WO1995029403A1

WO1995029403A1 - Methode de dosage du recepteur de l'asialoglycoproteine et reactif de dosage prevu a cet effet

Info

Publication number: WO1995029403A1
Application number: PCT/JP1995/000770
Authority: WO
Inventors: Yoshiro Niitsu; Yutaka Kohgo; Junji Kato; Hirokazu Yago; Hisashi Hanada; Koji Ushizawa
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
Priority date: 1994-04-20
Filing date: 1995-04-19
Publication date: 1995-11-02
Also published as: DE69533586T2; JP3345507B2; ATE278193T1; EP0757250A1; DE69533586D1; EP0757250A4; EP0757250B1; US5843677A; JPH07287014A

Description

明細書ァシァログリコプロテインレセプターの測定法及びこれに用いる測定試薬技術分野

本発明は、肝細胞機能の判定に有効なァシァログリコプロテインレセプ夕一

(以下「A G P R」という）濃度を感度及び精度良く測定する方法、この方法を用いた治療薬のスクリ一ニング方法及びこの方法に用いる測定試薬に関する。背景技術

肝臓は人体の中で最大の実質臓器であり、物質代謝の中心的役割を演じているが、その主たる機能は、（ 1 ) 栄養素に関する中間代謝、すなわち腸管から吸収したあるいは末梢組織から動員した糖 ·脂肪酸 ·ァミノ酸の酸化や糖新生、脂質や蛋白の合成、貯蔵ならびに他臓器や末梢組織への供給；（2 ) 栄養素以外の各種の蛋白及びその前駆物質の代謝、すなわち体組織構成蛋白、血清蛋白、肝での代謝に関わる各種の酵素の合成など；（3 ) 外因性の薬物、内因性のホルモンやアンモニアなどの代謝産物の解毒、抱合、破壊、不活化；（4 ) 網内系機能としての異物の摂取、排出；（5 ) 胆汁生成に伴う排出、消化作用；（6 ) 水、電解質、ビタミン代謝による内部環境の維持など、多岐にわたっているそのために、肝の病変は全身的な物質代謝の異常を引き起こし、二次的に他臓器の障害を誘発して全身的に大きな影響を及ぼす。このため、肝疾患における肝機能を把握することは重要なことである。

また、最近の医療用器具の発達、肝臓切除術の進歩、肝臓の保存液の開発及び免疫抑制剤の開発に伴い、肝癌における肝臓切除や肝 5更変における肝臓移植が積極的に行われるようになってきている。従って、術後においても、肝機能を把握することは重要である。

従来、肝機能検査法としての生化学検査項目は、「肝機能検査の選択と組み合せの基準」として日本消化器病学会肝機能研究班によって提示され（日消会誌， 8 5巻， 1 2 1 0 - 1 2 1 4ページ， 1 9 8 8年）内科、外科において広く用いられている。

外科領域において、小沢らは、肝機能検査法として、肝ミトコンドリアの機能を無侵襲的に、かつより直接的に評価する方法、つまり動脈血中のケトン体比

(AK B R) により評価する方法が優れていることを明らかしている (G a s t r o e n t e r o l o gy, 7 6巻， 6 9 1 — 6 9 6ぺージ， 1 979年）。

しかしながら、従来の生化学検査項目は、肝特異性が低く肝外因子に影響されることが少なくない、また AKBRによる方法は、採血、検体の扱い、測定、デ一夕の解釈に各々注意すべき事項があり、好適な方法とは言い難い。このように、外科'領域において、術後の肝障害はかなりの高い頻度で発生することから、術後の予後の評価を行うことは重要であるが、これに適した検査方法はいまだ見出されていない。

また、内科領域において新津らは、肝疾患の診断法として、肝に特異性の高いァシァログリコプロテインレセプター（AGPR) を測定する方法が適している事を報告している（特開平 4一 356 1 98号公報）。

AG PRはガラクトース、 N—ァセチルガラクトサミン残基を認識するレクチン（Mo r e l l ら， J. B i o l . C h em. ， 2 4 6巻， 1 4 6 1— 1 467ページ， 1 971年）であり、肝実質細胞膜表面に存在する肝臓に特異性の高い膜糖蛋白質である（松浦ら， J. C e l l B i o l . ， 9 5巻， 864— 875ページ， 1 982年）。また、 AG PRのリガンドである¹²⁵ I - l ab e l e d a s i a l o o r o s omu c o i dを用いて、肝実質細胞膜表面上の A G P R量が、肝臓障害の程度とともに減少することが明らかにされている（沢村ら， G a s t r 0 e n t e r 0 1 0 g y , 8 7巻， 1 2 1 7— 1 221ページ， 1 984年）。

しかしながら、従来の AG PRの測定法は、検体中の AG PRを定量的に測定するのに十分な性能を有するものとは言えず、肝疾患を適切に診断することは困難であった。

一方、従来、安全で有効な治療薬をスクリーニングする方法としては、ターゲットとなる培養細胞又は培養肝細胞への治療薬の影響を各細胞の機能異常、機能回復等から判断する方法が用いられている。しかしながら、培養肝細胞における治療薬の影響の判断は、肝細胞の物質産生能、代謝、解毒作用等から行われているもののこれらの機能だけでは肝細胞の機能を十分に把握しているとは言えず、新たな治療薬の開発においてはこれらとは異なつた肝細胞の機能である細胞膜、ェンドサイトーシス等の変化を把握する簡便な方法が望まれていた。

このように、肝細胞機能を判定するために A G P Rの測定法を確立することが求められており、本出願人はモノクローナル抗体を用いた A G P Rの測定法を見出し、先に特許出願した（特開平 4— 3 5 6 1 9 8号公報）。しかしながら、更により高感度で精度の高い A G P Rの測定法が望まれていた。

従って、本発明の目的は、肝細胞機能、特に肝再生能の把握、アルコール性肝障害の検出及び治療薬の効果あるいは肝細胞への影響の判定に有効な A G P Rをより高感度でかつ精度良く測定するための方法を提供することにある。発明の開示

斯かる実情に鑑み本発明者らは鋭意研究を行つた結果、 A G P Rを認識するモノクロ—ナル抗体を被検体と接触させて免疫測定を行う際、検体希釈液の pH を 5〜 7にするか、又は酵素標識抗体溶液にフノールを含有せしめれば、 A G P Rを高感度かつ高精度で測定できることを見出し、本発明を完成した。更に、この方法を用い、培養肝細胞から放出される培養上清中の A G P Rを測定すれば、容易に治療薬のスクリーニングを行うことができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、 A G P Rを認識するモノクローナル抗体を被検体と接触させて免疫測定法により A G P Rを測定する方法において、検体希釈液の pHを 5 〜 7にすることを特徴とする A G P Rの測定法を提供するものである。

また、本発明は A G P Rを認識するモノクローナル抗体を被検体と接触させて免疫測定法により A G P Rを測定する方法において、酵素標識抗体溶液にフノ —ルを含有せしめることを特徴とする A G P Rの測定法を提供するものである。更に、本発明は A G P Rを認識ずるモノクローナル抗体を被検体と接触させて免疫測定法により A G P Rを測定する方法において、酵素標識抗体溶液にフエノ一ルを含有せしめ、かつ検体希釈液の PHを 5〜7にすることを特徴とする A G P Rの測定法を提供するものである。

更に本発明は上記の A GPRの測定法により肝細胞から放出される培養上清中のァシァログリコプロテインレセプターを測定することを特徴とする治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。

更にまた、本発明は AG PRを認識するモノクローナル抗体及びフエノールを含有する A G P Rの測定試薬を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、 pHの相違及びフエノールの有無による反応性を比較した図である。図 2は、肝臓切除後の AGPRの変化を示す図である。

図 3は、肝細胞培養上清中の AGPRの変化を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明に用いられる AGPRを認識するモノクローナル抗体（以下、 Γ抗 AGPRモノクローナル抗体」という）は、例えば次のようにして製造することができる。

免疫原としての AG PRは、公知の方法、例えば B a e n z i n g e rら (Jou r na l o f B i o. Che m. , 255巻， 4607 - 46 1 3 ページ， 1 980年）の方法に従って、ヒト剖検肝より調製することができる。すなわち、インフォームド ' コンセントを得たヒト剖検肝をホモジナイズし、遠心分離にて肝細胞膜画分を集め、この画分 1容に対し、コールドアセトン 9容程度を加えた後、不溶物をアセトンパウダーとして濾過回収する。このアセトンパゥダーから界面活性剤を含む緩衝液により A G P Rを抽出し、この抽出液に塩化カルシウムを加え、次いで D—ガラクト一スーァガロースゲルを用いたァフィ二テイク口マトグラフィ一に付せば、精製された AG PRを得ることができる。抗 AGPRモノクローナル抗体は、上記 AGPRを免疫原として使用し、既知の細胞融合手段によって調製することができる。すなわち、 AGPRをフロインドの完全アジュバント、あるいは結核菌の精製アジュバントであるトレハロース 95/00770

ジミコール酸及び低毒性リピッド Aを最適濃度に調製したアジュバント（リビーアジュバントシステム）等の適当なアジュバントに乳濁し、これを数週間おきにマウスの腹腔、皮下又は静脈に数回繰り返し免疫する。一定期間後、マウスの脾臓細胞をとり出し、これと、ヒポキサンチンーグァニン一ホスホリボシルトランスフエラーゼ欠損（H G P R T— ) あるいはチミジンキナーゼ欠損（T K— ) の様な適切なマーカーを持つマウス骨髄腫細胞とをポリェチレングリコール処理することによって多様なハイプリドーマ細胞を得る。このハイプリドーマ細胞の培養上清中に産出された抗体の A G P Rに対する反応性に基づいて、抗 A G P Rモノクロ一ナル抗体を産生するハイプリドーマをスクリーニングすることができる。目的めハイプリドーマを単クローンとするため、 9 6穴のマイクロウェルにフィ一ダーレィヤーとして正常な脾臓細胞又は胸腺細胞を 1 0 ⁶個/ゥエル蒔いた上にハイプリドーマを 1穴に 1〜1 0個となるように蒔き、生育してくるクローンについて再びスクリ一二ングを行う。このサブクロ一ニングを繰り返すことにより、単一性のハイブリドーマを得ることができる。

ハイプリドーマを培養する培地としては、ハイプリドーマの培養に適した培地であれば良く、好適には、 R P M I 1 6 4 0に牛胎児血清、 L一グルタミン、 L一ピルビン酸及び抗生物質（ベニシリン Gとストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。また、培養は、例えば 5重量％ (以下単に「％」という） C 0₂ 濃度、 3 7 °Cの条件下で 3日間行うのが好ましい。

モノクローナル抗体は、こうして選抜されたハイプリドーマより動物細胞培養の技術、又はマウス腹腔内での培養技術で得た培養液上清又はマゥス腹水を硫安塩析、イオン交換樹脂及び分子篩ゲルを用いたカラムクロマトグラフィー、プロティン A及びプロテイン Gを用いるァフィ二ティクロマトグラフィー等により精製することができる。得られたモノクローナル抗体め特異性は、例えばウェス夕ンブロッティング法により確認することができる。

ヒト検体中の A G P Rを定量するためには、このようにして得られる抗 A G P Rモノグローナル抗体の 1種又は 2種以上を用いて免疫学的測定法を実施すれば良い。免疫学的測定法としてはォクタロニー法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法、酵素免疫測定法、ラテックス免疫測定法、ラジオィムノアツセィ、フロロイムノアツセィなどを利用することができる。例えば酵素免疫測定法を使用する場合には、抗 AG PRモノクローナル抗体のいずれかを適当な緩衝液中で不溶性担体に固定化して不溶化抗体とし、別の抗 A G P Rモノクローナル抗体を酵素で標識し、これらを被検体と反応させ、第二の抗体に結合させた酵素の活性を測ることにより、ヒト AGPRを測定することができる。

ここで使用する不溶性担体としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの各種合成高分子、ガラス、シリコン、不溶性多糖（架橋デキストラン、ポリサッカライド）などが好ましく、これらの担体は球状、棒状、微粒子等の形状で、あるいは試験管、マイクロプレートなどの形態で用いることができる。なお、不溶化抗体作成の条件としては、球状、棒状、試験管、マイクロプレートの形態の場合又は微粒子の形態の場合、抗体濃度は各々 1〜 1 0 zg Ζτη又は 1 〜1

緩衝溶液はリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液などの弱酸性からアル力リ性のものを用い、反応時間は室温又は 4でで、 1時間〜 72時間で調製することが好ましい。

この後の洗浄に用いる洗浄液の組成は、 5〜1 0 OmM濃度のリン酸緩衝液、トリス緩衝液等の pH6〜 8の弱酸〜弱アルカリを用いることが好ましい。更に、非特異反応を回避するため、 5 0〜20 OmM濃度の塩化ナトリゥム、塩化力リゥム及び 0. 0 1〜0. 1 %の Twe e n 8 0、 Twe e n 20、 NP— 4 0などの界面活性剤を添加することが好ましい。また、酵素反応の阻害剤を除くため、 0. 1〜5raM濃度のキレート剤（EDTA等）を加えてもよい。

本発明で使用する酵素標識抗体は公知の方法によって作成することができ、例えば中根らの方法（N a k a n e, P. K. e t a 1. , J. H i s t o c h em C y t o c h em, 22, 1 0 84— 1 0 8 9, 1 9 74 ) あるいは石川らの方法（マレイミド法：「酵素免疫測定法第 3版」医学書院）に従い、断片化していない免疫グロブリン分子をそのままか、あるいは必要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解して F (a b' ) 2 、又は F a b' とした後、酵素で標識することができる。標識に使用する酵素としては、' ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、 j8— D—ガラクトシダーゼ、グルコースォキシダーゼなどが挙げられる。酵素標識抗体溶液の組成は、固相化抗体に結合した抗原と酵素標識抗体の種類により、それぞれ反応に適した条件（PH、緩衝液、蛋白質、塩、界面活性剤など）を適宜設定すればよい。例えば、緩衝液濃度、組成及び PHとしては、 1 0〜 5 0 OmM (特に 1 0〜 5 OmM) 濃度のリン酸緩衝液、 T r i s緩衝液、 ME S · B i s Tr i s ' ACES ' BES ' HEPES等の Go o d' s緩衝液などの pH6〜8の弱酸〜弱アルカリ（特に pH6. 5〜7. 5の B E S ) 性のものが挙げられる。

本発明において酵素標識抗体溶液には、全組成中に 0. 0 0 1〜 2%、特に 0. 0 1〜0. 1 %のフヱノールを添加すると、反応が促進されると共に酵素標識抗体の安定化を図ることができ好ましい。

また、酵素標識抗体溶液には、更に非特異反応の回避及び安定化の目的のため、 0. 1〜1 0%、特に 0. 1〜0. 5%の BSA、低脂肪ミルク、ゼラチン等の蛋白質、 20〜 1 0 0 0 πιΜ、特に 5 0〜20 OmMの塩化ナトリウム、塩化力リウム等の電解質、 0. 0 1〜0. 1 %の Twe e n 8 0、 Twe e n 2 0、 NP- 4 0等の界面活性剤等を添加することが好ましい。

標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルォキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素を用い、発色剤として 0—フヱニレンジァミン、 3, 3 ' , 5, 5 ' —テトラメチルベンチジン、 2， 2 ' —アジノジー（ 3—ェチルベンズチアゾリンスルホン酸）アンモニゥム塩等、酵素にアルカリフォスファタ一ゼを用いる場合は基質として、 p—二トロフエニルフォスフェート、 3— （4—メトキシスピ口 { 1 , 2—ジォキセタン一 2 ' ， 3—トリシクロー〔3. 3. 1. 1³' ⁷〕デカン } 一 4—ィル）フエニルフォスフエ一ト： AMPPD等、酵素に ^一 D—ガラクトシダーゼを用いる場合は基質として、 — D—ガラクトビラノシド、 4一メチ.ルゥンベリフェリル一；8— D—ガラクトビラノシド等、酵素にグルコースォキシダーゼを用いる場合はペルォキシダーゼの共存下で基質として、 /S— D—グルコース、発色剤としてペルォキシダ一ゼを用いることができる。

本発明測定法に用いる検体希釈液は、その pHが 5〜7、好ましくは 5. 5 〜6. 5の範囲であることが必要である。この pH値が 5未満又は 7を超えると測定感度が下がり好ましくない。被検体希釈液の組成は上記 PH範囲内で固相化抗体と抗原の種類により、各種緩衝液等を用いて適宜決定すればよい。ここで用いられる緩衝液としては、例えば 2 0〜 5 0 OmM (好ましくは 5 0〜2 0 0 mM) 濃度のクェン酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、リン酸緩衝液、 ME S · B i s Tr i s · ACES - BES等の Go o d' s緩衝液が挙げられる。更に、非特異反応の回避及び安定化の目的のため、 0. 1〜 1 0 % (好ましくは 1〜5 %) B S A、低脂肪ミルク、ゼラチンなどの蛋白質； 2 0〜 1 0 0 OmM (好ましくは 5 0〜20 OmM) 塩化ナトリウム、塩化力リウムなどの電解質； 0. 0 1〜 0. l %0Twe e n 8 0, Twe e n 20、 N P— 4 0などの界面活性剤等を添加することが好ましい。

免疫反応は、先ず第一反応で、不溶化抗体に被検体を接触させ、抗原を結合させて不溶化抗体一抗原複合体とし、第二反応で、これに酵素標識抗体を結合させて不溶化抗体一抗原一酵素標識抗体複合体とすることによって行われる。そして得られた複合体の酵素活性を測定することによって、被検体中の抗原（ヒト AG PR) の量を測定することができる。

本発明においては、酵素標識抗体溶液にフノールを含有せしめ、かつ検体希釈液の pHを 5〜 7にして測定すると、より高感度で精度良く A G P Rの濃度を測定することができる。

上記の AGPRの測定法を用いた治療薬のスクリーニングは、例えば肝細胞として初代培養肝細胞、肝細胞株及び薬物等でダメージを与えた肝細胞等を用い、各薬物の添加及び無添加の状態で肝細胞から培養上清中に放出されるあるいは肝細胞中の物質を比較することにより行うことができる。例えば培養上清中（血清を含む含まない両方の培地が利用できる）の AG PR量を測定することにより、肝 ¾3胞が活動している状態での膜の流動性、細胞膜物質のターンオーバー及びェンドサイトーシスに関連する細胞内機構の働きなどを把握できる。実施例

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 95/00770

参考例 1

AGPRの精製：

インフォームド ' コンセントを得たヒト剖検肝（胃癌で亡くなった患者） 1 80 gを細かく切り、 5mM EDTA、 1 mM フエ二ルメチルスルホニルフルォライドを含む 5 Om トリス塩酸緩衝液（以下「Tr i s— H C ^」とレ）う） (pH7. 8，洗浄液 1) で洗浄した後、洗浄液 1の 900 を用いてポリトロンプレンダ一にてホモジナイズした。懸濁液を 80 O xg、 1 0分間遠心し、上清を 1 00, 000 xg、 90分間遠心した。得られたペレットを精製水にて再懸濁後、 9倍量のコールドアセトンを加え、濾過にてアセトンパウダーを回収した。回収したアセトンパウダー 2 0 gを、 0. 2M N a C ^を含む 2 0mM T r i s - H C i (pH7. 8 ) で洗浄後、 0. 4 M K C ^、 1 % Tr i t on X— 1 00を含む 20mM T r i s -HC (pH7. 8) 300 で抽出した。抽出液を 1, 200 X g. 1 5分間遠心し、上清を回収し、終濃度 25mになるように C a C 2 を添加した後、 D—ガラクト一ス—ァガロースゲルに吸着させた。 AG PRは 1. 25M NaC_Jgを含む20mM 酢酸アンモニゥ厶（pH5. 1) にて溶出し、精製を行った。精製 AG PRの純度は約 90% であり、ローリー法の変法による蛋白定量により、濃度は.1 30 zg /v であつた。

参考例 2

モノクローナル抗体の調製：

(1) 免疫

参考例 1で精製した AG PRの 20 gを 1回の免疫に使用した。初回免疫はフロインドの完全アジュバントを用い、追加免疫ではフロインドの完全アジュバント及び不完全アジュバントの 1 ： 1の混合液を使用した。 AG PR 1 00 ^ とフロインドのアジュバント 1 00 / を混合し、得られたェマルジョン 200 〃 ^を 1回の免疫につき 1匹の BALBZc雄性マウスの腹腔に注射し、 4回免疫を 2週間間隔で繰り返した。

また、フロインドのアジュバントの他、フナコシより市販されているリビーァジュバントシステムの変法により免疫を行った。本免疫ェマルジヨンの作成は次の操作により行った。すなわち、ポッターホモジナイザーを使用し、グラインダ

—チューブに精製 AGPR 20〃g を加え、窒素を吹き付けて乾固させ、更に、クロ口ホルム：メ夕ノール: = 4 ： 1の混合液に溶解しているトレハロースジミコール酸（TDM) 及びモノリン酸リピッド A (MPL) を加え、窒素を吹き付け乾固させた。本チューブにスクアレン 4〃 ^を加え、スリーワンモーターにセットしたテフロン棒にて抗原、アジュバント及びスクァレンを 1 , 2 0 Orpmで 3 分間混合した。その後、 0. 2% Twe e n 8 0、 0. 72% Na C^を含む 1 3 mM リン酸緩衝液（pH 7. 2 ) 20 0〃 ^を加え、 1 , 2 0 0 rpm で 4 分間混合し、免疫ェマルジヨンを作成した。得られたェマルジヨン 20 0〃_βを 1回の免疫につき 1匹の BALBZc雄性マウス腹腔に注射し、 4回免疫を 2週間間隔で繰り返した。

なお、初回免疫では TDM5 0 iig , MPL 5 0 g を、追加免疫では TDM 5 0 g 、 MP L 5 ig を使用した。

この 2方法により免疫したマウスの眼底静脈から採血し、抗体価を EL I S A 法で測定して、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合に使用した。

( 2 ) 細胞融合

4回目の免疫から 1ヶ月後、生理食塩水 2 0 0 に希釈した精製 AG PR 20 /g をマウス腹腔に注射し、その 3日後にマウスから脾臓を摘出した。摘出した脾臓を RPM I 1 64 0培地中、ピンセット及びスライドグラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収した。これを 1， 5 0 0 rpmで 5分間遠心して脾細胞を集め、更に同培地で洗浄、遠心した。最終的に 1 5 %牛胎児血清 (FCS) を含む同培地 2 を加え、脾細胞懸濁液を調製した。生きた脾細胞数は、ァグリジンオレンジノ臭化工チジュゥム溶液（各 0. lmgを PBS に溶解）と懸濁液を 1 ： 1で混ぜ、蛍光顕微鏡下で数えた。生きた脾細胞 1 0⁸ 個と、予め培養しておいた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞（ミエ口—マ細胞） SP 2Z 0— Ag 1 4の 1 0⁷ 個を混合した後、 1 , 5 0 Orpraで 5分間遠心した。上清を除去後、細胞をよく解きほぐした後、 GKN溶液（Na C ： 8 g, KCi ： 0. 4 g, グルコース： 2 g， Na₂HP〇₄ : l . 4 1 g, NaH₂P0₄ · 2 H₂0 ： 0. 78 gを精製水 1 に溶解したもの）にて懸濁し、 1， 5 0 Orpm / P95/00770

で 5分間遠心を行い、細胞の洗浄を行った。同洗浄を繰り返した後、 5 0 %

(w/v) のポリエチレングリコール 1 54 0を含む GKN溶液 0. を徐々に加え、静かに 1分間攪拌した。これに GKN溶液 1 を徐々に静かに加えて反応を停止させ、 1 , 5 0 0 rpm で 5分間遠心した。得られた細胞を 1 5 F C Sを含む R ΡΜ I 1 64 0の 3 0 に浮遊し、 HAT培地（ 1 0 -⁴Mヒポキサンチン、 4 X 1 0— ⁷Mアミノプテリン、 1. 5 X 1 0 -⁵Mチミジン及び 1 5 % ?じ≤含有1^?1^ 1 1 64 0培地）及びフイダ一細胞が含まれる（ 1ゥェル当り 2 0 0〃 ^) 9 6穴マイクロカルチヤ一プレート 3枚に、 1ゥエル当り 0. づっ分注し、 3 7で、 5 % 炭酸ガス培養器中で培養した。 1 0日後に全てのゥエルで融合細胞の増殖を確認した。

(3) 抗 AG PR抗体産生ハイプリドーマの選択とクローン化

培養上清中の抗 AG PR抗体の存在の有無を EL I S A法で測定した。すなわち、精製 AGPRを固相化した 9 6穴マイクロプレートを用いてスクリーニングを行った。詳細には、 AG PRを、 0. 72% Na C を含む 1 3πιΜ リン酸緩衝液（ρΗ7. 2 ； PBS) で希釈して 0. 2 / g に調製し、 5 0 ^Ζゥエルの割合で 9 6穴マイクロプレートに分注し、 4 °Cで一夜放置した。これを 1 %ゥシ血清アルブミン、 0. 0 5% Twe e n 20を含む PBS (pH7. 2

； BSA-PBS) で 3回洗浄した。各プレートの各ゥエルに培養上清 5 0 ix H を加え、 3 7でで 1時間保温した。次いで、 P B Sで 3回洗浄後、 B SA - P B Sで 1 , 0 0 0倍に希釈したペルォキシダーゼ標識抗マウス I g G抗体

(F c部位に特異的，ャギ由来）を 5 0 ^加え、 37°Cで 1時間保温した。これを PBSで 5回洗浄後、 1 IraM オルトフヱ二レンジァミン、 0. 02% 過酸化水素水を含むクェン酸一リン酸緩衝液（PH5. 0) を 5 ゥエル加えて室温で 3 0分間反応させた後、 4. 5M 硫酸を 5 0 ^ ウエル加えて反応を停止させた。この反応において、 5 5 Onmでの吸光度が高い結果を示した上清を得たゥエルを選択した。

EL I S Aで陽性のゥエルについては、ウエスタンブロッ卜において他の動物由来の AG PRとの反応性を確認し、交差反応を示すモノクローナル抗体の選択を行った。すなわち、上記 AGPRの精製に従い、ゥサギ、ラット（SD) 、マウス（BALBZc) の肝臓よりアセトンパウダーを調製し、その抽出液を 4一 20% SDS— PAGEにおいて、 1ゥエル当り 1 0〃アプライした。これらサンプルを電気泳動後、陽極液 1 ： 0. 3M Tr i s、 20 % メタノール

；陽極液 2 ; 2 5mM T r i s、 2 0 % メタノール；陰極液： 2 5 mM Tr i s、 4 Om ε—アミノー n—力プロン酸、 20% メタノールの緩衝液を用いたセミドライブ口ティングにて 80 mA、 1時間でポリビニリデンジフルォライド（PVDF) 膜に転写した。 P VDF膜は、 1 0% スキムミルクを含む ?83にて4 、ー晚ブロッキングした後、今回得た各モノクローナル抗体を反応させた。転写膜を短冊状に切り、短冊当り各ハイプリドーマの培養上清 500 ^を室温で 1時間反応させた後、 0. 05% Twe e n 20を含む PBS

(PB ST) で 3回洗净し、 1 % ゥマ血清を含む PBSで 200倍に希釈したピオチン標識抗マウス I gGゥマ抗体 500 / ^を室温で 1時間反応させた。更に、 PBSTで 3回洗浄後、 PBSで 50倍に希釈したペルォキシダーゼ標識ァビジン DH—ビォチン 500〃を室温で 30分間反応させた。 PBSTで 3回洗浄後、 5 OmM Tr i s-HCi (pH7. 6 ) 1 00 にジァミノベンチジン 25mg、過酸化水素 20 /^を含む基質液を加え酵素反応を行った。バンドが確認でき次第、水洗にて反応停止を行った。

その結果は表 1に示すとおりであり、得られたモノクローナル抗体がヒト AGPRと反応することを確認するとともに、他の動物由来の A G P Rとも交差反応を示すことを確認した。

表 1

各種動物 A G P Rに対する反応性体 No.. ヒ精製 AGPR マェ

マウ入計臓フッ卜肝臓フヒッ卜 B十贓

マ

非還元 / セ卜ノノヽソ ― ■fffl出物セ卜ノノヽヮ / J 卜 'ヽヮタ f田出域兀兀兀

+ + 十十十十十

30202 + +

όΌόΌά +

30204 + ―

30205 + +

+ 一

30208 + ― 十

30209 十

30210 + ― —— ― ― ― 一

30211 + + + + + + + +

30212 +

30213 +

30214 + +

30215 +

30216 +

30217 +

30218 +

30219 +

30220 +

30221 + + +

30222 + +

30223 + +

30225 +

次に、単クローン化は限界希釈法で行った。すなわち、フィーダ一細胞として

BALB/cマウスの胸腺細胞を、 1ゥエル当り 1 0⁶個 ZO. づっ分注した 9 6穴マイクロカルチャープレートに、特異抗体陽性ゥエル中のハイプリドーマを 1 0個/ となるように希釈したものを 0. ずつ分注した。培地は初回は HAT培地を、 2回目は HT培地を、 3回目以降は 1 5 % F C Sを含む RPM I 1 64 0を用い、 3 7°C、 5 % 炭酸ガス培養器中で 1 0日間培養した。

EL I S A法による特異抗体陽性ゥエルの選択及び限界希釈法による単クロ一ン化操作を各 3回繰り返した。その結果、抗 AGPR—モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ 24株を確立した。

参考例 3

モノクローナル抗体の分離及び精製：

参考例 2の方法によつて得た抗 A GPR—モノクロ一ナル抗体産生ハイブリド一マをマウス腹腔内で培養してモノクローナル抗体を得た。

前処理として、 8週齢の BALB/cマウスの腹腔内に 0. 5 m£のプリスタン (2， 6, 1 0, 1 4—テトラメチルペン夕デカン）を投与した。 8日後、 0. の RPM I 1 64 0培地に浮遊したハイプリドーマ 4〜 1 5 (X 1 0⁵個）を、このマウスの腹腔内に投与した。投与後 9日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集めた腹水は 3, 0 0 Orpmで 1 0分間遠心分離を行い、細胞等の不溶物を除去した。上清部分に等容の飽和硫酸アンモニゥム溶液を攪拌しながら加え、一夜、 4°Cに放置して得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を 2 Om Tr i s— HC_g緩衝液（pH8. 0 ) に溶解、透析した。同緩衝液で平衡化した DEAE— S e p h a c e 1カラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中、 0 - 0. 3 Mの N a C 直線濃度勾配で溶出させ精製抗体を得た。

参考例 4

モノクロ一ナル抗体組み合せの選定：

参考例 3で得られた精製モノクローナル抗体の内、参考例 2 (3) のスクリー二ングで発色値の低かつた抗体、ウエスタンプロッティングで反応性が類似してレ、た抗体及びサブクラスが 7 2 bであった抗体を除き、固相化抗体として 3 0 2 0 し 3 0 2 0 2、 3 0 2 0 3、 3 0 2 0 4、 3 0 2 0 8、 3 0 2 1 4、 3 0 2 1 5、 3 0 2 1 6、 3 0 2 1 8、 3 0 2 1 9、 3 0 2 2 0、 3 0 2 2 1、 3 0 2 2 2、 3 0 2 2 5を、酵素標識抗体として 3 0 2 0 1、 3 0 2 0 2、 3 0 2 0 3、 3 0 2 0 8、 3 0 2 1 0、 3 0 2 1 4、 3 0 2 1 6、 3 0 2 1 8、 3 0 2 1 9、 3 0 2 2 0、 3 0 2 2 し 3 0 2 2 2、 3 0 2 2 5を選択して E L I SAを行い、 AG PR測定に適した組み合せの選定を行った。抗体の酵素標識は参考例 6に従い、精製 I gGを用いて行った。

固相化用の抗体を P BSで希釈して 2〃g に調製し、 5 0 ボウェルの割合で 9 6穴マイクロプレートに分注し、 4 °Cで一夜放置した。これを 1 % ゥシ血清アルブミン、 0. 0 5 % Tw e e n 2 0を含む P B S pH7. 2 (BSA-P BS) で 3回洗浄した。各プレートの各ゥエルに、 4倍希釈したヒト血清あるいは 1 0倍希釈したヒト肝癌細胞株の細胞溶解液 5 0 ; / ^を加え、 4 °Cでー晚反応させた。次いで、 PBSで 3回洗浄後、 BSA— PBSで 1 0 0倍に希釈した各酵素標識モノクローナル抗体を 5 0 ^ _g加え、 4 °Cでー晚反応させた。これを PBSで 5回洗浄後、 1 lmM オルトフエ二レンジァミン、 0. 0 2 % 過酸化水素水を含むクェン酸—リン酸緩衝液（pH5. 0) を 5 ゥェル加え、室温で 3 0分間反応させた後、 4. 5M 硫酸を 5 0 ^ノウエル加えて反応を停止させ、 4 9 2nmの吸光度を測定した。その結果を表 2及び 3に示す。

表 2 それぞれの McAbsの組合せにおける HepG2細胞溶解液との反応性コ一ト HRP標識 McAb

McAb 01 02 03 08 10 14 16 18 19 20 21 22 25 U丄 1 十十十

1 + +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 十

02 I++ 1 - HI ++ + ++ +++

03 ++ - 1 ++ +++ ++ ++ + ++ ++

04 +++ - I++ IH + +++ +

08 +++ - ++ 1 +++ +++ \\\ +++ ++ +++ +++

14 +++ +++ \\\ H+ 1 +++ +

15 +++ +++ +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++

16 +++ - +++ IH ++ 1 +++

18 +++ - + +++ + + 1 + I++ ++

19 +++ - +H +++ +1 + 1 + H+ + ++

20 +H - +++ +++ ++ 1 +++ + +++

21 +++ - HI +++ H+ ++I \ \ \\\ +++ 1 + +++

22 +++ - +++ +H +++ +++ +++ +1+ +++ 1 +++

25 +++ - +++ +++ + + +++ 1

① + 、 ++、 +及び-は、 ELISA法で 10倍希釈した HepG2細胞溶解液を反応させた時の吸光度を示す。

②それぞれの吸光度は McAbをコ一卜したプレートとマウス IgGをコートしたプレート（コントロール）の差から求めた。

©+++：>!. 0 0D, ++ : 0. 5-1. 0 0D, + : 0. 2-0. 5, -：く 0. 2, /:測定せず

表 3 それぞれの McAbsの組合せにおけるヒト血清との反応性

コ一ト HRP標識 McAb

McAb 01 02 03 08 10 14 16 18 19 20 21 22 25

01 / +++ - - - - - +++ - - - 02 +++ / - - - - +++ _ + - 03 ++ +■ / - - - - H+ - - - 04

08 - -： - / - - - - - - - 14 - - ― - 一 / — — - - - 15

16 ― - - ― - - I 一一 — —

18 +++ ++ - - - - - / - - - 19 一一一一一一一一 I 一 +

20 +++ ++ - - - - - +++ - / - 21 一一一一一一一 + 一一 /

22

25

① +++、 ++、 +及び-は、 EL ISA法で 4倍希釈したヒト血清を反応させた時の吸光度を示す。

②それぞれの吸収は McAbをコ一卜したプレートとマウス IgGをコ一トしたプレー卜（コントロール）の差から求めた。

③ +++:>1.0 0D, ++:0.5-1.0 OD, +:0.2-0.5, -: <0.2, /:測定せず

参考例 5

固相化プレー卜の作成：

参考例 3の方法によって精製した抗 A G P R—モノクローナル抗体 ( 3 0 2 2 0 ) を NUNC社のマイクロプレートに固相化した。すなわち、 1 5 OmM Na C ^を含む 5 OmMの炭酸緩衝液（pH9. 6 ) に、 3 0 2 2 0が 2 c g ?^となるように希釈し、 1ゥエル当り 1 0 0 を加え、 4 °Cで 3時間ィンキュベイシヨンした。溶液を吸引除去後、 1 % BSA及び 5 % シュクロースを含むリン酸緩衝液（pH7. 2) を 1ゥエル当り 3 0 0 ^^加え、室温で 1時間ィンキュペイシヨンした後、溶液を吸引除去し、ォ一トドライデシケーターにて室温で一晚乾燥させ、抗体固相化プレートを作成した。

参考例 6

酵素標識抗体の作成：

抗体を標識する酵素として西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP) を用い、中根らの方法（Na k a n e e t a l . , J. H i s t o c h em. , 22 : 1 0 8 4， 1 9 74年）に従って標識した。すなわち、 F (a b' ) ₂に断片化した 3 0 2 0 1モノクローナル抗体の 2 8 Onmにおける吸光度で 50D相当を 0. 2M 炭酸緩衝液（pH9. 5 ) で透析し、コロジオンバックで約にまで濃縮した。 HRP 5mgをの精製水に溶かし、 0. 1 M Na I 0₄ 7 5 を加え、室温で 2 0分間攪拌し、これを lmM 酢酸緩衝液（pH4. 0) に対して透析し、 pHを 4程度に下げた。 0. 2M 炭酸緩衝液（pH 9. 5) を 1 0 0 ί加えて pHを 9付近にし、前記のモノク口一ナル抗体溶液と混合して室温で 2 時間攪拌し、 F (a b' ) ₂と HRPの標識を行った。 4mgZ Na BH₄ 1 0 0 ; / を加えることにより反応を停止させた後、 F PLCを用いたゲル濾過法により F (a b' ) 2— HRPの精製を行った。

実施例 1

各処方での反応性比較：

検体希釈液及び酵素標識抗体溶液として次の（ 1 ) 〜（4) のものを用いた場合について、反応性を比較した。

( 1 ) 検体希釈液及び酵素標識抗体溶液が処方 1 ( 1 % B SA, 1 2 3Mra N a C β, 0. 0 5% Twe e n 2 0を含む 1 3 mMリン酸緩衝液； pH 7. 2) の場合、

(2) 検体希釈液が処方 2 (2% BSA， 1 5 OmM N a C £, 0： 0 5 % Twe e n 2 0を含む 1 0 0 mM リン酸緩衝液； pH 6. 2 ) であり、酵素標識抗体溶液がフヱノールを含まない処方 3 ( 0. 1 % B S A， 1 5. O mM N a C β , 0. 0 5 % Tw e e n 2 0を含む 2 0 mM B E S緩衝液； pH7. 0 ) の場合、

(3) 検体希釈液が処方 1であり、酵素標識抗体溶液がフノールを含む処方 1 ( 0. 1 % B S A, 1 2 3 mM N a C β , 0. 0 5 % Tw e e n 2 0， 0. 1 % フヱノールを含む 1 3 mM リン酸緩衝液； pH 7. 2 ) の場合、

(4) 検体希釈液が処方 2であり、酵素標識抗体溶液が 0. 1 %フエノールを含む処方 3の場合。

すなわち、精製 AGPRが 2 5、 1 2. 5、 5、 2. 5ng/ となるように各緩衝液で希釈し、参考例 5で作成した固相化プレートに 1ゥエル当り 2 0 0 ^ を加え、室温でー晚反応させた。 PBSTで 3回洗浄後、 2 8 0 nmにおける吸光度が ImOD となるように各緩衝液で希釈した酵素標識抗体を 1ゥエル当り 1 0 0 /^添加し、室温で 1時間反応させた。 PBSTで 5回洗浄後、基質溶液（ 1 1 m オルトフヱ二レンジァミン、 0. 0 2% 過酸化水素を含むクェン酸緩衝液； pH5. 0) を 1ゥエル当り 1 0 0 £加え、室温で 1 0分間反応させた後、 1. 5N 硫酸を 1ゥエル当り 1 0 0〃加え、 4 9 2 mnにおける吸光度をマイクロプレートリーダ一にて測定した。その結果を図 1に示す。

図 1の結果から明らかなように、検体希釈液を pH 6. 2にした場合及びノ又は酵素標識抗体溶液にフエノールを含有せしめた場合には、より高感度に A GPR 濃度を測定することができる。

実施例 2

同時再現性及び日差再現性：

参考例 5にて調製した固相化プレート、検体希釈液（2%. BSA、 1 5 OmM Na C 0. 0 5 % Twe e n 2 0を含む 1 0 OmM リン酸緩衝液； pH

6. 2 ) 及び 2 8 0 nmにおける吸光度が 1 mOD の酵素標識抗体を含む溶液 ( 0. 1 % B SA、 1 5 OmM Na C 、 0. 0 5 % Tw e e n 2 0、 0. 1 % フヱノールを含む 2 OmM BES緩衝液； pH7. 0) を用い、各濃度の血清を 4倍希釈して測定した時の本測定系の同時再現性及び日差再現性を測定した。すなわち、 4倍希釈した各濃度の血清を 1ゥエル当り 2 0 0〃加え、室温で一晩反応させた。以下の操作は、実施例 1 と同様に行った。同時再現性及び日差再現性の結果を表 4に示した。そのバラツキは A G P R濃度により異なり、それぞれ 4〜 1 4 %、 7〜 1 4 %であった。

表 4

実施例 3

添加回収試験：

実施例 2と同様にして、各濃度の精度 AGPRを添加した血清を 4倍希釈して測定した時の本測定系の回収試験を行った。その結果を表 5に示した。回収率は、 9 3— 9 9 %であった。

表 5

回収試験

添加実測値理論値回収率（％)

0 0.2

2 2.1 1.9 95

7 6.7 6.5 93

20 20.1 19.9 . 99 実施例 4

フエノール添加試験実施例 1で用いた検体希釈液（処方 2) で 1 2. 5ngZ となるように希釈した AG PR溶液を参考例 5にて調製した固相化プレートに 1ゥエル当り 2 0 0 〃 ^加え室温で一晩反応させた。 P B S Tで 3回洗浄後、各濃度（ 0 %， 0. 0 0 1 %, 0. 0 1 %, 0. 0 5 %, 0. 1 のフエノール及び 2 8 Ornn における吸光度が 1 mOD の酵素標識抗体を含む酵素標識抗体溶液を 1ゥエル当り 1 0 0 £加え室温で 1時間反応させた。以下の操作は実施例 1に従って行った c 結果を表 6に示す。

表 6

値は吸光度値を示す。

実施例 5

肝臓切除術後の AG PR測定：

参考例 5に順じ、ラット及ぴヒトの AG PRと反応する 3 0 2 0 8—モノクローナル抗体を固相化したプレート、検体希釈液（ 2 % B S A、 1 5 O mM N a C . 0. 0 5 % Tw e e n 2 0を含む 1 0 OmM リン酸緩衝液； pH6. 2) 及び 2 8 Onmにおける吸光度が 1 mOD の酵素標識抗体を含む溶液 ( 0. 1 % B SA、 1 5 OmM Na C 0. 0 5 % Tw e e n 2 0、 0. 1 % フヱノールを含む 2 0mM BES緩衝液 pH7. 0) を用い、ラット肝臓の 7 0 %を切除した後の血清を 4倍希釈して測定を行った。ラットは術後、順調に生育した。詳細については、実施例 2に準じて測定を行った。その結果を図 2に示した。

良好な経過を取ったラットでは術後に AGPR値の上昇が認められ（図 2中、 3) 、肝再生の状態を把握していると考えられた。

実施例 6

肝疾患検体の AG PR測定：健常者 2 3 8例、アルコール性肝硬変 9例、ウイルス性肝硬変 1 9例、ウィルス性慢性活動性肝炎 2 3例の血清を用い、 AGPR量を測定した。測定法は実施例 2に従って行い、その結果を表 7に示した。ウィルス性肝炎及びアルコール性肝硬変患者の血清 AGPR濃度

のパーセンタイル表示

表 7の結果より、アルコール性肝硬変の血清は、 AGPR濃度が高いことが認められた。

実施例 7

肝細胞培養上清中の AG PR測定：

ヒト肝癌細胞株（He p G 2) を、 1 0 % F C Sを含む MEN/ [培地を用いてシャーレで培養後、コンフルェントになった時に培養上清を除き、細胞を同培地で洗浄後、エタノール 1 0 OmMを添加又は無添加で、 3 7 °Cで培養した。 0. 5、 1、 2、 3、 4、 5時間後に培養上清中（2 0 0〃を用いて）の AG PR量を測定した。抗原の反応後の測定方法については実施例 2と同様に行った。結果を図 3に示す。産業上の利用可能性

本発明の AG PRの測定法によれば、 AG PRを高感度で精度良く測定することができる。

従って、本発明の測定法は肝細胞の状態の把握に有用であり、特に、肝切除術に関連して肝再生の状態の把握、アルコール性の肝障害検出、インビト口において薬物刺激による肝細胞膜の流動性、肝細胞膜成分のターンオーバーの変化から肝細胞の機能変化の把握などを容易に行うことができる。

Claims

請求の範囲

1 . ァシァログリコプロテインレセプ夕一を認識するモノクロ一ナル抗体を被検体と接触させ、免疫測定法によりァシァログリコプロテインレセプ夕一を測定する方法において、検体希釈液の PHを 5〜 7にすることを特徴とするァシァ口グリコプロティンレセプターの測定法。

2 . ァシァログリコプロテインレセプターを認識するモノクロ一ナル抗体を被検体と接触させて免疫測定法によりァシァログリコプロテインレセプターを測定する方法において、酵素標識抗体溶液にフエノールを含有せしめることを特徴とするァシァログリコプロテインレセプターの測定法。

3 . ァシァログリコプロテインレセプ夕一を認識するモノクローナル抗体を被検体と接触させて免疫測定法によりァシァログリコプロテインレセプターを測定する方法において、酵素標識抗体溶液にフノールを含有せしめ、かつ検体希釈液の pHを 5〜7にすることを特徵とするァシァログリコプロテインレセプターの測定法。

4 . 請求項 1〜3のいずれか 1項記載のァシァログリコプロテインレセプ夕一の測定法により肝細胞から放出される培養上清中のァシァログリコプロテインレセプターを測定することを特徴とする治療薬のスクリーニング方法。

5 . アジアログリコプロティンレセプ夕一を認識するモノクロ一ナル抗体及びフエノールを含有するァシァログリコプロテインレセプターの測定試薬。