyik sem adott pozitív eredményt fluoreszcencia módszerrel 5 vizsgálva, vagyis nem tartalmaztak IV. típusú kollagenáz antigént. Másrészt 25 mellrákos szövetmintából 25 intenzív fluoreszcenciát mutatott a tumor határának szélein. Ennek megfelelően a leírásban ismertetett im- 10 munológiai módszerek rosszindulatú tumorsejtek jelenlétét ki tudják mutatni a szövetekben, és mivel a festés elsősorban a tumor határoló részein volt látható, nyilvánvaló, hogy a IV. típusú kollagenáz antigén az el- 15 terjedési készséggel rendelkező sejtekben dúsul fel.
Az emberi IV. típusú kollagenáz enzim antigén antitesteket, melyeket egér hibrid klónőkből állítottunk elő, használtuk tenyésztett sejtek immunológiai megfestéséhez. A következő sejteket tanulmányoztuk: emberi fibroszarkóma (HT—1080), mellrák karcinoma sejtek (MFC—-7) és normál emberi bőr fib- 2g roblasztok. A sejteket mikrotiter lapokon tenyésztettük antitestekkel együtt inkubálva, majd mostuk, és biotinilált ló antiegér IgG—IgM-mel inkubáltuk, majd megint mostuk. Ezután avidin-biotin-peroxidáz reagenst adtunk hozzá, hogy megfessük a sejtekhez 30 kötött egér imtnunoglobulin-antiegér immunoglobulin komplexeket. Az eredmények azt mutatták, hogy a rosszindulatú HT—1080 és MCF-»-7 sejtek megfestődtek, míg a normális 3g bőr fibroblasztok nem. így tehát nyilvánvaló, hogy az emberi, IV. típusú kollagenáz monokionális antitestjei megfelelnek arra, hogy a IV. típusú kollagenáz enzim antigén tartalmú rosszindulatú sejteket megkülönböztessük 40 az egészséges, a fenti enzim antigént nem tartalmazó normál sejtektől.
A találmány szerinti megoldást az alábbi példákkal ismertetjük anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk.
1. PÉLDA
A IV. típusú kollagenáz antigén izolálása
A IV. típusú egér kollagenáz előállítására először metasztatikus PMT tumorokat (átül- 50 tethető szarkoma, amely T241 fibroszarkomával rendelkező egér tüdöáttétjéböl származik) neveltünk C57B1/6J egerekben (fekete egerek/Jackson Labs. Bar Harbor, Maine, Amerikai Egyesült Államok). Kb. 2 hetes növesz- 55 tés után a tumorokat kimetszettük, feldaraboltuk és szérummentes RPMI—1640 (Gibco Labs. gyártmány) közegben mint szervkultúrában inkubáltuk őket 5 napon keresztül. A tápközeget naponta összegyűjtőt- θθ tűk, és a proteintartalmát ammónium-szulfáttal (25—60 %-os telítettség) kicsaptuk. A csapadékot enzim-pufferben (0,05 M trisz-sósav; pH = 7,4; 0,2 M nátrium-klorid; 10 millimól/l kalcium-klorid) oldottuk és concanavalin-A-agaróz (Sigma C6904 gyártmány) 65 4 oszlopon vezettük keresztül, így a legtöbb aktív enzimet megkötöttük. A megkötött enzimeket 1 M-os α-metil-mannoziddal eluáltuk, és egy agarózhoz kötött IV. típusú kollagént tartalmazó oszlopon vezettük keresztül. Az oszlophoz kötődött kollagént, amely érintetlen IV. típusú kollagén láncokat tartalmaz (185K és 175K), EHS-tumorból extraháltuk és tisztítottuk. Az EHS-tumor alapmembránt képez, amelyből IV. típusú kollagén extrahálható. Az EHS-tumor átültethető, murin petefészek tumor, amelyet először Swarm R. H. ismertetett »Transplantation of a murine chondrosarkoma in mice of different inbred etrains« című irodalmi helyen (J. Nati. Cancer, Inst., 31, 953—975 /1963/). A kollagén-agaróz enzim általi lebontását elkerülendő az oszlopon való átfutás ideje alatt a puffer kalcium-kloridtól mentes volt. Az aktív enzimeket az oszlopról 1 M nátrium-kloridot vagy 50 % etilén-glikolt tartalmazó enzim pufferral eluáltuk. Az enzim végső tisztítását molekulaszitán (Bio-Gel A, 0,5 m) végeztük, ahol az enzim kb. 160000 látszólagos móltömeggel vándorol. A kapott tisztított enzim két, 68 K és 62 K móltömegű polipeptid-láncot tartalmaz.
A IV. típusú emberi kollagenáz aktivitású enzimet, a murin enzim előállításához hasonlóan tenyésztett emberi fibroszarkóma sejtek (HT—1080) szérummentes tápközegéböl állítottuk elő. A sejteket Dulbecco által módosított Eagleféle tápközegben (DMEM) tenyésztettük, amely 10%-os magzati szérumot is tartalmazó borjúszérumot tartalmazott. A tenyésztést hengeres üvegekben végeztük, majd a közeget ugyanolyan, szérummentes közegre cseréltük le. A közeget naponta, 5 napon keresztül gyűjtöttük.
2. PÉLDA
A IV. típusú egér kollagenáz elleni antiszérum előállítása
100—200 pg fenti antigént egyenlő térfogatú foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) és Freund-féle komplett adjuvánssal, majd 4 hét elteltével Freund-féle inkomplett adjuvánssal szubkután injektáltuk egerekbe. 3 hetes időközökben ezután kétszer további injekciókat adtunk. 3 héttel az utolsó adag után a vért lecsapoltuk, és a szérumot specifikusság és titerérték szempontjából ELISA, Western elkenési és immunofestési technikák segítségével megvizsgáltuk.
3. PÉLDA
Monoklonális antitestek előállítása és meghatározása
BALB/C egereket 100 pg részlegesen tisztított, komplett Freund-féle adjuvánsban lévő, HT—1080 által termelt kollagenáz enzimmel immunizáltuk, és kétszer 50 pg ugyanilyen enzimmel reimmunizáltuk 3 hetes időközökben. Négy nappal később Köhler és Milstein (Natúré, 256, 496, 1975) módszere
-4Ί alapján a hibridizációt végrehajtottuk. Két egérből származó immunizált lépsejteket NS—1 sejtekkel (murin mieloma sejtvonal, amelyet lép limfociták nem pusztuló partnere standard forrásaként használnak) vagy megfelelő mieloma sejtekkel fuzionáltunk, és a fuzionált sejteket 96 bemélyedést tartalmazó mikrotiter lapokra helyeztük úgy, hogy kb. 2X105 sejt került egy mélyedésbe, és egér peritoneum sejteket (makrofágokat) használtunk táplálék sejtekként (6X103). A sejteket szelektív HAT-közegben (DMEM, mely 10~4 M hipoxantint, 10-7 M 1-amino-pentánt, 1,6X 10~5 M timidint, 20 %-os FCS-t tartalmaz) tenyésztettük 3—4 héten keresztül. Ez a közeg csak a hibrid sejteket engedi növekedni. A sejteket ELISA módszerrel vizsgáltuk az antitest-képzés szempontjából és általában a mélyedések 10 %-a volt pozitív. Az antitestek specifitását a Western elkenési technikával és immunológiai festéssel is vizsgáltuk.
Az ELISA-elj árast 96 mélyedést tartalmazó mikrotiter-lapon hajtottuk végre. Minden mélyedésbe kb. 50—100 ng antigént helyeztünk és megszárítottuk. A szabad kötőhelyeket 50 pl 1 %-os FCS-sel 30 percig való inkubálással blokkoltuk, és a mélyedéseket PBS-sel mostuk. Antiszérumként 50 pl hibrid szupernatánst adtunk a mélyedésekbe' é$ inkubáltuk. PBS-sel való mosás után 50 pl 1 % FCS-t tartalmazó biotinilált ló anti-egér IgG oldatot (forgalmazza: JCN Immunobiologicals, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) adtunk hozzá, és 30 percig inkubáltuk, majd PBS-sel mostuk. Ezután avidin-biotin-peroxidáz reagenst (forgalmazza: JCN Immunobiologicals, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) adtunk hozzá és inkubáltuk. Ezután a peroxidáz-szubsztrátot (0,1 % o-dianizidint, 0,01 % hidrogén-peroxidot tartalmazó PBS) adtunk hozzá, és a képződött barna színt Titertek Multiscan spektrofotométerrel vizsgáltuk.
A Western elkenési technika jobban használható az antitestek jellemzésére, mivel pontosan kimutatja, mely polipeptid-lánccal reagál az antitest. Az antigént vagy az antigént tartalmazó protein keveréket először 10%-os nátrium-dodecil-szulfát poliakril-amid-gélen való elektroforézissel választottuk el, majd a proteineket horizontálisan egy nitrocellulóz lapon futtattuk 0,1 A áramot használva egy éjszakán keresztül. Ezután a lapot heparín-toluidin festékoldattal (Gibco Labs. gyártmány) festettük meg. A proteint tartalmazó nitrocellulóz csíkokat ezután kivágtuk, és a színt 50 % etanolt, 8 % ecetsav.at és 42 % vizet tartalmazó eleggyel eltávolítottuk. A csíkok immunfestési vizsgálatát azután az ELISA módszerben alkalmazotthoz hasonló módon végeztük el. A pozitív antitestek csak az antigén barna színét eredményezték, de meg kell jegyeznünk, hogy amennyiben az antitest egy antigén tercier szerkezet ellen irányul, negatív eredményeket kaphatunk, mivel a proteinek a gél elektroforézis alatt denaturálódnak.
4. PÉLDA
A IV. típusú kollagenáz immunofestése
Tisztított IV. típusú egér kollagenáz elleni nyúl antiszérumot alkalmaztunk ahhoz, hogy az enzim lokalizációját tanulmányozzuk normális és rosszindulatú emberi mellrákos szövetekben, 10 normális mellszövet mintából és 25 mellrákos szövetmintából vett 5 pm vastag krioszekciókat előinkubáltunk 1 %-os FCS-sel, majd PBS-sel mostuk. Ezután az antiszérum l:50-re hígított oldatát inkubáltuk a, mintákkal 2 órán keresztül 20 “’Con, majd PBS-sel mostuk. Ezután a metszeteket FITC-cel (fluoreszcein-izotíocianát, Sigma-gyártmány) konjugált kecske antinyűl szérummal inkubáltuk egy éjszakán keresztül 4°C-on, és PBS-sel mostuk, majd megvizsgáltuk a fluoreszcenciát. Az eredmények azt mutatták, hogy a normális szövetek egyike sem festődött meg, míg a 25 rákos szövet mindegyike tiszta fluoreszcenciát mutatott. A festó'dés az elterjedési készséggel rendelkező tumorok szélső részén volt a legintenzívebb, és a tumor sejtek 10—80 %-a pozitív volt.
Humán HT—1080 szarkóma IV. típusú kollagenáz elleni monoklonális antitesteket használtunk tenyésztett HT—1080 sejtek, emberi mellkarcinoma sejtek (MCF—7) és emberi bőr fibroblasztok megfestésére. A sejteket fedó'szalagon tenyésztettük szubkonfluencia eléréséig, és metanollal rögzítettük őket (—20’C hőmérséklet, 10 perc). A sejteket ezután előinkubáltuk 1 %-os FCS-sel, és PBS-sel mostuk, ezután az egér-IgG-antitestekkel 2 órán keresztül 20°C-on inkubáltuk, és mostuk. Ezután a sejteket 30 percig biotinilezett ló antiegér IgG-vel (forgalmazza: JCN Immunobiologicals, Amerikai Egyesült Államok) inkubáltuk, mostuk és avidin-biotin-peroxidáz reagenssel (forgalmazza: JCN Immunobiologicals, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) inkubáltuk. Végül a sejteket peroxidáz szubsztráttal inkubáltuk. Az antitestek jól láthatóan festették a rosszindulatú HT—1080 és MFC—7 sejteket, míg a fibroblasztok negatív eredményt mutattak.
Az immunofestésre vonatkozó mindkét példa jelzi, hogy a IV. típusú kollagenáz antitestjei képesek a rosszindulatú, elterjedési készséggel rendelkező rákos sejtek kimutatására.

Claims (5)

1. Eljárás monoklonális antitestek előállítására, amelyek specifikusan kötődnek IV. típusú kollagenáz enzim antigénhez, azzal jellemezve, hogy IV. típusú kollagenáz enzim antigénnel immunizált egerek lépéből készült sejtszuszpenziót egér mieloma sejtekkel fu5
-5195004 zionálunk, a sejteket olyan szelektív tápközegen tenyésztjük, amely a hibridoma sejtek növekedését gyorsítja, az antitest aktivitással rendelkező tenyészeteket kiválasztjuk, klónozzuk, tenyésztjük, és a tenyészet felülúszójából kinyerjük az antitestet.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy IV. típusú kollagenáz enzim antigénként tisztított IV. típusú kollagenáz enzim antigént alkalmazunk, amely lényegében két, 68000, illetve 62 000 molekulatömegü polipeptidláncból áll.
3. Eljárás metasztatikus sejtaktivitással rendelkező, rosszindulatú sejtek kimutatására, azzal jellemezve, hogy
a) a vizsgálandó biológiai mintához az 1. igénypont szerinti eljárással előállított monoklonális antitestet adunk, és mérjük az antigén — monoklonális antitest reakciót; vagy
b) a vizsgálandó biológiai mintához az 1. igénypont szerinti eljárással előállított monoklonális antitestet adunk és inkubáljuk, második, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított antitestet állítunk elő és jelzéssel látjuk el, a má5 sodik, jelzett antitestet a monoklonális antitestet tartalmazó biológiai mintához adjuk, és mérjük az antigén — monoklonális antitest — második, jelzett antitest reakciót; vagy 1θ c) a vizsgálandó biológiai mintához jelzett IV. típusú kollagenáz antigént és az 1. igénypont szerinti eljárással előállított monoklonális antitestet adunk, és mérjük az antigén — monoklonális
15 antitest, illetve a jelzett antigén — monoklonális antitest reakciót.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelzett monoklonális antitestet használunk.
5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szilárd hordozóhoz kötött monoklonális antitestet használunk.
HU841936A 1983-05-19 1984-05-18 Method for detecting metastatic activity of cell HU195004B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/496,230 US4677058A (en) 1983-05-19 1983-05-19 Detecting malignant cells with monoclonal antibodies specific to type IV collagenase enzyme

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT34261A HUT34261A (en) 1985-02-28
HU195004B true HU195004B (en) 1988-03-28

Family

ID=23971775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU841936A HU195004B (en) 1983-05-19 1984-05-18 Method for detecting metastatic activity of cell

Country Status (26)

Country Link
US (1) US4677058A (hu)
JP (1) JPS602187A (hu)
AU (1) AU2808784A (hu)
BE (1) BE899663A (hu)
CA (1) CA1230052A (hu)
CH (1) CH668838A5 (hu)
DD (1) DD251208A5 (hu)
DE (1) DE3418625A1 (hu)
DK (1) DK243184A (hu)
ES (1) ES8605904A1 (hu)
FI (1) FI841897A (hu)
FR (1) FR2546302B1 (hu)
GB (1) GB2142030B (hu)
HU (1) HU195004B (hu)
IL (1) IL71802A0 (hu)
IT (1) IT1175842B (hu)
LU (1) LU85366A1 (hu)
NL (1) NL8401616A (hu)
NO (1) NO841993L (hu)
NZ (1) NZ208108A (hu)
PL (1) PL247745A1 (hu)
PT (1) PT78610B (hu)
RO (1) RO92427A (hu)
SE (1) SE8402703L (hu)
YU (1) YU86984A (hu)
ZA (1) ZA843539B (hu)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6294172B1 (en) 1983-08-12 2001-09-25 Dade Behring Marburg Gmbh Monoclonal antibodies with specificity for membrane-associated antigens
US4859581A (en) * 1986-03-10 1989-08-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Endoglycosidase assay
US4923818A (en) * 1987-09-04 1990-05-08 Washington University DNA clone of human type IV collagenase
CA1339874C (en) * 1987-09-04 1998-05-19 Arthur Zanvel Eisen Dna clone of human type iv collagenase
US4876332A (en) * 1987-10-08 1989-10-24 Regents Of The Univeristy Of Minnesota Polypeptides with type IV collagen activity
US5280106A (en) * 1988-05-20 1994-01-18 Liotta Lance A Matrix metalloproteinase peptides: role in diagnosis and therapy
US5030555A (en) * 1988-09-12 1991-07-09 University Of Florida Membrane-strip reagent serodiagnostic apparatus and method
DE3909799A1 (de) * 1989-03-24 1990-09-27 Behringwerke Ag Monoklonale antikoerper (mak) gegen tumorassoziierte antigene, ihre herstellung und verwendung
US4992537A (en) * 1989-05-15 1991-02-12 Washington University cDNA encoding 92-kDA type IV collagenase
DE69033810T2 (de) * 1989-10-18 2002-03-28 Us Health Herstellung und verwendung des menschlichen nm23-h2-proteins und dagegen gerichtete antikörper
AU647459B2 (en) * 1990-01-26 1994-03-24 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The A method for quantitatively measuring collagenase
WO1992020820A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Vanderbilt University Method to determine metastatic potential of tumor cells
US5324634A (en) * 1992-03-31 1994-06-28 The Research Foundation Of State University Of New York Diagnostic tests measuring gelatinase/inhibitor complexes for detection of aggressive and metastatic cancer
JP2673929B2 (ja) * 1993-04-12 1997-11-05 富士薬品工業株式会社 ヒト間質型コラゲナーゼと阻害剤との複合体の免疫学的定量法および臨床診断への応用
US20060102477A1 (en) * 2004-08-26 2006-05-18 Applera Corporation Electrowetting dispensing devices and related methods

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE343949B (hu) * 1966-06-02 1972-03-20 Pharmacia Ab
DE2363854C3 (de) * 1973-12-21 1980-01-03 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Substrat zur Proteinasebestimmung sowie dessen Herstellung
US4201763A (en) * 1975-10-09 1980-05-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Solid phase immunofluorescent assay method
AT392004B (de) * 1981-10-27 1991-01-10 Hybritech Inc Verfahren zur herstellung eines monoklonalen antikoerpers gegen tumor-assoziiertes antigen und dessen verwendung
US4424278A (en) * 1981-11-16 1984-01-03 Research Corporation Cancer detection procedure using an acyl carrier protein
US4443367A (en) * 1982-04-08 1984-04-17 Monsanto Company Peptide and peptolide substrates for mammalian collagenase

Also Published As

Publication number Publication date
DE3418625A1 (de) 1984-11-22
JPS602187A (ja) 1985-01-08
RO92427A (ro) 1987-09-30
IL71802A0 (en) 1984-09-30
HUT34261A (en) 1985-02-28
FI841897A (fi) 1984-11-20
AU2808784A (en) 1984-11-22
NL8401616A (nl) 1984-12-17
GB2142030A (en) 1985-01-09
ES8605904A1 (es) 1986-04-01
ES532597A0 (es) 1986-04-01
FR2546302A1 (fr) 1984-11-23
YU86984A (en) 1991-01-28
PT78610A (en) 1984-06-01
DK243184D0 (da) 1984-05-17
NO841993L (no) 1984-11-20
CH668838A5 (de) 1989-01-31
GB8411959D0 (en) 1984-06-13
FR2546302B1 (fr) 1988-03-04
FI841897A0 (fi) 1984-05-11
NZ208108A (en) 1988-04-29
SE8402703L (sv) 1984-11-20
PL247745A1 (en) 1985-08-27
ZA843539B (en) 1985-07-31
GB2142030B (en) 1987-02-04
IT8420998A1 (it) 1985-11-18
BE899663A (fr) 1984-08-31
CA1230052A (en) 1987-12-08
DK243184A (da) 1984-11-20
DD251208A5 (de) 1987-11-04
IT8420998A0 (it) 1984-05-18
LU85366A1 (fr) 1984-11-19
US4677058A (en) 1987-06-30
PT78610B (en) 1986-07-15
IT1175842B (it) 1987-07-15
SE8402703D0 (sv) 1984-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4628027A (en) Vitro diagnostic methods using monoclonal antibodies against connective tissue proteins
Zamarron et al. Monoclonal antibodies specific for a conformationally altered state of fibrinogen
HU195004B (en) Method for detecting metastatic activity of cell
Sykes et al. Assignment of a type I collagen structural gene to human chromosome 7
US5767247A (en) Anti-annexin-V monoclonal antibodies, and preparation and use thereof
AU632535B2 (en) Cancer related haptoglobin (hpr)
EP0244473A1 (en) Method of assaying the presence of cancer cells
US4767843A (en) Monoclonal antibody to cardiac myosin heavy chain
US4816400A (en) Basement membrane collagen degrading enzyme and method of purifying same
Matsumoto et al. Increased Amount of Serum Type IV Colagen Peptide n Human Liver Fibrosis as Determined by Enzyme‐Immunoassay with MonoclonaI Antibodies
US4808528A (en) Antibody composition for the detection of malignant cells with metastatic cell activity
JPH02497A (ja) ヒト前立腺特異性抗原に対する抗体組成物
EP0460016B1 (en) Metastasis-associated collagenolytic metalloproteinases
US5298397A (en) Method of assaying d-vanillylmandelic acid
CA2109086A1 (en) Monoclonal antibodies specific for human thymidylate synthase
JP2712018B2 (ja) モノクローナル抗体
Roberts et al. Antibody to prolyl hydroxylase from rat skin and its cross-reactivity with enzyme from other species
HU203257B (en) Process for producing monoclonal antiurokinase antibodies and for cleaning and testing urokinase
JP3226942B2 (ja) スロンビンとスロンビン阻害物質とにより形成された複合体に対して向けられたモノクローナル抗体
JPS60253871A (ja) 抗アポａ−１抗体
JPH044880B2 (hu)
JPH05317086A (ja) カンジダ・アルビカンスの抗菌糸型抗体及び抗酵母型抗体